CN103215340A - 一种新颖的粒细胞制备及其抗癌活性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离纯化粒细胞的方法，特别是一种新型的不损伤粒细胞活性的制备方法与抗癌活性检测方法(cancer-killing assay，CKA)。采集供血者外周血2ml，肝素抗凝。使用本公司研制的沉淀液(LIFT-001)配方，按血液∶沉淀液＝5∶1(v/v)混合。然后将上清液转移到加有LIFT-002的离心管中，离心，取白膜层。加入培养基计数即为效应细胞。将效应细胞与靶细胞孵育进行CKA检测。CKA实验结果表明：有的健康成年人的粒细胞能有效地杀死Hela肿瘤细胞。细胞实时监测系统结果表明：癌细胞被粒细胞破碎杀伤。抗癌活性检测可筛选出高活性的高效供体并用于癌症预防、治疗及危险因素的管理。

Description

一种新颖的粒细胞制备及其抗癌活性检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种分离纯化粒细胞的方法，特别是一种新型的不损伤粒细胞活性的制备方法与抗癌活性检测方法(cancer-killing assay，CKA)。 

(二)技术背景

目前，癌症已成为人类健康的第一杀手，夺走了千千万万人的宝贵生命。根椐世界卫生组织最新资料显示，在全球近66亿人口中，每年新发肿瘤病人约有1000万，约有500多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。 

它的可怕性不仅在于疾病对患者机体组织的严重破坏和癌症患者的高死亡率，而且在于传统疗法，如放疗、化疗等带来的难以忍受的副作用。国内外对治疗癌症的研究虽然取得了阶段性成果，但治疗癌症的方法和效果还是不尽如人意，仍然无法找到对癌症形成有效杀伤、清除和减低副作用的治疗方法。 

1999年，我公司首席科学家崔征教授及其研发团队意外发现了一只具有超强抗癌活性的小白鼠。这只小白鼠经受了大量多种恶性程度极高癌细胞的考验并保持了完美健康及超强的生育能力。而且这种天然抗癌能力由遗传因素决定并以显性方式传代。更为意外的发现是，这种天然抗癌能力完全是由自然免疫体系里的粒细胞和巨噬细胞执行的。迄今这只小白鼠已繁殖了几千只具有同样抗癌活性的子孙后代。将抗癌小鼠的粒细胞提供给患晚期癌症小鼠后，患晚期癌症小鼠痊愈，取得了极佳疗效。 

通过抗癌小白鼠的提示，崔教授及其团队近年来对人群进行了大量的研究并发现一部分健康年青人的粒细胞内也天然存有类似的超强抗癌活性。粒细胞是人体循环血里白血球中的主要成分，约占白血球总数的50％-70％。传统观念认 为粒细胞的功能只限于抗细菌。崔教授的发现显示粒细胞可为人体提供天然免疫监控。粒细胞可以不断及时清除新产生的癌细胞。癌症的产生很可能是由于粒细胞免疫监控活性降低使癌细胞得不到及时清除而大量堆积。粒细胞对癌细胞有极高的靶向性和鉴别能力。这种天然的鉴别能力并不是基于细胞表面的化学结构而是基于细胞表面的电荷。粒细胞的杀伤力是来自于胞浆颗粒中的正电多肽。粒细胞的靶向是带负电荷的细胞膜。因为几乎全靠大量葡萄糖无氧酵解，癌细胞产生并释放大量乳酸。大量乳酸的释放会导致癌细胞表面丢失大量正电荷而显负电。正常细胞由于靠葡萄糖有氧降解来产生细胞能量从而表面显电中性。粒细胞识别靶细胞后，即释放正电多肽在靶细胞膜上打孔从而杀死靶细胞。 

据此科研成果，崔征教授发明并提出了提高抗癌免疫力的独特方法——“粒细胞成分输血提高抗癌免疫力疗法”，我们称之为“粒福特疗法”。全新概念的疗法可利用新开发的检测技术-CKA去寻找有超级抗癌活性的健康人供体。然后用成分采血成分输血的方法把有特异抗癌活性的粒细胞输给病人进行治疗。 

粒细胞天然抗癌活性的检测方法及原理参见附图1。 

粒细胞天然抗癌活性的检测方法及原理 

(三)发明内容

众所周知，粒细胞是固有免疫系统和细胞免疫系统中的一个重要组成成分，具有抗癌活性，活性高的粒细胞能够杀死癌细胞，而很多人粒细胞抗癌活性降低，抗癌免疫力不足，因而患上癌症。通过我公司自主研发的新技术，制备得到高纯度的粒细胞，严格筛选出健康人具有杀死癌细胞能力的粒细胞。(和病人配型成功后，再将粒细胞以成分输血的方式输入癌症患者体内，粒细胞进入癌症患者体内后，就会发挥自己的功效，对癌细胞进行靶向性追杀，好似精确制导导弹一般对癌细胞进行“制导式轰炸”，从而达到杀死癌细胞的作用。) 

本发明的目的是提供一种分离纯化粒细胞的方法。 

本发明的另一目的是提供一种新颖的粒细胞抗癌活性的检测方法。 

本发明的再一目的是提供CKA的用途。 

在本发明的第一方面，提供了一种分离纯化粒细胞的方法，该方法的制备工艺流程见附图2。 

具体叙述如下：(1)采集健康成年人外周血2ml；(2)于冰盒中迅速送至CKA检测中心；(3)按照全血∶沉淀液(LIFT-001)＝5∶1(v/v)的比例加入沉淀液；于-4℃静置10分钟；(4)使用新颖的细胞分离纯化液LIFT-002，用纯化水配制成3个不同的浓度，将上清转移至新的预先加有分离纯化液的15ml离心管中；5000g离心60分钟；(5)取白膜层。 

技术路线如下： 

1.沉淀红细胞 

使用本公司自制的沉淀液(LIFT-001)，按照血液∶沉淀液＝5∶1(v/v)的比例混合，静置90分钟。期间摇晃3次。 

2.配制分离纯化液 

LIFT-002分离液配制3种密度粒细胞分离液各40ml，如有误差，进行调整。用0.22μm无菌过滤器负压吸引过滤除菌，分装于15ml无菌离心管中，10ml/管。 

3.粒细胞的制备 

(1)取1支15ml离心管，按照粒细胞分离液1、2、3的顺序分别加入3种不同比重分离液，每种分离液加入2ml，总体积6ml。将步骤1得到的上清层小心加入15ml离心管分离液的上层界面。 

(2)室温5000g离心，60分钟。 

(3)用移液器吸出上层血浆和分离液之间的细胞，移入1支新离心管待用。 

加入5ml完全培养基(CM)，计数，待用，即为效应细胞。 

在本发明的第二方面，提供了一种新颖的中性粒细胞抗癌活性的检测方法。其技术路线详述如下： 

1.接种肿瘤细胞 

(1)将Hela细胞接种于T25培养瓶中在37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养。 

(2)弃T25培养瓶中的培养液，加PBS清洗细胞，加胰酶消化细胞，加培养基终止胰酶消化。 

(3)调细胞浓度，将细胞加入96孔培养板相应孔中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养12小时。 

2.加入粒细胞 

粒细胞的杀伤功能是一个多步骤、多部件及高协调性的整体细胞过程，其中包括趋化作用、效应细胞和靶细胞的相互识别、及粒细胞的脱颗粒杀伤靶细胞。 

将本发明的第一方面得到的白膜层按照一定比例和肿瘤细胞孵育12小时。 

3.观察与检测 

使用实时细胞监控系统监测粒细胞的杀癌活性。使用LIFT-003试剂配方检测粒细胞杀伤活性。 

在本发明的第三方面是CKA的用途。如上所述，在临床上，用本发明所述的CKA方法严格筛选出健康人具有杀死癌细胞能力的粒细胞，和病人配型成功后，再将粒细胞以成分输血的方式输入癌症患者体内，粒细胞进入癌症患者体内后，就会发挥自己的功效，对癌细胞进行靶向性追杀，好似精确制导导弹一般对癌细胞进行“制导式轰炸”，从而达到杀死癌细胞的作用。有望对肿瘤患者进行有效的治疗。 

(四)附图说明

图1，粒细胞天然抗癌活性的检测方法及原理。 

图2，一种分离纯化粒细胞的制备工艺流程图。 

图3，沉降红细胞。 

图4，分离纯化粒细胞。 

图5，CKA实验实时观察图(粒细胞杀伤癌细胞)。 

图6，CKA实验结果图。 

(五)具体实施方式

材料： 

(1)细胞株 

Hela肿瘤细胞购自中国科学院上海细胞库。 

(2)酶和试剂： 

LIFT-001，公司自有配方配制。 

LIFT-002，公司自有配方配制。 

(3)培养基： 

Hyclone DMEM高糖培养基，购自上海生工。 

方法 

粒细胞杀癌活性的测定：参见Cui，Z.，Willingham，M.C.，Hicks，A.M.，Alexander-Miller，M.A.，Howard，T.D.，Hawkins，G.A.，Miller，M.S.，Weir，H.M.，Du，W.& DeLong，C.J.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，6682-6687方法进行。 

实施例1： 

接种肿瘤细胞 

(1)将1×10⁴个Hela细胞接种于T25培养瓶中，每瓶3.5ml完全培养基。 

(2)在37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养。 

(3)弃T25培养瓶中的培养液，加5-10毫升PBS清洗细胞，吸弃PBS。加5毫升0.25％的胰酶消化细胞，倒置显微镜下观察细胞回缩变圆，加5ml培养基终止胰酶消化，用吸管将细胞移入15ml离心管，取0.1毫升做台盼兰染色计数细胞。 

(4)调细胞浓度为1×10⁶个/ml，将细胞加入96孔培养板相应孔中200μl/孔，150μl/孔，100μl/孔，50μl/孔，3复孔。其余各实验孔加培养基。96孔板周边各孔加满生理盐水。 

7)在37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养12hr。 

实施例2： 

外周血的采集与红细胞的沉淀 

无菌采集供血者外周血2ml，肝素抗凝，在采血管上填写供血者相关信息。使用本公司研制的沉淀液(LIFT-001)配方，按照血液∶沉淀液＝5∶1(v/v)的比例混合，静置90分钟。期间摇晃3次。 

实施例3 

粒细胞的制备 

使用我公司研制的LIFT-002分离液配方配制3种密度粒细胞分离液各50ml 

粒细胞分离液名称	粒细胞分离母液A	粒细胞分离母液B	粒细胞分离母液C
				粒细胞分离液1	30	5	15
粒细胞分离液2	26	6	18
				粒细胞分离液3	21	7	22

(1)取3支50ml无菌离心管，分别标为1，2，3分别对应粒细胞分离液1-3。 

(2)将各离心管放在天平上分别称重，记录各管的重量。 

(3)按照上表标注的量分别往1-3号离心管中加入粒细胞分离母液C和B，轻轻摇匀。然后再分别加入粒细胞分离母液A，用吸管混匀。 

(4)再将各离心管放在天平上分别称重，分别减去各自空管的重量，与表中对应的重量进行对比，如有误差，进行调整。 

(5)用0.22μm无菌过滤器负压吸引过滤除菌，分装于15ml无菌离心管中，10ml/管，标签注明分离液名称，配制日期。 

(6)取1支15ml离心管，按照粒细胞分离液1、2、3的顺序分别加入3种不同比重分离液，每种分离液加入2ml，总体积6ml。无菌采集供血者外周血2ml，肝素抗凝，将步骤1得到的上清层小心加入15ml离心管分离液的上层界面。 

(7)室温5000g离心，60分钟。 

(8)用巴斯德吸管小心吸出上层血浆和分离液之间的细胞，移入1支新离心管待用。 

(9)加入1ml完全培养基(CM)，计数，用CM调整粒细胞浓度为5×10⁴/ml，即为效应细胞。 

实施例4 

CKA杀伤实验 

从培养箱中取出96孔板，用负压吸引器吸去各孔培养液。 

根据效应细胞∶靶细胞＝100∶1，50∶1，1∶1分别向已加入靶细胞孔和效应 细胞对照孔中加入相应数量的效应细胞，设相应细胞对照孔和只培养基的空白对照孔，每孔培养基终体积100μl，每组分别设3个复孔。在37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养12小时。用实时细胞监控系统实时监测，拍照。 

在培养结束时，取出96孔培养板，用真空泵将未贴壁细胞吸弃。每孔加入100μl检测试剂LIFT-003。 

在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱继续培养6小时。 

在酶标仪上用570 nm波长测各孔吸光度(A值)，计算出3个复孔的平均值。 

计算杀伤率：1-〔A_{(效应细胞+靶细胞)}-A_对照/A_{靶细胞对照}-A_对照〕×100％ 

抗癌活性的检测具有以下意义：1.将会筛选出高活性的高效供体。2.抗癌活性的检测可用于癌症预防及危险因素的管理。例如，早期发现抗癌活性降低可早期采取一些恢复措施或早期检查。这一点很类似于检测胆固醇在预防心血管疾病中的地位。3.抗癌活性的检测方法可用来筛选可提高抗癌活性的化合物及营养品。4.本发明基于的理念是最好的抗癌药剂是自身的健康的有抗癌活性的粒细胞。如果年青时把自身健康的粒细胞液氮冷藏下来，这将为抗癌和抗衰老的实践提供前所未有的、令人鼓舞的手段。 

Claims (10)

1.一种检测血液中粒细胞抗癌活性(cancer-killing assay，CKA)的方法，包括血液的采集及其粒细胞的分离纯化和活性检测。

2.按照权利要求1所述的CKA，其特征是血液是外周血，可采集自健康成年人，也可采集自癌症患者。

3.按照权利要求1或2所述的CKA，其特征是细胞是粒细胞。

4.按照权利要求1-3任一项所述的CKA，其特征是粒细胞是外周全血中分离的单细胞。

5.按照权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于一步法分离纯化得到粒细胞。

6.按照权利要求1-5任一项所述的制备方法，分离纯化所用的试剂与溶液对粒细胞的活性没有损伤。

7.按照权利要求1所述的CKA，其特征在于既可单独使用也可与药物载体组合制成药物组合物。

8.按照权利要求1所述的CKA，其特征在于既可单独使用也可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。

9.一种检测血液中粒细胞抗癌活性的方法，包括步骤：(1)由执业护士采集健康成年人或癌症患者的外周血2ml；(2)放入冰盒，迅速送至CKA检测中心；(3)按照全血∶沉淀液＝5∶1(v/v)的比例加入沉淀液；于-4℃静置10分钟；(4)将上清转移至新的预先加有分离纯化液的15ml离心管中；5000g离心60分钟；(5)取中间的一层白膜层；(6)按照一定比例将得到的粒细胞和肿瘤细胞孵育12小时，检测粒细胞的杀癌活性。

10.本发明中提供的CKA方法适用于人体和动物的血液中得到的粒细胞对各种肿瘤细胞杀伤活性的检测，也适用于单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的制备及其活性的检测。

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