CN104877953B - 促进黑色素细胞色素产生的皮肤制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种皮肤制剂，其包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有1～5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物。本发明还涉及包含该皮肤制剂或皮肤制剂的提取物的培养液以及该皮肤制剂的制备方法及其应用。

Description

促进黑色素细胞色素产生的皮肤制剂的制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种色素生产能力已经得到增强的含有黑色素细胞的皮肤制剂。

背景技术

决定皮肤颜色最重要的因子是一种被称为黑色素的色素性物质。黑色素的形成是由存在于表皮基底层的黑色素细胞产生的。如果这个黑色素的产生出现异常被抑制，或者黑色素细胞消失，就会形成一种后天性色素脱失症，俗称为白癜风。现阶段，针对白癜风的治疗方法包括甾族化合物治疗法以及光化学疗法。但是，这些治疗方法的预后不是很理想，都需要接受持续性的治疗。

除上述治疗方法外，也有从其他部位取皮或毛囊进行移植的治疗方法。但是，这种疗法会造成与治疗部位同等面积的皮肤缺损，因此当治疗部位面积相对大时就不能进行此类治疗了。另外，也有从自体采取黑色素细胞，经过体外培养后再注射移植的治疗方法。此疗法与自体取皮相比，可以进行相对大面积的治疗，但是在注射部位造成色素分布不均，大面积治疗时要达到色素的均匀分布是非常困难的。

另一方面，以创伤治愈以及烧伤治愈为目的的表皮培养方案也被提出。皮肤培养不仅可以实现大范围的治疗而且非常有效果。但是，目前的表皮培养都不含有黑色素细胞，就算有黑色素细胞也无法有效地使黑色素形态正常形成。虽然在细胞培养时，促进黑色素产生的方法有很多种，例如：用紫外线照射进行物理刺激，添加黑色素细胞活性因子等。但是，即使使用了这类的处理方法也无法有效且稳定地形成正常的色素形态。另外，当黑色素细胞和其他皮肤细胞共同培养的时候，如果进行这些处理，会影响到黑色素细胞以外细胞的成长，所以在运用上还是相当困难的。

针对上述问题，本发明提供了一种新的使培养物接近人体肤色，使色素形态正常形成，促进黑色素细胞能够很好地产生的方法以及由此方法得到的皮肤制剂。

发明内容

本发明的本发明者经过研究发现，通过对提取的黑色素细胞和表皮细胞进行共培养，发现了如何能够很好的促进黑色素细胞色素的产生的新方法。本发明方法制备的皮肤制剂具有促进黑色素细胞的色素产生的作用，因此能够很好的还原皮肤色素，因而适用于治疗白癜风以及进行美白药物的筛选等领域的研究。

在本发明的一方面，提供了一种皮肤制剂，其包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有1～5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物。

在本发明的一个实施方式中，所述皮肤制剂中表皮细胞的数量与黑色素细胞的数量之比为100:1-50。在一个优选的实施方式中，所述皮肤制剂中表皮细胞的数量与黑色素细胞的数量之比为100:3-10。

在本发明的另一方面，提供了一种促进黑色素细胞色素产生的培养液，所述培养液包含本发明的皮肤制剂，即包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有1～5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物。

在本发明的另一方面，提供了一种促进黑色素细胞色素产生的培养液，所述培养液包含本发明的皮肤制剂，即包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有1～5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物。

在本发明的另一方面，提供了一种皮肤制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.从皮肤组织中提取黑色素细胞和表皮细胞；

b.将步骤a)获得的黑色素细胞和表皮细胞共培养；

c.任选地去除成纤维细胞；

d.通过传代培养，使黑色素细胞均匀分布；

e.评价黑色素细胞的色素生产能力，选定接近皮肤颜色的皮肤制剂。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤d)的传代控制在3代以内。在本发明的一个实施方式中，所述步骤c)去除成纤维细胞的过程包括加入抑制成纤维细胞增殖的试剂，选自EDTA、霍乱毒素、异丙肾上腺素、IBMX。

在本发明的另一方面，提供了本发明的皮肤制剂在进行皮肤美容产品筛选中的应用。在一个实施方式中，所述皮肤美容产品包括：美白产品、白癜风治疗产品、过度晒伤治疗产品、烧伤治疗产品、大面积黑痣治疗产品、疤痕治疗产品、痤疮治疗产品和纹身治疗产品。

发明详述

本发明的皮肤制剂包含具有增强的色素产生能力的黑色素细胞。黑色素细胞是产生黑色素的色素细胞。黑色素细胞是形成黑色素的色素细胞。本发明对于黑色素细胞的采集没有部位的局限性，可以从表皮基底层或毛囊基底部充分获取。表皮角质细胞是构成表皮的上皮细胞，所以也可以从表皮基底部或毛囊基底部(Bulge位置)获取。

黑色素细胞是分裂次数有限的正常细胞。比如分裂50～80次后细胞寿命就结束了。本发明对于黑色素细胞的生物种类来源没有特别的规定，优选使用小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳类，或者是人、猴子等灵长类，最优选使用人来源的细胞。例如，黑色素细胞可以是已经建立的市售黑色素细胞，也可以是从患者自身提取的黑色素细胞。

本发明的皮肤制剂中黑色素细胞的色素生产的能力得到增强。促进黑色素细胞的色素产生作用分为两种。第一种：促进每个黑色素细胞的色素产生，提高黑色素细胞的黑色度。另一种：增加黑色素细胞的细胞数量。不论是那种作用，结果就是通过目测就能确认含有黑色素细胞细胞培养组合物的黑色的程度有显著的提高。本发明所述促进黑色素细胞的色素产生作用可能是上述中的某一种，也可能两个作用都包含。

本发明的皮肤制剂作为促进黑色素细胞的色素产生的条件有很多种，例如：黑色素细胞和表皮细胞共培养的方法，上述共培养组合物的培养悬液供给黑色素细胞培养物的方法，上述共培养提取物的培养悬液供给黑色素细胞培养物等，其中比较好的是黑色素细胞和表皮细胞共同培养。共培养的条件也没有特定的规定，比如本发明的黑色素细胞和表皮细胞混合培养的方法是比较好的条件之一。

本文所述的皮肤制剂指的是含有黑色素细胞的人工皮肤，而所谓的人工皮肤是指在培养容器内通过培养形成的整体片状的培养物，其中所谓整体就是通过显微镜观察，培养容器底部细胞的覆盖面积达到95～100％。所谓的片状培养物是指细胞有1～5层，以二维连接的展开培养物。

本发明的皮肤制剂通过以下过程得到：

(1)从皮肤组织提取黑色素细胞以及表皮细胞的过程

本发明对于黑色素细胞的采集没有部位的局限性，可以从表皮基底层或毛囊基底部充分获取。另外，表皮细胞可以从作为构成表皮的上皮细胞、表皮基底部、毛囊基底部等采取。

(2)含黑色素细胞的培养组合物的培养过程

所谓“含有黑色素细胞的培养组合物的培养过程”是指通过过程(1)所得到的黑色素细胞和表皮细胞的共培养过程。这里所指的培养组合物是指含有黑色素细胞和表皮细胞的细胞培养物。此类的培养组合物可以只由黑色素细胞和表皮细胞构成，也可以包含其他细胞。其他细胞可以是成纤维细胞等。通过黑色素细胞和表皮细胞共培养，可以观测对于黑色素细胞的影响。作为共培养的方法有，黑色素细胞和表皮细胞混合后接种到培养容器，但并不是唯一的方法。

(3)成纤维细胞的排除过程

所谓“成纤维细胞排除过程”是指消除对皮肤制剂形成有阻碍作用的成纤维细胞的过程。为了去除成纤维细胞，过程(1)中混入的比例要控制在1％以下。可以使用不利于成纤维细胞的培养液或抑制成纤维细胞增殖的培养液等。或者在成纤维细胞增殖后进行消除也是可以的。

(4)使黑色素细胞均匀分布的过程

过程(2)中因为共培养形成的皮状培养物中的黑色素细胞分布会集中在一个地方，所谓“使黑色素细胞均匀分布的过程”就是使其能够均匀的分布的过程。通过此操作能够使表皮细胞均匀化。

(5)黑色素细胞的色素产生能力评价过程

所谓“黑色素细胞的色素生产能力评价过程”是指，对过程(2)制作的含有黑色素细胞的培养组合物中的黑素细胞的色素形成状态评价的过程。黑色素细胞的色素形态的评价方法，可以通过目测观察黑色化状态，也可以使用光学显微镜对黑色化的黑色素细胞的细胞数进行计数，或对酪氨酸酶等和色素形成相关的酶活性，遗传因子发现量进行评价等方法。黑色素细胞的产生能力的评价在过程(2)之后进行，和表皮细胞共培养中对于黑色素细胞的影响是在充分时间培养之后进行评价的。培养的时间没有特别规定，一般为1～30天，理想状态为6～20天后进行黑色素细胞的色素生产能力进行评价。具体操作包括：如果是皮肤片消化悬浊液接种，在经过10～14天的培养后，培养物做DOPA染色，然后用光学显微镜观察黑色素细胞的细胞数，这只是一种方法，但不局限于这种方法。

本发明的皮肤制剂具体是指能够促进黑色素细胞和表皮细胞的共培养物中黑色素细胞的色素生产能力的试剂。虽然关于本发明的共培养是如何促进色素产生的机理还不是很清楚，但可以肯定的是，本发明的共培养中含有诱导作用的体液因素或者含有细胞黏附因子。不光是共培养组合物，还有共培养物和细胞培养基材的混合物，共培养组合物和胶原，层粘连蛋白等的细胞外基盘的混合物也是本发明的操作条件。另外，从共培养组合物的培养悬液以及共培养组合物中取得的提取液也是本发明的操作条件之一。

因为本发明的皮肤制剂能很好的促进黑色素细胞的色素产生能力，所以能很好的还原皮肤的原本状态。例如，本发明的黑色素细胞和表皮细胞培养后形成的培养组合物，能够通过移植到白癜风的部位，达到恢复到正常的颜色状态。

本发明的含黑色素细胞共培养组合物的制作方法没有特别的规定，通过以下的方法可以很好的制作完成。

从腰部，腹部，背部，臀部等，主要是从能被衣服所遮盖的部位采集表皮组织。采集的皮肤组织片在培养之前，先要用含有消化酶的培养液浸泡进行酶处理。作为比较合适的消化酶，有胰蛋白酶，胶原酶，中性蛋白酶等。作为溶解消化酶的培养液，原代培养时也可以使用无血清培养液。另外，例如Dulbecco’s MEM等也用的很好。

本发明的含黑色素细胞的人工皮肤，皮肤片的消化液通过培养液培养，培养至完成90～100％的状态。对于培养的容器没有特殊的规定，12孔的培样板，6孔的培养板，3.5cm的培养皿，6cm的培养皿，10cm培养皿，15cm培养皿等都可以使用。作为培养容器，需要是能够细胞贴壁的细胞培养用经过涂层处理的，或经过胶原蛋白，层粘连蛋白等涂层处理的容器都可以使用。

将含有黑色素细胞以及表皮细胞的细胞分散液接种于上述培养容器中进行培养。作为合适的培养液，Ca2+浓度要控制在0.1mM内，低葡萄糖(1000mg/L)的无血清培养液也可以使用，类似的培养液有：M254(商品名)；GIBCO公司。

类似这样的无血清培养液中也可以添加胰岛素，EGF，FGF，KGF，SCF，Bfgf，内皮素，aMSH等的荷尔蒙，成长因子。另外，一些在细胞培养时常用的培养液也可以使用，比如，除了以上的无血清培养液外，还有MCDB153，Medium199，DMEM(Dulbecco’s MEM)，RPMI1640，F-10，F-12，MMEM，限制的角化细胞培养基SFM(Defined keratinocyte SFM)；GIBCO，10744-019，角化细胞培养基SFM(Keratinocyte SFM)；GIBCO，17005-4＝042等。作为添加物，除了以上这些外，还有氢化可的松，转铁蛋白，孕甾酮，乙醇胺，血清素，肾上腺素等都是可以用的。

类似于这类的无血清培养液中也可以加入用于抑制成纤维细胞增殖的药剂，类如霍乱毒素，异丙肾上腺素，IBMX等。

为了能够适用于广泛的移植领域，从皮肤片取得的黑色素细胞，皮肤细胞通过传代，可以培养出更多的细胞。因为只是通过共培养形成的皮肤片状培养物中黑色素细胞会集中分布，表皮细胞的分布也会集中，所以传代可以解决这样的问题。但是由于过多的传代黑色素细胞和表皮细胞比例就会降低，所以最好传代控制在3代以内。关于细胞传代，使用普通的胰蛋白酶处理，accutase细胞消化液处理等方法就可以。

培养容器中的表皮细胞达到整体化后，将培养液换成分化培养用的培养液。然后就能培养出拥有复数细胞层的片状的近似皮肤的培养组合物。作为分化培养液，可以使用上述无血清培养液中添加了Ca2+浓度控制在0.2～2.2mM之间的氯化钙的培养液，也可以使用KGM培养液。在分化培养液中常规培养为3～14天，理想的时间为5～12天后，细胞会形成多层的皮状培养组合物。作为用于分化诱导用的无血清培养液的Ca2+浓度，一半在0.5～1.9mM之间，理想范围为0.8～1.6mM，如果能够达到1.0～1.4mM那就更好了。

作为分化用培养液，可以使用上述的无血清培养液，培养液中添加的葡萄糖的浓度在3000～5000mg/L，最理想的范围是4000～4500mg/L。

培养组合物根据以上方法，一般需要培养10～50天，最理想的天数是在12～35天。

这样的一个培养组合物，通过目测就能了解黑色的程度，具体细节上，就需要通过光学显微镜来观察了解，其中基础的黑色素细胞和角质细胞的数量比，表皮角质细胞100：黑色素细胞数量在1～50之间为基础，1～30为普通，2～20之间为理想，3～10之间为完美。数量比可以通过光学显微镜来观察测定，另外当培养组织物在消化酶处理的阶段，成型或半成型的时候也能计数测定。

本发明的培养组合物没有规定动物的种类，但是治疗白癜风时最好使用人由来物质。特别对于黑色素细胞和表皮角质细胞最好是同一个人由来比较好，因为同一个人提供自体的组织形成的培养组成物没有排异性。另外，因为是没有使用异类动物或同类的滋养层细胞做成的培养组合物，所以在移植的时候相应的风险就比较小。

本发明的细胞培养组合物中的黑色素细胞有多个的树状凸起，类似于人类身体环境。该形态能通过DOPA染色等对黑色素细胞细胞培养组合物进行染色，然后用光学显微镜观察。据数据显示，该形态的黑色素细胞的黑色素生产能力相当高。

黑色素细胞细胞培养组合物这项研究虽然适用于局限性白癜风的治疗，但也适用于烧伤，过度晒伤，痔，刺青等的各类色素异常的治疗。另外，不仅在医疗方面，在对黑色素进行药效评价的时候也适用美白效果等。比如：上述细胞培养组合物在培养的时候，在培养液中添加各种药物，从而对黑色素细胞的形成进行评价，从而达到筛选有抑制黑色素生长作用的药物等。

附图简述

图1是成型的培养组合物的苏木精染色图片。其中图1A为未传代培养组合物，图1B为传代培养组成物。

图2是培养组合物的DOPA染色图像，咖啡色点(深色点)为黑色素细胞，青紫色的点位(较浅色的点)是表皮细胞的核。图2A是未传代培养组合物，图2B为传代培养组合物。其中，采用的显微镜是OLYMPUS公司制造IX51,DP26显微摄影系统，焦距：x4倍。

图3是培养组合物的移植图片。图3A为移植前，图3B是移植4个月后。

具体实施方案

以下是对于此项发明的表皮组织培养物以及用途和制造方法的实例展示以及具体说明，但是本发明并不局限于此。

(1)从皮肤组织提取黑色素细胞以及表皮细胞的过程

对患者的腰部使用碘液脱脂棉进行杀菌，定位后采集组织片。采集的组织片在碘液中浸泡后，再用70％酒精浸泡灭菌，然后用PBS清洗。将组织片切碎，放入消化液中(消化液：TrypLE被PBS 5倍稀释后)4℃环境下放置16～24个小时。使用细胞过滤设备(cellstrainer)回收残渣。得到的残渣使用胶原蛋白酶(GIBCO公司)在37℃环境下处理3～4小时，离心后进行细胞回收。

(2)含黑色素细胞的培养组合物的制作

回收的细胞接种于培养容器内，使用无血清培养液(M254；GIBCO)放在37℃5％的二氧化碳培养箱中进行培养。培养7～10天，成型60～70％。

(3)成纤维细胞的排除过程

在培养含有黑色素细胞培养组合物的时候，当发现成纤维细胞混入过多的时候，使用含有0.01～0.02％EDTA的PBS在37℃环境下进行5～10分钟的处理后，使用吸量管将成纤维细胞清除。

(4)黑色素细胞均匀分布的培养组合物的制作

将含有黑色素细胞的培养组合物中的成纤维细胞清除后，使用含有0.05％胰蛋白酶的PBS，在37℃环境下培养3～5分钟，从容器中剥离后进行回收，回收的细胞进行接种，用无血清培养液培养5～10天，达到成型状态后，更换KGM培养液，继续培养7～10天，得到培养组合物(图1)。此外为了能够有对比参照物，也制作了没有传代的培养组合物。

(5)黑色素细胞的色素生产能力的评价过程

(5-1)培养组合物的外观评价

完成的培养组合物，通过目测对其外观的黑色度进行评价。另外使用光学显微镜测定黑色素细胞和表皮角质细胞的数量比。

(5-2)DOPA染色等

将黑色素培养组合物进行DOPA染色。使用光学显微镜，观察被DOPA染色的黑色素细胞的形状，黑色素细胞和表皮角质细胞的数量以及堆积的细胞数(图2)。

由这些实验结果可知，本发明的皮肤制剂能够很好的促进黑色素细胞的色素产生能力。

(6)向人体移植

对患者的白斑部位使用碘液脱脂棉进行灭菌后，打磨表皮。将培养组合物覆盖在打磨部位并摊开。覆盖上消毒的纱布，然后用纱布裹住。3-5月后，观测移植区域，和非白斑部进行对比，确认没有色素脱色现象，状态良好(图3)。因此，本发明的培养组合物能够很好的用于稳定性白癜风的治疗，并且能够达到大面积的色素均匀再生。

虽然本发明已经以较佳实施例揭示如上，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当视所附的权利要求所界定的为准。

Claims (6)

1.一种制备包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物的皮肤制剂的方法，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有1～5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物，所述方法包括：

a.从皮肤组织中提取黑色素细胞和表皮细胞；

b.将步骤a)获得的黑色素细胞和表皮细胞在无血清培养液中共培养；

c.任选地去除成纤维细胞；

d.通过传代培养，使黑色素细胞均匀分布；

e.评价黑色素细胞的色素生产能力，选定接近皮肤颜色的皮肤制剂；

其中所述步骤b)中所述包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物先在Ca²⁺浓度控制在0.1mM内、葡萄糖浓度为1000mg/L的无血清培养液中培养，然后，使用Ca²⁺浓度控制在0.5-1.9mM之间、葡萄糖浓度为3000-5000mg/L的无血清培养基作为分化培养液进行培养，培养为3-14后，形成多层的皮状展开培养物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮肤制剂中表皮细胞的数量与黑色素细胞的数量之比为100:1-50。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮肤制剂中表皮细胞的数量与黑色素细胞的数量之比为100:3-10。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)的传代控制在3代以内。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)去除成纤维细胞的过程包括加入抑制成纤维细胞增殖的试剂，选自EDTA、霍乱毒素、异丙肾上腺素、IBMX。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抑制成纤维细胞增殖的试剂是0.01-0.02％EDTA的PBS。