CN109971819A - 个体化的粒细胞抗癌活性检测 - Google Patents

个体化的粒细胞抗癌活性检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及个体化的粒细胞抗癌活性检测，包括肿瘤标本的取材、肿瘤单细胞悬液的制备、去除红细胞及杂细胞、纯化肿瘤细胞、单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养、粒细胞制备和粒细胞抗癌活性检测（CKA）。本发明通过原代培养获得的肿瘤细胞，作为靶细胞筛选高抗癌活性的粒细胞，对临床肿瘤的治疗具有极好的指导作用，避免凭借临床经验盲目用药，降低抗癌药物作用的不良反应，为临床治疗提供客观依据，同时其作为靶细胞筛选高抗癌活性的粒细胞，在制备过程中步骤严谨，粒细胞能够有效作为个体化的粒细胞抗癌活性检测的检测项目，保证检测数据的严谨性与准确性,为临床应用提供数据支持。

Description

个体化的粒细胞抗癌活性检测
技术领域
本发明涉及粒细胞抗癌活性检测技术领域，具体为个体化的粒细胞抗癌活性检测。
背景技术
粒细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分，在调节机体免疫应答过程中发挥重要作用。近年来研究表明：粒细胞不仅具有抗菌作用，而且具有显著的抗肿瘤作用。
研究表明：癌症对不同化疗药物或不同化疗药物组合方案的敏感性差异较大，即使是同一组织类型的肿瘤，对同一药物的敏感程度也不相同。究其原因传统治疗方法忽略了肿瘤的异质性，对不适合标准药物治疗的患者进行标准化治疗，不仅增加了患者的经济负担，同时也增加了毒副作用，不利于提高患者的生活质量。
对于粒细胞，作为生物制剂，同一来源的粒细胞对不同肿瘤的杀伤活性不同；同一肿瘤，不同的粒细胞对其的杀伤活性也不同。因此需要切实可行的技术方法筛选出抗癌活性高的粒细胞，为临床提供治疗方案依据
目前国内癌细胞研究多采用癌细胞株的方式，在传代培养的过程中，随着培养时间的延长或培养环境的改变，癌细胞的特性会发生改变。这正是体外筛选出的高杀癌活性的药物或粒细胞往往体内杀癌效果不佳或无效果的原因。与此相反，肿瘤组织的原代培养获取的肿瘤细胞，最接近和反映体内生长特性，可以为药物敏感性试验、免疫学研究、遗传学特性及肿瘤的治疗等提供理想的生物学模型。通过原代培养获得的肿瘤细胞，作为靶细胞筛选高抗癌活性的粒细胞，对临床肿瘤的治疗具有极好的指导作用，避免凭借临床经验盲目用药，降低抗癌药物作用的不良反应，为临床治疗提供客观依据。
发明内容
本发明的目的在于提供个体化的粒细胞抗癌活性检测，以解决上述背景技术中提出的目前国内癌细胞研究多采用癌细胞株的方式，在传代培养的过程中，随着培养时间的延长或培养环境的改变，癌细胞的特性会发生改变。这正是体外筛选出的高杀癌活性的药物或粒细胞往往体内杀癌效果不佳或无效果的原因的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：个体化的粒细胞抗癌活性检测，包括以下步骤：
1）肿瘤标本的取材；
2）肿瘤单细胞悬液的制备；
3）去除红细胞及杂细胞；
4）纯化肿瘤细胞；
5）单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养；
6）粒细胞制备；
7）粒细胞抗癌活性检测（CKA）。
优选的，所述肿瘤标本的取材为，新鲜无菌癌组织是手术切除的未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗的。取新鲜癌组织1cm³，置于DMEM（含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素）中，4℃储存不超过3小时。置于超净工作台中，用无菌生理盐水将标本组织冲洗3次；用锐利的眼科剪小心剔除可见血管及坏死组织，迅速浸入含有双抗（青霉素200U/ml，链霉素200mg/ml）及二性霉素2mg/ml的D-Hank’s液中。
优选的，所述肿瘤单细胞悬液的制备，其中，
将癌组织剪碎剪成1mm³的小块，再用Hank’s液洗三次，转移至新的平皿中。然后用胶原酶IV(100u／mL)，透明质酸酶（2mg／mL）于37℃振荡条件下消化1h，用滴管反复轻柔吹打成单细胞悬液，PBS洗涤细胞2次。过80目和200目不锈钢筛网，以去除残留的组织块。取悬液加入到离心管中。1000rpm/min，离心5分钟，弃上清液。
优选的，所述去除去除肿瘤单细胞中的红细胞及杂细胞的方法，
加入细胞沉淀体积的1～5倍红细胞裂解液，充分混匀，室温下以离心半径8cm，1500r／min离心6min，弃上清液，若红细胞未裂解充分，可重复红细胞裂解步骤一次，然后按1：1比例将细胞悬液轻轻滴入盛有75%/100%的Ficoll分离液的离心管，400×g离心30min，收集上界面层中的细胞，再用PBS洗涤细胞2次，细胞计数并重悬于DMEM培养液（加10%自体血浆）中。调整细胞密度至2×106个／mL，取5mL细胞悬液接种到含EGF(20ng／mL)、bFGF(20ng／mL)和胰岛素(1mg／mL)的超低吸附培养皿内，置于37℃、CO2体积分数为5％及饱和湿度培养箱中培养，每隔48h添加上述细胞因子1次。
优选的，所述纯化肿瘤细胞，其中，
根据软琼脂法。
制备底层琼脂：配制6％低熔点琼脂，高压灭菌，待其温度降至40℃左右后置于40℃水浴锅备用。取1mL6％低熔点琼脂，冷却至40℃，迅速加入已经配好的9份预温的37℃的新鲜DMEM培养基（含20％FBS）培养液，混合均匀，倒入培养皿中，每皿3ml，室温凝固备用。
制备上层琼脂：将对数生长期的肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整密度为1×102/ml，37℃预温，细胞悬液9.5ml和40℃、5％琼脂0.5ml混匀，取混合液2ml加入底层琼脂上，使每皿细胞数约200个，制成双琼脂层。置于室温待其冷却凝固后置于培养箱中培养7～14d左右镜检，观察软琼脂克隆团的形成情况。
优选的，所述单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养方法，
软琼脂克隆形成第14d置于倒置显微镜下观察，标记并挑出较大克隆团后置于细胞培养瓶中培养。每天观察有无贴壁细胞生长，若有则弃去含有琼脂渣的培养基，加入新鲜培养基培养，每隔2～3d更换细胞培养液，待细胞铺满瓶底90％左右时传代备用。
优选的，所述粒细胞制备方法，其中，
A)粒细胞的分离纯化步骤包括：(1)由执业护士采集健康成年人或癌症患者的外周血2ml；
(2)放入冰盒，迅速送至CKA检测中心；
(3)按照全血∶沉淀液＝1∶1(v/v)的比例加入本公司自制的沉淀液（LIFT-001），按照血液：沉淀液=1:1（v/v）的比例混合，静置60分钟。期间摇晃3次。
B)配制分离纯化液：LIFT-002分离液配制3种密度粒细胞分离液各40ml，如有误差，进行调整。用0.22μm无菌过滤器负压吸引过滤除菌，分装于15ml无菌离心管中，10ml/管。
C)粒细胞的制备：（1）取1支15ml离心管，按照粒细胞分离液1、2、3的顺序分别加入3种不同比重分离液，每种分离液加入2ml，总体积6ml。将步骤A得到的上清层小心加入15ml离心管分离液的上层界面。
（2）室温2000g离心，20分钟。
（3）用移液器吸出分离液1,2之间的细胞，移入1支新离心管待用。加入0.85％s破坏红细胞后，洗涤收集中性粒细胞，加入5ml完全培养基（CM），计数，待用，即为效应细胞。
优选的，所述细胞抗癌活性检测（CKA），活性检测步骤包括：
A)接种上述制备的肿瘤细胞，(1)将细胞接种于T25培养瓶中在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养；
(2)弃T25培养瓶中的培养液，加PBS清洗细胞，加胰酶消化细胞，加培养基终止胰酶消化；
(3)调细胞浓度，将细胞加入96孔培养板相应孔中，在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养24小时，加入粒细胞，检测粒细胞的杀癌活性。
B）加入粒细胞：粒细胞的杀伤功能是一个多步骤、多部件及高协调性的整体细胞过程，其中包括趋化作用、效应细胞和靶细胞的相互识别、及粒细胞的脱颗粒杀伤靶细胞，将步骤7.C得到的效应细胞按照一定比例和肿瘤细胞孵育24小时
C）观察与检测，使用实时细胞监控系统监测粒细胞的杀癌活性。使用LIFT-003试剂配方检测粒细胞杀伤活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过原代培养获得的肿瘤细胞，作为靶细胞筛选高抗癌活性的粒细胞，对临床肿瘤的治疗具有极好的指导作用，避免凭借临床经验盲目用药，降低抗癌药物作用的不良反应，为临床治疗提供客观依据，同时其作为靶细胞筛选高抗癌活性的粒细胞，在制备过程中步骤严谨，粒细胞能够有效作为个体化的粒细胞抗癌活性检测的检测项目，保证检测数据的严谨性与准确性。
附图说明
图1为本发明个体化的粒细胞抗癌活性检测的原代培养的克隆；
图2为本发明个体化的粒细胞抗癌活性检测的沉淀红细胞；
图3为本发明个体化的粒细胞抗癌活性检测的细胞分层；
图4为本发明个体化的粒细胞抗癌活性检测的1-9号粒细胞抗癌活性检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：本发明提供技术方案：个体化的粒细胞抗癌活性检测，包括以下步骤：
1）肿瘤标本的取材；
2）肿瘤单细胞悬液的制备；
3）去除红细胞及杂细胞；
4）纯化肿瘤细胞；
5）单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养；
6）粒细胞制备；
7）粒细胞抗癌活性检测（CKA）。
所述肿瘤标本的取材为，新鲜无菌癌组织是手术切除的未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗的。取新鲜癌组织1cm³，置于DMEM（含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素）中，4℃储存不超过3小时。置于超净工作台中，用无菌生理盐水将标本组织冲洗3次；用锐利的眼科剪小心剔除可见血管及坏死组织，迅速浸入含有双抗（青霉素200U/ml，链霉素200mg/ml）及二性霉素2mg/ml的D-Hank’s液中。
肿瘤单细胞悬液的制备，其中，
将癌组织剪碎剪成1mm³的小块，再用Hank’s液洗三次，转移至新的平皿中。然后用胶原酶IV(100u／mL)，透明质酸酶（2mg／mL）于37℃振荡条件下消化1h，用滴管反复轻柔吹打成单细胞悬液，PBS洗涤细胞2次。过80目和200目不锈钢筛网，以去除残留的组织块。取悬液加入到离心管中。1000rpm/min，离心5分钟，弃上清液。
去除去除肿瘤单细胞中的红细胞及杂细胞的方法，
加入细胞沉淀体积的1～5倍红细胞裂解液，充分混匀，室温下以离心半径8cm，1500r／min离心6min，弃上清液，若红细胞未裂解充分，可重复红细胞裂解步骤一次，然后按1：1比例将细胞悬液轻轻滴入盛有75%/100%的Ficoll分离液的离心管，400×g离心30min，收集上界面层中的细胞，再用PBS洗涤细胞2次，细胞计数并重悬于DMEM培养液（加10%自体血浆）中。调整细胞密度至2×106个／mL，取5mL细胞悬液接种到含EGF(20ng／mL)、bFGF(20ng／mL)和胰岛素(1mg／mL)的超低吸附培养皿内，置于37℃、CO2体积分数为5％及饱和湿度培养箱中培养，每隔48h添加上述细胞因子1次。
纯化肿瘤细胞，其中，
根据软琼脂法。
正常的上皮或内皮细胞生存依赖基质的黏附和支持，细胞在体外培养条件下，必须附着于坚硬表面(如玻璃瓶底表面、塑料皿表面等)，如果失去来自基质的信号的有效支持，则不能生长与增殖。而恶性转化细胞往往失去此种贴壁依赖性，它们可在半固体的基质中生长与分裂，形成细胞集落，此现象称为锚着独立性生长(AIG)。双层软琼脂集落形成实验是利用双层软琼脂作为培养介质观察细胞生长与分裂情况，由于细胞在软琼脂中处于单细胞悬浮生长的状态，排除了细胞与细胞之间相互作用带来的影响，从而可以判定细胞是否具有AIG特性的一种常用方法，可反映细胞的群体依赖性和增殖能力。与细胞恶性程度有很大符合率。常被用来检测和筛选纯化肿瘤细胞。
制备底层琼脂：配制6％低熔点琼脂，高压灭菌，待其温度降至40℃左右后置于40℃水浴锅备用。取1mL6％低熔点琼脂，冷却至40℃，迅速加入已经配好的9份预温的37℃的新鲜DMEM培养基（含20％FBS）培养液，混合均匀，倒入培养皿中，每皿3ml，室温凝固备用。
制备上层琼脂：将对数生长期的肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整密度为1×102/ml，37℃预温，细胞悬液9.5ml和40℃、5％琼脂0.5ml混匀，取混合液2ml加入底层琼脂上，使每皿细胞数约200个，制成双琼脂层。置于室温待其冷却凝固后置于培养箱中培养7～14d左右镜检，观察软琼脂克隆团的形成情况。
单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养方法，
软琼脂克隆形成第14d置于倒置显微镜下观察，标记并挑出较大克隆团后置于细胞培养瓶中培养。每天观察有无贴壁细胞生长，若有则弃去含有琼脂渣的培养基，加入新鲜培养基培养，每隔2～3d更换细胞培养液，待细胞铺满瓶底90％左右时传代备用。
粒细胞制备方法，其中，
A)粒细胞的分离纯化步骤包括：(1)由执业护士采集健康成年人或癌症患者的外周血2ml；
(2)放入冰盒，迅速送至CKA检测中心；
(3)按照全血∶沉淀液＝1∶1(v/v)的比例加入本公司自制的沉淀液（LIFT-001），按照血液：沉淀液=1:1（v/v）的比例混合，静置60分钟。期间摇晃3次。
B)配制分离纯化液：LIFT-002分离液配制3种密度粒细胞分离液各40ml，如有误差，进行调整。用0.22μm无菌过滤器负压吸引过滤除菌，分装于15ml无菌离心管中，10ml/管。
C)粒细胞的制备：（1）取1支15ml离心管，按照粒细胞分离液1、2、3的顺序分别加入3种不同比重分离液，每种分离液加入2ml，总体积6ml。将步骤A得到的上清层小心加入15ml离心管分离液的上层界面。
（2）室温2000g离心，20分钟。
（3）用移液器吸出分离液1,2之间的细胞，移入1支新离心管待用。加入0.85％NH4CI破坏红细胞后，洗涤收集中性粒细胞，加入5ml完全培养基（CM），计数，待用，即为效应细胞。
细胞抗癌活性检测（CKA），活性检测步骤包括：
A)接种上述制备的肿瘤细胞，(1)将细胞接种于T25培养瓶中在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养；
(2)弃T25培养瓶中的培养液，加PBS清洗细胞，加胰酶消化细胞，加培养基终止胰酶消化；
(3)调细胞浓度，将细胞加入96孔培养板相应孔中，在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养24小时，加入粒细胞，检测粒细胞的杀癌活性。
B）加入粒细胞：粒细胞的杀伤功能是一个多步骤、多部件及高协调性的整体细胞过程，其中包括趋化作用、效应细胞和靶细胞的相互识别、及粒细胞的脱颗粒杀伤靶细胞，将步骤7.C得到的效应细胞按照一定比例和肿瘤细胞孵育24小时
C）观察与检测，使用实时细胞监控系统监测粒细胞的杀癌活性。使用LIFT-003试剂配方检测粒细胞杀伤活。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：包括以下步骤：
1）肿瘤标本的取材；
2）肿瘤单细胞悬液的制备；
3）去除红细胞及杂细胞；
4）纯化肿瘤细胞；
5）单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养；
6）粒细胞制备；
7）粒细胞抗癌活性检测（CKA）。
2.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述肿瘤标本的取材为，新鲜无菌癌组织是手术切除的未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗的；
取新鲜癌组织1cm³，置于DMEM（含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素）中，4℃储存不超过3小时；
置于超净工作台中，用无菌生理盐水将标本组织冲洗3次；用锐利的眼科剪小心剔除可见血管及坏死组织，迅速浸入含有双抗（青霉素200U/ml，链霉素200mg/ml）及二性霉素2mg/ml的D-Hank’s液中。
3.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述肿瘤单细胞悬液的制备，其中，
将癌组织剪碎剪成1mm³的小块，再用Hank’s液洗三次，转移至新的平皿中；
然后用胶原酶IV(100u／mL)，透明质酸酶（2mg／mL）于37℃振荡条件下消化1h，用滴管反复轻柔吹打成单细胞悬液，PBS洗涤细胞2次；
过80目和200目不锈钢筛网，以去除残留的组织块；
取悬液加入到离心管中；
1000rpm/min，离心5分钟，弃上清液。
4.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述去除去除肿瘤单细胞中的红细胞及杂细胞的方法，
加入细胞沉淀体积的1～5倍红细胞裂解液，充分混匀，室温下以离心半径8cm，1500r／min离心6min，弃上清液，若红细胞未裂解充分，可重复红细胞裂解步骤一次，然后按1：1比例将细胞悬液轻轻滴入盛有75%/100%的ficoll分离液的离心管，400×g离心30min，收集上界面层中的细胞，再用PBS洗涤细胞2次，细胞计数并重悬于DMEM培养液（加10%自体血浆）中；
调整细胞密度至2×106个／mL，取5mL细胞悬液接种到含EGF(20ng／mL)、bFGF(20ng／mL)和胰岛素(1mg／mL)的超低吸附培养皿内，置于37℃、CO2体积分数为5％及饱和湿度培养箱中培养，每隔48h添加上述细胞因子1次。
5.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述纯化肿瘤细胞，其中，
根据软琼脂法；
制备底层琼脂：配制6％低熔点琼脂，高压灭菌，待其温度降至40℃左右后置于40℃水浴锅备用；
取1mL6％低熔点琼脂，冷却至40℃，迅速加入已经配好的9份预温的37℃的新鲜DMEM培养基（含20％FBS）培养液，混合均匀，倒入培养皿中，每皿3ml，室温凝固备用；
制备上层琼脂：将对数生长期的肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整密度为1×102/ml，37℃预温，细胞悬液9.5ml和40℃、5％琼脂0.5ml混匀，取混合液2ml加入底层琼脂上，使每皿细胞数约200个，制成双琼脂层；
置于室温待其冷却凝固后置于培养箱中培养7～14d左右镜检，观察软琼脂克隆团的形成情况。
6.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养方法，
软琼脂克隆形成第14d置于倒置显微镜下观察，标记并挑出较大克隆团后置于细胞培养瓶中培养；
每天观察有无贴壁细胞生长，若有则弃去含有琼脂渣的培养基，加入新鲜培养基培养，每隔2～3d更换细胞培养液，待细胞铺满瓶底90％左右时传代备用。
7.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述粒细胞制备方法，其中，
A)粒细胞的分离纯化步骤包括：(1)由执业护士采集健康成年人或癌症患者的外周血2ml；
(2)放入冰盒，迅速送至CKA检测中心；
(3)按照全血∶沉淀液＝1∶1(v/v)的比例加入本公司自制的沉淀液（LIFT-001），按照血液：沉淀液=1:1（v/v）的比例混合，静置60分钟；
期间摇晃3次；
B)配制分离纯化液：LIFT-002分离液配制3种密度粒细胞分离液各40ml，如有误差，进行调整；
用0.22μm无菌过滤器负压吸引过滤除菌，分装于15ml无菌离心管中，10ml/管；
C)粒细胞的制备：（1）取1支15ml离心管，按照粒细胞分离液1、2、3的顺序分别加入3种不同比重分离液，每种分离液加入2ml，总体积6ml；
将步骤A得到的上清层小心加入15ml离心管分离液的上层界面；
（2）室温2000g离心，20分钟；
（3）用移液器吸出分离液1,2之间的细胞，移入1支新离心管待用；
加入0.85％NH4CI破坏红细胞后，洗涤收集中性粒细胞，加入5ml完全培养基（CM），计数，待用，即为效应细胞。
8.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述细胞抗癌活性检测（CKA），活性检测步骤包括：
A)接种上述制备的肿瘤细胞，(1)将细胞接种于T25培养瓶中在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养；
(2)弃T25培养瓶中的培养液，加PBS清洗细胞，加胰酶消化细胞，加培养基终止胰酶消化；
(3)调细胞浓度，将细胞加入96孔培养板相应孔中，在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养24小时，加入粒细胞，检测粒细胞的杀癌活性；
B）加入粒细胞：粒细胞的杀伤功能是一个多步骤、多部件及高协调性的整体细胞过程，其中包括趋化作用、效应细胞和靶细胞的相互识别、及粒细胞的脱颗粒杀伤靶细胞，将步骤7.C得到的效应细胞按照一定比例和肿瘤细胞孵育24小时；
C）观察与检测，使用实时细胞监控系统监测粒细胞的杀癌活性；
使用LIFT-003试剂配方检测粒细胞杀伤活性。
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