CN107326004A - 构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供涉及构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，涉及组织工程技术领域，通过聚集的不正常生发的黑素模型组织切片发现，主要是因为黑素生发不均匀，局部角质形成细胞生发过量导致的，本发明培养基具有促进黑素细胞均匀生发抑制角质形成细胞过量生发的特点，霍乱毒素和TPA的添加促进黑素细胞贴壁和增殖。该构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：角质无血清培养基K‑SFM 500ml，胰岛素2～30μg，氢化可的松10～800μg，牛脑垂体提取物10～200mg，上表皮生长因子20～2000μg，碱性成纤维生长因子1～1500μg，角质细胞生长因子5～80μg，12‑O‑十四烷酰佛波醇‑13‑醋酸酯TPA 20～200ng，CaCl2 10～200mg，霍乱毒素20～200nM。

Description

构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基。
背景技术
人类皮肤颜色的形成主要是黑素细胞产生并分泌的黑素小体到达角质形成细胞，并在角质形成细胞中重新分布。建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养模型可以为研究皮肤色素发生发展机制提供研究平台。生理情况下，黑素细胞可以通过树突与周围角质形成细胞发生接触和联系，角质形成细胞通过直接的细胞间连接控制黑素细胞的生长、形态、树突形成和抗原表达。
黑素细胞与角质形成细胞直接接触共培养分为单层细胞共培养和重建三位表皮结构的共培养，前者比较简便，能为研究黑素细胞和角质形成细胞提供较理想的体外模型，因而被大多数学者所采用，但这种模型并不能形成类似于皮肤的细胞复层化结构，与皮肤正常生理结构存在一定的差距。后者能够准确的模拟表皮黑素单元，为体外研究黑素细胞与角质形成细胞相互作用，色素的转移与分布提供了良好的模型基础。
目前含黑素重组人工皮肤存在的问题是黑素生发不均匀，导致黑素模型表面有点状黑素聚集或半月形黑素聚集，与正常人皮肤状态不一致，形成类似于斑状皮肤，这对于黑素模型的美白功效评价形成阻力。
CN201019018002.2含色素的人工皮肤检测模型及其制备方法中使用的黑素细胞和角质形成细胞共培养的培养基中添加了具有还原性的维生素C，对黑素的生发有抑制作用，不利于后期美白功效评价，且其培养的含色素人工皮肤模型存活时间较短，只有6到11天，不利于长效美白产品的功效评价。
发明内容
本发明提供了构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，通过聚集的不正常生发的黑素模型组织切片发现，主要是因为黑素生发不均匀，局部角质形成细胞生发过量导致的，本专利培养基具有促进黑素细胞均匀生发抑制角质形成细胞过量生发的特点，霍乱毒素和TPA的添加促进黑素细胞贴壁和增殖并且抑制角质形成细胞贴壁和增殖。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：
角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 2～30μg，氢化可的松 10～800μg，牛脑垂体提取物 10～200mg，上表皮生长因子 20～2000μg，碱性成纤维生长因子 1～1500μg，角质细胞生长因子 5～80μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 20～200ng，CaCl2 10～200mg，霍乱毒素 20～200nM。
进一步地，角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 3～10μg，氢化可的松 100～300μg，牛脑垂体提取物 20～80mg，上表皮生长因子 200～600μg，碱性成纤维生长因子 5～17μg，角质细胞生长因子 6～20μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 30～100ng，CaCl2 20～100mg，霍乱毒素 20～50nM。
进一步地，角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 5μg，氢化可的松 250μg，牛脑垂体提取物 35mg，上表皮生长因子 500μg，碱性成纤维生长因子 1.25μg，角质细胞生长因子7μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 50ng，CaCl2 在气液面培养的第一天添加27.5mg，气液面培养的第二天添加55mg，气液面培养的第三天及以后添加82.5m，霍乱毒素25nM。
由于该培养基不含血清，排除血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高某些药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，为体外美白测试准确性提供基础。该培养基不含维生素C，对于后期在黑素模型上进行美白评价提高准确性具有重要意义，该培养基可使2种细胞均迅速增殖，黑素细胞树突多为3～5个，黑色素细胞在皮肤基底层内散在分布，细胞突起伸入到角质形成细胞之间，银染染色显示黑色素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑色素细胞增殖状态良好，该培养基可保持2种细胞构建形成的重组皮肤模型较长时间的存活率，可使重组皮肤模型存活时间达到13-18天，有利于较长时间的美白功效评价。
附图说明
图1为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用苏木精-伊红染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的结构分层；
图2为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用苏木精-伊红染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的分化状态；
图3为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用银染染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的黑素分布状态；
图4为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用银染染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的黑素分布状态；
图5为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，使用比色卡进行表观拍照的拍照图；
图6为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，使用比色卡进行表观拍照的拍照图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
实施例1
构建中所用细胞的获取构建中所用细胞的获取
1.原代黑色素细胞的获取及传代培养：黑色素细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见刘源的《构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究》；
2.角质形成细胞的获取及传代培养：角质形成细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见马英智的《人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定》；
角质形成细胞与黑素细胞共培养的液下培养基使用角质无血清培养基K-SFM；
角质形成细胞与黑素细胞共培养的气液面培养基的配制
a.气液面第一天培养基的配制：使用角质无血清培养基K-SFM 500mL为基础液，再加入胰岛素5μg，氢化可的松添加250μg，牛脑垂体提取物添加35mg，上表皮生长因子500μg，碱性成纤维生长因子添加1.25μg，角质细胞生长因子7μg，TPA40ng，霍乱毒素添加25nM，CaCl2添加27.5mg。对照组气液第一天培养基组分为除不含TPA和霍乱毒素外其他组分；
b.气液面第二天培养基的配制：使用角质无血清培养基K-SFM 500mL为基础液，再加入胰岛素5μg，氢化可的松添加250μg，牛脑垂体提取物添加35mg，上表皮生长因子500μg，碱性成纤维生长因子添加1.25μg，角质细胞生长因子7μg，TPA40ng，霍乱毒素添加25nM，CaCl2添加55mg。对照组气液第二天培养基组分为除不含TPA和霍乱毒素外其他组分；
c.气液面第三天及以后培养基的配制：使用角质无血清培养基K-SFM 500mL为基础液，再加入胰岛素5μg，氢化可的松添加250μg，牛脑垂体提取物添加35mg，上表皮生长因子500μg，碱性成纤维生长因子添加1.25μg，角质细胞生长因子7μg，TPA40ng，霍乱毒素添加25nM，CaCl2添加82.5mg。对照组气液第三天培养基组分为除不含TPA和霍乱毒素外其他组分；
将体外培养的角质形成细胞和黑素细胞以液下培养的培养基为溶液配置成细胞悬液，按黑色素细胞与角质形成细胞1：5～10的比例混合，将混合的细胞悬液按1×105个/cm2的密度接种于生物重组合材料支撑膜表面，生物重组材料支撑膜的制备参照专利CN201019018002.2完成，加入角质形成细胞与黑素细胞共培养的液下培养基使液面淹没支撑膜表面，培养2天，每天换液，形成皮肤雏形；
将皮肤雏形内的培养液进行换液处理，加入培养液a进行气液面培养，培养一天后更换为培养液b进行气液面培养，培养一天后更换为培养液c进行气液面培养，对照组使用对照组培养液培养，培养10天，培养期间每天换液，最后一天收模型完成含色素的人工皮肤检测模型的制备。
对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用苏木精-伊红染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的结构分层以及分化状态，实验结果见图1和图2。由图1可见，体外重组人体皮肤表皮模型的结构完整，表皮各层分化明显，具有显著的基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层的区分，角质细胞层分化完全，细胞排列紧密，成紧凑的编花篮状交叉分布，与天然皮肤结构类似；图2对照组也有类似的表皮分化状态。
对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用银染染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的黑素分布状态，实验结果见图3和图4。由图3可见，黑素细胞均匀紧密的排布在基底层，黑素小体在整个切面均匀分布，并在角质层分布较多；图4显示对照组银染切片基底层黑素细胞分布不均，黑素小体在角质形成层有聚集现象。
对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，使用比色卡进行表观拍照，拍照结果见图5和图6，由图5可见，黑素模型表观完整，表面颜色均匀，肉眼观察模型表面无明显的黑色素细胞聚集；图6对照组表面颜色分布不均，有黑素聚集斑点现象。
综上所制备的含色素的人工皮肤表皮黑色素检测模型，培养15天后观察表皮HE切片结果显示表皮层分层结构层次清晰，银染染色显示基底层黑素细胞与支撑材料膜结合紧密，黑色素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑色素细胞增殖状态良好，皮肤模型表面颜色黑褐色，模型存活时间长达15天，体外存活时间较长，可用于化妆品美白功效检测。
本发明实施例提供一种构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 2～30μg，氢化可的松 10～800μg，牛脑垂体提取物 10～200mg，上表皮生长因子 20～2000μg，碱性成纤维生长因子 1～1500μg，角质细胞生长因子 5～80μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 20～200ng，CaCl2 10～200mg，霍乱毒素 20～200nM。基于上述实施例的描述，通过聚集的不正常生发的黑素模型组织切片发现，主要是因为黑素生发不均匀，局部角质形成细胞生发过量导致的，本专利培养基具有促进黑素细胞均匀生发抑制角质形成细胞过量生发的特点，霍乱毒素和TPA的添加促进黑素细胞贴壁和增殖并且抑制角质形成细胞贴壁和增殖。并且由于该培养基不含血清，排除血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高某些药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，为体外美白测试准确性提供基础。该培养基不含维生素C，对于后期在黑素模型上进行美白评价提高准确性具有重要意义，该培养基可使2种细胞均迅速增殖，黑素细胞树突多为3～5个，黑色素细胞在皮肤基底层内散在分布，细胞突起伸入到角质形成细胞之间，银染染色显示黑色素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑色素细胞增殖状态良好。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (3)

1.一种构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，其特征在于，所述构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：
角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 2～30μg，氢化可的松 10～800μg，牛脑垂体提取物 10～200mg，上表皮生长因子 20～2000μg，碱性成纤维生长因子 1～1500μg，角质细胞生长因子 5～80μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 20～200ng，CaCl2 10～200mg，霍乱毒素 20～200nM。
2.根据权利要求1所述的构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，其特征在于，所述构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：
角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 3～10μg，氢化可的松 100～300μg，牛脑垂体提取物 20～80mg，上表皮生长因子 200～600μg，碱性成纤维生长因子 5～17μg，角质细胞生长因子 6～20μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 30～100ng，CaCl2 20～100mg，霍乱毒素 20～50nM。
3.根据权利要求1或2所述的构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，其特征在于，所述构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：
角质无血清培养基K-SFM500ml，胰岛素 5μg，氢化可的松 250μg，牛脑垂体提取物35mg，上表皮生长因子 500μg，碱性成纤维生长因子 1.25μg，角质细胞生长因子7μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 50ng，CaCl2 在气液面培养的第一天添加27.5mg，气液面培养的第二天添加55mg，气液面培养的第三天及以后添加82.5mg，霍乱毒素 25nM。
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