CN108300688A

CN108300688A - 原代肝细胞分离和培养方法

Info

Publication number: CN108300688A
Application number: CN201810120912.0A
Authority: CN
Inventors: 鄢和新; 周徐; 翟博; 黄伟健; 吴红平; 唐为忠
Original assignee: Shanghai Sailiwei Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Sailiwei Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-07-20
Anticipated expiration: 2038-02-07
Also published as: CN108300688B

Abstract

本发明提供一种原代肝细胞分离和培养方法，包括：步骤S1，穿刺活检肝组织，得到肝组织样本；将所述肝组织样本切碎，得到组织碎块；步骤S2，将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；步骤S3，将所述第二组织碎块接种在培养装置中进行扩增培养。该方法对肝组织来源门槛要求低，组织来源广泛，手术风险小，且步骤简便易行，操作性强，节约时间，降低成本。

Description

原代肝细胞分离和培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原代肝细胞的分离和培养方法。

背景技术

肝脏是人体内重要的器官，具有参与物质代谢、分泌性蛋白的合成、毒素生物转化等功能。肝细胞作为组成肝脏的主体，在生命医学领域有极为广泛的应用，例如，在肝细胞移植、生物人工肝、基因治疗及药物研发等方面都有较高的应用需求。但是，在一般培养条件下，原代肝细胞在体外培养的时间短，分化功能维持时间短，特异性功能迅速降低，限制了肝细胞的应用。

目前，主要的原代肝细胞分离方法是两步原位灌流法，先从门静脉用无钙、含氧前期缓冲液，冲出血细胞和钙离子，再换含蛋白水解酶的溶液至组织软化。此种方法分离获得的肝细胞纯度高、数量多、活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。但是此种方法所需要的供肝来源少，灌流过程耗费的时间长，花费大，操作环节多，技术要求较高，过程易污染。

现针对手术切除的肝组织样本，可采取多点穿刺胶原酶灌注法获得原代肝细胞，分离的肝细胞悬液通过滤网初步筛除较大的组织块、筋膜等，然后采用密度梯度离心的方法获得较纯的肝细胞。例如，公开号为CN102061284A的发明专利公开了一种采用多点穿刺胶原酶灌注法，针对手术切除获得的人肝组织来进行的人原代肝细胞的分离培养方法，该方法克服了手术样本无法体外灌流的缺点。但是此种方法需要样本具备一定的体积和重量，并且具备较为完整的包膜，临床不易获取，从而限制了该方法在一般实验室以及人原代肝细胞在医学中的应用。

因此，有必要设计一种新的原代肝细胞的分离及培养方法以解决上述技术问题。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种针对微量肝组织块的原代肝细胞的分离及培养方法，该方法组织来源广泛，手术风险小，且步骤简便易行，操作性强，成本低。

本发明的第一个方面是提供了一种原代肝细胞分离和培养方法，包括：

步骤S1：穿刺活检肝组织，得到肝组织样本；将所述肝组织样本切碎，得到组织碎块；

步骤S2：将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；

步骤S3：将所述第二组织碎块接种在培养装置中进行扩增培养。

进一步地，所述组织碎块大小为0.5-2mm³。

进一步地，步骤S2中，将所述组织碎块用胶原酶溶液消化，过滤，得到初步消化的组织碎块；将所述初步消化的组织碎块移入第一消化液中消化，过滤后获得所述第二组织碎块；所述第一消化液选自胰酶、胰酶替代物、胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物中的至少一种；所述胰酶替代物为Accutase细胞消化液；所述胰蛋白酶替代物为TrypLE。

进一步地，步骤S3中，将所述第二组织碎块密度调整为1-2个/cm²后，再接种在所述培养装置中。

进一步地，步骤S3中，将所述第二组织碎块接种在所述培养装置中，加入肝细胞扩增培养基进行扩增培养；所述肝细胞扩增培养基是由基础培养基和添加的营养成分组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加的营养成分包括5％-10％的血清或血清替代物。

进一步地，步骤S3中，将所述第二组织碎块进行研磨，过滤，离心，收集细胞；向所述细胞中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，离心分离得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀重悬于所述肝细胞扩增培养基中，得到细胞悬液，将所述细胞悬液接种于所述培养装置中进行扩增培养。

进一步地，所述离心条件为：离心力为40-60g，离心时间为1-3min。

进一步地，调整所述细胞悬液的密度为0.5-2×10³个/cm²后，再接种于所述培养装置中。

进一步地，所述胶原酶溶液是由四型胶原酶和HANKS液配制而成，所述胶原酶溶液中四型胶原酶的浓度为0.2-0.8mg/mL。

进一步地，所述胶原酶溶液中还含有胎牛血清白蛋白，所述胎牛血清白蛋白的浓度为2-8mg/mL。

进一步地，所述消化条件是：35-39℃温度下，以5-15rmp/min的振动频率振动10-40min。

进一步地，所述培养装置采用胶原蛋白或细胞外基质蛋白预包被；所述细胞外基质蛋白选自Matrigel基质胶。

本发明的另一方面是提供一种根据上述分离和培养方法制备得到的肝细胞。

本发明的有益效果如下：

1.本发明公开了一种原代肝细胞的分离和培养方法，该方法通过细针穿刺活检肝组织，获得微量肝组织样本，所述肝组织样本的质量小于0.05g，该方法对肝组织来源门槛要求低，组织来源广泛，手术风险小，且步骤简便易行，操作性强，时间及成本花费少。

2.本发明采用了胶原酶和TrypLE消化体系对肝组织碎块进行消化分离，相对于传统的胰酶，该消化体系对细胞伤害小，能够有效提高获得的肝细胞的存活率。

3.本发明原代肝细胞的扩增培养方法是利用组织爬片的技术，肝细胞在从肝脏组织块爬出来的同时可进行扩增，围绕组织碎块形成一个独立的克隆结构，该方法在短时间获得的肝细胞纯度高，活性好，而且可以扩增。

4.本发明进一步利用细胞单克隆培养法扩增培养肝细胞，有利于肝细胞的分离提纯。

5.不同个体肝细胞具有较大的异质性，通过本发明的方法可建立由不同个体肝细胞组成的肝细胞库，为肝病患者用药个性化精准治疗以及药毒药敏提供了更全面群体样本，也为肝细胞的个性化治疗建立了基础，具有重大的临床应用价值。

附图说明

图1显示了本发明实施例1中所述第二组织碎块被扩增培养至第3天的细胞爬片形态图；

图2显示了本发明实施例1中所述第二组织碎块被扩增培养至第9天的细胞爬片形态图；

图3显示了本发明实施例1中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞形态图；

图4显示了图3中矩形框的放大图，放大倍数为40x；

图5A显示了免疫荧光检测本发明实施例1中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞表达转录因子HNF4α；

图5B显示了免疫荧光检测本发明实施例1中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞表达白蛋白Alb；

图5C显示了免疫荧光检测本发明实施例1中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞共表达转录因子HNF4α及白蛋白Alb；

图6显示了糖原染色检测经本发明实施例1中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞的糖原储存水平；

图7显示了PCR法检测经本发明实施例1中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞的基因表达；

图8显示了明场下本发明实施例2中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞的形态图；

图9A显示了结晶紫染色本发明对照例1中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的明场图；

图9B显示了结晶紫染色本发明对照例2中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的明场图；

图9C显示了结晶紫染色本发明对照例3中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的肝细胞克隆的明场图；

图9D显示了结晶紫染色本发明实施例2中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的明场图；

图10A显示了结晶紫染色本发明对照例1中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，放大倍数为10x；

图10B显示了结晶紫染色本发明对照例2中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，放大倍数为10x；

图10C显示了结晶紫染色本发明对照例3中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，放大倍数为10x；

图10D显示了结晶紫染色本发明实施例2中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，放大倍数为10x；

图11A显示了结晶紫染色本发明对照例1中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x；

图11B显示了结晶紫染色本发明对照例2中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x；

图11C显示了结晶紫染色本发明对照例3中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x；

图11D显示了结晶紫染色本发明实施例2中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x；

图12显示了结晶紫染色本发明对照例1、对照例2、对照例3及实施例2中所述不同消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆数目统计图；

图13A显示了结晶紫染色本发明对照例4中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的明场图；

图13B显示了结晶紫染色本发明实施例3中所述消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆的明场图；

图14显示了结晶紫染色本发明对照例4及实施例3中所述不同消化方式消化所述组织碎块并培养后获得的细胞克隆数目统计图；

图15A显示了本发明实施例4中所述原代肝细胞分离及培养方法获得的肝细胞培养3天后获得的细胞克隆形态图；

图15B显示了本发明实施例4中所述原代肝细胞分离及培养方法获得的肝细胞培养5天后获得的细胞克隆形态图；

图15C显示了本发明实施例4中所述原代肝细胞分离及培养方法获得的肝细胞培养6天后获得的细胞克隆形态图；

图15D显示了本发明实施例4中所述原代肝细胞分离及培养方法获得的肝细胞培养7天后获得的细胞克隆形态图；

图16A显示了免疫荧光检测本发明实施例4中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞表达转录因子HNF4α；

图16B显示了免疫荧光检测本发明实施例4中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞表达白蛋白Alb；

图16C显示了免疫荧光检测本发明实施例4中所述原代肝细胞的分离及培养方法获得的细胞共表达转录因子HNF4α及白蛋白Alb；

图17显示了糖原染色检测经本发明实施例4中所述原代肝细胞分离及培养法获得的细胞的糖原储存水平；

图18显示了PCR法检测经本发明实施例4中所述原代肝细胞分离及培养法获得的细胞的基因表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

试剂：

四型胶原酶为Worthington公司生产，产品编号为CLS-4；

TrypLE消化液为Gibco公司生产，产品编号为12605010；

胰酶为上海源培生物科技有限公司生产，产品编号为E40406；

胎牛血清白蛋白为SIGMA-ALDRICH公司生产，产品编号为B2064；

HANKS液体为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为B410；

D-HANKS液体为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为B430；

抗生素为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为S110；

肝素钠为迈新试剂公司生产，产品编号为151703017A；

4％甲醛溶液为Leagene公司生产，产品编号为DF0135；

一抗抗体ALB为Proteintech公司生产，产品编号为16475-I-AP；

一抗抗体HNF4α为SANTA CRUZ公司生产，产品编号为sc-6556；

二抗抗体为life technologies公司生产，产品编号为A21429；

Williams’medium培养基为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为L660KJ；

结晶紫染液为Beyotime公司生产，产品编号为C0121；

糖原染液为南京建成生物研究所生产，产品编号为D004-1；

乙二醇二乙醚二胺四乙酸为Beyotime公司生产，产品编号为ST068。

为解决现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种原代肝细胞分离和培养方法，包括：

步骤S2：将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；

在本发明中，所述组织碎块大小为0.5-2mm³，优选为1mm³。

在本发明中，将所述组织碎块用胶原酶溶液消化，过滤，得到初步消化的组织碎块；将所述初步消化的组织碎块移入第一消化液中消化，过滤后获得所述第二组织碎块；所述第一消化液选自胰酶、胰酶替代物、胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物中的至少一种；所述胰酶替代物为Accutase细胞消化液；所述胰蛋白酶替代物为TrypLE。优选的第一消化液为胰蛋白酶替代物TrypLE。

在本发明中，所述第二组织碎块以1-2个/cm²的密度接种在培养装置中，优选为1个/cm²。

在本发明中，将所述第二组织碎块接种在所述培养装置中，加入肝细胞扩增培养基进行扩增培养；所述肝细胞扩增培养基是由基础培养基和添加的营养成分组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加的营养成分包括5％-10％的血清或血清替代物。

在本发明中，所述胶原酶溶液是由四型胶原酶和HANKS液配制而成，所述胶原酶溶液中四型胶原酶的浓度为0.2-0.8mg/mL，优选为0.5mg/mL。

本发明中，所述胶原酶溶液中还含有胎牛血清白蛋白，所述胎牛血清白蛋白浓度为2-8mg/mL，优选为5mg/mL。

在本发明中，所述培养装置采用胶原蛋白或细胞外基质蛋白预包被，优选为Matrigel基质胶包被。

在本发明中，在步骤S3中，将所述第二组织碎块进行研磨，过滤，收集细胞；向所述细胞中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，离心分离得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀重悬于所述肝细胞扩增培养基中，获得细胞悬液，将所述细胞悬液接种于培养装置中进行扩增培养。

在本发明中，调节所述细胞悬液的密度，以0.5-2×10³个/cm²的密度接种于所述培养装置中。

在本发明中，所述离心条件为：离心力为40-60g，离心时间为1-3min，优选为：离心力为50g，离心时间为1min。

在本发明中，所述消化条件是：35-39℃温度下，以5-15rmp/min的振动频率振动10-40min，优选温度为37℃。

实施例1

一、针对肝穿刺样本的人原代肝细胞分离培养

1.肝组织样本的获得

采用手术穿刺针取肝病患者正常活检组织，其中，采用的手术针型号为18Gx15cm，获得肝组织样本；所述肝组织样本的直径大小为1-1.2mm，长度为1.5cm，重量为0.02-0.05g。将所述肝组织样本放入含抗生素及肝素钠的HNAKS液中低温运输至实验室中。所述肝组织样本是经知情同意后，从上海交通大学仁济医院肿瘤介入科获得。

用无菌手术镊取出所述肝组织样本，放置于10cm²培养皿中，用HANKS液浸润，保持所述肝组织样本处于湿润状态。用极薄刀片将所述肝组织样本切成体积大小为1mm³的组织碎块，所述刀片为DORCO公司生产，产品编号为ST300。

本发明其他优选实施例中，将所述肝组织样本切成体积大小为0.5mm³或2mm³的组织碎块。

2.肝组织碎块的消化

将所述组织碎块移入到离心管中，所述离心管中装有10mL含0.5mg/mL四型胶原酶及5mg/mL胎牛血清白蛋白的HANKS液，其配制方法为：向100mL HANKS液中加入0.05g的四型胶原酶、0.5g的胎牛血清白蛋白。将所述离心管放在37℃孵箱的摇床上，在晃动频率为10rmp/min的条件下晃动30min，然后用70μm的滤网过滤，接着用HANKS液将所述组织碎块清洗2遍，得到初步消化的组织碎块；将初步消化的组织碎块移入含有TrypLE消化液的离心管中，重新置于37℃孵箱的摇床上，在晃动频率为10rmp/min的条件下晃动10min，然后用70μm的滤网过滤，去除所述TrypLE消化液，接着用HANKS液将所述组织碎块清洗2遍；得到所述第二组织碎块。

本发明其他优选实施例中，所述四型胶原酶的浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL或0.8mg/mL。

本发明其他优选实施例中，所述胎牛血清白蛋白的浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL或8mg/mL。

3.肝细胞的培养

将所述第二组织碎块以1个/cm²的密度接种于Matrigel包被的培养皿中，加入肝细胞扩增培养基培养。

将所述第二组织碎块静置培养3天后，细胞开始从所述第二组织碎块中爬出，此时所述第二组织碎块粘附于所述培养皿上，见图1。对所述培养皿进行换液，继续对所述第二组织碎块进行培养，当培养至第9天时，细胞基本从所述第二组织碎块中全部爬出，见图2。

本发明其他优选实施例中，将所述第二组织碎块以0.5个/cm²或2个/cm²的密度接种于Matrigel包被的培养皿中，加入所述肝细胞扩增培养基培养。

二、肝细胞的增殖形态及细胞性质的鉴定

1.细胞形态观察

用光学显微镜观察本实施例所述分离培养方法获得的细胞，结果见图3和图4，图3为10x倍数放大图；图4显示了图3中矩形框的放大图，放大倍数为40x，其中箭头所示为双核肝细胞。由图4可以看出，本实施例所述分离及培养方法所得到的细胞呈典型的肝细胞形态：核浆比例大，有的细胞呈现双核形态。

2.免疫荧光染色法对细胞克隆鉴定

转录因子HNF4α在成熟肝细胞中特异表达，白蛋白Alb只在肝细胞中产生，因此我们将以上两个指标结合，采用免疫荧光染色法对细胞克隆鉴定，若细胞共表达HNF4α及Alb，则认为细胞为肝实质细胞。其中，染色步骤如下：弃去所述肝细胞扩增培养基，用PBS溶液将细胞冲洗两遍，将储存在-20℃的细胞固定液或常温的4％甲醛溶液加入所述培养皿中，覆盖细胞即可，常温固定细胞10min；将固定好的细胞用PBS溶液清洗三次，每次间隔5min；然后加入0.2％Triton细胞穿膜液，覆盖细胞，将所述培养皿放入37℃孵箱中孵育15min；取出所述培养皿，弃掉所述细胞穿膜液，向所述培养皿加入PBS溶液清洗3次，每次间隔五分钟；然后加入3％牛血清白蛋白封闭液覆盖细胞，放入37℃孵箱孵育30min；吸走所述3％牛血清白蛋白封闭液，向所述培养皿加入稀释好的一抗，所述一抗抗体为HNF4α/Alb，放入冰箱过夜，冰箱温度设置为4℃；次日将细胞从冰箱中取出，用PBS溶液清洗细胞3次，每次间隔5min，然后加入与所述一抗相对应种属的荧光二抗，常温孵育30min。将所述二抗稀释液吸走，用PBS溶液清洗细胞三次，每次间隔5min，加入含DAPI的荧光封片剂，上机观察。

检测结果见图5A、图5B和图5C，其中图5A显示了本实施例中所述方法获得的细胞表达转录因子HNF4α，图5B显示了本实施例中所述方法获得的细胞表达白蛋白Alb，图5C显示了本实施例中所述方法获得的细胞共表达转录因子HNF4α及白蛋白Alb。结果表明，本实施例所述方法获得的细胞能够同时表达转录因子HNF4α和白蛋白Alb，为肝实质细胞。

3.糖原合成鉴定

取上述分离培养方法获得的细胞进行糖原染色鉴定，染色操作参考糖原染色试剂盒，所述试剂盒购自南京建成生物研究所、货号为D004-1。具体步骤如下：吸去所述肝细胞扩增培养基，向所述培养皿中加入4％中性甲醛固定液室温固定细胞10min，去掉所述4％中性甲醛固定液，用蒸馏水冲洗细胞3遍；向所述培养皿中加入过碘酸溶液，室温放置5-8min，去掉所述过碘酸溶液，用自来水冲洗细胞1遍后，用蒸馏水冲洗细胞2遍；向所述培养皿中加入Schiff试剂，然后将所述培养皿置于阴暗处，浸染10-20min，去掉所述Schiff试剂，用蒸馏水冲洗细胞3遍；向所述培养皿中加入苏木素染色液，复染细胞核1-2min，去掉所述苏木素染色液，用蒸馏水冲洗细胞3遍；用中性树脂封固细胞，将封固好的细胞置于光学显微镜下观察。

检测结果见图6，由图6可见，本实施例所述分离及培养方法获得的细胞胞浆深染，表明这些细胞具有较强的糖原合成能力，反映其具有肝实质细胞的特有功能。

4.DNA鉴定

抽取DNA，具体步骤如下：吸去所述肝细胞扩增培养基，在所述培养皿中加入500μLTrizol试剂，用枪尖轻刮所述培养皿的底层，吹打后用离心管收集液体。向收集的液体中加入100μL的氯仿，剧烈震荡30s后，室温放置3min，直至液面分层；在离心力为12000g，离心温度为4℃条件下离心15min；吸取上清液至新的离心管，吸取的体积为Trizol试剂体积的0.5-1.5倍；加入与吸取的上清液相同体积的异丙醇，震荡后室温放置10min；再在离心力为12000g，离心温度为4℃条件下离心10min；弃去上清，加入75％的乙醇洗一遍；在离心力为7500g，离心温度为4℃条件下离心5min；弃去上清，56℃温度下控干5-10min，直至沉淀完全透明；加入预热好的DEPC液吹打溶解。然后采用HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA。最后采用表1中的引物通过PCR技术扩增肝细胞相关基因，所述试剂盒购买自上海翊圣生物科技有限公司，产品编号为11121ES50；进行凝胶电泳，紫外灯下观察结果。检测结果见图7，如图7所示，本实施例所述分离及培养方法获得的细胞表达肝细胞功能相关基因Alb、Ttr、Ck8、Ck18和Hnf4α，不表达成纤维细胞相关基因FSP1，表明获得的细胞为肝细胞。

表1

基因名称	上游引物	下游引物
			Alb	GAGACCAGAGGTTGATGTGATG	AGTTCCGGGGCATAAAAGTAAG
Ttr	TGGGAGCCATTTGCCTCTG	AGCCGTGGTGGAATAGGAGTA
			HNF4α	CACGGGCAAACACTACGGT	TTGACCTTCGAGTGCTGATCC
Ck8	CAGAAGTCCTACAAGGTGTCCA	CTCTGGTTGACCGTAACTGCG
			Ck18	GGCATCCAGAACGAGAAGGAG	ATTGTCCACAGTATTTGCGAAGA
Cd90	ATCGCTCTCCTGCTAACAGTC	CTCGTACTGGATGGGTGAACT
			HalphaSMA	AAAAGACAGCTACGTGGGTGA	GCCATGTTCTATCGGGTACTTC
HFSP1-F	GATGAGCAACTTGGACAGCAA	CTGGGCTGCTTATCTGGGAAG

实施例2

一、针对肝穿刺样本的人原代肝细胞分离培养

1.肝组织样本的获得

肝组织样本的获得同实施例1。

2.原代肝细胞的分离

将所述肝组织碎块移入到离心管中，所述离心管中装有10mL含0.5mg/mL四型胶原酶的HANKS液，其配制方法为：向100mLHANKS液中加入0.05g的四型胶原酶；将所述离心管放在37℃孵箱的摇床上，在晃动频率为10rmp/min的条件下晃动30min，然后用70μm的滤网过滤，去除溶液，接着用HANKS液将所述组织碎块清洗2遍，得到初步消化的组织碎块。将所述初步消化的组织碎块移入含有TrypLE消化液的离心管中，重新置于37℃孵箱的摇床上，在晃动频率为10rmp/min的条件下晃动10min，然后用70μm的滤网过滤，去除所述TrypLE消化液，接着用HANKS液将所述组织碎块清洗2遍，得到第二组织碎块。用1mL注射器内芯头将所述第二组织碎块放在70μm滤网上进行研磨，同时用Williams’medium培养基冲洗残留在滤网上的细胞；收集过滤后的细胞悬液，在50g离心力条件下离心1min；弃上清，得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，然后加入PBS混匀清洗，再次在50g离心力条件下离心1min，弃上清，得到初次清洗的细胞沉淀；向所述初次清洗的细胞沉淀中加入所述Williams’medium培养基，清洗两遍，得到清洗后的细胞沉淀。

3.原代肝细胞的培养

将清洗后的细胞沉淀用所述肝细胞扩增培养基重悬，以10³个/cm²密度接种于Matrigel包被的培养皿中。

对照例1

单酶消化法：用实施例1中肝组织样本的获得方法获得组织碎块，将所述组织碎块放入离心管中，该离心管中装有10ml经过37℃预热的0.5mg/mL的胶原酶溶液，所述0.5mg/mL的胶原酶溶液的配制方法为：100mLHANKS液中加入0.05g的所述四型胶原酶；然后将所述离心管置于37℃孵箱的摇床上，以10rmp/min的频率晃动40min；用70μm的滤网过滤后，用HANKS液冲洗所述组织碎块2遍，获得第三组织碎块；用1mL注射器内芯头将所述第三组织碎块在70μm的滤网上进行研磨；同时用所述Williams’medium培养基冲洗残留在滤网上的细胞，收集过滤后的细胞悬液，移入离心管中，以50g离心1min；弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置至红细胞裂解完全，加入PBS溶液混匀清洗，以50g离心1min；用所述Williams’medium培养基清洗细胞两遍，得到细胞沉淀；用所述肝细胞扩增培养基对所得到的细胞沉淀进行重悬，调节密度为10³个/cm²，将该密度的细胞接种于Matrigel包被的培养皿中。

对照例2

两步胶原酶灌注法：用实施例1中所述肝组织样本的获得方法获得组织碎块，将所述组织碎块放入离心管中，该离心管中装有10ml经过37℃预热的含5mg/mL胎牛血清白蛋白及0.5mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸的HANKS液，其中，所述HANKS液为不含钙镁的HANKS溶液。将所述离心管置于37℃孵箱的摇床上，以10rmp/min的频率晃动10min，得到初步消化的组织碎块；用70μm的滤网的过滤，用HANKS液清洗所述组织碎块2遍；然后将初步消化的组织碎块移入装有10mL 0.5mg/mL胶原酶溶液的离心管中，所述0.5mg/mL的胶原酶溶液的配制方法为：100mL HANKS液中加入0.05g的所述四型胶原酶；将该离心管重新置于37℃孵箱的摇床上，以10rmp/min的频率晃动30min；然后用70μm的滤网的过滤，用HANKS液冲洗所述组织碎块2遍，得到第四组织碎块；用1mL注射器内芯头将所述第四组织碎块在70μm的滤网上进行研磨；同时用Williams’medium培养基冲洗残留在滤网上的细胞，收集过滤后的细胞悬液，移入离心管中，以50g离心1min；弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置至红细胞裂解完全，加入PBS溶液混匀清洗，再次以50g离心1min；用所述Williams’medium培养基清洗细胞两遍，得到细胞沉淀；用所述肝细胞扩增培养基对所得到的细胞沉淀进行重悬，稀释至密度为10³个/cm²，将该密度的细胞接种于Matrigel包被的培养皿中。

对照例3

胶原酶加胰酶溶液两步消化法：用实施例1中所述肝组织样本的获得方法获得组织碎块，将所述组织碎块放入离心管中，该离心管中装有10mL经过37℃预热的0.5mg/mL的胶原酶溶液，所述0.5mg/mL的胶原酶溶液的配制方法为：向100mL HANKS液中加入0.05g的所述四型胶原酶；将所述离心管置于37℃孵箱的摇床上，以10rmp/min的频率晃动30min，得到初步消化的组织碎块；然后用70μm的滤网的过滤，用HANKS液将清洗所述组织碎块2遍，然后将所述初步消化的组织碎块移入装有10mL 0.5mg/mL胰酶溶液的离心管中，所述0.5mg/mL的胰酶溶液的配制方法为：向100mL HANKS液中加入0.05g的所述胰酶；将该离心管重新置于37℃孵箱的摇床上，以10rmp/min的频率晃动10min；然后用70μm的滤网的过滤，用HANKS液冲洗所述组织碎块2遍，得到第五组织碎块；用1mL注射器内芯头将所述第五组织碎块在70μm的滤网上进行研磨；同时用Williams’medium培养基冲洗残留在滤网上的细胞，收集过滤后的细胞悬液，移入离心管中，以50g离心1min；弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置至红细胞裂解完全，加入PBS溶液混匀清洗，再次以50g离心1min；用Williams’medium培养基清洗细胞两遍，得到细胞沉淀；用所述肝细胞扩增培养基对所得到的细胞沉淀进行重悬，调节密度为10³个/cm²，将该密度的细胞接种于Matrigel包被的培养皿中。

二、肝细胞的增殖形态及细胞性质的鉴定

1.肝细胞的增殖形态

将实施例2中所述消化分离及培养方法得到的细胞，在5％二氧化碳，37℃的环境中培养24小时后换液，之后每隔三天换一次液，继续培养6-8天，可形成细胞单克隆，如图8所示。

2.单克隆肝细胞染色

将实施例2中所述方法和对照例1、对照例2、对照例3中所述方法得到的细胞，在5％二氧化碳，37℃的环境中培养24小时后换液，之后每隔三天换一次液，继续培养6-8天，吸走培养液，用PBS洗涤一次，用所述4％中性甲醛固定液将细胞室温固定10min，吸去所述4％中性甲醇固定液，向培养板的每个培养孔中加0.5ml结晶紫染液，室温中放置20min，吸走所述结晶紫染液，用PBS溶液洗涤细胞3次，将所述培养板倒置于吸水纸上吸干水分，然后将样本置于光学显微镜下观察，观察结果如图9A-图9D、图10A-图10D及图11A-图11D所示，其中，图9A显示对照例1中所述方法得到的细胞克隆结晶紫染色明场图，图9B显示对照例2中所述方法得到的细胞克隆结晶紫染色明场图，图9C显示对照例3中所述方法得到的细胞克隆结晶紫染色明场图，图9D显示本实施例所述方法得到的细胞克隆结晶紫染色明场图；图10A显示了对照例1中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为10x，图10B显示了对照例2中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为10x，图10C显示了对照例3中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为10x，图10D显示了本实施例中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为10x；图11A对照例1中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x，图11B显示了对照例2中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x，图11C显示了对照例3中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x，图11D显示了本实施例中所述方法得到的细胞克隆的形态图，其放大倍数为40x。

统计实施例2中所述方法和对照例1、对照例2、对照例3中所述方法最终获得的细胞克隆数，结果如图12所示，与对照组比较，**＝P(<0.01)，存在显著性差异。

以上结果表明，利用实施例中的消化方式获得的细胞与对照例消化方式获得的细胞相比较，利用本实施例的消化方式获得的细胞克隆数目及大小均有明显的增多，说明对本实施例的消化体系对肝细胞伤害小，能够有效提高肝细胞存活率。

实施例3

一、针对肝穿刺样本的人原代肝细胞分离培养

1.肝组织样本的获得

肝组织样本的获得同实施例1。

2.原代肝细胞的分离

将所述组织碎块移入到离心管中，该离心管中装有10mL经过37℃预热的含0.5mg/mL四型胶原酶及5mg/mL胎牛血清白蛋白的HANKS液，其配制方法为：向100mL HANKS液中加入0.05g的四型胶原酶、0.5g的胎牛血清白蛋白。将所述离心管放在37℃孵箱的摇床上，在晃动频率为10rmp/min的条件下晃动30min，然后用70μm的滤网过滤，接着用HANKS液将所述组织块清洗2遍，得到初步消化的组织碎块；将初步消化的组织碎块移入装有TrypLE消化液的离心管中，重新置于37℃孵箱的摇床上，在晃动频率为10rmp/min的条件下晃动10min，然后用70μm的滤网过滤，去除所述TrypLE消化液，接着用HANKS液将所述组织碎块清洗2遍；得到所述第二组织碎块。用1mL注射器内芯头将所述第二组织碎块放在70μm滤网上进行研磨，同时用Williams’medium培养基冲洗残留在滤网上的细胞；收集过滤后的细胞悬液，在50g离心力条件下离心1min；弃上清，得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，加入PBS混匀清洗，再次以50g离心力条件下离心1min，弃上清，得到初次清洗的细胞沉淀；向所述初次清洗的细胞沉淀中加入Williams’medium培养清洗两遍，得到清洗后的细胞沉淀。

3.原代肝细胞的培养

将清洗后的细胞沉淀用肝细胞扩增培养基重悬，以10³个/cm²密度接种于Matrigel包被的培养皿中。

对照例4

用实施例1中所述肝组织样本的获得方法获得肝组织碎块，将所述肝组织碎块放入离心管中，该离心管中装有10mL经过37℃预热的0.5mg/mL的胶原酶溶液，所述0.5mg/mL的胶原酶溶液的配制方法为：向100mL HANKS液中加入0.05g的四型胶原酶；然后将所述离心管置于37℃孵箱的摇床上，以10rmp/min的频率晃动30min；然后用70μm的滤网过滤，用HANKS液冲洗所述组织碎块2遍，得到第六组织碎块；用1mL注射器内芯头将所述第六组织碎块在70μm的滤网上进行研磨；同时用Williams’medium培养基冲洗残留在滤网上的细胞，收集过滤后的细胞悬液，移入离心管中，以50g离心1min；弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置至红细胞裂解完全，加入PBS溶液混匀清洗，再次以50g离心1min；得到的细胞沉淀再次用Williams’medium培养基清洗两遍，得到细胞沉淀；用所述细胞扩增培养基对所得到的细胞沉淀进行重悬，稀释至密度为10³个/cm²，将该密度的细胞接种于Matrigel包被的培养皿中。

二、肝细胞性质的鉴定

单克隆肝细胞染色

将实施例3中的所述消化方式消化分离得到的细胞和对照例4中所述消化方式消化分离得到的细胞，在5％二氧化碳，37℃的环境中培养24小时后换液，之后每隔三天换一次液，继续培养5天，吸走所述肝细胞增殖培养基，用PBS洗涤细胞一次，用所述4％中性甲醛固定液室温固定细胞10min，吸去所述4％中性甲醇固定液，向所述培养皿中加0.5mL结晶紫染液，室温中放置20min，吸走所述结晶紫染液，用PBS溶液洗涤细胞3次，将所述培养皿倒置于吸水纸上吸干水分，然后将所述培养皿置于光学显微镜下观察，观察结果如图13A和图13B所示，其中，图13A显示了对照例4所述方法获得的细胞克隆结晶紫染色明场图，图13B显示了本实施例所述方法获得的细胞克隆结晶紫染色明场图。统计实施例3中所述消化分离方法和对照例4中所述消化分离方法最终获得的克隆数，结果见图14，与对照组比较，**＝P(<0.01)，存在显著性差异。结果显示，通过本实施例所述消化方式消化分离及培养获得的细胞存活率得到了很大的提高，表明加入所述胎牛血清白蛋白能够有效提高肝细胞的存活率。

实施例4

一、针对肝穿刺样本的人原代肝细胞分离培养

1.肝组织样本的获得

肝组织样本的获得同实施例1。

2.原代肝细胞的分离

原代肝细胞的分离同实施例3

3.原代肝细胞的培养

三、肝细胞的增殖形态及细胞性质的鉴定

1.肝细胞的增殖形态

将本实施例所述分离培养方法获得的细胞在5％二氧化碳，37℃的环境中培养24小时后换液，之后每隔三天换一次液，继续培养6-8天，细胞形态的变化如图15A、图15B、图15C和图15D所示，其中，图15A显示了培养3天后的细胞形态；图15B显示了培养5天后的细胞形态；图15C显示了培养6天后的细胞形态；图15D显示了培养7天后的细胞形态。由图15A、图15B、图15C和图15D可以看出，利用本实施例的分离培养方法获得的细胞在培养6-8天后形成了肝细胞克隆。

2.免疫荧光染色法对细胞克隆鉴定

采用免疫荧光染色法对细胞克隆鉴定，鉴定方法参照实施例1中细胞免疫荧光染色法对细胞克隆鉴定的方法。

检测结果见图16A、图16B、图16C，其中图16A显示了本实施例中所述方法获得的细胞表达转录因子HNF4α，图16B显示了本实施例中所述方法获得的细胞表达白蛋白Alb，图16C显示了本实施例中所述方法获得的细胞共表达转录因子HNF4α及白蛋白Alb。结果表明，本实施例所述方法获得的细胞能够同时表达转录因子HNF4α和白蛋白Alb，为肝实质细胞。

3.糖原合成鉴定

肝细胞特异性储存糖原染色，染色操作步骤参照实施例1中所述糖原合成鉴定方法，检测结果见图17，由图17可见，本实施例所述分离及培养方法获得的细胞胞浆深染，表明这些细胞可以合成糖原，为肝细胞。

4.DNA鉴定

DNA检测方法参照实施例1中所述DNA鉴定的方法，检测结果见图18，如图18所示，本实施例所述分离及培养方法获得的细胞表达肝细胞功能相关基因Alb、Ttr、Ck8、Ck18和Hnf4α，不表达成纤维细胞相关基因FSP1，表明本实施例所述分离及培养方法获得的细胞为肝细胞。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

上面对本发明的各种实施方式的描述以描述的目的提供给本领域技术人员。其不旨在是穷举的、或者不旨在将本发明限制于单个公开的实施方式。如上所述，本发明的各种替代和变化对于上述技术所属领域技术人员而言将是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些另选的实施方式，但是其它实施方式将是显而易见的，或者本领域技术人员相对容易得出。本发明旨在包括在此已经讨论过的本发明的所有替代、修改、和变化，以及落在上述申请的精神和范围内的其它实施方式。

虽然通过实施方式描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。

Claims

1.一种原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，包括：

步骤S2：将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；

2.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述组织碎块大小为0.5-2mm³。

3.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S2中，将所述组织碎块用胶原酶溶液消化，过滤，得到初步消化的组织碎块；将所述初步消化的组织碎块移入第一消化液中消化，过滤后获得所述第二组织碎块；所述第一消化液选自胰酶、胰酶替代物、胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物中的至少一种；所述胰酶替代物为Accutase细胞消化液；所述胰蛋白酶替代物为TrypLE。

4.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二组织碎块密度调整为1-2个/cm²后，再接种在所述培养装置中。

5.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二组织碎块接种在所述培养装置中，加入肝细胞扩增培养基进行扩增培养。

6.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二组织碎块进行研磨，过滤，离心，收集细胞；向所述细胞中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，离心分离得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀重悬于所述肝细胞扩增培养基中，得到细胞悬液，将所述细胞悬液接种于所述培养装置中进行扩增培养。

7.根据权利要求6所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述离心条件为：离心力为40-60g，离心时间为1-3min。

8.根据权利要求6所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，调整所述细胞悬液的密度为0.5-2×10³个/cm²后，再接种于所述培养装置中。

9.根据权利要求3所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述胶原酶溶液是由四型胶原酶和HANKS液配制而成，所述胶原酶溶液中四型胶原酶的浓度为0.2-0.8mg/mL。

10.根据权利要求9所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述胶原酶溶液中还包含胎牛血清白蛋白，所述胎牛血清白蛋白的浓度为2-8mg/mL。

11.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述消化条件是：35-39℃温度下，以5-15rmp/min的振动频率振动10-40min。

12.根据权利要求1或6所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述培养装置采用胶原蛋白或细胞外基质蛋白预包被；所述细胞外基质蛋白选自Matrigel基质胶。

13.根据权利要求1至12任一项所述的原代肝细胞分离和培养方法制备得到的肝细胞。