CN109694852B - 一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用，该细胞命名为人低级别胶质瘤原代细胞XHLG‑07，人高级别胶质瘤原代细胞XHHG‑02，保藏编号分别为CCTCC NO：C2018256、CCTCC NO：C2018215，分离培养方法为：体外获取临床术后切除胶质瘤组织，解剖镊子去除组织中血管及脂肪组织，经胶原酶/胰酶消化作用，过滤，低速离心获取细胞沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞后，用DF31完全培养基重悬细胞并接种培养，分离方法可用于WHO不同分级胶质瘤原代细胞获取，所得细胞可在体外、体内分析不同级别人脑胶质瘤的发病机制，药物敏感性及转移性，为不同级别人脑胶质瘤研究提供更接近于临床肿瘤生物学特性的研究材料。

Description

一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，更具体的，涉及一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用。
背景技术
胶质瘤是神经系统最常见的颅内恶性肿瘤，为起源于神经胶质细胞的肿瘤。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类，胶质瘤分为WHOI-IV级，其中I、II为低级别胶质瘤，III和IV级为高级别胶质瘤。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，以老年群体尤为显著。胶质瘤发病率约占所有中枢神经系统肿瘤的30％，其中胶质母细胞瘤的发病率最高，约为3.2/10万，其次是弥漫性星形细胞瘤，发病率为0.53/10万。尽管应用各种治疗方法，包括手术切除，放疗和化疗，胶质瘤患者的预后仍差。
针对胶质瘤这种发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的特点，近年来针对胶质瘤发病机制的研究处于热门领域，主要研究方向包括信号通路研究及基因水平变异的研究。然而，胶质瘤的发病机制依然尚未明确。现阶段针对胶质瘤研究的主要模型仍然是肿瘤细胞系(patient-derived cancer cell lines,PDC)。然而，目前全球范围内用于基础研究及药敏检测的脑瘤细胞系屈指可数且肿瘤细胞系具有严重的缺陷,即体外培养的过程中易丢失肿瘤细胞的异质性和肿瘤细胞在体内的特征，目前，在脑肿瘤临床治疗常用手段主要有手术治疗、放射治疗和化疗，另外还有一些比较新的治疗方法，如免疫治疗、以EGFR、IGFR、PDGFR等为靶点的靶向治疗和抗血管生成的治疗方法。这些方法通常根据病人的实际情况进行联合应用，但对于脑肿瘤的治疗效果却不尽人意。因此临床上不仅需要新型的治疗方法，同时也需要开发有效的治疗药物。
申请号为CN201210299549.6的专利公开一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用，其是以高级胶质瘤细胞原代细胞作为研究模型，采用DMEM/F12完全培养液培养纯化GLC-001细胞，然后使用含有胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。该申请涉及为高级别胶质瘤细胞系，以往研究认为，体外多次传代细胞系形态趋于均一，逐渐丧失了原代胶质瘤细胞的异质性，由于其遗传背景发生变化，无法准确反映临床患者的真实生理反应。而且该申请仅涉及胶质瘤的高级别类型细胞系，对于低级别胶质瘤的相关研究无法提供有效的研究系统。根据以往研究表明低级别胶质瘤原代细胞体外极难获得及进行传代培养，而本申请是以高级胶质瘤细胞和低级胶质瘤细胞作为研究模型，采用DF31完全培养基培养两种细胞，为不同等级的细胞研究提供了模型，及不同药物针对不同等级细胞的筛选和发病机理提供了研究模型。
发明内容
本发明的目的是针对现今科研领域研究模型的不足，提供一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种人胶质瘤原代细胞，包括人高级别胶质瘤原代细胞XHHG-02和人低级别胶质瘤原代细胞XHLG-07，其保藏编号分别为CCTCC NO：C2018215，CCTCC NO：C2018256。
上述人胶质瘤原代细胞的体外分离培养方法，包括以下步骤：
(1)收集新鲜临床人脑胶质瘤手术切除的胶质瘤组织，用解剖镊子于显微镜下去除血管、脂肪及坏死成分，用解剖剪刀将胶质瘤组织剪至糜状获得样本组织；
(2)将步骤(1)样本组织用消化液消化；所述消化液为含胶原酶及胰酶的DMEM培养基；
(3)消化后组织用无菌过滤器收集细胞悬液，收集后，低速离心去上清，收集细胞沉淀；
(4)将步骤(3)收集细胞沉淀加入红细胞裂解液，室温放置，轻柔上下颠倒促进红细胞裂解，低速离心，收集细胞沉淀；
(5)将步骤(4)收集的细胞沉淀用1XPBS漂洗，低速离心收集细胞沉淀；
(6)重悬步骤(5)收集的细胞沉淀于DF31完全培养基，接种于细胞培养瓶培养，获得人胶质瘤原代细胞。
所述的人胶质瘤原代细胞培养条件优选为用DF31完全培养基于37℃，5％CO2培养；所述的DF31完全培养基为：DMEM/F12培养基添加1xN2、1mM丙酮酸钠、1x非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5ug/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、100ug/ml肝素、5ng/ml孕酮及100U/mL青霉素、100ug/ml链霉素、0.25ug/mL两性霉素B。上述DF31完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。
步骤(2)中消化液用量为5倍于组织样本体积，消化条件为37℃，60rpm震荡消化1-1.5h；胶原酶和胰酶浓度分别为1x浓度和0.25％胰酶-0.2％EDTA。
步骤(3)、(4)、(5)中离心条件为1000rpm，4分钟；步骤(6)中的培养条件为37℃、5％CO2。
上述人胶质瘤原代细胞的传代培养方法，优选操作步骤如下：
A、除去旧培养基，用PBS漂洗2次后，用0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞，消化时间为2-3min；
B、加入DF31完全培养基终止消化反应，1000rpm，4分钟，离心去上清，用DF31完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养获得子代细胞，培养条件为37℃、5％CO2。
本发明提供上述人胶质瘤原代细胞及子代细胞的用途。其中所述较佳用途包括一种筛选治疗胶质瘤最佳敏感药物的方法，其中较佳操作步骤如下：将测试药物添加至细胞模型中，根据药物作用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的程度，筛选最佳敏感性测试药物为治疗人胶质瘤的候选药物，其中所述细胞模型为本发明所述的人胶质瘤原代细胞。
其中所述筛选方法为常规筛选方法，所述筛选方法较佳的包括以下步骤：
(1)将2000个/孔的人胶质瘤原代细胞或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；
(2)将测试药物稀释成不同浓度作用于细胞，药物作用72小时后测定细胞活力，计算不同浓度药物对细胞增殖抑制能力，用以评估测试药物的抗肿瘤能力。
其中步骤(2)所述用以评估测试药物的抗肿瘤能力的方法为本领域常规检测及计算方法。其中所述检测方法较佳的包括MTT法或CCK-8法，本发明所述检测方法优选的为CCK-8法。优选的CCK-8法全称Cell Counting Kit-8，其原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。优选的CCK-8法为MTT法的替代法，其特征为快速、低毒、灵敏度高及重复性佳。
本发明的人高级别胶质瘤原代细胞及人低级别胶质瘤原代细胞的STR基因型以22个“STR基因座/等位基因长度”来表示：人高级别胶质瘤原代细胞的STR序列为：AMEL-X，CSF1P0-12/13，D10S1248-14/15，D12S391-20，D13S317-10，D16S539-9/10，D18S51-14/20，D19S433-13/15.2，D2S441-10，D21S11-29/32，D2S1338-18/24，D3S1358-15，D5S818-10/12，D6S1043-10/11，D7S820-9/12，D8S1179-15，FGA-21/23，Penta D-9/11，Penta E-14/17，TH01-6/9，TPOX-8/11，vWA-18，由于检测方法优化，删掉D2S441和D10S1248检测位点，增加D1S1656检测位点，共检测21个位点，检测结果依然涵盖国际通用检测19个位点。人低级别胶质瘤原代细胞STR序列为：AMEL-X，CSF1P0-11，D1S1656-15，D13S317-9/12，D16S539-9/12，D18S51-15/21，D19S433-13/14，D21S11-30/31，D2S1338-22/24，D3S1358-17，D5S818-10/11，D6S1043-10/17，D7S820-12，D8S1179-11/17，FGA-19，Penta D-9/13，Penta E-16/17，TH01-6/9，TPOX-8/9，vWA-15/17。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供低级别和高级别的人脑胶质瘤原代细胞，经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册的低级别和高级别人胶质瘤原代细胞，性状稳定，为不同级别胶质瘤的研究提供了更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料和模型。本发明所得的原代细胞可以直接作为研究低级别胶质瘤及高级别胶质瘤发病机制研究的基础研究模型，也可以直接作为体外临床前胶质瘤最佳用药方案的筛选模型。
附图说明
图1为本发明人高级别胶质瘤原代细胞的细胞形态图，放大倍数：40；
图2为本发明人低级别胶质瘤原代细胞的细胞形态图，放大倍数：40；
图3、图4分别为人高级胶质瘤原代细胞和人低级别胶质瘤原代细胞的生长曲线图；
图5和图6为人高级别胶质瘤原代细胞的特异性标记物免疫组化图，图7和图8为人低级别胶质瘤原代细胞的特异性标记物免疫组化图，放大倍数均为：200；
图9、图10分别为人高级别胶质瘤原代细胞和人低级别胶质瘤原代细胞的染色体核型分析图；
图11、图12分别为人高级别胶质瘤原代细胞和人低级别胶质瘤原代细胞的STR基因分型图；
图13为人胶质瘤原代细胞的软琼脂克隆形成实验结果图；
图14-图16为人胶质瘤原代细胞的药敏检测结果图，其中图14-图15分别为人胶质瘤原代细胞和人低级别胶质瘤原代细胞对不同药物作用的反应，图16为不同浓度TMZ作用于人胶质瘤原代细胞的药敏结果。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件进行，或按照制造厂商所建议的条件，室温为26℃，本发明所用的原料或试剂除特别说明外，均市售可得。
实施例1：人高级别胶质瘤原代细胞的原代分离培养
(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉协和医院获得新鲜的临床胶质瘤切除标本，该标本为WHOIV级，胶质母细胞瘤。
(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000U/ml青霉素、1000ug/ml硫酸链霉素、2.5ug/ml两性霉素和50ug/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。
(3)原代分离培养：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1xPBS(pH7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状。加入20mL含1xI型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液消化肿瘤组织，消化时间为1.5小时，并用100um滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5ml的1xPBS(pH7.2-7.4)，1000rpm，4分钟，离心收集细胞沉淀。用DF31完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％CO2条件下进行培养，DF31完全培养基：DMEM/F12培养基添加1xN2、1mM丙酮酸钠、1x非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5ug/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、100ug/ml肝素、5ng/ml孕酮及100U/mL青霉素、100ug/ml链霉素、0.25ug/mL两性霉素B；以下实施例中的DF31完全培养基成分均与此相同。
按照上述方法分离培养成功的人胶质瘤原代细胞，显微镜下观察细胞形态如图1(呈梭形，不规则分支或分叉)。细胞分类命名为人高级别胶质瘤原代细胞XHHG-02，已于2018年保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C2018215。
实施例2：人低级别胶质瘤原代细胞的原代分离培养
(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉协和医院获得新鲜的临床胶质瘤切除标本，该标本为WHOII级，弥漫性星形胶质细胞瘤。
(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000U/ml青霉素、1000ug/ml硫酸链霉素、2.5ug/ml两性霉素和50ug/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。
(3)原代分离培养：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1xPBS(pH7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状。加入20mL含1xI型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液消化肿瘤组织，消化时间为50分钟，并用100um滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5ml的1xPBS(pH7.2-7.4)，1000rpm，4分钟，离心收集细胞沉淀。用DF31完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％CO2条件下进行培养。
按照上述方法分离培养成功的人胶质瘤原代细胞，显微镜下观察细胞形态如图2(呈梭形，不规则分支或分叉)。细胞分类命名为人低级别胶质瘤原代细胞XHLG-07，已于2018年保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C2018256。
实施例3：人胶质瘤原代细胞的传代培养
(1)培养于T25培养瓶的细胞丰度达到80％时，用1xPBS(pH7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1ml0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2-3min。
(2)加入2ml DF31完全培养基终止消化。
(3)1000rpm离心4min，去上清，收集细胞悬液，用1mlDF31完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入T25培养瓶中进行培养。
按照上述方法传代培养的人高级别胶质瘤原代细胞和人低级别胶质瘤原代细胞，培养建系的细胞生长曲线如图3和图4，连续传代50天，本发明的人胶质瘤原代细胞仍能保持增殖状态正常生长。
实施例4：人胶质瘤原代细胞的特异性标记物表达鉴定
(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
(2)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)；
(4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
(5)吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
(6)第二天用PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
(7)DAB显色3-5min，自来水充分涮洗；
(8)苏木素复染5min，自来水充分涮洗；
(9)盐酸酒精分化10s，用自来水冲洗2min，再用氨水反蓝2min，自来水充分冲洗；
(10)依次通过梯度酒精后，再过2遍的二甲苯，流水冲洗2min；
(11)中性树脂封片观察。
染色结果见图5-图8，其中，图5为人高级别胶质瘤原代细胞Ki-67表达，图6为人高级别胶质瘤原代细胞GFAP表达，图7为人低级别胶质瘤原代细胞Ki-67表达，图8为人低级别胶质瘤原代细胞GFAP表达，数据显示体外分离所得胶质瘤原代细胞的Ki-67及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达均为阳性。
实施例5：人胶质瘤原代细胞的核型分析鉴定
(1)细胞接种次日早晨打开水浴箱调至37℃，将低渗液放入水浴箱中，待水温恒定后，用温度计测量低渗液的温度，当低渗液温度也达到37℃时方可使用。
(2)向每一个培养基中加入秋水仙素80ul，来回混匀3次后放入培养箱中继续培养30分钟。
(3)胰酶消化收集细胞，将细胞悬液缓缓倒入离心管中，以1500转离心5分钟，离心完成后小心取出离心管，用真空泵吸取上清液。
(4)将预热好的低渗液缓缓加入到离心管中，用一次性吸管轻轻吹打混匀。再放入水浴箱中低渗30min。
(5)将离心管从水浴箱中取出，在通风橱中每支离心管加固定液1ml，用一次吸管轻轻吹打混匀后，以1500rpm离心5分钟。
(6)将离心完的样本轻轻取出，用真空泵吸取上清液，再在每支离心管中加入固定液8ml，轻轻吹打混匀，静置30min后以1500转离心5分钟，除去上清液后，再加入固定液8ml静置10min。
(7)将固定好的悬液再次以1500rpm离心5分钟，弃去上清液，加入1ml固定液(视沉淀物多少可适量加减固定液)混匀。
(8)将固定好的细胞悬液滴片，滴片后在低倍显微镜下观察，细胞间距在2个细胞到3个细胞之间且没有重叠，分裂相较多时可见分裂相分散良好即为合格，则该浓度的细胞悬液最佳。
(9)使用HANABI Ver.2.0b染色体中期分散仪滴片：每张片上滴2滴，每滴用移液枪吸取12ul细胞悬液滴加，将滴好的玻片放入75℃烤箱中烘烤过夜。
(10)烘烤后玻片用吉姆萨染色，染色前用胰酶处理10s，生理盐水漂洗3次后进行染色，以紫红色为标准，颜色合适后在水龙头下冲洗玻片，玻片上的残渣冲洗干净为宜。
(11)染色完毕后即可进行观察。
细胞核型分析结果见图9-图10，其中图9为人高级别胶质瘤原代细胞核型分析图，图10为人低级别胶质瘤原代细胞核型分析图，分离所得的人胶质瘤原代细胞染色体未发现异常。
实施例6：人胶质瘤原代细胞的STR基因分型鉴定
短串联重复序列(short tandem repeat,STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10-60次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，不同个体中具有唯一的一组STR序列重复次数，为个体的“基因身份证”，为细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。具体操作如下：
(1)收集新鲜培养的对数期贴壁胶质瘤原代细胞，数量控制在106数量级；
(2)根据AxyPrep基因组DNA小剂量试剂盒(AP-MN-MS-GDNA)说明书提取细胞基因组DNA，用5′端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，计算各个短片段重复序列的重复数。STR检测结果见图11-图12，其中，图11为人高级别胶质瘤原代细胞的STR检测图谱，图12为人低级别胶质瘤原代细胞STR检测图谱；技术升级前检测22个位点(高级别胶质瘤检测方法)，技术升级后检测21个STR位点(低级别胶质瘤检测方法)，以“STR基因组/等位基因长度”来表示，两种检测方法涉及位点均涵盖国际通用19个检测位点：技术升级前人高级别胶质瘤原代细胞AMEL-X，CSF1P0-12/13，D10S1248-14/15，D12S391-20，D13S317-10，D16S539-9/10，D18S51-14/20，D19S433-13/15.2，D2S441-10，D21S11-29/32，D2S1338-18/24，D3S1358-15，D5S818-10/12，D6S1043-10/11，D7S820-9/12，D8S1179-15，FGA-21/23，Penta D-9/11，Penta E-14/17，TH01-6/9，TPOX-8/11，vWA-18，技术升级后人低级别胶质瘤原代细胞AMEL-X，CSF1P0-11，D1S1656-15，D13S317-9/12，D16S539-9/1，D18S51-15/21，D19S433-13/14，D21S11-30/31，D2S1338-22/24，D3S1358-17，D5S818-10/11，D6S1043-10/17，D7S820-12，D8S1179-11/17，FGA-19，Penta D-9/13，Penta E-16/17，TH01-6/9，TPOX-8/9，vWA-15/17。
实施例7：人胶质瘤原代细胞的软琼脂克隆形成实验结果
(1)不同浓度低熔点琼脂糖溶液准备：用超纯水分别配制1.4％和0.7％两个浓度的琼脂糖溶液，高压灭菌后维持在40℃水浴中保持其溶液状态。
(2)以1：1比例混合1.2％琼脂糖和2xDF31完全培养基，迅速混匀后倒入6孔板，每孔倒入2ml，室温冷却30min使其凝固后备用，每株细胞做三个复孔。
(3)以1：1比例混合0.7％琼脂糖和2xDF31完全培养基，迅速混匀后加入适量细胞悬液，保持每孔1000细胞量，充分混匀后铺入含有1.2％琼脂糖底层平皿中，室温放置使其凝固后置入37℃，5％CO2培养箱培养2周。
(4)于显微镜下观察平皿中克隆形态以判断细胞的致瘤性。
结果见图13，如图所示，小鼠正常皮肤细胞在软琼脂中无法形成克隆，培养2周后细胞无明显增殖；而人胶质瘤原代细胞能在软琼脂形成明显且较大的细胞克隆，人高级别胶质瘤原代细胞克隆形成率高于人低级别胶质瘤原代细胞，说明人胶质瘤原代细胞在体外具有致瘤性且人高级别原代细胞的成瘤性更强。
实施例8：人胶质瘤原代细胞的药敏检测
(1)0.05％胰酶消化常规培养人胶质瘤原代细胞，制备细胞悬液，以每孔2000个细胞接种于96孔板，每孔加100ul悬液，放于37℃、5％CO2培养箱培养24h。
(2)每孔加入10uL不同浓度药物，卡铂(CBP)和顺铂(DDP)药物浓度(uM)设置为12.5、25、100、400，替莫唑胺(TMZ)药物浓度(uM)设置为250、500、1000、2000。每种药物浓度设置3个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不含药物)、空白对照孔(只含培养基)，每组设置6个复孔。
(3)药物加入后放入37℃，5％CO2培养箱继续培养72h，吸去孔内液体，每孔加入10uLCCK-8检测试剂。
(4)根据试剂盒说明，上述体系在培养箱中继续培养0.5-4h，根据细胞量的多少确定孵育时间(可参考液体颜色变化)，吸光度范围控制在1.0-1.5之间最好。
(5)测定450nm处的吸光度。
细胞药敏实验结果见图14-图16，高级别和低级别胶质瘤对于不同的药物呈现出不同的反应，在药物作用浓度条件下，低浓度和高浓度的CBP对于两种细胞的抑制率并不明显，DDP在25uM时对两种细胞的抑制率均达到80％左右，500uM的TMZ作用于细胞时，低级别胶质瘤原代细胞对于TMZ作用更为敏感，其抑制率达到40％，而高级别细胞的抑制率为30％。以上数据表明原代胶质瘤细胞对于不同药物药敏检测的敏感度和区分度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种人胶质瘤原代细胞，其特征在于，所述人胶质瘤原代细胞为人高级别胶质瘤原代细胞XHHG-02，其保藏编号为CCTCC NO：C2018215。
2.一种人胶质瘤原代细胞，其特征在于，所述人胶质瘤原代细胞为人低级别胶质瘤原代细胞XHLG-07，其保藏编号为CCTCC NO：C2018256。
3.权利要求1或2所述的人胶质瘤原代细胞在体外分析不同级别人脑胶质瘤的发病机制，药物敏感性的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗目的。
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Effective date of registration: 20220721

Granted publication date: 20200324

Pledgee: China Construction Bank Corporation Wuhan Gangcheng sub branch

Pledgor: WUHAN SAIER LANGLING TECHNOLOGY Co.,Ltd.

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