CN112410301A - 一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，该方法包括如下步骤：1)卵巢癌类器官的构建，使用卵巢癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的卵巢癌类器官；2)大通量药物筛选试验，以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测。本发明的体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法具有：研磨组织使消化时间缩短，且消化程度一致；温和的消化液减少此步骤对细胞的伤害；去除絮状物，防止目的细胞被包裹；不同的孔径过滤，更精确筛选所需细胞；去除免疫细胞，获得更纯净的癌细胞；自制培养基，更符合卵巢癌类器官生长所需成分，提高培养成功率；以类器官为单位进行药筛，更好的模拟临床用药后体内癌组织的反应。

Description

一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法。

背景技术

目前，预测卵巢癌患者用药的方法主要有以下几种：

1、肿瘤基因检测

根据患者基因中的突变靶点推测可能有效的药物，针对某种突变靶点往往有多种用药选择，无法锁定具体的有效药物；且临床上基于肿瘤患者样本基因测序的大数据来指导该患者的靶向治疗，往往无效情况居多，其原因在于基于某些原癌基因或抑癌基因的测序结果并不能完全反应出肿瘤患者的遗传背景，导致对患者用药的预测性不高。

2、2D体外培养卵巢癌细胞系

多为商业化的通用细胞系，不能反映原代的基因组特性，无法模拟个体间及肿瘤内的异质性，药物检测结果与临床实际使用疗效存在较大的差距，预测性不高。

3、人源肿瘤异种移植模型(patient-derived xenograft model,PDX模型)

肿瘤植入的成功率不稳定，并非所有移植到小鼠体内的肿瘤都能导致PDX稳定生长；操作复杂、成本高、生成周期长(2-12个月)，在建模期间患者可能出现疾病进展，而无法得到最后的药筛结果，限制了它们在个性化医疗中的使用。

4、类器官技术

目前类器官培养技术仍在不断探索中，培养出生长状态良好且功能接近原病灶的卵巢癌类器官仍是该领域研究者努力的方向。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，该方法完善了卵巢癌类器官培养方法，更精确的模拟卵巢癌器官体内生长状态，使其对药物的敏感性更接近体内卵巢癌细胞对药物的敏感性，更快速和直观的反映有效药物；同时该方法建立针对卵巢癌病患的精准靶向药物筛选平台，从而为广大肿卵巢癌患者提供最准确的靶向药物依据。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，该方法包括如下步骤：

1)卵巢癌类器官的构建

使用卵巢癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的卵巢癌类器官；该步骤包括了如下步骤：

a)对癌组织需要进行研磨操作；

b)对癌组织的消化使用PBS和Tryple处理30-60min；

若出现絮状物，则使用1×DNaseⅠ消化5-10min；

c)对消化液进行不同孔径的2次过滤；

d)对消化液进行去除免疫细胞及红细胞的操作；

e)使用自制培养基进行培养；

2)大通量药物筛选试验

以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测。

作为本发明的一种优选方案，步骤1)中的卵巢癌类器官的构建具体包括如下步骤：

1.1)清洗：将癌组织取出放入普通培养皿中用PBS清洗3-4次，至无血性混浊，液体基本无色；

1.2)研磨：洗净后将组织转移至干净的低吸附皿中使用无菌刀片剁碎，使其均匀松散且不粘连；

1.3)消化：取4-8ml组织消化液消化剁碎的组织，吹打混匀，并在37℃恒温水浴锅中，消化30-60min；若出现絮状物，则使用1×DNaseⅠ消化5-10min，至絮状物消失；

1.4)过筛：终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4-8min，弃上清，用DMEM-F12混悬，依次用70μm和40μm的滤膜过滤；

1.5)去除免疫细胞：将过滤液加入提前准备的低吸附皿中，放入37℃，5％CO₂培养箱，孵育1h后将液体以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，若有红细胞残留，则加入500μl红细胞裂解液裂解4-6min，终止反应后离心，弃上清；

1.6)清洗：加1-2mlPBS清洗，吹打混匀后取适量计数，余下的部分以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

1.7)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按2000-20000个/50μl的比例混匀，以50μl/孔加入48孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20-25min；

1.8)加培养基：待胶凝固后每孔加入500uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育，每三天更换一次培养基；3代后类器官状态可保持稳定。

作为本发明的一种优选方案，步骤2)中的大通量药物筛选试验具体包括如下步骤：

2.1)消化：选择状态稳定的类器官，去除6孔细胞培养板中培养基，并使用HBSS清洗1-2次，加入1.5mL/孔传代消化液至培养板中，吹打基质胶，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱14-16min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

2.2)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按100-300个/8μl的比例混匀，以8μl/孔加入384孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固10-15min；

2.3)加培养基：待胶凝固后每孔加入20uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育；

2.4)加药换液：培养一天后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；

2.5)检测：加药6天后，放于22-25℃的室温平衡30min，加入与培养试剂等量的CellTiter-Glo3D检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光。

作为本发明的一种优选方案，所用药物及其浓度如下：

药物：顺铂、卡铂、紫杉醇、拓扑替康、多西他赛、环磷酰胺、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、长春瑞滨、阿帕替尼、培美曲塞、索拉菲尼、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、奥拉帕利或尼拉帕利；

浓度：100μM、25μM、6.25μM、1.56μM或0.39μM。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、研磨组织使消化时间缩短，且消化程度一致。

2、温和的消化液减少此步骤对细胞的伤害。

3、去除絮状物，防止目的细胞被包裹。

4、不同的孔径过滤，更精确筛选所需细胞。

5、去除免疫细胞，获得更纯净的癌细胞。

6、自制培养基，更符合卵巢癌类器官生长所需成分，提高培养成功率。

7、以类器官为单位进行药筛，更好的模拟临床用药后体内癌组织的反应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，该方法包括如下步骤：

1)卵巢癌类器官的构建

使用卵巢癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的卵巢癌类器官；该步骤具体包括如下步骤：

1.1)清洗：将组织取出放入普通培养皿中用PBS清洗3-4次，至无血性混浊，液体基本无色；

1.2)研磨：洗净后将组织转移至干净的低吸附皿中使用无菌刀片剁碎，使其均匀松散且不粘连；

1.3)消化：取4-8ml组织消化液消化剁碎的组织，吹打混匀，并在37℃恒温水浴锅中，消化30-60min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4-8min；若出现絮状物，则使用1×DNaseⅠ消化5-10min，至絮状物消失；

1.4)过筛：终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4-8min，弃上清，用DMEM-F12混悬，依次用70μm和40μm的滤膜过滤；

1.5)去除免疫细胞：将过滤液加入提前准备的低吸附皿中，放入37℃，5％CO2培养箱，孵育1h后将液体以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，若有红细胞残留，则加入500μl红细胞裂解液裂解4-6min，终止反应后离心，弃上清；

1.6)清洗：加1-2mlPBS清洗，吹打混匀后取适量计数，余下的部分以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

1.7)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按2000-20000个/50μl的比例混匀，以50μl/孔加入48孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20-25min；

1.8)加培养基：待胶凝固后每孔加入500uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育，每三天更换一次培养基。3代后类器官状态可保持稳定。

2)大通量药物筛选试验

以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测，该步骤具体包括如下步骤：

2.1)消化：选择状态稳定的类器官，去除6孔细胞培养板中培养基，并使用HBSS清洗1-2次，加入1.5mL/孔传代消化液至培养板中，吹打基质胶，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱14-16min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

2.2)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按100-300个/8μl的比例混匀，以8μl/孔加入384孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固10-15min；

2.3)加培养基：待胶凝固后每孔加入20uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育；

2.4)加药换液：培养一天后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；

其中，本实例所用药物及其浓度如下：

药物：顺铂、卡铂、紫杉醇、拓扑替康、多西他赛、环磷酰胺、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、长春瑞滨、阿帕替尼、培美曲塞、索拉菲尼、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、奥拉帕利或尼拉帕利；

浓度：100μM、25μM、6.25μM、1.56μM或0.39μM；

5)检测：加药6天后，放于22-25℃的室温平衡30min，加入与培养试剂等量的CellTiter-Glo3D检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光。

结果分析：该实例患者样本的检测结果为：对顺铂、卡铂、依托泊苷、索拉菲尼、他莫昔芬敏感；其临床用药为卡铂，用药后有效，其预后结果与药筛结果基本一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)卵巢癌类器官的构建

使用卵巢癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的卵巢癌类器官；该步骤包括了如下步骤：

a)对癌组织需要进行研磨操作；

b)对癌组织的消化使用PBS和Tryple处理30-60min；

若出现絮状物，则使用1×DNaseⅠ消化5-10min；

c)对消化液进行不同孔径的2次过滤；

d)对消化液进行去除免疫细胞及红细胞的操作；

e)使用自制培养基进行培养；

2)大通量药物筛选试验

以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测。

2.如权利要求1所述的一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，其特征在于，步骤1)中的卵巢癌类器官的构建具体包括如下步骤：

1.1)清洗：将癌组织取出放入普通培养皿中用PBS清洗3-4次，至无血性混浊，液体基本无色；

1.2)研磨：洗净后将组织转移至干净的低吸附皿中使用无菌刀片剁碎，使其均匀松散且不粘连；

1.3)消化：取4-8ml组织消化液消化剁碎的组织，吹打混匀，并在37℃恒温水浴锅中，消化30-60min；若出现絮状物，则使用1×DNaseⅠ消化5-10min，至絮状物消失；

1.4)过筛：终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4-8min，弃上清，用DMEM-F12混悬，依次用70μm和40μm的滤膜过滤；

1.5)去除免疫细胞：将过滤液加入提前准备的低吸附皿中，放入37℃，5％CO₂培养箱，孵育1h后将液体以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，若有红细胞残留，则加入500μl红细胞裂解液裂解4-6min，终止反应后离心，弃上清；

1.6)清洗：加1-2mlPBS清洗，吹打混匀后取适量计数，余下的部分以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

1.7)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按2000-20000个/50μl的比例混匀，以50μl/孔加入48孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20-25min；

1.8)加培养基：待胶凝固后每孔加入500uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育，每三天更换一次培养基；3代后类器官状态可保持稳定。

3.如权利要求1所述的一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，其特征在于，步骤2)中的大通量药物筛选试验具体包括如下步骤：

2.1)消化：选择状态稳定的类器官，去除6孔细胞培养板中培养基，并使用HBSS清洗1-2次，加入1.5mL/孔传代消化液至培养板中，吹打基质胶，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱14-16min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

2.2)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按100-300个/8μl的比例混匀，以8μl/孔加入384孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固10-15min；

2.3)加培养基：待胶凝固后每孔加入20uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育；

2.4)加药换液：培养一天后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；

2.5)检测：加药6天后，放于22-25℃的室温平衡30min，加入与培养试剂等量的CellTiter-Glo3D检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光。

4.如权利要求3所述的一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法，其特征在于，所用药物及其浓度如下：

药物：顺铂、卡铂、紫杉醇、拓扑替康、多西他赛、环磷酰胺、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、长春瑞滨、阿帕替尼、培美曲塞、索拉菲尼、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、奥拉帕利或尼拉帕利；

浓度：100μM、25μM、6.25μM、1.56μM或0.39μM。