CN110387351A - 一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法 - Google Patents

一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种原代人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)无菌取出角膜捐献者手术切除的正常眼球；(2)解剖显微镜下，无菌剥离视网膜组织；(3)加入混合胶原酶消化；(4)终止消化，过滤，离心，洗涤，用完全培养基重悬，接种培养瓶；(5)置于37℃，5%CO2培养箱培养；(6)细胞传代和纯化；(7)细胞形态观察与鉴定。本发明提供的一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，操作简单，稳定，高效，为进一步研究视网膜病变损伤发生机制提供了良好的实验材料。

Description

一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法
技术领域
本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法。
背景技术
Muller细胞由德国人Müller（1851）首先描述，后以其名字命名。由于呈细长形似纤维，又称Muller纤维。其胞体向内外发出细长的突起占据从内界膜至外界膜的整个视网膜厚度，包绕着视网膜中视锥视杆细胞，双极细胞及神经节细胞的大部分神经元，特化的足板附于视网膜毛细血管壁参与构成血—视网膜屏障。 Muller细胞是脊椎动物视网膜内最主要的神经胶质细胞。它贯穿整个视网膜，与视网膜神经细胞及视网膜血管发生多种功能的交互作用。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发病机制至今尚未明，近年来的临床和基础研究发现DR患者和动物模型中Muller细胞超微结构和生理功能发生了变化，Muller细胞的这些变化在DR的发生发展中起重要作用，这种变化早于视网膜血管损伤。因此用定量分析的方法深入探讨Muller细胞在DR发生发展中的作用及机制，延缓或逆转其结构及功能异常成为预防与治疗DR的热点，并且已经有学者提出通过移植Muller细胞来治疗DR的建议。
目前，国内外可供应的人视网膜Muller细胞很少且有关体外正常视网膜Muller细胞培养方法的研究甚少，而且多数方法不稳定，再加上眼球组织不容易获取，严重制约了后续的研究工作。本研究通过多次操作实践，使用混合胶原酶联合消化法分离Muller细胞，成功率高，采用消化传代的方法进行纯化，同时培养基中加入适当生长因子可促进Muller细胞增殖。本发明旨在提供一种操作简单、稳定高效的视网膜Muller细胞分离方法，建立一套完整可靠的正常人视网膜Muller细胞体外培养技术。
发明内容
根据上述问题，本发明提供了一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和纯度高，是一种较为理想的人视网膜Muller细胞原代培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。
本发明采用的的技术方案如下： (1) 无菌取出角膜捐献者手术切除的正常眼球，修剪去除周边结缔组织和肌肉，然后在解剖显微镜下剥离视网膜组织，放入预冷无菌含双抗(100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)的PBS缓冲液中洗涤除去血渍，去除多余的结缔组织，反复清洗，之后再浸泡10min；(2) 将视网膜组织剪成1mm×1mm×1mm组织碎片，加入10ml0.1%I型和IV型混合胶原酶，37℃消化60~90min；(3) 用5～8ml含10%胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养基终止消化，滴管吹打后，经过200目不锈钢筛网过滤，收集滤液到15ml离心管中，1200～1500rpm离心5min；(4) 完全培养基配制：DMEM/F12培养基中加入10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5mg/L普通胰岛素，pH值为7.2～7.4；(5) 弃上清，沉淀用PBS缓冲液清洗两次，每次1200～1500rpm离心5min，清洗完之后，沉淀加5ml完全培养基重悬，接种多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶，置于37℃、5% CO2培养箱培养；(6) 培养24h后进行首次换液，之后每隔2～3d换液；(7) 细胞形态观察：原代培养的人视网膜Muller细胞呈纤维状，胞体较大，细胞核大且明显，突起较长；(8) 细胞传代：细胞达到80~90%融合时，用PBS缓冲液（浓度为0.01M，PH值为7.2~7.4）清洗细胞2次，加入1ml 0.25%胰酶37℃消化3~5min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1500rpm离心去上清，加入完全培养基重悬细胞沉淀，按照1：2比例进行传代培养，记为P1；(9) 细胞纯化：经过传代培养，细胞形态均一，之后进行鉴定。(10) 细胞计数及存活率的测定：锥虫蓝排斥实验计算P1代活细胞百分比； (11) 细胞鉴定：取P1代细胞，进行谷氨酰胺合成酶（GS）免疫荧光鉴定。
其中，步骤(1)所述的PBS缓冲液已4℃预冷，PBS缓冲液浓度为0.01M，PH值为7.2~7.4。
其中，步骤(2)所述的胶原酶作用温和，对细胞损伤较小。
其中，步骤(5)所述的培养瓶用多聚赖氨酸包被，可以提高细胞的贴壁率。
有益效果
本发明建立了一种简单、高效的分离培养人视网膜Muller细胞的方法，所得原代细胞经过形态观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95%以上，通过免疫细胞化学等方法检测细胞标记物，纯度达99%以上。
本发明采用美国CHI Scientific 公司特制研发的人视网膜Muller细胞完全培养基，其培养的细胞经过谷氨酰胺合成酶(GS)免疫荧光染色证实纯度达99％以上。相对于免疫磁珠分选等方法，其技术简单易掌握，价格更低。
本发明采用多聚赖氨酸包被培养瓶，细胞生长状态好，可满足视网膜Muller细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比APES包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究视网膜Muller细胞的特性，为后续实验提供可靠的细胞资源。
附图说明
图1为培养7d的人视网膜Muller细胞免疫荧光图片，200×。
图2为培养7d的人视网膜Muller细胞DAPI染核，200×。
图3为培养7d的人视网膜Muller细胞图片，200×。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本实验所用的实验仪器与试剂如下：外科手术器械一套，倒置显微镜（XDS-1A，上海），荧光显微镜（Leica，美国），恒温孵育箱（Heraeus，美国），低温离心机（TD24B-WS，上海），超低温冰箱（中科美菱），移液枪（Eppendorf，美国），电子分析天平（Sartorius，美国），超净工作台（HJ-CJ-1D，上海），CO2细胞培养箱（SANYO MCO-17AI，日本）。
DMEM/F12培养基，青霉素-链霉素，胎牛血清均购买于美国GIBCO公司，多聚赖氨酸来自Sigma，小鼠抗人GS抗体、羊抗小鼠IgG-PE标记二抗和DAPI购买于Abcam，碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素均购买于美国Peprotech，PBS缓冲液自制（8.0gNaCl、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、1.44gNa2HPO4溶于1L超纯水中，调整PH值为7.2~7.4，非特殊指出，本专利所用的PBS缓冲液皆为此配方），胰酶、I型胶原酶和IV型胶原酶均购买于美国Worthington公司，细胞培养瓶、离心管购于美国Corning公司，锥虫蓝购买于美国Biofer。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
（1）用超纯水配制PBS缓冲液，灭菌锅消毒灭菌，室温冷却后使用；实验器械置于铝盒中121℃高压灭菌，烘干后备用；
（2）包被液的配制：PBS缓冲液中加入多聚赖氨酸粉末配制成0.01%溶液，0.22um滤膜过滤，4℃保存备用；
(3) 无菌取出角膜捐献者手术切除的正常眼球，修剪去除周边结缔组织和肌肉，然后在解剖显微镜下剥离视网膜组织，放入预冷无菌含双抗（100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素）的PBS缓冲液（浓度为0.008~0.015M，PH值为7.2~7.4）中洗涤除去血渍，进一步去除多余的结缔组织，反复清洗，之后再浸泡10min；
(4) 将视网膜组织剪成1mm×1mm×1mm组织碎片，加入10ml 0.1%I型和IV型混合胶原酶，37℃消化60~90min，每隔5min振荡一次；
（5）用8ml含10%胎牛血清，双抗（100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素）的DMEM/F12培养基终止消化，滴管吹打后，经过200目不锈钢筛网过滤，收集滤液到15ml离心管中，1500rpm离心5min，去掉上清，保留沉淀；
（6）完全培养基配制：DMEM/F12培养基中加入100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，10%胎牛血清，5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5mg/L普通胰岛素，PH值为7.2～7.4；
（7）沉淀用PBS缓冲液清洗两次，每次1200～1500rpm离心5min，清洗完之后，沉淀加5ml完全培养基重悬，接种多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶，置于37℃、5% CO2培养箱培养；
（8）培养24h后进行首次换液，之后每隔2～3d换液；
（9）细胞形态观察：原代培养的人视网膜Muller细胞呈纤维状，细胞体积较大，轮廓清晰，核大且明显，突起较长；
（10）细胞传代：细胞达到80~90%融合时进行传代，用PBS缓冲液（浓度为0.01M，PH值为7.2~7.4）清洗细胞2次，加入1ml 0.25%胰酶37℃消化3~5min，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆，开始脱落时加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，制成单细胞悬液，之后1200～1500rpm离心5min，弃上清，沉淀用10ml完全培养基重悬，按照1：2比例进行传代培养，记为P1，以后以同样方法进行传代；
（11）细胞纯化：经过传代培养，P1代细胞形态均一，均为长梭形，之后进行鉴定。
（12）细胞计数及成活率测定：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2mlP1代细胞悬液加入0.2ml的0.4%锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示人视网膜Muller细胞存活，如细胞核被染蓝，提示人视网膜Muller细胞死亡，计数四个大格子细胞数（四大格细胞总数/4×104），计算细胞成活率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%；
（13）细胞爬片的制作：①.取P1代细胞，PBS缓冲液洗涤1~2次；②.用0.25%胰酶消化3~5min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心收集沉淀；③.沉淀用完全培养基重悬，在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数（四大格细胞总数/4×104），对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。计数完成后再加入完全培养基，调整细胞密度1×106/ml；④.培养皿内放入多聚赖氨酸包被处理后的玻璃爬片，加入细胞悬液，37℃，5%CO2培养箱培养；
（14）视网膜Muller细胞免疫荧光鉴定：①.细胞爬片用PBS缓冲液洗3次，每次5min，4%多聚甲醛固定20~30min，PBS缓冲液洗3次，每次5min；②.0.3% TritonX-100室温(15～25℃)下孵育15min，PBS缓冲液洗3 次，每次5min；③.1% BSA室温封闭30min，吸去封闭液。PBS缓冲液洗3次，每次5min；④.加入小鼠抗人GS抗体（用1％BSA稀释），4℃孵育过夜，PBS缓冲液洗3 次，每次5min；⑤.滴加羊抗小鼠PE荧光标记二抗 IgG（用1％BSA稀释），在37℃避光孵育60min，PBS缓冲液洗3次，每次5min；⑥.加入DAPI染液，室温避光染细胞核10min，PBS缓冲液洗3次，每次5min；⑦. 90%甘油封片后显微镜下观察。荧光拍照，计数阳性细胞。
显微镜下观察到大部分细胞发出红色荧光，计数阳性细胞与所有细胞数的比值，阳性率即细胞纯度大于99%。
本发明所得到的人视网膜Muller细胞数量多，P1代细胞成活率达95%以上，细胞纯度达99%以上。
本发明分离得到的人视网膜Muller细胞可大量增殖，并且可以培养5-6代，为后续的实验提供可靠的细胞资源。
以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无菌取出角膜捐献者手术切除的正常眼球，修剪去除周边结缔组织和肌肉，然后在解剖显微镜下剥离视网膜组织，再以预冷含双抗的PBS缓冲液反复清洗后，置于此种双抗PBS缓冲液中浸泡10min；(2) 将视网膜组织剪成1mm×1mm×1mm组织碎片，加入I型和IV型混合胶原酶消化；(3) 用含胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养基终止消化，经过200目不锈钢筛网过滤，滤液1200～1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；(4) 完全培养基配制：DMEM/F12培养基中加入胎牛血清，碱性成纤维细胞生长因子，普通胰岛素，青霉素和链霉素；(5) 沉淀加完全培养基重悬，接种多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱培养；(6) 接种24h后进行首次换液，之后每隔2～3d换液；(7) 细胞传代与纯化；(8) 细胞形态观察与鉴定。
2.根据权利要求1所述的人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(1)所述的预冷PBS缓冲液浓度为0.01M，PH值为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(2)所述的I型和IV型混合胶原酶浓度为0.1%。
4.根据权利要求1所述的人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(3)所述的胎牛血清浓度为10%，双抗浓度为青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml。
5.根据权利要求1所述的人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(4)所述的培养基为含10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素、5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5mg/L普通胰岛素的DMEM/F12培养基，PH值为7.2～7.4。
6.根据权利要求1所述的人视网膜Muller细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述的培养瓶用浓度为0.01%的多聚赖氨酸包被。
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