CN110904043B - 人肠癌原代细胞、应用和培养方法 - Google Patents

人肠癌原代细胞、应用和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人肠癌原代细胞、应用和培养方法，该人肠癌原代细胞命名为HCOC‑731，保藏号为CGMCC NO.18527。保藏地址为：中国，北京。本发明的人肠癌原代细胞可用于在癌症相关疾病的发病机理研究中的应用、在药物敏感性研究和检测中的应用以及在抗肿瘤药物研究中的应用。本方案与现有纯化培养过程所培养出的肿瘤原代细胞的细胞状态相比，该人肠癌原代细胞的细胞状态更好。

Description

人肠癌原代细胞、应用和培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及人肠癌原代细胞、应用和培养方法。
背景技术
肠癌是常见的消化道疾病，一般原代培养的肿瘤细胞由于组织刚刚离体，其生物学特性未发生很大变化，仍保留原遗传特性，基因保留量在90％以上，适用于生化分子实验和药物敏感性试验及机制探究相关试验，其数据更具有说服力。建立人肠癌原代细胞对于细胞株的建立、药敏检测实验、个性化治疗和肠癌的发病及其治疗机制的研究具有重要意义。
目前，通常单纯依靠酶消化法进行人肠癌原代细胞的获得。但是，此方法可能由于过度消化，会引起细胞状态差或者死亡，进而导致人肠癌原代细胞培养失败。
发明内容
本发明实施例提供了人肠癌原代细胞、应用和培养方法，能够培养出状态良好的人肠癌原代细胞。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了人肠癌原代细胞，其命名为人肠癌原代细胞HCOC-731，保藏号为CGMCC NO.18527。
优选地，
所述人肠癌原代细胞HCOC-731的核型为：染色体数目为56条，超二倍体核型。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的人肠癌原代细胞在癌症相关疾病的发病机理研究中的应用。
第三方面，本发明还提供了一种第一方面所述的人肠癌原代细胞在抗肿瘤药物研究中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种第一方面所述的人肠癌原代细胞在药物敏感性研究和检测中的应用。
第五方面，本发明提供了一种人肠癌原代细胞的培养方法，包括：
利用清洗液清洗肠癌组织，其中，所述清洗液包括：含有抗生素的生理盐水；
利用细胞分散酶对清洗后的肠癌组织进行消化处理；
利用细胞消化液将所述细胞分散酶消化处理后得到的细胞进行消化处理；
利用含血清培养基和无血清培养基培养所述细胞消化液消化处理后得到的细胞，其中，所述含血清培养基，包括：DF培养基、10％胎牛血清FBS和所述抗生素，所述无血清培养基包括：DF培养基、添加物和所述抗生素；
当培养的细胞的汇合度达到70-90％时，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式对培养的细胞进行纯化，获得人肠癌原代细胞。
具体地，细胞分散酶可以为：含有1-10mg/ml的胶原酶Ⅰ和0.2-2mg/ml透明质酸酶的混合物。
针对胶原酶Ⅰ的浓度来说，1-10mg/ml是指1mg/ml到10mg/ml范围内的任一浓度，比如，1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml以及10mg/ml。
针对透明质酸酶的浓度来说，0.2-2mg/ml是指0.2mg/ml到2mg/ml范围内的任一浓度，比如，0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml以及2mg/ml。
优选地，
所述添加物，包括：谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子EGF、氢化可的松和牛血清白蛋白BSA。
优选地，
所述抗生素，包括：青霉素、硫酸卡那霉素、两性霉素B和万古霉素。
具体地，无血清培养基的添加物中，谷氨酰胺的浓度为1-5mM、胰岛素的浓度为5-30mg/L、转铁蛋白的浓度为5-20mg/L、亚硒酸钠的浓度为5-20μg/L、EGF的浓度为5-20μg/L、氢化可的松的浓度为10-100nM以及BSA的浓度为1-5mg/ml。
具体地，上述无血清培养基、含血清培养基以及清洗液中的抗生素中，青霉素的浓度为0.1-0.5mg/ml、硫酸卡那霉素的浓度为0.1-0.5mg/ml、两性霉素B的浓度为0.25-0.5μg/ml以及万古霉素的浓度为1-5μg/ml。
具体地，清洗液中青霉素浓度为0.1-0.5mg/ml、硫酸卡那霉素浓度为0.1-0.5mg/ml、两性霉素B浓度为0.25-0.5μg/ml、万古霉素浓度为1-5μg/ml。
针对谷氨酰胺的浓度来说，1-5mM是指1mM到5mM范围内的任一浓度，比如，1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM以及5mM。
针对胰岛素的浓度来说，5-30mg/L是指5mg/L到30mg/L范围内的任一浓度，比如，5mg/L、5.5mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L、14mg/L、16mg/L、18mg/L、20mg/L、22mg/L、24mg/L、26mg/L、28mg/L以及30mg/L。
针对转铁蛋白的浓度来说，5-20mg/L是指5mg/L到20mg/L范围内的任一浓度，比如，5mg/L、5.5mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L、14mg/L、16mg/L、18mg/L以及20mg/L。
针对亚硒酸钠的浓度来说，5-20μg/L是指5μg/L到20μg/L范围内的任一浓度，比如，5μg/L、5.5μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12μg/L、14μg/L、16μg/L、18μg/L以及20μg/L。
针对EGF的浓度来说，5-20μg/L是指5μg/L到20μg/L范围内的任一浓度，比如，5μg/L、5.5μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12μg/L、14μg/L、16μg/L、18μg/L以及20μg/L。
针对氢化可的松的浓度来说，10-100nM是指10nM到100nM范围内的任一浓度，比如，10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM以及100nM。
针对BSA的浓度来说，1-5mg/ml是指1mg/ml到5mg/ml范围内的任一浓度，比如，1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml以及5mg/ml。
针对青霉素的浓度来说，0.1-0.5mg/ml是指0.1mg/ml到0.5mg/ml范围内的任一浓度，比如，0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml以及0.5mg/ml。
针对硫酸卡那霉素的浓度来说，0.1-0.5mg/ml是指0.1mg/ml到0.5mg/ml范围内的任一浓度，比如，0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml以及0.5mg/ml。
针对两性霉素B的浓度来说，0.25-0.5μg/ml是指0.25μg/ml到0.5μg/ml范围内的任一浓度，比如，0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml以及0.5μg/ml。
针对万古霉素的浓度来说，1-5μg/ml是指1μg/ml到5μg/ml、范围内的任一浓度，比如，1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml以及5μg/ml。
优选地，
所述利用含血清培养基和无血清培养基培养所述细胞消化液消化处理后得到的细胞，包括：
通过200-300μm尼龙膜过滤所述细胞消化液消化处理后得到的细胞，收集过滤后的细胞；
在1000-2000rpm下离心3-8min，移除上清液，并利用所述含血清培养基对移除上清液后的细胞沉淀进行重悬，将重悬后的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
当培养的细胞完全贴壁生长后，将所述含血清培养基换为无血清培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
具体地，在对肿瘤细胞进行培养时，需要先利用尼龙膜进行过滤，以滤除非肿瘤组织，例如脂肪组织，然后对过滤后的细胞进行离心处理，取沉淀细胞，并利用含血清培养基进行重悬接种至细胞培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱中培养24-72h，以使细胞完全贴壁生长。
优选地，
所述采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式对培养的细胞进行纯化，获得人肠癌原代细胞，包括：
移除培养的细胞中的所述无血清培养基，并用EDTA-Trypsin消化处理；
显微镜下观察，弃掉EDTA-Trypsin先消化下来的成纤维细胞，再边消化边收集消化处理后的细胞，收集的细胞用DF10培养基终止消化，直至所有细胞均消化完成；
顺次在1000-2000rpm下离心3-8min，移除上清液，并用所述无血清培养基将移除上清液后的细胞沉淀重悬，并将重悬后的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中10-120min，使成纤维细胞贴壁；
收集未贴壁的人肠癌原代细胞，并继续培养，反复贴壁2-5次，获得人肠癌原代细胞。
具体地，在对培养的细胞纯化过程中，需要先去除无血清培养基，然后加入EDTA-Trypsin(即，胰蛋白酶-EDTA消化液)，显微镜下观察细胞皱缩变圆，弃掉EDTA-Trypsin先消化下来的成纤维细胞，再边消化边收集消化处理后的细胞，收集的细胞用DF10培养基终止消化，直至所有细胞均消化完成，然后离心去上清，顺次用无血清培养基重悬，并在37℃、5％CO2细胞培养箱中放置10-120min，成纤维细胞贴壁后再将未贴壁的人肠癌原代细胞收集起来，转入新的细胞培养瓶继续培养，反复贴壁2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用，同时还可以避免因过度消化导致细胞状态差或者死亡。
可以理解的是，EDTA-Trypsin的量，略盖过培养的细胞即可。一般25cm2细胞培养瓶采用1-2ml的EDTA-Trypsin。
具体地，DF10培养基包括：DF培养基和10％FBS。
具体地，EDTA-Trypsin消化时间为5-60min。
优选地，
所述利用细胞分散酶对清洗后的肠癌组织进行消化处理，包括：
将清洗后的肠癌组织剁成碎泥状；
将碎泥状的肠癌组织在1000-2000rpm下离心3-8min，移除上清液，并向移除上清液后的细胞沉淀中加入DF培养基进行重悬；
顺次加入细胞分散酶，置于37℃、5％CO2培养箱中低速振荡消化0.5-2h，再加入DF10培养基终止反应，吹散混匀；
顺次在1000-2000rpm下离心3-8min，移除上清液，得到所述细胞分散酶消化后的细胞。
具体地，为了便于肠癌组织后续消化成适宜大小的肿瘤细胞，在肠癌组织消化前需要将其剁成碎泥状，然后离心移除上清，以去除肠癌组织中的杂质，例如，脂肪组织、膜组织、结缔组织以及坏死组织。再加入DF培养基进行重悬，然后利用细胞分散酶在低速振荡条件下分散肠癌组织，防止细胞结块。消化结束后利用DF10培养基进行终止消化，吹散混匀，并进行离心去除上清，保留沉淀细胞。
优选地，
所述利用细胞消化液将所述细胞分散酶消化处理后得到的细胞进行消化处理，包括：
向所述细胞分散酶消化处理后得到的细胞中加入细胞消化液，吹散混匀，室温静置3-8min，加入所述DF10培养基终止反应，吹散混匀，得到所述细胞消化液消化后的细胞。
具体地，在得到分散的细胞后，再加入细胞消化液，再利用DF10培养基终止反应，吹散混匀，离心去除上清液，得到细胞消化液消化后的细胞。
具体地，细胞消化液可以是EGTA-Trypsin。
本发明实施例提供了人肠癌原代细胞、应用和培养方法，通过清洗液对肠癌组织进行清洗前处理，以去除杂质，顺次通过细胞分散酶和细胞消化液在不损害细胞膜的前提下，使清洗后的肠癌组织被消化成适宜大小的肿瘤细胞，再利用含血清培养基和无血清培养基进行培养。由于清洗液、含血清培养基以及无血清培养基中均含有抗生素，可以在清洗肠癌组织以及在培养肿瘤细胞时起到抑菌杀菌作用，以防止污染影响细胞正常培养。当细胞的汇合度达到70-90％时，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式进行纯化，避免纯化过程中因过度消化导致细胞状态差或者死亡，以得到状态良好、无成纤维细胞等杂质细胞的人肠癌原代细胞，提高人肠癌原代细胞培养的成功率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的细胞形态图；
图2是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的生长曲线图；
图3是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的免疫荧光鉴定结果图；
图4是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的染色体核型分析图；
图5是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的STR基因分型图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：人肠癌原代细胞的分离培养
(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集病人手术时切除的部分肠癌组织；
(2)将步骤(1)收集的肠癌组织转移至细胞培养皿中，用清洗液(含0.3mg/ml青霉素、0.3mg/ml硫酸卡那霉素、0.3μg/ml两性霉素B、3μg/ml万古霉素的生理盐水)冲洗6次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质；
(3)将步骤(2)中清洗处理后的肠癌组织转移至新的培养皿中，用剪刀和刀片将清洗处理后的肠癌组织剪成小块并剁成碎泥状；
(4)将碎泥状的肠癌组织转移至50ml离心管中，在1500rpm离心5min，移除上清液，顺次加入9ml DF培养基进行重悬，顺次再加入1ml含有5mg/ml的胶原酶Ⅰ和1mg/ml透明质酸酶的细胞分散酶，在37℃、5％CO2培养箱中低速振荡消化1h；细胞分散酶反应结束后，加入20ml DF10培养基终止反应，吹散混匀；并在1500rpm离心5min，移除上清液，取细胞沉淀；
(5)向步骤(4)得到的细胞沉淀加入5ml EGTA-Trypsin溶液，混匀，室温静置5min，顺次加入20ml DF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞消化液消化后的细胞；
(6)将步骤(5)得到的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50ml离心管中，1500rpm离心5min，移除上清液，取细胞沉淀；
(7)将步骤(6)中的细胞沉淀用10ml含血清培养基重悬接种至25cm2的培养瓶中，顺次置于37℃、5％CO2培养箱中过夜(24h)培养。
(8)当培养的细胞完全贴壁生长后，将含血清培养基换为无血清培养基，并置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
实施例2：人肠癌原代细胞的纯化
(1)当实施例1的步骤(8)中培养的细胞的汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基，用1-2ml EDTA-Trypsin消化处理；
(2)显微镜下观察待细胞从培养瓶中脱离下来，弃掉EDTA-Trypsin先消化下来的成纤维细胞，再边消化边收集消化处理后的细胞，收集的细胞用DF10培养基终止消化，直至所有细胞均消化完成；
(3)1000rpm离心5min，移除上清液，用无血清培养基重悬，并在37℃、5％CO2细胞培养箱中放置1h，成纤维细胞贴壁后再将未贴壁的细胞收集起来，转入新的培养瓶继续培养，反复贴壁5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用，获得人肠癌原代细胞HCOC-731。
具体地，考虑到已纯化的人肠癌原代细胞通常可进一步做传代培养，且由于人肠癌原代细胞已纯化，故可使用无血清培养基来做传代培养。因此，实施例2中使用无血清培养基来培养细胞时，反复贴壁直至清除全部成纤维细胞时的人肠癌原代细胞无需离心，即可进行传代培养，从而可以避免因离心操作对人肠癌原代细胞的损伤影响。
实施例3：形态学观察
通过在倒置显微镜下观察可以发现，经过实施例1和2之后培养出的人肠癌原代细胞为上皮样细胞形态，癌细胞团中，细胞大小、形态不等，失去极性，排列紊乱，癌细胞增殖快，无接触抑制，互相挤压，呈堆叠状或镶嵌状。具体结果详见图1。
实施例4：人肠癌原代细胞的传代培养
(1)取实施例2步骤(3)得到的人肠癌原代细胞，当细胞汇合度达到70-90％时，用1倍浓度(1×)磷酸缓冲盐溶液PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和脱落的状态差的细胞，再用1-2ml EDTA-Trypsin消化5-60min。
(2)显微镜下观察，边消化边收集消化处理后的细胞，收集的细胞用DF10培养基终止消化，直至所有细胞均消化完成。
(3)顺次在1000-2000rpm下离心3-8min，移除上清液，再用无血清培养基重悬，接种于新的培养瓶中，顺次在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
(4)必要时可将(1×106个)人肠癌原代细胞重悬于1～2ml的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。
实施例5：人肠癌原代细胞的生长曲线测定
(1)取实施例2步骤(3)得到的人肠癌原代细胞，当细胞汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基，用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和飘浮的状态差的细胞，用1-2ml EDTA-Trypsin消化处理，并用含血清培养基终止消化。
(2)细胞以5×104/ml接种至96孔板，200μl/孔；
(3)24h后开始进行测定，以后每隔24h测定一次，分别进行吸光度测定，计算平均值；
(4)测定时用终浓度为100μg/ml的中性红染色2h，再用PBS清洗3次后加入中性红洗脱液(水：乙醇：乙酸＝49：50：1)振荡混匀10min，于550nm处测吸光光度值，连续测定10天。
下述表1为人肠癌原代细胞HCOC-731人肠癌原代细胞的生长曲线数据。
表1
时间(天) 相对OD值(平均)(550nm) 误差
1 0.0319 0.0060
2 0.0546 0.0078
3 0.1047 0.0212
4 0.1391 0.0304
5 0.1666 0.0249
6 0.2863 0.0286
7 0.3678 0.0698
8 0.4516 0.0572
9 0.5738 0.0538
10 0.7279 0.0683
从上述表1可以看出人肠癌原代细胞HCOC-731连续10天生长良好。人肠癌原代细胞HCOC-731的生长曲线如图2所示。其中，图2的横坐标为培养时间，单位为(天)，纵坐标为OD值。
具体地，人肠癌原代细胞HCOC-731的癌细胞倍增时间为24-72h。体外培养状态稳定，生长活跃，第五天进入对数期。
实施例6：人肠癌细胞的免疫荧光鉴定
(1)取实施例2步骤(3)得到的人肠癌原代细胞，当人肠癌原代细胞汇合度达到70-90％左右，移除无血清培养基，用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和飘浮的状态差的细胞，用1-2ml EDTA-Trypsin消化，接种至48孔板。
(2)当细胞汇合度达70％-90％时，去除无血清培养基，PBS清洗3次，加入500μl/孔冰甲醇，固定30min后移除。
(3)加入200μl/孔2.5％BSA封闭液，室温封闭60min后吸出封闭液。
(4)加入150μl/孔第一抗体(CK18 1:800稀释，CR 1:1000稀释)；37℃孵育2h后吸出。
(5)加入150μl/孔的荧光二抗(二抗Anti-Mouse-IgG-FITC 1：100稀释；Cy3标记山羊抗兔IgG 1：500稀释)，室温避光孵育1h，吸出二抗，PBS洗涤3次。
(6)加入150μl/孔的PBS，荧光拍照，物镜×目镜(20×10)。
具体地，细胞角蛋白(Keratin，CK)是上皮细胞的常见标志物，上皮细胞及其来源的肿瘤细胞中只表达CK，而不表达钙视网膜蛋白(Calretinin，CR)。经免疫荧光鉴定发现，该人肠癌原代细胞CK强表达，CR不表达，说明该人肠癌原代细胞来源于上皮细胞，具体结果详见图3。
实施例7：人肠癌原代细胞的染色体核型分析鉴定
(1)细胞培养：取实施例2步骤(3)得到的人肠癌原代细胞，当细胞汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基培养，用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和脱落的状态差的细胞，用1-2ml EDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集消化处理后的细胞，收集的细胞用DF10培养基终止消化，直至所有细胞均消化完成。1000rpm离心5min，移除上清液。
(2)秋水仙素处理：向细胞沉淀中加入浓度为300μg/ml的秋水仙素20μl-25μl，37℃培养箱中处理25min。
(3)低渗处理：秋水仙素处理完毕后，离心(1300rpm，10min)，弃上清液。然后加入37℃水浴的0.075mol/L的KCL溶液低渗液至10ml，用吸管吹打成细胞悬液，置37℃水浴处理30-35min。
(4)预固定：低渗处理结束在每个离心管中加入1ml的固定液，继续37℃水浴，5min。
(5)离心：1300rpm，10min，弃上清液。
(6)固定：在离心管中加入固定液6-8ml，立即用吸管轻轻吹打成单个细胞悬液，在37℃水浴中固定30min后，1300rpm离心10min，弃上清液。
(7)第二次固定：在离心管中加入固定液6-8ml，立即用吸管轻轻吹打成单个细胞悬液，在37℃水浴中固定15min后，1300rpm离心10min，弃上清液。
(8)制片：在离心管中加入新固定液0.2ml左右，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，从冰箱的冷冻室内取出冰片，调到合适悬液，每片滴加悬液1-2滴，75℃烤3h。
(9)染色：用6％Giemsa染液染色10min，然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两面，室温干燥后镜检。
(10)镜检：待玻片干后，在显微镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。
本发明的人肠癌原代细胞经染色体核型分析鉴定为异型核型，即为超二倍体核型的肿瘤细胞，染色体数为56条，不同于人体正常细胞的核型，符合人恶性肿瘤的遗传特性。具体结果详见附图4。
实施例8：人肠癌原代细胞的短串联重复序列STR鉴定
(1)取实施例2步骤(3)的人肠癌原代细胞，将贴壁生长的人肠癌原代细胞(1×106个)用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞两次，顺次用1-2ml EDTA-Trypsin消化5-60min，10mlDF10终止消化反应；
(2)10000rpm离心1min，弃上清液，加200μl缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮；
(3)加入20μl Proteinase K溶液，混匀；
(4)加入200μl缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心；
(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液；
(7)向吸附柱中加入500μl缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液；
(8)向吸附柱中加入600μl漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液；
(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μl洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将提取的DNA溶液收集到离心管中；
(10)利用ABI 9700PCR扩增仪(ABI公司)进行21个基因座(20个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增；
(11)使用ABI 3130XL型遗传分析仪进行扩增片段的检测；
(12)使用GenoMapper3.2软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果见附图5，检测21个基因座，以“基因座/等位基因长度”来表示：D19S433/13/13，D5S818/11/12，D21S11/28/29，D18S51/16/16，D6S1043/12/18，AMEL/X/X，D3S1358/15/17，D13S317/8/12，D7S820/8/11，D16S539/12/13，CSFIPO/11/12，PentaD/9/12，D2S441/11/11，vWA/14/16，D8S1179/12/12，TPOX/8/8，PentaE/13/20，TH01/9/9，D12S391/19/21，D2S1338/24/24，FGA/21/22。
综上，将纯化后的人肠癌原代细胞进行STR鉴定，结果证实其为单一人类来源，且无交叉污染的细胞。
实施例9：人肠癌原代细胞药敏检测(CD-DST方法)
(1)胶原凝胶滴培养
取实施例2步骤(3)的人肠癌原代细胞，与凝胶构成液(Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ＝8:1:1)混合均匀，按照30μl/胶滴，3个胶滴/孔，将细胞悬液接种于6孔板中，同时在另一6孔板中接种3个胶滴，作为0-time对照组。1-2h后待胶滴凝固加入3mL含10％胎牛血清的DF培养基，于37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(2)抗癌药物接触与清洗
上述步骤(1)的人肠癌原代细胞培养24h后加入抗癌药物，设未用药物的阴性对照孔(Control)，及临床肠癌常用药处理的阳性对照孔，同时将0-time组进行染色固定。培养相应时间后，用DF培养基清洗2次，每次15min，然后用无血清培养基继续培养5天，其中第3天更换一次培养基。
(3)染色固定与扫描
第8天进行染色固定，终浓度为50μg/ml的中性红染色2h，PBS清洗细胞3次，每次5min，中性福尔马林固定45min，蒸馏水清洗15min，通风干燥，获得具有活性的肿瘤细胞。然后用Primage图像分析系统对胶滴进行扫描分析。
人肠癌原代细胞HCOC-731的药敏检测(CD-DST法)结果如下述表2：
表2
药物名称 细胞存活率
吉西他滨(GEM) 33.53
替吉奥胶囊(TS-1) 21.71
卡培他滨+奥沙利铂(XELOX) 15.81
伊立替康(CPT-11) 50.40
奥沙利铂+氟尿嘧啶(FOLFOX) 17.20
上述人肠癌原代细胞可用于吉西他滨(GEM)、替吉奥胶囊(TS-1)、卡培他滨+奥沙利铂(XELOX)、伊立替康(CPT-11)和奥沙利铂+氟尿嘧啶(FOLFOX)的药物有效性评价。
上述人肠癌原代细胞命名为HCOC-731，于2019年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC NO.18527。
需要说明的是：
上述实施例中的无血清培养基为：DF培养基(即，DME/F-12 1:1培养基)，DF培养基的添加物为3mM谷氨酰胺、3mg/L胰岛素、3mg/L转铁蛋白、10μg/L亚硒酸钠、10μg/L EGF，50nM氢化可的松、3mg/ml BSA、0.3mg/ml青霉素、0.3mg/ml硫酸卡那霉素、0.4μg/ml两性霉素B和3μg/ml万古霉素。
上述实施例中的含血清培养基为：DF培养基、10％FBS、0.3mg/ml青霉素、0.3mg/ml硫酸卡那霉素、0.4μg/ml两性霉素B和3μg/ml万古霉素。
上述实施例中的DF10培养基为DF培养基和10％FBS的混合物。
经CCTCC鉴定实验，得出以下结论。
1、在COC-731细胞株中没有发现第三等位基因，这表明没有与人源细胞株发生交叉污染。
2、在ATCC和DSMZ数据库中COC-731细胞株的STR数据，其概况与当前数据都不完全匹配。
3、COC-731细胞株与ATCC数据库中的NIH：OVCAR-3(HTB-161)细胞株的STR数据最高匹配度为75％。
本发明各个实施例至少具有如下有益效果：
1、本发明提供的人肠癌原代细胞，原代分离培养自中国人的肠癌组织，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为癌细胞异型核型。经STR基因分型鉴定，其为单一人类来源，且无交叉污染的细胞。
2、本发明提供的人肠癌原代细胞，显微镜下观察细胞的大小、形态不等，失去极性，排列紊乱，无接触抑制，互相挤压，呈堆叠状或镶嵌状的上皮细胞。
3、本发明提供的人肠癌原代细胞，可用于人癌症相关疾病的发病机理研究、药物敏感性研究和检测、以及抗肿瘤药物研究等应用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.人肠癌原代细胞，其特征在于，命名为人肠癌原代细胞HCOC-731，保藏号为CGMCCNO.18527。
2.一种根据权利要求1所述的人肠癌原代细胞在药物敏感性检测中的应用。
3.一种根据权利要求1所述的人肠癌原代细胞在抗肿瘤药物制备中的应用。
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