CN107217039B - 肿瘤组织3d培养方法及培养液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于多种肿瘤组织的肿瘤组织3D培养方法，包括步骤为：1）向孔板中滴加水凝胶，将剪切好的肿瘤组织块移至所述水凝胶中，滴加培养液，CO2培养箱内静置使所述水凝胶凝固；2）向孔板中加入培养液进行培养，再取出培养后的所述肿瘤组织块并固定；所述培养液包括的组分有Advanced DMEM/F12培养液、1×GlutaMAX、表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF10、N‑乙酰‑L‑半胱氨酸NAC、前列腺素E2 PGE2、Nicotinamide和50×B27。此外本发明还公开了一种肿瘤组织3D培养液。本发明方法适用于多种肿瘤组织，能更快、更准确地评价抗肿瘤药物的药效，弥补细胞2D培养和动物实验评价方法的不足，为临床药物研究和新药研发提供了更加便捷经济的模型方法。

Description

肿瘤组织3D培养方法及培养液
技术领域
本发明涉及生物学领域，特别是涉及一种肿瘤组织3D培养方法；此外，本发明还涉及一种肿瘤组织3D培养液。
背景技术
世界癌症报告估计，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。由于人口老龄化等原因，当前我国癌症发病率、死亡率呈持续增长趋势。目前在癌症的治疗当中，药物治疗占据了60%，仍是肿瘤的主要治疗方案。然而，在现有的标准化药物治疗中，70%的病人均为无效治疗，并且在癌症的治疗过程中，还存在着严重的过度化疗现象，这种过度或不合理的治疗方案，至少促使了15%的癌症患者加速死亡。因此，精准化医疗逐渐成为了未来肿瘤医学研究与应用的趋势。
由于复杂的肿瘤异质性及肿瘤细胞和微环境的相互作用，肿瘤患者对于目前常规化疗药物的敏感性存在着极大差异，而目前辅助精确化诊疗实施的主要方法是基因测序和生物分子的标记，缺乏针对于传统化疗药物的有效筛查方法。
虽然临床上已开展了个体化药物评价实验，但所采用的方法依然是传统的2D细胞模型和动物模型实验。目前使用的动物评价体系，大多都是人肿瘤组织在裸鼠皮下成瘤体系（PDX模型），该模型成本高，成瘤时间长，并不适用于临床治疗方案的筛选，另外由于人鼠之间较大的种属差异，有时动物实验结果并不能准确反映药物在人体内的代谢情况和药效作用。与体内肿瘤相比，而常用的肿瘤细胞系模型与体内肿瘤相比，缺乏肿瘤组织的基因突变现象，肿瘤细胞系的2D培养也不具备肿瘤生长时所处的微环境条件，缺少体内某些特殊因子的刺激和蛋白调控作用，无法模拟体内肿瘤生长的真实环境，而采用原代肿瘤细胞，一是原代细胞分离过程繁琐耗时，而是由于缺乏相关的基质成分、细胞因子、免疫细胞，仍旧无法准确反应人体内，肿瘤对化疗药物的敏感性和耐受性。目前存在的一些多细胞共培养体系，仍旧缺乏复杂的脉管系统，而体内这些脉管系统能够通过简单扩散为组织提供氧、营养物质并清除废物，由于这一缺陷，使其在研究抗肿瘤药物药效学研究中仍具有一定不足。
体外组织3D培养模型，直接选取病人癌及癌旁组织，放于特定载体上进行短时间培养，最大程度上维持了肿瘤在体内的生长环境，保存肿瘤异质性，具备患者个体差异性，弥补了动物模型耗时长、成本高，细胞模型准确性低的缺陷，是一种较为理想的药效评价模型。如今，组织培养条件的选择大都借鉴于3D细胞培养或类器官培养的培养条件，尤其在培养载体方面，所采用的大多都是软琼脂、Matrigel 胶和水凝胶等常用的细胞团培养载体。Matrigel 胶其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，室温条件下，聚合形成有生物学活性的三维基质， 能够模拟体内细胞基底膜的功能、结构和生物学特性。水凝胶是一种人工合成的多肽类生物纳米材料，无需通过肿瘤分离，能有效避免因动物异源蛋白和病原体污染造成的细胞生长抑制等其他不利影响，可用于多种类型细胞的培养，这两种都是目前较为常用的细胞培养载体。使用时，用培养基或蔗糖溶液对Matrigel 胶或水凝胶进行一定比例的稀释，随后将重悬好的细胞悬液与胶快速混合，铺板接种。而与细胞培养操作不同，组织块直接培养，在培养过程中，组织块容易与载体分离，从而失去载体支撑，贴壁生长。另外，细胞3D培养时，细胞种类单一，即便是多细胞共培养体系，其中包含的细胞类型也十分明确，而组织3D培养所采用的组织块中不仅包含肿瘤细胞、淋巴细胞等多种细胞类型和基质成分，还有部分脉管系统，因此在培养液成分的筛选上，比细胞培养更加复杂。
中国专利申请CN201510755769.9，发明名称“卵巢癌癌组织3D培养方法及其在药效评价中的应用”，公开了一种卵巢癌癌组织3D培养方法，其采用传统常用的Matrigel 胶，该载体存在组织固定性不好，组织样本易漂浮，Matrigel 胶本身容易凝结，需严格控制操作温度等缺点；其采用的两种培养液，添加的因子成分单一，不适用于多种肿瘤组织的培养和药效评价；其采用3个步骤，其中Matrigel 胶凝固有两个步骤，流程步骤较繁琐。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种肿瘤组织3D 培养方法，解决了目前常规的抗肿瘤药物的评价方法准确性低，特异性差、成本高，周期长、存在种属差异等问题，还能解决采用常用的Matrigel 胶，存在组织固定性不好，组织样本易漂浮的问题，本发明采用的培养载体为水凝胶，该载体样本固定性良好，还能简化步骤，操作简便，拓宽应用范围，能广泛适用于多种肿瘤组织的培养和药效评价。此外，本发明还提供一种肿瘤组织3D培养液。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面提供一种肿瘤组织3D培养方法，包括步骤为：
（1）向孔板中滴加水凝胶，将剪切好的肿瘤组织块移至所述水凝胶中，滴加培养液，CO2培养箱内静置使所述水凝胶凝固；
（2）向步骤（1）的孔板中加入培养液进行培养，再取出培养后的所述肿瘤组织块并固定；所述培养液包括的组分有Advanced DMEM/F12培养液、1×GlutaMAX 、表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF10、N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、前列腺素E2PGE2、Nicotinamide 和50×B27。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）和步骤（2）中所述水凝胶是用20%无菌蔗糖溶液稀释的，所述20%无菌蔗糖溶液与所述水凝胶的体积比为1:1-1:3。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）和步骤（2）中所述的孔板中，事先滴加了5-10μL的磷酸盐缓冲液，放入了与孔板大小一致的圆形盖玻片，所述稀释后的水凝胶滴加在该盖玻片上。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中所述每次滴加的水凝胶的量为20-100μL；所述步骤（1）中滴加培养液的量为50-200μL；所述步骤（2）中加入培养液的量为300-450μL。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中所述肿瘤组织块的大小为0.5-1 mm3，所述肿瘤组织块先用含1%双抗和庆大霉素的缓冲液洗涤后再浸于生理盐水中，所述肿瘤组织块的制作过程在冰上进行。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述培养液按如下方法制得：将所述Advanced DMEM/F12培养液、所述1×GlutaMAX 、所述50×B27按体积比为40:5:5-50：1:1进行混合，形成混合液，再在混合液中依次加入5-10μL的所述表皮细胞生长因子EGF、1-5μL的所述成纤维细胞生长因子FGF 、100-200μL的所述N-乙酰-L-半胱氨酸NAC 、3-8μL的所述前列腺素PGE2混合得到所述培养液。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中分别将培养时间为7d、10d和14d的肿瘤组织块从所述培养液里取出，固定于质量百分比为4% 的多聚甲醛固定液中。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中还包括对固定的所述肿瘤组织块进行石蜡包埋、切片、 染色，观察组织结构和细胞形态的变化。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中还包括向所述培养液中加入化疗药物，继续培养3d、6d，然后将所述肿瘤组织块从所述培养液里取出，固定于质量百分比为4% 的多聚甲醛固定液中，再对固定的所述肿瘤组织块进行石蜡包埋、切片、染色，观察肿瘤组织组织结构和细胞形态的变化，统计增殖细胞数，计算细胞增值率，分析细胞增殖比率作为抗肿瘤药物效价评价方法和指标的可行性。
作为本发明优选的技术方案，所述染色为HE 染色或Ki67 免疫组化染色。
作为本发明优选的技术方案，所述肿瘤组织包括肠癌肿瘤组织、胃癌肿瘤组织和食管癌肿瘤组织。
在本发明的另一方面，提供一种用于肿瘤组织3D培养的培养液，所述培养液包括的组分有 AdvancedDMEM/F12培养液、1×GlutaMAX 、表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF10、N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、前列腺素E2 PGE2、Nicotinamide 和50×B27。
在本发明的另一方面，提供所述的用于肿瘤组织3D 培养的培养液的制备方法，包括如下步骤：将所述Advanced DMEM/F12培养液、所述1×GlutaMAX 、所述50×B27按体积比为40:5:5-50：1:1进行混合,形成混合液，再在混合液中依次加入5-10μL的所述表皮细胞生长因子EGF、1-5μL的所述成纤维细胞生长因子FGF 、100-200μL的所述N-乙酰-L-半胱氨酸NAC 、3-8μL的所述前列腺素PGE2混合得到所述培养液。
本发明的有益效果是：本发明所建立的人肿瘤组织的3D 培养方法，以水凝胶为载体，与Matrigel 胶相比，其成本更低，且具有更好的组织固定性，操作更为简便。改进后的培养液适合肠癌、胃癌等多种肿瘤组织生长，实验验证其大大增强了肿瘤组织培养的成活率，达到了预料不到的培养效果。采用多种检测方法对组织生长情况和药物药效进行评估，结果更为可靠，能更快、更精准地评价常规抗肿瘤药物的药效，弥补2D 细胞培养和动物实验评价技术准确性差、成本高、耗时长等缺点，有望促进我国创新型抗癌药物的研发和精确化治疗的进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明实施例一中肠癌组织以Matrigel 胶培养7d、10d、14d时的组织外观示意图，放大倍数为40x；其中，图1A代表培养7d时，图1B代表培养10d时，图1C代表培养14d时；
图2是本发明实施例一中肠癌组织以水凝胶培养7d、10d、14d时的组织外观示意图照片，放大倍数为40x；其中，图2A代表培养7d时，图2B代表培养10d时，图2C代表培养14d时；
图3是本发明实施例一中肠癌组织以Vitro-Gel 3D-RGD胶培养7d、10d、14d时的组织外观示意图，放大倍数为40x；其中，图3A代表培养7d时，图3B代表培养10d时，图3C代表培养14d时；
图4是本发明实施例一中肠癌组织分别以Matrigel 胶（A）、水凝胶（B）和Vitro-Gel 3D-RGD胶（C）为载体培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400× ；其中，图4A代表Matrigel 胶，图4B代表水凝胶，图4C代表Vitro-Gel 3D-RGD胶；
图5是本发明中肠癌组织分别以Matrigel 胶（A）、水凝胶（B）和Vitro-Gel 3D-RGD胶（C）为载体培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是Ki67 染色结果，放大倍数为400×；其中图5A代表Matrigel 胶，图5B代表水凝胶，图5C代表Vitro-Gel3D-RGD胶；
图6是本发明实施例二中肠癌、胃癌和食管癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、14d时的组织外观示意图，放大倍数为40x；图6A-图6C代表肠癌组织在培养液一的条件下培养0d、7d、14d时；图6D-图6F代表肠癌组织在培养液二的条件下培养0d、7d、14d时；图6G-图6I代表胃癌组织在培养液一的条件下培养0d、7d、14d时；图6J-图6L代表胃癌组织在培养液二的条件下培养0d、7d、14d时；图6M-图6O代表食管癌组织在培养液一的条件下培养0d、7d、14d时，图6P-图6R代表食管癌组织在培养液二的条件下培养0d、7d、14d时；
图7是本发明实施例二中肠癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×，图7A代表了肠癌组织在培养液一条件下培养7d、10d、14d时，图7B代表了肠癌组织在培养液二条件下培养7d、10d、14d时；
图8是本发明实施例二中胃癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×，图8A代表了胃癌组织在培养液一条件下培养7d、10d、14d时，图8B代表了胃癌组织在培养液二条件下培养7d、10d、14d时；
图9是本发明实施例二中食管癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是HE染色结果，放大倍数为400×，图9A代表了食管癌组织在培养液一条件下培养7d、10d、14d时，图9B代表了食管癌组织在培养液二条件下培养7d、10d、14d时；
图10是本发明实施例二中肠癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是Ki67染色结果，放大倍数为400× ；图10A代表了肠癌组织在培养液一条件下培养7d、10d、14d时，图10B代表了肠癌组织在培养液二条件下培养7d、10d、14d时；
图11是本发明实施例二中胃癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是Ki67染色结果，放大倍数为400× ；图11A代表了胃癌组织在培养液一条件下培养7d、10d、14d时，图11B代表了胃癌组织在培养液二条件下培养7d、10d、14d时；
图12是本发明实施例二中食管癌组织分别在培养液一和培养液二的条件下培养7d、10d、14d时组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是Ki67染色结果，放大倍数为400×，图12A代表了食管癌组织在培养液一条件下培养7d、10d、14d时，图12B代表了食管癌组织在培养液二条件下培养7d、10d、14d时；
图13是本发明实施例三中肠癌组织在培养条件下加入不同化疗药物后的组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是HE结果，放大倍数为400×，图13A为control组，图13B为草酸铂组，图13C为顺铂组，图13D为草酸铂+5-FU组；
图14是本发明实施例三中肠癌组织在培养条件下加入不同化疗药物后的组织结构和细胞形状的变化示意图，图中所示是Ki67结果，放大倍数为400×；图14A为control组，图14B为草酸铂组，图14C为顺铂组，图14D为草酸铂+5-FU组；
图15是本发明实施例三中肠癌组织在培养条件下加入不同化疗药物后根据Ki-67染色结果对每组增殖细胞的计数和统计结果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
提供一种肠癌癌组织3D 培养方法，包括步骤为：
（1）组织培养板的准备
取24孔板，滴加5-10μL的磷酸盐缓冲液，将高温灭菌后的圆形盖玻片放于孔板中，轻拍使其与底部贴合，置于一旁备用；
（2）肿瘤组织块的制作
取肠癌肿瘤组织，用含1%双抗和庆大霉素的PBS清洗，采用眼科手术器械将其剪切成0.5-1 mm3的组织块，用生理盐水清洗，整个操作在碎冰上进行。
（3）肿瘤组织块培养
以下是筛选胶的对比实验，针对细胞培养常用的三种胶Matrigel 胶、水凝胶、vitro-Gel 3D-RGD进行对比实验：
3.1 Matrigel 胶
在玻片上滴加30-100μL未经稀释的Matrigel 胶，将肠癌肿瘤组织块小心移至Matrigel 胶中（整个 操作4℃冰盒上进行），室温或CO2培养箱中放置30-50 min。取出孔板，每孔小心加入0.5-1ml培养液，进行培养。培养过程中每天用倒置显微镜记录组织生长情况。具体请参阅图1。
3.2 水凝胶
在玻片上滴加20-100μL水凝胶（与20%无菌蔗糖溶液1:1-1:5稀释），将肠癌肿瘤组织块小心移至水凝胶中，随后加入50-200μL培养液， CO2培养箱中放置10-30min 。取出孔板，每孔补加300-450μL培养液，进行培养。培养过程中每天用倒置显微镜记录组织生长情况。具体请参阅图2。
3.3 vitro-Gel 3D-RGD
在玻片上滴加30-100μL 稀释后的vitro-Gel 3D-RGD （与DMEM 的稀释比例为1:2-1:4），将肠癌肿瘤组织块小心移至vitro-Gel 3D-RGD 中，CO2培养箱中放置30-50 min。取出孔板，每孔小心加入0.5-1ml培养液，进行培养。培养过程中每天用倒置显微镜记录组织生长情况。具体请参阅图3。从图1、图2和图3中可以看出，与另外两组相比，以水凝胶为载体培养14天的组织并未出现漂浮、移动现象。在筛选胶的过程中，出乎意料地发现采用水凝胶为载体培养14天的组织并未出现漂浮、移动现象，克服了采用Matrigel 胶存在组织固定性不好，组织样本易漂浮，Matrigel 胶本身容易凝结，需严格控制操作温度等缺点。
上述所用培养液一成分如下表1所示，表1中是100ml培养液中所含的各种成分的量。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（4）肿瘤组织块检测
分别于组织培养7d、10d、14d时，小心取出圆形玻片，将组织块完整转移到质量百分比为4% 的多聚甲醛固定液中固定至少72 h。对固定的肿瘤组织块进行常规的石蜡包埋、切片、HE 染色和Ki67染色，观察组织形态和生长情况。
镜下观察上述培养条件下肿瘤组织的组织结构和细胞形态的变化，具体请参阅图4、图5。图4为肠癌组织以在上述培养条件下分别以Matrigel 胶（图4A）、水凝胶(图4B)和vitro-Gel 3D-RGD 胶（图4C）为载体培养7天、10 天、14 天时的组织结构和细胞形状，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×。图5 为肠癌组织在上述培养条件下分别以Matrigel 胶（图5A）、水凝胶(图5B)和vitro-Gel 3D-RGD 胶（图5C）为载体培养7 天、10天、14 天时的组织结构和细胞形状，图中所示是Ki67染色结果，放大倍数为400×。
实施例二
提供一种多种肿瘤组织3D培养方法，包括步骤为：
（1）组织培养板的准备
取24孔板，滴加5-10μL的磷酸盐缓冲液，将高温灭菌后的圆形盖玻片放于孔板中，轻拍使其与底部贴合，置于一旁备用；
（2）肿瘤组织块的制作
取肠癌、胃癌和食管癌肿瘤组织，用含1%双抗和庆大霉素的PBS清洗，，采用眼科手术器械将其剪切成0.5-1 mm3的组织块，用生理盐水清洗，整个操作在碎冰上进行。
（3）肿瘤组织块培养
在玻片上滴加20-100μL水凝胶（与20%无菌蔗糖溶液1:1-1:5稀释），分别将肠癌、胃癌和食管癌肿瘤组织块小心移至水凝胶中，随后加入50-200μL培养液一（其组分见实施例一中的表1，为中国专利申请CN201510755769.9采用的培养液）或培养液二（其组分见下表2，为本发明培养液）， CO2培养箱中放置10-30min 。取出孔板，每孔补加300-450μL培养液一或培养液二，进行培养。培养过程中每天用倒置显微镜记录组织生长情况。具体请参阅图6。
所述培养液二成分如下表2所示，表2中所示是50ml培养液中各成分的量。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（4）肿瘤组织块检测
分别于组织培养7d、10d、14d时，小心取出圆形玻片，将组织块完整转移到质量百分比为4% 的多聚甲醛固定液中固定至少72 h。
对固定的肿瘤组织块进行常规的石蜡包埋、切片、HE 染色和Ki67染色，观察组织形态和生长情况。镜下观察上述培养条件下肿瘤组织的组织结构和细胞形态的变化，具体请参阅图7至图12。图7A为肠癌组织在培养液一的培条件下 培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图7B为肠癌组织在培养液二的培条件下 培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×。图8A为胃癌组织在培养液一的条件下培养7 d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图8B为胃癌组织在培养液二的条件下培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×。 图9A为食管癌组织在培养液一的条件下培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图9B为食管癌组织在培养液二的条件下培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×。图10A为肠癌组织在培养液一的培条件下 培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图10B为肠癌组织在培养液二的培条件下 培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图中所示是ki67染色结果，放大倍数为400×。图11A为胃癌组织在培养液一的条件下培养7 d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图11B为胃癌组织在培养液二的条件下培养7 d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图中所示是ki67染色结果，放大倍数为400×。 图12A为食管癌组织在培养液一的条件下培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图12B为食管癌组织在培养液二的条件下培养7d、10d、14d时的组织结构和细胞形状，图中所示是ki67染色结果，放大倍数为400×。从上述图中可以看出， 在上述培养条件下培养7d、10d、14d时，相同天数的肠癌组织生长情况无明显差别，组织结构无明显变化，细胞核结构和染色深浅差异不明显；但采用培养液一培养的胃癌组织和食管癌组织（参见实施例二的图7和图8），14d时，明显可以看出成活细胞数量少于培养液二中培养的组织样本，即本发明采用的培养液大大增强了组织培养的成活率，达到了预料不到的培养效果。
实施例三 3D 培养的肿瘤组织对抗肿瘤药物药效评价的可行性分析
实施例二中肠癌组织培养时，在培养液中加入不同浓度、不同种类的化疗药物，于培养后不同时间，取出组织， 固定于上述固定液中，经HE 染色、Ki67 免疫组化染色或相应的其它染色，镜下观察组织结构和细胞形态， 比较与未加抗肿瘤药物的标本的形态差异，评价药物的药效作用，统计增殖细胞数，计算细胞增值率，见表3，分析细胞增殖比率作为抗肿瘤药物效价评价方法和指标的可行性。 具体参阅图13、图14和图15。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE004
图13 为肠癌在实施例二的培养条件下培养时同时加入不同临床常用化疗药物，继续培养 6 天时的组织结构和细胞核形状的变化，图中所示是HE 染色结果，放大倍数为400×。图13A为control组，图13B草酸铂组，图13C为顺铂组，图13D为草酸铂+5-FU 组；
图14为肠癌在实施例二的培养条件下培养时同时加入不同临床常用化疗药物，继续培养6 天时的组织结构和细胞核形状的变化，图中所示是Ki67 免疫组化染色结果，放大倍数为400×。图14A为control组，图14B草酸铂组，图14C为顺铂组，图14D为草酸铂+5-FU组。
图15是对每组增殖细胞的计数和统计结果。
从图13、图14和图15中可以看出，草酸铂联合5-FU对肠癌组织的杀伤情况最佳，随后是顺铂组，单独使用草酸铂杀伤效果最差。
实验结果表明，本发明所建立的肿瘤组织3D 培养模型能作为评价抗肿瘤药物药效评价的一个方法，且重复性好、结果稳定，呈现了比动物体内药效实验费时短、比常规的体外实验更精确的优势特点。本发明中长期培养后的组织并未出现细胞间质结构的明显变化，但特定给药组肿瘤组织的细胞核发生明显畸形，同时出现细胞间质结构的变化，体现了该方法用于抗肿瘤药物药效学评价的可行性。
作为对照，本发明使用了传统的体外细胞药效评价试验评价了草酸铂、顺铂、伊立替康和氟尿嘧啶联合用药的抗肿瘤药效，发现给药后72h，每组给药方案对肠癌细胞系colo205的杀伤效果基本相同，而使用本方法，每组给药方案对肿瘤组织抑制率分别为，草酸铂+5-FU组：70-80%，顺铂组：60-65%，草酸铂组:30-40%， 间接反应出了组织来源的病人对不同化疗药物敏感性差异。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，包括步骤为：
（1）向孔板中滴加水凝胶，将剪切好的肿瘤组织块移至所述水凝胶中，滴加培养液，CO2培养箱内静置使所述水凝胶凝固；
（2）向步骤（1）的孔板中加入培养液进行培养，再取出培养后的所述肿瘤组织块并固定；所述培养液包括的组分有Advanced DMEM/F12培养液、1×GlutaMAX 、表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF10、N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、前列腺素E2 PGE2、Nicotinamide 和50×B27；
步骤（1）和步骤（2）中所述水凝胶是用20%无菌蔗糖溶液稀释的，所述20%无菌蔗糖溶液与所述水凝胶的体积比为1:1-1:3；
步骤（1）中所述每次滴加的水凝胶的量为20-100μL；所述步骤（1）中滴加培养液的量为50-200μL；所述步骤（2）中加入培养液的量为300-450μL。
2.根据权利要求1 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中所述的孔板中，事先滴加了5-10μL的磷酸盐缓冲液，放入了与孔板大小一致的圆形盖玻片，所述稀释后的水凝胶滴加在该盖玻片上。
3.根据权利要求1 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述肿瘤组织块的大小为0.5-1 mm3，所述肿瘤组织块先用含1%双抗和庆大霉素的缓冲液洗涤后再浸于生理盐水中，所述肿瘤组织块的制作过程在冰上进行。
4.根据权利要求1 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养液按如下方法制得：将所述Advanced DMEM/F12培养液、所述1×GlutaMAX 、所述50×B27按体积比为40:5:5-50：1:1进行混合，形成混合液，再在混合液中依次加入5-10μL的所述表皮细胞生长因子EGF、1-5μL的所述成纤维细胞生长因子FGF 、100-200μL的所述N-乙酰-L-半胱氨酸NAC 、3-8μL的所述前列腺素PGE2混合得到所述培养液。
5.根据权利要求1 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，步骤（2）中分别将培养时间为7d、10d和14d的肿瘤组织块从所述培养液里取出，固定于质量百分比为4% 的多聚甲醛固定液中。
6.根据权利要求1 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，步骤（2）中还包括对固定的所述肿瘤组织块进行石蜡包埋、切片、染色，观察组织结构和细胞形态的变化。
7.根据权利要求1 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，步骤（2）中还包括向所述培养液中加入化疗药物，继续培养3d、6d，然后将所述肿瘤组织块从所述培养液里取出，固定于质量百分比为4% 的多聚甲醛固定液中，再对固定的所述肿瘤组织块进行石蜡包埋、切片、染色，观察肿瘤组织组织结构和细胞形态的变化，统计增殖细胞数，计算细胞增殖率，分析细胞增殖比率作为抗肿瘤药物效价评价方法和指标的可行性。
8.根据权利要求6 所述的肿瘤组织3D 培养方法，其特征在于，所述染色为HE 染色或Ki67 免疫组化染色。
9.根据权利要求1所述的肿瘤组织3D培养方法，其特征在于，所述肿瘤组织包括肠癌肿瘤组织、胃癌肿瘤组织和食管癌肿瘤组织。
10.一种用于肿瘤组织3D培养的培养液，其特征在于，所述培养液包括的组分有AdvancedDMEM/F12培养液、1×GlutaMAX 、表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF10、N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、前列腺素E2 PGE2、Nicotinamide 和50×B27。
11.如权利要求10所述的用于肿瘤组织3D 培养的培养液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述Advanced DMEM/F12培养液、所述1×GlutaMAX 、所述50×B27按体积比为40:5:5-50：1:1进行混合,形成混合液，再在混合液中依次加入5-10μL的所述表皮细胞生长因子EGF、1-5μL的所述成纤维细胞生长因子FGF 、100-200μL的所述N-乙酰-L-半胱氨酸NAC 、3-8μL的所述前列腺素PGE2混合得到所述培养液。
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