CN105132358A

CN105132358A - 培养获得组织工程表皮的方法及其应用

Info

Publication number: CN105132358A
Application number: CN201510454054.XA
Authority: CN
Inventors: 刘洪�; 李琳; 杨熙
Original assignee: H&B HEALTH GROUP
Current assignee: Suzhou nuopu Regenerative Medicine Co. Ltd.
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-07-29
Also published as: CN105132358B

Abstract

本发明提供了一种体外培养获得组织工程表皮的方法及其应用，表皮细胞与黑色素细胞共培养，并可获得具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构的表皮膜片，具有面积大、无排异反应、结构与自然表皮极为相似、治疗效果好等特点。

Description

培养获得组织工程表皮的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种培养获得组织工程表皮的方法，尤其涉及一种黑色素细胞和角质细胞共培养的表皮形成的培养方法。

背景技术

组织工程皮肤在医疗和美容界随着这项技术的成熟有着越来越广泛的应用，并且在安全、广泛性治疗效果等方面远远优于其他治疗手段。现在在皮肤组织疾病的治疗上除了药物治疗外大都实施两种治疗方法：自体皮肤的直接移植和异体皮肤或皮肤替代物的移植；自体移植物无法一次性完成大面积部位的治疗，需要重复手术。

在可以大面积治疗的产品中，常将自体或异体的表皮细胞提取并培养研究进而获得产品，现在出现将提取出的表皮细胞与成纤维细胞等细胞接种至生物材料中做皮肤替代物的专利，如2003年吕伟光、韩斌等人申请的有关专利(申请号为03150373.X)为组织工程自体符合皮肤及其制备方法，该发明是将来源于患者自体的表皮干细胞和真皮成纤维细胞在体外扩增和分化，再将表皮细胞种植于含有患者自体真皮成纤维的纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外结构组织工程自体复合皮肤。这种组织工程复合皮肤有来源于自体细胞，无排斥反应，且因支架的存在而具有一定的强度与韧性，但尚存在一些缺陷：一、角质细胞与成纤维细胞共同培养时有竞争关系，因而几种细胞在生物支架上共同生长时的生长状态可能存在一种细胞对另一种细胞的抑制，无法保证全部种类细胞的良好生长；二、纤维蛋白支架直接与移植面接触，相比自然生长的全层皮肤存在一定粘连性等接触问题；三、移植之后环境的变化能否让支架上的细胞很好存活并各种代谢活动正常仍不清楚。

而对于其他的异体皮肤组织工程产品来说，仍存在与自然皮肤的结构不同，异体来源的皮肤细胞的排斥、细胞在生物支架上的存活、生长状态和细胞基质的分泌会存在差异，生物支架与移植面的快速融合等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种体外培养获得组织工程表皮的方法及其应用，表皮细胞与黑色素细胞共培养，并可获得具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构的表皮膜片，具有面积大、无排异反应、结构与自然表皮极为相似、治疗效果好等特点。

本发明第一个方面是提供一种培养获得组织工程表皮的方法，包括：将表皮角质细胞与黑色素细胞共培养，获得组织工程表皮。

其中，所述共培养优选为无血清、无滋养层的共培养方法。

其中，所述表皮角质细胞与黑色素细胞优选为第一次传代细胞。

其中，表皮角质细胞与黑色素细胞共培养的培养基组分包括：DMEM和F12按照3:(0.5-2)体积比例的混合液，并且，所述混合培养基组分还含有KSR5-20wt％，优选为6-16wt％，更优选为8-15wt％，更优选为10-14wt％。

其中，DMEM和F12体积比例优选为3:(1-1.5)。

更优选地，所述混合培养基还可以含有如下任意一种或几种组分：

胰岛素2-8mg/L，优选为3-6mg/L，更优选为4-5mg/L；

转铁蛋白2-10mg/L，优选为3-8mg/L，更优选为5-6mg/L；

氢化可的松0.1-1mg/L，优选为0.2-0.8mg/L，更优选为0.4-0.6mg/L；

表皮生长因子2-15u/L，优选为5-12u/L，更优选为8-10u/L；

三碘甲状腺原氨酸1-2u/L，优选为1.2-1.8u/L，更优选为1.4-1.6u/L。

其中，表皮角质细胞与黑色素细胞数量比例优选为100:(0.001-80)，优选为100:(0.01-60)，优选为100:(0.1-50)，优选为100:(0.5-40)，优选为100:(1-30)，优选为100:(5-20)，优选为100:(10-15)。

其中，所述表皮角质细胞与黑色素细胞可以是源于同一生物体或不同生物体，也可以是源于同一生物体的不同部位或相同部位。

在本发明的一种优选实施例中，所述表皮角质细胞和黑色素细胞的获得方法优选为：将保留表皮层以及至少部分真皮层的活性皮肤样本破碎，经过胰酶消化液冷消化后，收集沉淀组织；

将收集的沉淀组织通过I型胶原酶进行热消化，收集表皮细胞作为原代细胞接种。

本发明上述内容中，所述皮肤样本可以是异体和/或自体皮肤样本，并优选为自体皮肤样本。

所述皮肤样本可以是源自胸部、腹部、背部、臀部、四肢等任意一种或几种部位的皮肤。

本发明上述内容中，所述活性皮肤样本中，真皮层占初始皮肤样本中真皮层的体积比，优选为15-50％，更优选为20-45％，更优选为25-40％，更优选为30-35％。

在本发明的一种更优选实施例中，所述培养方法包括：

原代细胞接种后进行传代，直至细胞汇合；

细胞汇合后在混合培养基中培养生成具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构并且黑色素细胞分布在基底层中的组织工程表皮皮片。

本发明上述内容中，所述胰酶消化液优选为包括trypsin/EDTA与DPBS的混合液物，其中trypsin/EDTA与DPBS体积比优选为1:(2-5)，更优选为1:(2.5-4.5)，更优选为1:(3-4)。

其中，所述胰酶消化液浓度优选为0.01-0.5wt％，更优选为0.03-0.25wt％，更优选为0.05-0.1wt％。

其中，trypsin/EDTA浓度优选为0.1-1wt％，更优选为0.2-0.6wt％，更优选为0.25-0.5wt％。

其中，所述胰酶消化液冷消化的条件优选为2-8℃，更优选为3-6℃，更优选为4-5℃。

其中，所述胰酶消化液冷消化的时间优选为8-24小时，更优选为10-20小时，更优选为12-18小时，更优选为14-16小时。

本发明上述内容中，所述I型胶原酶浓度优选为0.05-0.5wt％。

其中，所述I型胶原酶进行热消化的条件优选为36-37.5℃，优选为36.5-37℃。

发明上述内容中，所述传代方法优选为：在y27632存在下，36-37.5℃(优选为36.5-37℃)、CO₂(优选为2-8％体积比例，如5-6％)存在下培养，用含EDTA的缓冲液清洗表皮细胞，然后继续胰酶消化，添加酶抑制剂，收集细胞，继续培养至细胞汇合。

更优选地，接种后的原代细胞用Y-276322HCl处理，清洗后再进行胰酶消化，其中所述胰酶优选为含有Y-276322HCl，浓度优选为0.01-0.1wt％，更优选为0.02-0.08wt％，更优选为0.04-0.07wt％，更优选为0.05-0.06wt％。其中，所述清洗优选为使用EDTA/PBS缓冲液清洗，EDTA/PBS缓冲液浓度优选为0.001-0.005wt％，更优选为0.002-0.004wt％。

发明上述内容中，所述原代细胞接种所用培养基优选为角化细胞培养基，如KGM-Gold培养基。更优选为所述接种后3-6天时进行传代。

本发明上述内容中，所述组织工程表皮的培养方法还包括将生成的皮片从培养容器中分离的步骤。

其中，所述分离的步骤包括：用分散酶消化生成的表皮皮片，然后将油纱布覆盖在皮片上，使皮片依附油纱布，从而将皮片从培养容器中分离。

本发明上述内容中，所述组织工程表皮的培养方法还包括对所述表皮皮片的后处理的步骤。

其中，所述后处理的步骤包括：清洗表皮皮片后，用培养基润湿。其中所述培养基优选为PBS培养基。其中优选地，用PBS清洗所述表皮皮片。

其中，用培养基润湿后的可以冷冻储存、或不冷冻储存直接进行合格检查、或直接应用。

本发明上述内容中，所述组织工程表皮的培养方法还包括对所述表皮皮片进行合格检查的步骤。

其中，所述合格检查优选为包括如下检查项目中的任意一种或几种：多巴染色和苏木素染色，观察黑色素细胞在基底层中的分布；切片检查皮片的纵向结构。

本发明第二个方面是提供一种上述任意方法制备的组织工程表皮，按照顺序，所述组织工程表皮具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构，并且黑色素细胞分布在所述组织工程表皮的基底层中。

其中，所述黑色素细胞中全部或至少部分为树枝状结构，优选为至少60％为树枝状结构，更优选为至少80％为树枝状结构，更优选为至少95％为树枝状结构，更优选为至少99％为树枝状结构。

其中，所述黑色素细胞优选为均匀分布。

其中，所述组织工作表皮优选为至少包括4个细胞层结构，更优选为包括4-10个细胞层结构，更优选为4-8个细胞层结构。

本发明第三个方面是提供一种所述组织工程表皮的应用。

所述应用包括制备皮肤修复材料中的应用，如用于疤痕修复、妊娠纹的去除、皮肤损伤治疗、以及治疗皮肤疾病中的任意一种或几种的皮肤修复材料。

其中，所述皮肤疾病包括：色素变化及斑痣类、真菌感染类、病毒感染类皮肤疾病，诸如白癜风、雀斑、白化病、花斑癣、黄褐斑、紫癜、色素痣、太田痣、热激红斑、手癣、足癣、体癣、疱疹、疣等。

其中，皮肤损伤包括手术创面、晒伤、烧伤、冻伤、擦伤、割伤、溃疡、外伤导致的真皮萎缩中的任意一种或几种。所述手术创面如肿瘤、胎记等切除后的创面。所述溃疡可以包括代谢性疾病如糖尿病足溃疡、放疗和/或化疗后皮肤慢性溃疡、压力性溃疡、静脉溃疡等慢性溃疡。

其中，所述皮肤修复材料用于植入创面，替代或覆盖病损皮肤。

所述应用包括制备用于皮肤的制品致敏性和/或效果测试材料中的应用，如用于皮肤对化妆品敏感性的测试材料。

所述应用包括制备整形和/或美容外科手术材料中的应用。

本发明提供的组织工程表皮培养方法，是一种表皮细胞与黑色素细胞共培养的方法，并可获得具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构的表皮膜片。

在极大程度上与自体自然生长的表皮结构类似，与移植面直接接触的是具有乳头状突起的基底层，极大程度上促进了表皮膜片与移植面之间的融合和快速生长，在扩大表皮面积的同时保证皮片质量和移植效果，在医疗美容领域的应用上会有很大的发展。

附图说明

图1为本发明组织工程表皮苏木素染色与多巴染色检测结果；

图2为本发明组织工程表皮切边检测结果；

图3为采用本发明组织工程表皮对早期烧伤疤痕治疗前后对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明组织工程表皮培养方法和应用进行详细的介绍和说明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。

在实例1中，申请人选取3cm²的组织，培养获得5张面积约为40cm²的表皮膜片，成功地用成人胸部皮肤扩大培养出自体的表皮膜片。

经体外培养获得的大面积自体的具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层的表皮结构且黑色素细胞分布均匀的表皮片，可以移植应用于疤痕修复、妊娠纹的去除等，还可应用于皮肤对化妆品等的敏感测试和效果测试。在医疗领域可以用于烧伤、溃疡及其他外科伤口的治疗和白癜风这类色素问题带来的皮肤疾病。

在实例2中，申请人成功地用实施例1中成人腹部皮肤扩大培养出的自体的表皮膜片，临床应用于病人早期烧伤疤痕的整形修复。

实例1：用成人胸部皮肤成功培养表皮膜片。

(1)材料和方法

样本：医院手术废弃的成人正常胸部皮肤约3cm²

皮肤培养基：KGM-Gold培养基，DMEM/F12混合培养基

(2)细胞分离及皮片培养

a)皮肤样本在DMEM培养液中冷藏运输到实验室，测量面积；

b)用PBS清洗样本；碘酒、酒精消毒后再重复清洗样本，剪去2/3部分的真皮层后切碎；

c)0.05％胰酶(DPBS与0.25％的trypsin/EDTA按照4:1的比例配成)冷消化样本12-16小时；加胰酶抑制剂终止消化；

d)0.05％-0.5％浓度的I型胶原酶继续热消化2-6小时，过滤后离心后收集表皮细胞接种至培养皿中培养；

e)隔天更换一次KGM-Gold培养基；

f)3-6天时传代，添加y27632后37℃，5％CO₂下培养1小时，用0.02％的EDTA/PBS清洗表皮细胞，EDTA与钙、镁离子形成复合物，阻断细胞的粘附添加胰酶继续消化；离心收集细胞，将收集的细胞接种至新的培养皿中培养至细胞汇合；

g)细胞汇合后更换角质化细胞培养基KGM，角质化细胞培养基KGM培养液主要为DMEM和F12(Ham’snutrientmixture)混合液(比例为3:1)，含有10％的KSR(LifeTechnologiesCorporation)；此外还可以加入胰岛素5mg/l、转铁蛋白5mg/l、氢化可的松0.4mg/l、表皮生长因子10u/l、三碘甲状腺原氨酸(T3)1.4u/l；

h)细胞汇合4-8天后进行皮片剥离；用dispase分散酶消化表皮后覆盖油纱布使皮片依附纱布将皮片轻轻从培养皿剥离，得到5张40cm²的的组织工程表皮。

(3)对剥离下的表皮膜片做苏木素染色和多巴染色检查基底层黑色素细胞与角质细胞的分布；做切片检查反映皮片分层情况。

结果：表皮膜片细胞状态良好，苏木素染色与多巴染色结果显示黑色素细胞被染成黑色在基底层分布均匀，细胞呈树枝状，状态良好(如图1，箭头所指黑色区域)；切片结果显示皮片分层良好，明显具有角质层、颗粒层、有棘层、基底层(如图2)。

通过实施例1可以看出，本发明培养方法是一种成活率较高的一种表皮细胞传代培养的方法，可以由很小面积的自体样本获得大面积的表皮膜片，适用于治疗直接自体移植不到的一次性的大面积的病变部位的治疗。

实例2：用自体表皮膜片移植应用于修复烧伤疤痕。

皮片培养及质检：具体步骤参照实例1所述；

皮片移植：对患者的疤痕部位(如图3-1，色素减退性白斑)使用医用酒精消毒，用手术用水刀切除表皮及疤痕组织。将实施例1所得表皮膜片平铺在手术部位。覆盖消毒纱布并用绷带固定。

结果：移植3月后第一次随访观察移植部位疤痕修复情况，组织工程表皮与本身组织结合良好，由于部分部位手术时切割过深，导致增生性疤痕生成，较其他部位着色略深(如图3-2)，但随着时间的延长，逐渐恢复至与周边部位一致的颜色。

综上所述，本发明获得了包含有功能性的黑色素细胞的表皮，应用领域极广，可在白癜风等色素缺失的皮肤疾病上得到应用，并且对稳定期白癜风的临床治疗效果良好。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种培养获得组织工程表皮的方法，其特征在于，包括：

将表皮角质细胞与黑色素细胞共培养，获得组织工程表皮；

其中，表皮角质细胞与黑色素细胞共培养的培养基组分包括：DMEM和F12按照3:(0.5-2)体积比例的混合液，并且，所述混合培养基组分还含有KSR5-20wt％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合培养基还含有如下任意一种或几种组分：胰岛素2-8mg/L；转铁蛋白2-10mg/L；氢化可的松0.1-1mg/L；表皮生长因子2-15u/L；三碘甲状腺原氨酸1-2u/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，表皮角质细胞与黑色素细胞数量比例为100:(0.001-80)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表皮角质细胞和黑色素细胞的获得方法优选为：将保留表皮层以及至少部分真皮层的活性皮肤样本破碎，经过胰酶消化液冷消化后，收集沉淀组织；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述皮肤样本是异体和/或自体皮肤样本。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活性皮肤样本中，真皮层占初始皮肤样本中真皮层的体积比，为15-50％。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养方法包括：

原代细胞接种后进行传代，直至细胞汇合；

细胞汇合后在所述混合培养基中培养生成具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构并且黑色素细胞分布在基底层中的组织工程表皮皮片。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胰酶消化液冷消化的条件为2-8℃，冷消化的时间为8-24小时。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述I型胶原酶进行热消化的条件为36-37.5℃。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述传代方法为：在y27632存在下，36-37.5℃(优选为36.5-37℃)、CO₂存在下培养，用含EDTA的缓冲液清洗表皮细胞，然后继续胰酶消化，添加酶抑制剂，收集细胞，继续培养至细胞汇合。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，接种后的原代细胞用Y-276322HCl处理，使用EDTA/PBS缓冲液清洗，清洗后再进行胰酶消化，其中所述胰酶优选为含有Y-276322HCl。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养为无血清、无滋养层体系的培养方法。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织工程表皮的培养方法还包括将生成的皮片从培养容器中分离的步骤、和/或对所述表皮皮片的后处理的步骤；其中，所述合格检查优选为包括如下检查项目中的任意一种或几种：多巴染色和苏木素染色，观察黑色素细胞在基底层中的分布；切片检查皮片的纵向结构。

14.一种如权利要求1所述方法获得的组织工程表皮，其特征在于，按照顺序，所述组织工程表皮具有基底层、有棘层、颗粒层、角质层结构，并且黑色素细胞分布在所述组织工程表皮的基底层中。

15.根据权利要求14所述的组织工程表皮，其特征在于，所述组织工作表皮包括4-10个细胞层结构。

16.一种如权利要求1所述方法获得的组织工程表皮的应用，其特征在于，所述应用选自：

制备皮肤修复材料中的应用；

制备用于皮肤的制品致敏性和/或效果测试材料中的应用；

制备整形和/或美容外科手术材料中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述皮肤修复材料选自：用于疤痕修复、妊娠纹的去除、皮肤损伤治疗、以及治疗皮肤疾病中的任意一种或几种的皮肤修复材料。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述皮肤疾病包括：色素变化及斑痣类、真菌感染类、病毒感染类皮肤疾病；皮肤损伤包括手术创面、晒伤、烧伤、冻伤、擦伤、割伤、溃疡、以及外伤导致的真皮萎缩中的任意一种或几种。