CN102321582A

CN102321582A - 一种粒细胞分离液及其粒细胞分离及活性测定方法

Info

Publication number: CN102321582A
Application number: CN201110250834A
Authority: CN
Inventors: 李晓祥
Original assignee: Zmks International Cancer Therapy Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Zmks International Cancer Therapy Biotechnologies Co Ltd
Priority date: 2011-08-29
Filing date: 2011-08-29
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明公开一种粒细胞分离液及其粒细胞分离及活性测定方法，所述粒细胞分离液是由percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水配置而成，所述percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水体积比为3~8:1:1~5。本发明主要利用特殊的粒细胞分离液进行分离粒细胞，进而测定粒细胞的活性，达到筛选出高效的粒细胞的目的，提高粒细胞治疗肿瘤的效果，有利于针对性选择供体。

Description

一种粒细胞分离液及其粒细胞分离及活性测定方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种粒细胞的分离及活性测定的方法。

背景技术

肿瘤是危害人类生命和健康的一大疾病，目前已列人群疾病死亡病因的第二位。据世界卫生组织统计，全世界每年有900万新发癌症，500万人死亡。目前肿瘤的治疗方法主要是手术、放疗和化疗。其中，外科手术治疗只适用于早期肿瘤，而放化疗毒副作用较大。因此，开发安全有效的新一代抗肿瘤生物疗法将有着极其重要的社会效益和经济效益。异体人粒细胞输注治疗技术即通过向癌症患者注射来自健康捐赠者“超强生命力”的肿瘤杀伤活性（cancer killer activity, CKA）粒细胞，帮助治疗甚至治愈恶性肿瘤。

而选择高效的粒细胞是异体人粒细胞输注治疗技术治疗肿瘤的关键，但是现有技术中并没有关于通过分离粒细胞并测定其活性就能筛选出高效的粒细胞的方法。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种粒细胞分离液及其粒细胞分离及活性测定方法，旨在解决如何分离并筛选出高效的粒细胞的问题。

本发明的技术方案如下：

一种粒细胞分离液，其中，所述粒细胞分离液是由percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水配制成，所述percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水体积比为3~8:1:1~5。

所述的粒细胞分离液，其中，所述的粒细胞分离液的配制方法为：

先加入10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水，摇匀，再加入percoll，混匀；所述percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水体积比为3~8:1:1~5。

一种使用上述的粒细胞分离液进行粒细胞分离及活性测定方法，其中，包括以下步骤：

S100、从采集到的血液样本中分离粒细胞；

S200、对分离得到的粒细胞进行测定活性；

所述粒细胞分离的过程，是用所述粒细胞分离液进行分离粒细胞，将配制好的多个密度的粒细胞分离液按照管底浓管顶稀的密度梯度加入到离心管中，将血液样本平铺于粒细胞分离液的液面上，进行室温离心。

所述的粒细胞分离及活性测定方法，其中，所述步骤S100具体包括以下步骤：

S101、在血液样本中加入红细胞沉淀液，使红细胞沉淀，取上清白膜层；

S102、将配置好的所述粒细胞分离液按照管底浓管顶稀的密度梯度，将不同密度的粒细胞分离液加入到离心管中，然后把所述上清白膜层平铺于粒细胞分离液的液面上；

S103、室温500g离心30分钟；

S104、用吸管吸出上层血浆和分离液之间的单个核细胞，和吸出管底第1层至第2层粒细胞分离液的液面之间的粒细胞。

所述的粒细胞分离及活性测定方法，其中，所述步骤S102中，所述粒细胞分离液设置5个密度梯度。

所述的粒细胞分离及活性测定方法，其中，所述步骤S102中，所述粒细胞分离液设置的5个密度梯度，按Percoll 比重为：1.208、1.195、1.179、1.167和1.155。

所述的粒细胞分离及活性测定方法，其中，所述步骤S200具体包括以下步骤：

S201、在培养板上，设置只加粒细胞的粒细胞对照孔、只加靶细胞的靶细胞对照孔和只加CM的空白对照孔，还有加有粒细胞和靶细胞的实验孔，在所述靶细胞对照孔和实验孔中分别加入肿瘤靶细胞；

S202、分别向粒细胞对照孔和实验孔的培养孔中加入粒细胞；

S203、混匀，饱和湿度培养箱中培养；

S204、每孔加入CCK-8试剂；

S205、在饱和湿度培养箱继续培养；

S206、在酶标仪上用450-490 nm波长测各孔吸光度，计算粒细胞的杀伤率。

所述的粒细胞分离及活性测定方法，其中，所述步骤S203和S205中，都是在37℃、5% CO₂的条件下进行培养。

有益效果：本发明主要利用特殊的粒细胞分离液进行分离粒细胞，进而测定粒细胞的活性，达到筛选出高效的粒细胞的目的，提高粒细胞治疗肿瘤的效果，有利于针对性选择供体。

附图说明

图1为本发明实施例中96孔培养板上的布局图。

图2为本发明实施例中使用粒细胞分离液分离粒细胞的示意图。

图3为本发明实施例中A值曲线图。

具体实施方式

本发明提供一种粒细胞分离液及其粒细胞分离及活性测定方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的粒细胞分离及活性测定的方法，主要包括以下两个步骤：

S100、从采集到的血液样本中分离粒细胞；

S200、对分离得到的粒细胞进行测定活性。

所述步骤S100粒细胞的分离过程，主要是利用特殊的粒细胞分离液进行分离粒细胞，进而测定粒细胞的活性。

所述步骤S100粒细胞的分离过程主要包括以下步骤：

S101、将血液样本进行必要的消毒处理；

S102、用细胞仪对血液样本进行白细胞分类及计数；

S103、加入红细胞沉淀液，使红细胞沉淀，取上清白膜层；

S104、将配置好的所述粒细胞分离液按照管底浓管顶稀的密度梯度，将不同密度的粒细胞分离液加入到离心管中，然后把上清白膜层平铺于粒细胞分离液的液面上；

S105、室温500g离心30分钟；

S106、用巴斯德吸管吸出管底第1层至第2层粒细胞分离液的液面之间的粒细胞，即为效应细胞。

所述粒细胞分离液的由三种组分组成，分别为：

母液A： percoll(珀可，是聚乙烯吡咯酮包被的二氧化硅壳粒的无菌胶体悬液)；

母液B： 10倍PBS（磷酸盐缓冲溶液）；

母液C：生理盐水。

所述percoll密度是1.23g/L。

应用所述母液A、母液B、母液C的配置不同密度的粒细胞分离液时，所述母液A、母液B、母液C的体积比为3~8:1:1~5。

所述不同浓度梯度的粒细胞分离液的制备方法如下：

S1、取n（n为大于1的自然数）支50mL无菌离心管，分别标为1、···、n，对应粒细胞分离液1-n。

S2、将各离心管放在天平上分别称重，记录各管的重量。

S3、按照比例和所需密度，分别往1-n号离心管中加入粒细胞分离母液C和B，轻轻摇匀；然后再分别加入粒细胞分离母液A，用吸管混匀。

S4、再将各离心管放在天平上分别称重，分别减去各自空管的重量，与表中对应的重量进行对比，如有误差，分别添加母液A或C进行调整，直到重量相符为止。

S5、用0.45μm无菌过滤器负压吸引过滤除菌，分装与50mL无菌离心管中，20mL/管，标签注明分离液名称，配制日期。

使用所述粒细胞分离液进行分离粒细胞，是将配制好的粒细胞分离液按照管底浓管顶稀的密度梯度加入到离心管中，然后把血液样本沉淀后的上清白膜层平铺于粒细胞分离液的液面上，然后进行室温离心。如图2所示，在从管底算起，第1层粒细胞分离液（即粒细胞分离液1）和第2层粒细胞分离液的液面之间即为粒细胞。红细胞在第一层粒细胞分离液之中，单个核细胞在第5层细胞分离液的液面之上。

使用所述粒细胞分离液进行分离粒细胞，粒细胞分离液的密度越精细，粒细胞分离的纯度越高。应用上述密度梯度的粒细胞分离液分离粒细胞，纯度可以达到90%。

经过S100分离得到的粒细胞即为效应细胞，所述S200的粒细胞活性测定过程，主要包括以下步骤：

S201、在96孔培养板上，设置只加效应细胞的效应细胞对照孔、只加靶细胞的靶细胞对照孔和只加CM的空白对照孔，还有加有效应细胞和靶细胞的实验孔，在靶细胞对照孔和实验孔中分别加入Hela细胞（肿瘤靶细胞）；

S202、根据效应细胞：靶细胞20:1、10:1、3:1的比例，分别向效应细胞对照孔和实验孔的培养孔中加入相应数量的效应细胞；

S203、混匀，在37℃，5% CO₂的条件下，饱和湿度培养箱中培养24h；

S204、每孔加入CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂；

S205、在37℃，5% CO₂饱和湿度培养箱继续培养2h；

S206、在酶标仪上用450-490 nm波长测各孔吸光度（A值），计算出3-5个复孔的平均值，计算杀伤率。

所述效应细胞的杀伤率的计算公式为：K=1-〔A_{（效应细胞+靶细胞）}-A_{效应细胞对照}/A_{靶细胞对照}-A_空白对照〕*100%。

下面详细说明一下结合具体实施例说明本发明的效应细胞分离及活性测定的方法详细步骤：

将采集到的效应细胞进行分离前，需要先做以下准备：

Day（-2） Hela细胞（肿瘤靶细胞）培养接种

1）将2.5×10⁵或3×10⁵个Hela细胞接种于T25培养瓶中，每瓶5mL CM（完全培养基）。

2）在37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养。

Day（-1）

Hela细胞培养的观察

3）Hela细胞经24h培养细胞数可翻倍，形态良好。

4）培养基颜色未明显变黄（培养基颜色明显变黄说明细胞长过了）。

Day（0） Hela细胞接种平底96孔培养板

5）弃T25培养瓶中的培养液，加5-10毫升PBS（磷酸盐缓冲溶液）清洗细胞，吸弃PBS，加3-5毫升0.25%的胰酶消化细胞，倒置显微镜下观察细胞回缩变圆，加入5mL CM（完全培养基）终止胰酶消化，用吸管将细胞移入15mL离心管，取0.1毫升做台盼兰染色计数细胞。

6）调细胞浓度为50000/mL，充分混匀，将细胞加到加样槽中，充分混匀，用排枪将细胞加入96孔培养板相应孔中（加细胞时要轻），96孔培养板布局见图1，100μL/孔（5000个细胞/孔），50μL/孔（2500个细胞/孔）+50μL/孔CM，25μL/孔（1750个细胞/孔）+75μL/孔CM，每加一排轻摇培养板和靶细胞悬液。注意：（1）使每孔细胞均匀分布于孔底（避免细胞聚集于孔的周边），（2）混匀靶细胞悬液，其余各实验孔（效应细胞对照孔、空白对照孔）每孔加100uL CM，96孔板周边各孔加满生理盐水。

7）在37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养24h。

将采集到的效应细胞进行分离的步骤主要包括：

Day（1）效应细胞的分离及接种

8）对所得血液样本进行必要的消毒处理，经传递窗送入实验室。

9）将20mL血液样本移入尖底50mL离心管，确定血液总体积，用吸管将细胞轻轻混匀，立即吸取细胞悬液20μL用血细胞分析仪进行外周血白细细胞分类及计数。

10）红细胞沉淀液：加入等量的3% 葡聚糖（Dextran）和0.9%NaCl沉淀液，盖紧离心管盖，轻轻颠倒离心管5次混匀，打开管盖用棉签仔细将管盖及管口及液面以上的血擦干净，在室温静置45分钟使红细胞沉淀。

11）取2-3支15mL离心管，按照粒细胞分离液1、2、3、4、5的顺序，分别依次加入5种分离液，每种分离液加入1mL，总体积5mL；

所述粒细胞分离液1、2、3、4、5按照以下表格的配方配制而成，

所述粒细胞分离液1-5，其密度分别如下：

粒细胞分离液1: 1.208 (Percoll 比重)；

粒细胞分离液2: 1.195 (Percoll 比重)；

粒细胞分离液3: 1.179 (Percoll 比重)；

粒细胞分离液4: 1.167 (Percoll 比重)；

粒细胞分离液5: 1.155 (Percoll 比重)。

12）将步骤10）得到的上清白膜层小心加入步骤11）的15 mL离心管分离液的上层界面，每支离心管加不多于5 mL的上清白膜层（主要含有血浆、白细胞和血小板）。

13）室温500g离心，30分钟。

14）用巴斯德吸管小心吸出上层血浆和分离液之间的单个核细胞，移入1支新离心管待用。

15）用巴斯德吸管小心吸出管底（第1层）红细胞以上（避免吸出红细胞）至第2层分离液液面之间的效应细胞（避免吸出单个核细胞），加入1支15mL离心管，见附图2。

16）加入1ml完全培养基（CM），计数，用CM调整效应细胞浓度为1×10⁶/mL，即为效应细胞。

Day（1）效应细胞接种96孔板

17）从培养箱中取出96孔板，小心吸出各孔培养液。

18）根据效应细胞：靶细胞为20：1、10：1、3：1的比例，分别向已加入靶细胞的实验孔和效应细胞对照孔中加入相应数量的效应细胞（此时效应细胞的计算应在头一天的起始数目加倍，即一天前的5000应为10000），设只加效应细胞的效应细胞对照孔、只加靶细胞的靶细胞对照孔和只加CM的空白对照孔，每孔培养基终体积200μL，不足200μL的孔补加CM至200μL，每组分别设5个复孔，96孔板布局见附图1所示：

B2-6：实验孔（效：靶比为20：1），5000个靶细胞/孔，200μL/孔效应细胞；

B7-11：效应细胞对照孔，200μL/孔效应细胞；

C2-6：实验孔（效：靶比为10：1），5000个靶细胞/孔，100μL/孔效应细胞，100μL/孔CM；

C7-11：效应细胞对照孔，100μL/孔效应细胞, 100μL/孔CM；

D2-6：实验孔（效：靶比为3：1），5000个靶细胞/孔，30μL/孔效应细胞，170μL/孔CM；

D7-11：效应细胞对照孔，30μL/孔效应细胞，170μL/孔CM；

E2-6：靶细胞对照孔，5000个靶细胞/孔，200μL/孔CM；

E7-11：靶细胞对照孔，2500个靶细胞/孔，200μL/孔CM；

F2-6：靶细胞对照孔，1750个靶细胞/孔，200μL/孔CM；

F7-11：只加CM的空白对照孔，200μL/孔CM。

每加一排轻摇培养板和效应细胞悬液，注意：（1）使每孔细胞均匀分布于孔底（避免细胞聚集于孔的周边）；（2）边加细胞边混匀效应细胞悬液。

19）在37℃，5% CO₂，饱和湿度培养箱中培养24h。

Day（2）效应细胞的活性检测

20）在培养结束时，取出96孔培养板，用力用手掌敲打培养板的侧面，将未贴壁的效应细胞摇起，立即用真空泵或排枪将未贴壁细胞吸弃。吸弃时，将培养板倾斜45度角，将排枪头一直插到孔角的最低点。此过程可重复数次。将未贴壁的效应细胞摇起后，也可以试着将培养板翻过来用手用力甩干。

21）每孔加入200μl生理盐水，重复步骤20）。

22）每孔加入100μl CM和10μl CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂。

23）在37℃，5% CO₂饱和湿度培养箱继续培养2h。

24）在酶标仪上用450-490 nm波长测各孔吸光度（A值），计算出3-5个复孔的平均值。

25）计算杀伤率K=1-〔A（效应细胞+靶细胞）-A效应细胞对照/A靶细胞对照-A空白对照〕*100% 。将1-5组的平均A值做曲线图：纵坐标为平均A值，横坐标为细胞数，在曲线上找出6-10组平均A值的位置，并推算出相对细胞数（X）。用10,000 被6-10组推算出的细胞数除，再乘上100%，即得出在一定效：靶比时的CKA值（杀伤率）。杀伤率≥50%的供体为阳性，所筛选出来的粒细胞可用于肿瘤治疗。

在酶标仪上用450-490 nm波长测各孔吸光度（A值）如下下表所示，

	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
											B	1.589	1.743	1.279	1.374	1.544	0.712	0.724	0.725	0.735	0.731
C	2.013	2.154	2.154	2.231	2.533	0.719	0.72	0.752	0.743	0.741
											D	2.816	2.941	2.779	2.788	2.928	0.7	0.728	0.728	0.737	0.71
E	2.998	2.877	3.065	3.331	3.166	2.632	2.682	2.802	2.889	2.764
											F	2.105	1.92	1.977	1.895	2.182	0.723	0.742	0.74	0.751	0.745

如表中数据所示，单数据趋势符合理论值，较符合期望值，如5个复孔值较均一；效应细胞越多，则杀伤后所剩肿瘤细胞越少，吸光度值越小。

根据吸光度值的结果，效靶比为20:1的杀伤率即活性为92%，效靶比为10:1的杀伤率是74%，效靶比为3:1的杀伤率是58%。

根据接种不同数量细胞所测细胞吸光度值作图，如图3所示，所作曲线也呈正相关性，符合趋势。（接中细胞为0，1250，2500，5000）

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种粒细胞分离液，其特征在于，所述粒细胞分离液是由percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水配制成，所述percoll、10倍磷酸盐缓冲溶液和生理盐水体积比为3~8:1:1~5。

2.根据权利要求1所述的粒细胞分离液，其特征在于，所述的粒细胞分离液的配制方法为：

3.一种使用权利要求所述的粒细胞分离液进行粒细胞分离及活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S100、从采集到的血液样本中分离粒细胞；

S200、对分离得到的粒细胞进行测定活性；

4.根据权利要求3所述的粒细胞分离及活性测定方法，其特征在于，所述步骤S100具体包括以下步骤：

S103、室温500g离心30分钟；

5.根据权利要求4所述的粒细胞分离及活性测定方法，其特征在于，所述步骤S102中，所述粒细胞分离液设置5个密度梯度。

6.根据权利要求5所述的粒细胞分离及活性测定方法，其特征在于，所述步骤S102中，所述粒细胞分离液设置的5个密度梯度，按Percoll 比重为：1.208、1.195、1.179、1.167和1.155。

7.根据权利要求3所述的粒细胞分离及活性测定方法，其特征在于，所述步骤S200具体包括以下步骤：

S202、分别向粒细胞对照孔和实验孔的培养孔中加入粒细胞；

S203、混匀，饱和湿度培养箱中培养；

S204、每孔加入CCK-8试剂；

S205、在饱和湿度培养箱继续培养；

8.根据权利要求7所述的粒细胞分离及活性测定方法，其特征在于，所述步骤S203和S205中，都是在37℃、5% CO₂的条件下进行培养。