CN109294981A - 一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人皮肤成纤维细胞提取方法，其包括步骤：1)将人的真皮组织剪碎并用含0.25％IV型胶原酶和0.1％胰蛋白酶的混合酶溶液消化至大组织块消失后终止消化；2)过滤消化后的真皮组织，收集滤液，离心，弃上清，收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用筛选培养基培养；3)培养至细胞融合度达到70％后更换部分筛选培养基为扩增培养基，继续培养；4)培养至细胞融合度达到90％后，传代培养，并更换全部培养基为扩增培养基。其中，筛选培养基的配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8‑12％的澳洲胎牛血清，以及0.4‑0.6ng/mL的EGF和4‑6ng/mL的bFGF作为添加因子；扩增培养基的配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8‑12％的澳洲胎牛血清。

Description

一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基。
背景技术
成纤维细胞(fibroblast，Fbs)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞功能活动旺盛，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。成纤维细胞的独特性能帮助修复受损皮肤，并降低年龄老化对皮肤的影响。
成纤维细胞合成分泌的胶原纤维是Ⅰ型胶原纤维。处于成熟期或称静止状态的纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。
除创伤修复之外，研究表明，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，成纤维细胞能够刺激这些细胞生长，恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。
人皮肤成纤维培养历史有很多年，但是在原代细胞提取和培养中仍有些技术难点，传统的贴壁法耗时常达30-40天，爬出的细胞融合度过高常出现接触抑制，第一次消化传代后细胞存活率较低，常出现消化后存活细胞状态差等问题；传统的消化法，常常先用胰蛋白酶消化过夜分离真皮层、表皮、脂肪和肌肉等组织，以免消化后杂细胞贴壁存活，造成成纤维细胞纯度降低等问题，在用胶原酶消化4小时左右再过滤出单细胞接种培养，其缺点在于耗时常且过程繁琐，组织块在消化过程中往往先消化下来成纤维细胞后消化下来内皮细胞，消化过度容易造成成纤维细胞受损影响后续培养和传代，消化下来的内皮细胞影响成纤维细胞纯度和生长。
发明内容
针对传统皮肤成纤维细胞提取方法弊端本发明通过采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶结合的快速消化法，并使用新配方的筛选培养基去除杂质细胞，快速提取高纯度高活性的人皮肤成纤维细胞(Fbs)。
首先，本发明提供了一种用于人皮肤成纤维细胞提取的皮肤成纤维细胞筛选培养基，其配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清，以及0.4-0.6ng/mL的EGF和4-6ng/mL的bFGF作为添加因子。
优选地，所述澳洲胎牛血清的体积含量为10％；优选地，EGF的含量为0.5ng/mL，bFGF的含量为5ng/mL。
其次，本发明还提供了一种用于人皮肤成纤维细胞提取的皮肤成纤维细胞扩增培养基，其配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清。
优选地，所述澳洲胎牛血清的体积含量为10％。
进一步，本发明提供了一种快速消化结合培养基筛选的人皮肤成纤维细胞提取方法，包括以下步骤：
1)将人的真皮组织剪碎并用含0.25％IV型胶原酶和0.1％胰蛋白酶的混合酶溶液消化至大组织块消失后终止消化；
2)过滤消化后的真皮组织，收集滤液，离心，弃上清，收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用筛选培养基培养；
3)培养至细胞融合度达到70％后更换部分筛选培养基为扩增培养基，继续培养；
4)培养至细胞融合度达到90％后，传代培养，并更换全部培养基为扩增培养基。
优选地，所述提取方法在步骤1)之前还包括步骤：手术采集人皮肤组织，并去除皮下肌肉及脂肪组织，保留真皮组织；进一步优选地，采集的人皮肤组织置于含抗生素的缓冲液中进行肌肉、脂肪的去除以及真皮组织的剪碎，其中所述含抗生素的缓冲液的配方优选为：含有体积比分别为1/100双抗、1/500庆大霉素及1/1000克林霉素、pH＝7的无菌PBS。
优选地，步骤1)中消化温度为37℃，消化时间为30-40分钟。
优选地，步骤2)中过滤的目数为200目，离心转速为1600-2000rpm，离心时间为8-12分钟。
优选地，步骤2)中接种细胞的密度为0.8×105-1.2×105个/mL。
本发明具有以下有益技术效果：
本发明采用快速消化结合培养基筛选的方法提取人皮肤成纤维细胞，其中IV型胶原酶和胰蛋白酶制得的混合酶消化获得的成纤维细胞活性高、增殖速度快，此外，本发明提供的筛选培养基和扩增培养基可达到很好的纯化效果，更好地清除杂质细胞，获得高胶原蛋白表达量的高纯度人皮肤成纤维细胞。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为实施例2中原代提取的人皮肤成纤维细胞分别培养第2天、第4天、第7天的细胞状态；
图2为培养一周后对比例1的贴壁法、对比例2的一般消化法与实施例2的本发明消化图；
图3为实施例2提取的人皮肤成纤维细胞流式检测结果；
图4为MTT测定的对比例2的一般消化法和实施例2的本发明消化法提取的细胞生长曲线的比较。
具体实施方式
实施例1培养基、缓冲液的制备
1.筛选培养基：DMEM高糖培养基(Gbico，C11995500BT)加入10％的澳洲胎牛血清(Gbico，10099-141)，再加入添加因子EGF 0.5ng/mL与bFGF 5ng/mL；
2.扩增培养基：DMEM高糖培养基(Gbico，C11995500BT)加入10％的澳洲胎牛血清(Gbico，10099-141)；
3.含抗生素的PBS缓冲液：pH＝7的无菌PBS中加入1/100双抗(Gbico，15140-122)、1/500庆大霉素及1/1000克林霉素，于4℃预冷；
4.混合酶溶液：0.25％(0.25g/100mL)Ⅳ型胶原酶中加入0.1％(0.1g/100mL)胰蛋白酶。
实施例2快速消化结合培养基筛选的人皮肤成纤维细胞提取
1.皮肤组织来源：皮肤样本50例左右，均来源于自体因施行割双眼皮、切除眼袋的女性眼睑周围部位的皮肤或耳后皮肤组织，年龄35～50岁，由上海市各医疗整形医院提供。
2.提取步骤：
1)将手术切下的皮肤用含抗生素的PBS缓冲液反复漂洗后，用无菌眼科剪和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉及脂肪组织，保留真皮组织；
2)将真皮组织剪碎，用混合酶溶液在37℃摇床消化30-40分钟至大组织块消失，还有部分小组织块的时候加入10％胎牛血清终止消化；
3)用200目筛网过滤，收集滤液，1800rpm离心10min，弃上清，收集沉淀的细胞，用筛选培养基调整细胞以1×105个/mL密度接种于75mL培养瓶中，每个培养瓶中加入15mL的含细胞培养基，中途记录细胞生长状态，如图1所示；
4)培养7天后，将一半的培养基更换为扩增培养基，培养至第10天，此时细胞融合度达到90％以上，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并将培养基换为纯扩增培养基传代培养。
对比例1贴壁法提取人皮肤成纤维细胞
将手术切下的皮肤经含抗生素的PBS缓冲液反复漂洗后，用无菌眼科剪和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉及脂肪组织，保留真皮；将真皮剪成2mm×2mm的小块，贴于10×10cm的培养皿中，在37℃、含5％二氧化碳的恒温培养箱中倒置4小时后，补10毫升培养液，等细胞爬出长满后传代。
对比例2一般消化法提取人皮肤成纤维细胞
将手术切下的皮肤经含抗生素的PBS缓冲液反复漂洗后，用无菌眼科剪和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉及脂肪组织，保留真皮；将皮肤组织剪碎，用含0.1％的胰蛋白酶37℃消化30分钟至大组织块消失，还有部分小组织块的时候加入10％胎牛血清终止消化，200目筛网过滤，1800rpm离心10min，弃上清，收集沉淀的细胞，用筛选培养基，以1×105个/mL密度接种于75mL培养瓶中，每个培养瓶中加入15mL的含细胞培养基。
实施例3细胞形态学观察及鉴定
对培养一周后贴壁法(对比例1)、一般消化法(对比例2)与本发明方法(实施例2)细胞状态进行比较，其结果如图2所示，从结果可看出，与本发明方法相比贴壁法爬出的细胞接触抑制现象严重，一般消化法细胞老化、增殖缓慢。
HE染色：待染细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度约为1×104个/mL接种到铺有盖玻片的24孔板中培养，待细胞生长至单层，吸出上清，用PBS洗板3次，然后用95％酒精固定30min，在常规HE染色光学显微镜下进行形态学观察。
本领域普通技术人员可知：状态好的成纤维细胞胶原蛋白较多，胶原蛋白HE染色呈淡粉色，纤维蛋白HE染色为深粉色，在本发明中实施例2与对比例2中提取的人皮肤成纤维细胞的HE染色结果显示，实施例2中提取的细胞呈浅粉色，而对比例2中提取的细胞呈橘粉色。
实施例4流式鉴定成纤维细胞
取适量的细胞液吹打混匀，以无菌的PBS清洗细胞2-3次，用不含血清的DMEM高糖重悬细胞，调整浓度为1×106-3×106个/mL，将细胞重悬液分装至1.5mL离心管(100μL/管)中，加入PE-anti-CD31(BD PharMingen，San Diego)、PE-anti-CD105(BD PharMingen，SanDiego)、FITC anti-Vimentin(BD PharMingen，San Diego)抗体(1μL/test)后，用流式细胞仪检测成纤维细胞的特征蛋白表达情况，实施例2中提取的成纤维细胞的流式结果如图3所示，CD31、CD105为阴性，Vimentin为阳性。
实施例5Fbs生长曲线测定
取第3代细胞，选对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成单个细胞的悬液，计数并稀释至终浓度为1×103个/孔，接种至96孔板中，采用MTT法进行生长曲线测定，比较一般消化方法与实施例2中的提取法的细胞生长曲线，其结果如图4所示，从图中可知本发明提取法培养的细胞活性高于一般消化方法。
实施例6用ELSA方法检测胶原蛋白含量
用ELSA方法检测第3代细胞培养上清液中I型胶原蛋白含量，490nm波长检测吸光度值A，用A表示胶原蛋白量，比较一般消化法与本发明消化法，Fbs中I型胶原蛋白(ICollagen)含量，结果如表1所示。
表1.一般消化法与本发明消化法提取的Fbs中I型胶原蛋白含量
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将人的真皮组织剪碎并用含0.25％IV型胶原酶和0.1％胰蛋白酶的混合酶溶液消化至大组织块消失后终止消化；
2)过滤消化后的真皮组织，收集滤液，离心，弃上清，收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用筛选培养基培养；
3)培养至细胞融合度达到70％后更换部分筛选培养基为扩增培养基，继续培养；
4)培养至细胞融合度达到90％后，传代培养，并更换全部培养基为扩增培养基。
2.如权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，所述提取方法在步骤1)之前还包括步骤：手术采集人皮肤组织，并去除皮下肌肉及脂肪组织，保留真皮组织。
3.如权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，步骤1)中消化温度为37℃，消化时间为30-40分钟。
4.如权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，步骤2)中过滤的目数为200目，离心转速为1600-2000rpm，离心时间为8-12分钟。
5.如权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，步骤2)中接种细胞的密度为0.8×105-1.2×105个/mL。
6.如权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，步骤2)中所述筛选培养基的配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清，以及0.4-0.6ng/mL的EGF和4-6ng/mL的bFGF作为添加因子。
7.如权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞提取方法，其特征在于，步骤3)中所述扩增培养基的配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清。
8.一种用于人皮肤成纤维细胞提取的皮肤成纤维细胞筛选培养基，其特征在于，其配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清，以及0.4-0.6ng/mL的EGF和4-6ng/mL的bFGF作为添加因子。
9.如权利要求8所述的皮肤成纤维细胞筛选培养基，其特征在于，所述澳洲胎牛血清的体积含量为10％，EGF的含量为0.5ng/mL，bFGF的含量为5ng/mL。
10.一种用于人皮肤成纤维细胞提取的皮肤成纤维细胞扩增培养基，其特征在于，其配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清。
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