CN110241071B - 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用，该细胞命名为人正常肾小管原代细胞XHRN‑01，保藏编号为CCTCC NO：C201970。其原代细胞分离培养方法为：体外获取临床术后切除肾癌旁组织，经病理学鉴定无癌细胞侵染，去除组织中血管及脂肪组织，组织样本经胶原酶/胰酶消化，过滤，低速离心获取细胞沉淀，红细胞裂解液裂解红细胞后，用COMR完全培养基重悬细胞，再通过传代培养构建细胞系。本发明的细胞可用于在人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞药物毒性研究、肾脏及其相关疾病包括肾癌、慢性肾炎及感染性疾病的发病机理及治疗药物筛选研究中的应用。

Description

一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，更具体的，涉及一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用。
背景技术
肾脏是机体血流量较大的功能器官，血液中的毒性物质能够快速到达肾脏部位，药物进入机体后，多数药物经肾小球过滤、近曲小管分泌、远曲小管重吸收和小关上皮细胞降解等代谢过程排除体外，这一过程均可累及肾脏发生结构或功能改变，导致肾毒性或肾损伤。此外，肾脏对于尿液的浓缩功能又进一步提高了肾脏细胞和肾小管腔内的毒性物质浓度；同时由于肾脏组织处于高代谢状态，需氧量大，多种酶作用活跃，极易受到缺氧、毒素、免疫因素或药物损伤。因此，肾脏极易受到外源物质的作用引起脏器病变或损伤。
目前，肾脏毒性的研究模型主要为动物模型和细胞模型。传统的肾毒性研究方法是进行动物实验验证药物肾毒性，但动物实验的耗时和耗资均不具备研究优势。由于细胞分离培养技术的发展及细胞实验的经济时效性，体外细胞模型逐渐应用于药物肾毒性的评价、优化筛选及机制研究中，尤其是肾小管上皮细胞拥有庞大的转运系统及丰富的生物转化酶，对外源性读物的损害极为敏感，是研究药物肾毒性的常用细胞模型。
国内外常用的细胞模型为美洲负鼠肾小管上皮细胞系(OK细胞系)、猪肾小管上皮细胞系(LLC-PK1细胞系)及人肾皮质近曲小管上皮细胞系(HK-2细胞系)，经过人为改造使其永生化，传代细胞系拥有强大的生物转化功能，并且在可控条件下能够长期接触化合物，为研究者们所青睐。然而OK细胞系和LLC-PK1细胞系均为非人类细胞，存在种属差异；HK-2虽然为人类细胞，但该细胞系的应用过程中人为导入人乳头瘤病毒HPV16的E6/E7基因，转染而使其永生化，虽然排除了实验从动物推到人的种属差异，但外源基因的导入无疑改变了细胞的遗传背景。种属间差异及外源修饰均导致基于细胞系研究的实验数据无法准确反应临床结果。
原代细胞分离培养技术的发展为体外研究提供了一项新可能性，即采用原代细胞作为体外研究的模型。虽然原代细胞的培养难度高于细胞系的培养，但直接分离于组织的原代细胞的生理功能和遗传背景均与临床上保持了高度的一致性，因此原代肾细胞无疑是目前用来研究药物细胞毒性、肾毒性实验最佳的体外细胞模型。
现有技术中已公开中国专利CN109022350A，依赖小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞建立细胞模型，虽然实验得到的原代肾小管上皮细胞纯度高达92％，但应用于研究急性肾损伤或慢性肾脏病肾小管上皮细胞的损伤机质，小鼠原代肾小管上皮细胞与人类之间依旧存在种属差异，不能准确地反映临床结果。
现有技术中公开的文献《人肾近端小管上皮细胞的原代培养、传代及鉴定方法研究》，提供了人肾小管上皮细胞分离及培养方法，获得人肾小管上皮细胞，排除了种属差异，但人肾小管上皮细胞的传代培养代数有限，获得的子代细胞数量有限，继续培养获得的细胞形态改变至衰老死亡，不利于药物细胞毒性、肾毒性的研究。
发明内容
本发明的目的是针对现今科研领域研究模型的不足，提供一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用。
为实现上述目的，本发明提供一种人正常肾小管原代细胞，分类名命为XHRN-01，保藏编号为CCTCC NO：C201970。
所述人正常肾小管原代细胞XHRN-01通过STR基因型鉴定，包括21个STR基因座位点，所述STR基因座位点的等位基因具体是：AMEL-X、CSF1P0-11/12、D12S391-18、D13S317-8/12、D16S539-11、D18S51-14/17、D19S433-13/15、D2S441-11/14、D21S11-28/29、D2S1338-17/24、D3S1358-15/17、D5S818-11、D6S1043-13/17、D7S820-8/11、D8S1179-10/14、FGA-22.2/24、Penta D-9/11、Penta E-11/14、TH01-7/9、TPOX-9/12、vWA-18/20，检测结果涵盖国际通用检测19个位点。
由此证明，人正常肾小管原代细胞XHRN-01属于人类细胞，与现有已公开的细胞STR基因型位点对比，发现人正常肾小管原代细胞XHRN-01未被国内外登记注册，为新发现的人正常肾小管原代细胞，得到的原代细胞的生理功能和遗传背景均与临床保持了高度的一致性，为体内外肾相关疾病的发病机制分析、药物敏感性研究分析或药物毒性研究分析提供新的方向。
上述人正常肾小管原代细胞XHRN-01的体外分离培养方法，包括以下步骤：
S1.收集临床透明细胞癌患者手术切除的新鲜癌旁组织，用解剖镊子于显微镜下去除血管、脂肪及坏死成分，将组织剪至糜状获得组织样本；
S2.将步骤S1组织样本用消化液消化，所述消化液为含胶原酶及胰酶的DMEM培养基；
S3.将S2消化后的组织样本通过无菌过滤器收集细胞悬液，低速离心去上清，收集细胞沉淀；
S4.在步骤S3收集的细胞沉淀加入红细胞裂解液，室温，轻柔上下颠倒促进红细胞裂解，低速离心，收集细胞沉淀；
S5.将步骤S4得到的细胞沉淀用1×PBS漂洗，低速离心收集细胞沉淀；
S6.COMR完全培养基重悬步骤S5得到的细胞沉淀，接种于细胞培养瓶中培养，获得体外分离培养的人正常肾小管原代细胞；
S7.除去步骤S6人正常肾小管原代细胞中的旧培养基，用PBS漂洗2次后，用Accutase消化液消化单层细胞，消化时间为3-5min；
S8.消化反应结束后，1000rpm离心5min，去上清，用COMR完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养，培养条件为37℃，5％CO2，获得人正常肾小管原代细胞传代培养的子代细胞。
优选地，上述消化液用量为10倍于组织样本体积，消化条件为37℃，60rpm震荡消化2-3.5h,消化液中胶原酶和胰酶浓度分别为1x浓度和0.25％胰酶-0.2％EDTA；
进一步优选地，上述步骤S3、S4、S5中离心条件为，1000rpm，5min。
进一步优选地，上述步骤S6、S8中COMR完全培养基包括：在DMEM/F12培养基中添加1mM丙酮酸钠、5％胎牛血清、1x非必需氨基酸、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、1mg/mL抗坏血酸、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、10ng/mL硒酸钠、0.6mg/mL牛胆汁。
进一步优选地，上述DMEM/F12培养基是F12培养基和DMEM培养基按照1:1制备的。
进一步优选地，上述COMR完全培养基需经过0.22μm孔径滤膜过滤后使用。
人正常肾小管原代细胞XHRN-01通过上述体外分离培养方法，获得人正常肾小管原代细胞XHRN-01的子代细胞，继续培养，细胞增殖时间为2-3天，传代10代时细胞状态正常，形成人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞系，构建人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞模型，用于体内外肾相关疾病的发病机制分析、药物敏感性研究分析或药物毒性研究分析。
药物敏感性研究分析或药物毒性研究分析的原理是将测试药物添加至人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞模型中，药物发挥作用后，监测细胞增殖的抑制或细胞凋亡的相关数据，评价药物对肾小管细胞的毒性反应，具体包括以下步骤：
(1)将2000个/孔的人正常肾小管原代细胞XHRN-01或其子代细胞接种于96孔细胞培养板的板孔中，培养24小时；
(2)将测试药物稀释成不同浓度作用于细胞，药物作用96小时后测定细胞活力，计算不同浓度药物对细胞增殖抑制能力，用以评估测试药物对目标细胞的细胞毒性/肾毒性。
优选地，上述步骤(2)所述计算不同浓度药物对细胞增殖抑制能力的方法为本领域常规检测的计算方法，包括MTT法、CCK-8法。
进一步优选地，本发明采用CCK-8法，其原理为：CCK-8检测试剂盒中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，其在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中脱氢酶还原，产生具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。利用这一特性，通过计算甲瓒物的数量得出活细胞的数量，分析细胞增殖和毒性的数据。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的人正常肾小管原代细胞XHRN-01，经STR基因分型鉴定，人正常肾小管原代细胞XHRN-01属于人类细胞，且在国内外从未被登记注册，性状稳定，经染色体核型分析鉴定为正常的人二倍体细胞。
(2)本发明提供的人正常肾小管原代细胞XHRN-01，对DNA损伤应答正常，特异性标记物CK18表达阳性，人正常肾小管原代细胞XHRN-01体外增殖无异常，无致瘤性，且增殖性标记物Ki67表达阳性，说明体外传代细胞增殖活力旺盛，有利于构建细胞模型。
(3)本发明提供的人正常肾小管原代细胞XHRN-01，与导入HPV-16E6/E7基因而获得永生化的人正常肾近曲小管细胞HK-2细胞系相比，人正常肾小管原代细胞XHRN-01具有正常p53信号通路，对肾毒性药物DDP(顺铂)的细胞毒性/肾毒性反应更加敏感，对肝毒性药物CTX(环磷酰胺)的反应更为灵敏准确，为人体正常细胞的生理学研究、体外正常细胞药物毒性研究、肾脏及其相关疾病包括肾癌、慢性肾炎及感染性疾病的发病机理及治疗药物筛选研究提供了更接近于临床生物学特性的实验材料和模型。
附图说明
图1为实施例1人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞形态图，放大倍数为100；
图2为实施例1人正常肾小管原代细胞XHRN-01的染色体核型分析图；
图3为实施例1人正常肾小管原代细胞XHRN-01的STR基因分型图；
图4为实施例2人正常肾小管原代细胞XHRN-01传代培养的生长曲线图；
图5为实施例2人正常肾小管原代细胞XHRN-01的特异性标记物CK18免疫组化图，放大倍数为200；
图6为实施例2人正常肾小管原代细胞XHRN-01的增殖性标记物Ki67免疫组化图，放大倍数为200；
图7为实施例2人正常肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2的软琼脂克隆形成实验结果图，放大倍数为200；
图8为实施例2人正常肾小管原代细胞XHRN-01的软琼脂克隆形成实验结果图，放大倍数为200；
图9为实施例2人肾癌细胞系786-0的软琼脂克隆形成实验结果图，放大倍数为200；
图10为应用例人正常肾小管原代细胞的DNA损伤应答实验中p53蛋白和p21蛋白的表达结果图；
图11为应用例中DDP和CTX对人正常肾小管原代细胞XHRN-01的肾毒性反应检测结果示意图；
图12为应用例中DDP对HK-2细胞系和人正常肾小管原代细胞XHRN-01的药物毒性检测结果示意图；
图13为应用例中CTX对HK-2细胞系和人正常肾小管原代细胞XHRN-01的药物毒性检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，或按照制造厂商所建议的条件，室温为26℃，本发明所用的原料或试剂除特别说明外，均市售可得。
实施例1：人正常肾小管原代细胞XHRN-01的体外分离培养和鉴定
1、人正常肾小管原代细胞XHRN-01的体外分离培养
(1)通过医院伦理委员会，经透明细胞癌患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉协和医院获得新鲜的临床肾癌旁切除组织标本，经病理结果验证，无癌细胞侵袭或转移。
(2)获得的组织标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000U/mL青霉素、1000μg/mL硫酸链霉素、2.5μg/mL两性霉素和50μg/mL的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，在4h内运输至实验室进行细胞分离。
(3)体外分离培养：
S1.获得的组织标本在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，再1xPBS(pH7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状；
S2.加入20mL消化液即含1xI型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的DMEM培养基，消化肿瘤组织，时间为2h；
S3.用100μm滤膜过滤步骤S2消化后的组织样本，1000rpm离心5min，收集细胞沉淀。
S4.向步骤S3收集的细胞沉淀中加入10mL红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，室温裂解5min后，1000rpm离心5min，收集细胞沉淀；
S5.向S4得到的细胞沉淀中加入5mL 1xPBS(pH7.2-7.4)，1000rpm离心5min，收集细胞沉淀；
S6.COMR完全培养基重悬S4得到的细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％CO2条件下进行培养，获得人正常肾小管原代细胞；
所述COMR完全培养基包括DMEM/F12培养基、1mM丙酮酸钠、5％胎牛血清、1x非必需氨基酸、10ng/mL硒酸钠、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、1mg/mL抗坏血酸、0.6mg/mL牛胆汁及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B，其中DMEM/F12培养基是F12培养基和DMEM培养基按照1:1制备的。
以下步骤中所述COMR完全培养基成分均与此相同。
按照上述方法分离培养成功的人正常肾小管原代细胞，显微镜下观察细胞形态，见图1，低密度状态下细胞多呈多角形，高密度状态下细胞呈铺路石状，细胞排列紧密，细胞分类命名为人正常肾小管原代细胞XHRN-01，已于2019年保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C201970。
2、人正常肾小管原代细胞XHRN-01的染色体核型分析鉴定
鉴定分析获得的人正常肾小管原代细胞XHRN-01的核型，包括以下步骤：
(1)细胞接种次日早晨打开水浴箱调至37℃，将低渗液放入水浴箱中，待水温恒定后，用温度计监测低渗液的温度，当低渗液温度也达到37℃时方可使用；
(2)向每一个培养基中加入秋水仙素80μL，来回混匀3次后放入培养箱中继续培养30min；
(3)胰酶消化收集细胞，将细胞悬液缓缓倒入离心管中，1500rpm转离心5min后，用真空泵吸取上清液；
(4)将预热好的低渗液缓缓加入到离心管中，用一次性吸管轻轻吹打混匀。再放入水浴箱中低渗30min；
(5)将离心管从水浴箱中取出，在通风橱中每支离心管加固定液(即甲醇:乙酸＝3:1)1mL，用一次性吸管轻轻吹打混匀后，1500rpm离心5min；
(6)取出已离心的样本，用真空泵吸取上清液，再向每支离心管中加入固定液8mL，轻轻吹打混匀，静置30min后，1500转离心5min，除去上清液，再加入固定液8mL静置10min；
(7)将固定好的悬液以1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mL固定液(视沉淀物多少可适量加减固定液)混匀；
(8)将固定好的细胞悬液滴片，滴片后在低倍显微镜下观察，细胞间距在2个细胞到3个细胞之间且没有重叠，分裂相较多时可见分裂相分散良好即为合格，则该浓度的细胞悬液最佳；
(9)使用HANABI Ver.2.0b染色体中期分散仪滴片：每张片上滴2滴，每滴液体是用移液枪吸取12μL细胞悬液滴加，将滴加好液体的玻片放入75℃烤箱中烘烤过夜。
(10)烘烤后玻片用吉姆萨染色，染色前用胰酶处理10s，生理盐水漂洗3次，再进行染色，以紫红色为标准，颜色合适后在水流下冲洗玻片，玻片上的残渣冲洗干净为宜。
(11)染色完毕后即可进行观察。
细胞染色体核型分析结果，见图2，分离所得的人正常肾小管原代细胞XHRN-01染色体未发现异常，为正常的人类二倍体细胞。
3、人正常肾小管原代细胞XHRN-01的STR基因分型鉴定
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10-60次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，不同个体中具有唯一的一组STR序列重复次数，为个体的“基因身份证”，为细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
鉴定获得的人正常肾小管原代细胞XHRN-01的STR基因分型，具体步骤如下：
(1)收集新鲜培养的对数期贴壁人正常肾小管原代细胞XHRN-01，数量控制在106数量级；
(2)根据AxyPrep基因组DNA小剂量试剂盒(AP-MN-MS-GDNA)说明书提取细胞基因组DNA，用5′端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，计算各个短片段重复序列的重复数。
STR检测结果，见图3，以“STR基因座”来表示，人正常肾小管原代细胞XHRN-01检测的STR基因座包含21个位点，该种检测方法涉及位点均涵盖国际通用19个检测位点，21个STR基因座的等位基因是AMEL-X，CSF1P0-11/12，D12S391-18，D13S317-8/12，D16S539-11，D18S51-14/17，D19S433-13/15，D2S441-11/14，D21S11-28/29，D2S1338-17/24，D3S1358-15/17，D5S818-11，D6S1043-13/17，D7S820-8/11，D8S1179-10/14，FGA-22.2/24，Penta D-9/11，PentaE-11/14，TH01-7/9，TPOX-9/12，vWA-18/20。
由此证明，人正常肾小管原代细胞XHRN-01属于人类细胞，与现有已公开的细胞STR基因型位点对比，发现人正常肾小管原代细胞XHRN-01在国内外未被登记注册，为新发现的人正常肾小管原代细胞。
实施例2：人正常肾小管原代细胞XHRN-01传代培养和鉴定
1、人正常肾小管原代细胞XHRN-01的传代培养
将实施例1获得的人正常肾小管原代细胞进行传代培养，具体步骤如下：
S7.当人正常肾小管原代细胞XHRN-01在T25培养瓶中培养的细胞丰度达到80％时，用1xPBS(pH7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1mLAccuse消化液，消化单层细胞3-5min。
S8.消化反应结束后，1000rpm离心5min，去上清，收集细胞悬液，用1mL COMR完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入T25培养瓶中进行培养。
所述COMR完全培养基与实施例1中COMR完全培养基的成分相同，包括：在DMEM/F12培养基中添加1mM丙酮酸钠、5％胎牛血清、1x非必需氨基酸、10ng/mL硒酸钠、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、1mg/mL抗坏血酸及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、0.6mg/mL牛胆汁，其中DMEM/F12培养基是F12培养基常和DMEM培养基按照1:1制备的。
以下步骤中所述COMR完全培养基成分均与此相同。
按照上述方法传代培养获得人正常肾小管原代细胞XHRN-01的子代细胞，传代培养的细胞生长曲线，见图4，连续传代50天，本发明的人正常肾小管原代细胞XHRN-01的生长增殖状态仍能保持正常，镜下观察细胞形态未发生变化。
2、人正常肾小管原代细胞XHRN-01的特异性标记物表达鉴定
上述获得的人正常肾小管原代细胞XHRN-01培养后，鉴定细胞的特异性标记物表达，具体步骤如下：
(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
(2)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)；
(4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
(5)吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足量的已稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
(6)第二天用PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后，滴加已稀释好的二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
(7)DAB显色3-5min，自来水充分涮洗；
(8)苏木素复染5min，自来水充分涮洗；
(9)盐酸酒精分化10s，自来水冲洗2min后，再用氨水反蓝2min，自来水充分冲洗；
(10)依次通过梯度酒精，再过2遍的二甲苯，流水冲洗2min；
(11)中性树脂封片观察。
染色结果见图5、6，其中图5为人正常肾小管原代细胞XHRN-01的特异性标记物CK18表达结果示意图，图6为人正常肾小管原代细胞XHRN-01的增殖性标记物Ki67表达结果示意图，数据显示体外分离得到的人正常肾小管原代细胞XHRN-01的特异性标记物CK18及增殖性标记物Ki67表达结果均为阳性，证明得到的人正常肾小管原代细胞XHRN-01与人体内正常肾细胞基本一致，且人正常肾小管原代细胞XHRN-01的体外传代细胞增殖活力旺盛。
3、人正常肾小管原代细胞XHRN-01的软琼脂克隆形成实验结果
(1)不同浓度低熔点琼脂糖溶液准备：用超纯水分别配制1.4％和0.7％两个浓度的琼脂糖溶液，高压灭菌后维持在40℃水浴中保持其溶液状态。
(2)以1：1比例混合1.4％琼脂糖和2xCOMR培养基或2xDMEM培养基，迅速混匀后倒入6孔板，每孔倒入2mL，室温冷却30min使其凝固后备用，每株细胞做三个复孔。
(3)0.7％琼脂糖和含有细胞的培养基以1：1比例混合，即琼脂糖和2xCOMR培养基中加入人正常肾小管原代细胞，琼脂糖和2xDMEM培养基中加入HK-2细胞系或786-0细胞系，迅速混匀后加入适量细胞悬液，保持每孔1000细胞量，充分混匀后铺入含有1.4％琼脂糖底层平皿中，室温放置使其凝固后置入37℃，5％CO2培养箱培养2周。
(4)于显微镜下观察平皿中克隆形态以判断细胞的致瘤性。
由图7、8、9可知，人正常肾小管原代细胞XHRN-01在软琼脂中无法形成克隆，培养2周后细胞无明显增殖；而人肾癌细胞系786-0能在软琼脂形成明显且较大的细胞克隆，人为构建成系的人正常肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2在软琼脂上无明显增殖，上述结果说明人正常肾小管原代细胞在体外无异常增殖及致瘤性。
应用例1:人正常肾小管原代细胞XHRN-01和HK-2细胞的DNA损伤应答实验
(1)将人正常肾小管原代细胞XHRN-01和HK-2细胞分别接种到直径10mm的细胞培养皿中，接种量为5x105。
(2)细胞放置37℃，5％CO2培养箱中24h后，加入0.5nM的放线菌素D(Act D)，继续培养24h，同时以未加药物的细胞作为阴性对照。
(3)药物作用24h后收集细胞沉淀，加入RIPA裂解液收集蛋白质做蛋白免疫印记(WB)，步骤如下：
①蛋白收集：放线菌素D作用细胞24h后，弃去培养基，用预冷的PBS漂洗细胞3次，加入RIPA裂解液，冰上裂解15min，反复吹打后将含有细胞碎片的裂解液转移至1.5mL离心管中，置于4℃，12000rpm离心20min，收集上清弃沉淀。
②BCA法测定蛋白浓度，根据BCA检测试剂盒操作说明，以BSA为标准品制作标准曲线，计算各蛋白样品的总蛋白量。
③根据总蛋白浓度计算蛋白上样量(总上样量为50ug)，将蛋白样品和5x上样缓冲液置于沸水中煮5min，使蛋白完全变性，瞬时离心后收集上清。
④SDS-PAGE凝胶电泳：制备12％的分离胶和5％的浓缩胶，将处理后的样品加入凝胶微孔，放于4℃冰箱中恒压80v电泳30min，此时溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，再调电压至120V约1.5h后，溴酚蓝移动到凝胶底部，停止电泳。
⑤转膜：将PVDF膜放置甲醇中激活30s，转移液中浸泡5-10min。取下凝胶，根据Marker切下目的条带，按照正→负(海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵)的顺序放入电转槽，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜。4℃条件下稳流转膜(200mA)，不同蛋白所用时间不同，p21转膜70min，p53转膜120min，β-actin转膜90min。
⑥封闭：5％BSA TBST溶液，室温摇床封闭2h。
⑦孵育一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。抗体稀释浓度如下：β-actin为1：200，p21为1:200，p53为1:1000。
⑧孵育二抗：用封闭液稀释相应的HRP标记二抗---1:50000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h。
⑨显影：将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀制成工作液，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟，待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。
细胞DNA损伤应答反应实验结果，见图10，在HK-2细胞系中，p53和p21蛋白的表达量在Act D处理前后均无显著变化，而人正常肾小管原代细胞XHRN-01经过Act D处理后，相比对照组HK-2细胞，其p53蛋白的表达量上调，下游信号分子p21蛋白的表达量也同时上调，说明人正常肾小管原代细胞XHRN-01对DNA损伤有正常的应答能力。
应用例2：人正常肾小管原代细胞XHRN-01和HK-2细胞的药物毒性检测
(1)0.05％胰酶分别消化人正常肾小管原代细胞XHRN-01和HK-2，按照常规培养方法分别制备XHRN-01和HK-2的细胞悬液，以每孔2000个细胞分别接种于96孔板的空白孔中，每孔加100μL悬液，置于37℃、5％CO2培养箱培养24h。
(2)每孔加入10μL不同浓度药物，DDP(顺铂)和CTX(环磷酰胺)药物浓度(μM)均设置为0.1、1、10、100、1000，每种药物浓度设置3个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不含药物)、空白对照孔(只含培养基)，每组设置3个复孔。
(3)药物加入后放入37℃，5％CO2培养箱继续培养96h，吸去孔内液体，每孔加入10μLCCK-8检测试剂。
(4)根据试剂盒说明，上述体系在培养箱中继续培养0.5-4h，根据细胞量的多少确定孵育时间(可参考液体颜色变化)，吸光度范围控制在1.0-1.5之间最好。
(5)测定450nm处的吸光度。
细胞肾毒性实验结果，见图11，人正常肾小管原代细胞XHRN-01对于不同的药物呈现出不同的毒性反应，在药物作用浓度条件下，低浓度和高浓度的肝毒性药物CTX对于人正常肾小管原代细胞XHRN-01无明显的肾毒性；而肾毒性药物DDP随着药物浓度的增加，人正常肾小管原代细胞XHRN-01的肾毒性反应明显且具有浓度梯度依赖性，100μM的DDP对人正常肾小管原代细胞XHRN-01的肾毒性达到100％。
由图12可知，肾毒性药物DDP对HK-2细胞系和人正常肾小管原代细胞XHRN-01的药物毒性检测结果发现，虽然两种细胞系总的抑制率一致，无明显差异，但数据曲线可以看出人正常肾小管原代细胞XHRN-01对DDP的毒性反应更为敏感，在1μM-100μM不同浓度的DDP，人正常肾小管原代细胞XHRN-01毒性反应的抑制率的变化趋势比HK-2细胞系更明显。
由图13可以得出，在1μM-1000μM不同浓度肝毒性药物CTX条件下检测，两种细胞系总的反应趋势明显不同，XHRN-01细胞对CTX毒性反应抑制率≤0，未表现出毒性作用，而同等浓度条件下，HK-2细胞表现出一定的毒性反应，尤其是CTX高浓度条件下，HK-2细胞抑制率较高达到15％以上，体现了HK-2细胞改造后，其对于药物的毒性反应与真正意义上的原代细胞有明显差异，HK-2细胞不能准确地反映临床结果，反之，XHRN-01细胞对CTX的毒性反应更能反映临床结果。
以上数据表明人正常肾小管原代细胞XHRN-01对于不同药物毒性检测的敏感度和区分度，且灵敏度高于HK-2细胞系，因此，利用人正常肾小管原代细胞XHRN-01建立体外细胞模型更有利于筛选和评价药物肾毒性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种人正常肾小管原代细胞，其特征在于，分类名命为人正常肾小管原代细胞XHRN-01，保藏编号为CCTCC NO：C201970。
2.根据权利要求1所述人正常肾小管原代细胞，其特征在于，所述人正常肾小管原代细胞检测的STR基因座包含21个位点，所述STR基因座位点的等位基因具体是：AMEL-X、CSF1P0-11/12、D12S391-18、D13S317-8/12、D16S539-11、D18S51-14/17、D19S433-13/15、D2S441-11/14、D21S11-28/29、D2S1338-17/24、D3S1358-15/17、D5S818-11、D6S1043-13/17、D7S820-8/11、D8S1179-10/14、FGA-22.2/24、Penta D-9/11、Penta E-11/14、TH01-7/9、TPOX-9/12、vWA-18/20。
3.一种权利要求1或2所述人正常肾小管原代细胞的应用，其特征在于，用于针对体内外肾相关疾病的发病机制分析、药物敏感性研究或药物毒性研究，构建体外细胞模型。
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