CN106591216B - 一种人正常角膜上皮细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人正常角膜上皮细胞及其用途。该细胞命名为人正常角膜上皮细胞HNCEC/HL‑008，保藏编号为CCTCC NO：C201550。所述细胞株是从胬肉患者手术切除的胬肉旁正常角膜缘组织样品中制备所得，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞，显微镜下观察细胞的形态为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞，这种均一的细胞形态一直保持到65天，而且仍能处于增殖状态正常生长，在三维的培养条件下具有正常的分化功能。这种人正常角膜上皮细胞可用于人正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的药物毒性研究和检测，角膜和角膜相关疾病包括病毒性角膜炎的发病机理研究。

Description

一种人正常角膜上皮细胞及其用途
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种人正常角膜上皮细胞及其用途。
背景技术
人体重要器官如肺、肾、肝、胰腺和皮肤都由器官特异性分化的上皮细胞为其组成成分。这些特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关，如肺的气体交换功能、肾的过滤功能、肝的解毒及中和功能、胰腺细胞产生胰岛素、皮肤具有保护机体免受外界环境的伤害。而这些重要器官一旦发生病变或退化就会威胁人类的健康，因为这些重要器官是很难被替换的，不同器官的特异性细胞也不能相互取代其它器官的细胞。这些特异性分化的细胞都是很难再生的，更不要说在体外进行培养增殖了。
这样大大限制了人们对机体正常细胞功能的认识，很多来自于科技文献甚至教科书的细胞生物学知识的描述是不准确甚至是错误的。真正的原因是多数正常细胞的生物学知识来源于体外培养的细胞系研究结果。尽管各国科学家始终不断的尝试着培养和增殖人体重要器官的功能性的上皮细胞，但是，对于分离自人和哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用目前的无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养(存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞)，有的只能进行有限的传代培养(1-3代，如气管/角膜及前列腺等上皮细胞)，有的甚至根本不能体外培养(如肝、结肠、前列腺等上皮细胞)，只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。
为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，如p53和pRB信号通路常常被抑制。而且，这些经遗传修饰的细胞是不可能重新再移植进机体的。但是由于目前缺乏有效的体外培养上皮细胞的技术，上述这些细胞在当今世界的医学和生命科学研究中仍然备受青睐。在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官。现阶段，国内外还从未有过“正常细胞”可以应用于基础和临床医学研究。
正常人角膜上皮细胞主要功能：(1)角膜表面的上皮细胞构成了非角化的复层上皮(2)能分泌黏蛋白组成物理屏障，可有效防止多种物理和化学损伤。(3)产生和分泌化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。人角膜上皮细胞与主要病理生理疾病有关，如角膜损伤、病毒性角膜炎。如果能获得体外稳定传代的人正常角膜上皮细胞，将使人们可以更全面地研究角膜上皮细胞的正常功能，角膜疾病发病机理，组织器官功能重建或再造，以及测定药物对正常细胞的毒性，这些都将对基础和临床医学研究与应用有重大意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人正常角膜上皮细胞，命名为人正常角膜上皮细胞HNCEC/HL-008，保藏编号为CCTCC NO:C201550。该细胞分离培养自中国人的正常角膜缘组织的正常角膜上皮细胞，染色体为二倍体，STR(短串联重复序列)基因型以22个“STR基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，CSF1PO/10/12，D10S1248/13/15，D12S391/18/20，D13S317/8/12，D16S539/10/11，D18S51/16/17，D19S433/13/14，D21S11/30，D2S1338/18/25，D2S441/10/11，D3S1358/15/17，D5S818/11，D6S1043/14/21.3，D7S820/9/12，D8S1179/13/15，FGA/22/25，Penta D/10/11，Penta E/11/15，TH01/9，TPOX/9/11，vWA/14。
所述的人正常角膜上皮细胞的培养条件优选为用HL培养基于37℃、5％CO2培养；所述的HL培养基为：DMEM与无血清培养基SFM按体积比1:3混合，同时添加5％(v/v)的FBS(胎牛血清)，以及0.4μg/mL皮质醇(hydrocortisone)，5μg/mL胰岛素(insμLin)，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor(EGF))，24μg/mL腺嘌呤(adenine)，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
上述人正常角膜上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：
(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集胬肉患者手术切除的胬肉旁正常角膜缘组织样品。
(2)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪。
(3)将组织样品用消化液消化；优选的，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的HL培养基。
(4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中消化。
(5)加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清。
(6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品。
(7)再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清。
(8)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常角膜上皮细胞。
具体地，人正常角膜上皮细胞的原代分离培养方法，
步骤(2)中，所述的预冷优选为在冰上预冷。
步骤(3)中，所述的消化液的用量优选为10倍于组织样品体积。
步骤(3)中，所述的消化的条件优选为37℃消化1～3小时。
步骤(3)中，所述的胶原酶和分散酶的浓度优选为均为0.2mg/mL。
步骤(4)中，所述的消化优选为冰上消化1小时或室温消化10分钟。
步骤(6)中，所述的温水浴优选为37℃的温水浴。
步骤(4)、(5)、(7)中，所述的离心优选为1000rpm离心5分钟。
步骤(8)中，所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
上述人正常角膜上皮细胞的传代培养方法，包括如下步骤：
(1)当人正常角膜上皮细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞。
(2)加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。
具体地，人正常角膜上皮细胞的传代培养方法
步骤(1)中，所述的消化的时间优选为2～5分钟。
步骤(2)中，所述的离心优选为1000rpm离心5分钟。
步骤(2)中，所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
上述人正常角膜上皮细胞可用于人正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的药物毒性研究和检测，角膜和角膜相关疾病包括病毒性角膜炎的发病机理研究。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
(1)本发明提供的人正常角膜上皮细胞，原代分离培养自人的正常角膜组织，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞。经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
(2)本发明提供的人正常角膜上皮细胞，显微镜下观察细胞的形态为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞，这种均一的细胞形态一直保持到65天，而且仍能处于增殖状态正常生长。
(3)本发明提供的人正常角膜上皮细胞在三维的培养条件下具有正常的分化功能，可用于人正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的药物毒性研究和检测，角膜和角膜相关疾病包括病毒性角膜炎的发病机理研究。
附图说明
图1是人正常角膜上皮细胞的细胞形态图。
图2是人正常角膜上皮细胞的生长曲线图。
图3是人正常角膜上皮细胞的染色体核型分析图。
图4是人正常角膜上皮细胞的STR基因分型图。
图5人正常角膜上皮细胞的正常生理功能鉴定图
软琼脂克隆形成实验，体外不形成细胞克隆。
图6是人正常角膜上皮细胞的抗病毒药物毒性检测结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】原代人正常角膜上皮细胞的原代分离培养
(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集胬肉患者手术切除的胬肉旁正常组织样品。
(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均0.2mg/mL的HL培养基；其中，HL培养基为：DMEM(GIBCO#11965-092)与无血清培养基SFM(GIBCO#10744-019)按体积比1:3混合，同时添加5％(v/v)的胎牛血清，以及0.4μg/mL皮质醇(hydrocortisone)，5μg/mL胰岛素(insμLin)，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growthfactor(EGF))，24μg/mL腺嘌呤(adenine)，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤)。
(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品1次，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。
(4)将组织样品1～2cm3放入(2)的10mL消化液的14mL或50mL离心管中，37℃消化1～3小时。
(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清。
(6)将细胞沉淀重悬于2～5mL的0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温10分钟。
(7)然后加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟；尽量将上清去除干净。
(8)加入2mL温水浴(37℃)的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟。
(9)加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。
(10)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％CO2。
按照上述方法分离培养成功的原代人正常角膜上皮细胞，显微镜下观察细胞的形态如图1(排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞)。该细胞命名为“人正常角膜上皮细胞HNBEC/HL-008”，已于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C201550。
【实施例2】人正常角膜上皮细胞的传代培养
(1)当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常角膜上皮细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞两次，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟。
(2)加入10mL完全DMEM中和消化反应1～2分种。
(3)1000rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于10mL HL培养基中接种培养。
(4)必要时可将1×106上皮细胞重悬于1～2mL的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。
按照上述方法传代培养人正常角膜上皮细胞，培养建系的细胞生长曲线如图2，连续传代培养65天，本发明的人正常角膜上皮细胞仍能保持增殖状态正常生长。
【实施例3】人正常角膜上皮细胞的核型分析鉴定
(1)当人正常角膜上皮细胞(1×106)处于指数生长期时，加秋水仙素，终浓度为0.2μg/mL，继续培养3.5小时。
(2)反复吹打细胞使其脱落，2000rpm离心5分钟收获细胞。
(3)弃上清液，加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液8mL，轻轻吹打细胞团混匀，置37℃低渗处理25分钟。
(4)加入1mL新配制的固定剂(甲醇:冰乙酸＝3:1，v/v)，小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。
(5)弃上清液，加入8mL固定剂，吹打制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。
(6)2000rpm离心5分钟，弃上清液，重复固定一次。
(7)弃上清液，加入数滴固定剂制成细胞悬液，取2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上。
(8)将载玻片置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。
(9)2.5％(质量体积比)胰酶溶液(pH6.8～7.2)5mL处理25～45秒钟。
(10)37℃预温的生理盐水漂洗，Giemsa染色5～10分钟，做G显带分析。
(11)显微镜下观察细胞核型并摄影，进行核型分析；至少观察分析20个以上有丝分裂中期细胞。代表性的细胞核型分析结果见图3，人正常角膜上皮细胞为正常二倍体，46条染色体未见异常排列。
【实施例4】人正常角膜上皮细胞的基因分型分析鉴定
(1)贴壁生长的人正常角膜上皮细胞(1×106)，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟，10mL完全DMEM中和消化反应。
(2)10000rpm离心1分钟，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。
(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入200μL缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。
(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。
(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μL洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中。
(10)利用
Figure BDA0001177076050000071
16HS系统(DC2101，promega公司)进行21个基因座(15个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增。
(11)使用ABI
Figure BDA0001177076050000072
3100型遗传分析仪(1.1版本数据收集软件)进行扩增片段的检测。
(12)使用
Figure BDA0001177076050000073
和PowerTyperTM 16Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果图4，检测22个STR基因位点，以“STR基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，CSF1PO/10/12，D10S1248/13/15，D12S391/18/20，D13S317/8/12，D16S539/10/11，D18S51/16/17，D19S433/13/14，D21S11/30，D2S1338/18/25，D2S441/10/11，D3S1358/15/17，D5S818/11，D6S1043/14/21.3，D7S820/9/12，D8S1179/13/15，FGA/22/25，Penta D/10/11，Penta E/11/15，TH01/9，TPOX/9/11，vWA/14。
本发明的人正常角膜上皮细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
【实施例5】人正常角膜上皮细胞的软琼脂克隆形成实验
(1)用蒸馏水分别配制1.2％和0.8％两个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃的水浴中保证其不凝固。
(2)按照1:1的比例使1.2％的琼脂糖和2×DMEM或2×HL培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)在无菌离心管中混匀，取3mL混合液注入6孔板中，冷却凝固，作为底层琼脂置37℃，5％CO2培养箱中备用，每株细胞做三个复孔。
(3)再按照1:1的比例使0.8％的琼脂糖和2×DMEM或2×HL培养基在无菌离心管中混匀，再向管内加入2mL的细胞悬液(琼脂糖和2×DMEM混合液中加入含有HeLa细胞的琼脂糖细胞悬液，琼脂糖和2×HL培养基中加入含有人正常角膜上皮细胞的细胞悬液)，六孔板中每孔加3×104个细胞，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃，5％CO2培养箱中培养30天。
(4)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆的形态与细胞的致瘤性。
HeLa细胞和人正常角膜上皮细胞在软琼脂中的生长状态如图5，HeLa细胞能在软琼脂中形成较大的细胞克隆，而人正常角膜上皮细胞在软琼脂中则不能形成克隆。说明人正常角膜上皮细胞在体外无异常增殖和致瘤性，为正常细胞。
【实施例6】人正常角膜上皮细胞的抗病毒药物毒性检测
(1)将人正常角膜上皮细胞用0.05％胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，每孔约为5000个细胞，于37℃、5％CO2培养箱培养。
(2)第二天加药(更昔洛韦、干扰素)处理，每孔加入100μL不同浓度药物，药物浓度梯度(μM)为更昔洛韦由高到低)：300、100、30、10、3、1、0.3、0.1μg/μL干扰素(由高到低)：20、6.6、2、0.66、0.2、0.066、0.02、0.0066万IU。每种药物的每个梯度设置6个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不加药处理)及只加HL培养基的空白对照组，每组设置6个复孔。
(3)药物处理(37℃、5％CO2培养箱培养)24小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10μLCKK-8检测试剂(碧云天，上海)，即10μL CCK-8+90μL HL培养基。
(4)在37℃、5％CO2细胞培养箱内继续孵育0.5～2个小时，孵育时间跟细胞量的多少相关，具体时间根据预实验确定(可根据液体颜色变化来初步确定)，吸光度范围控制在1.0～1.5之间最好。
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
人正常角膜上皮细胞对两种抗病毒药物，更昔洛韦和干扰素的敏感性(毒性)检测结果如图5，更昔洛韦对人正常角膜上皮细胞存活率的影响在小浓度范围内不存在剂量-反应关系。更昔洛韦作用48h时，浓度为10μg/μL时才能引起50％细胞死亡；干扰素为广谱抗病毒药物，长期毒性试验均未发现其病理学变化。干扰素对人角膜上皮细胞存活率的影响在大约1/10临床人用治疗剂量时才出现细胞较大死亡率。人干扰素作用48h时，浓度为1万IU/ml时才能引起50％细胞死亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种人正常角膜上皮细胞，其特征在于，分类命名为人正常角膜上皮细胞HNCEC/HL-008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201550；所述人正常角膜上皮细胞原代分离培养自人的正常角膜组织，所述人正常角膜上皮细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞；所述人正常角膜上皮细胞在显微镜下观察到的形态为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞，所述上皮细胞形态在培养65天仍处于增殖状态正常生长，所述上皮细胞在三维的培养条件下具有正常的分化功能，在体外无异常增殖和致瘤性，所述人正常角膜上皮细胞的原代分离培养包括以下步骤：
在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集胬肉患者手术切除的胬肉旁正常角膜缘组织样品；
用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS洗2次，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；
将组织样品用消化液消化，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的HL培养基，所述HL培养基为按体积比为1:3的比例混合的DMEM与无血清培养基，同时还添加5％(v/v)的FBS，0.4μg/mL皮质醇，5μg/mL胰岛素，8.4ng/mL霍乱毒素，10ng/mL表皮生长因子，24μg/mL腺嘌呤，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.25μg/mL两性霉素B以及30μM法舒地尔；
消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于质量体积比为0.25％的胰酶-EDTA中消化；
加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；
加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品；
再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；
重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常角膜上皮细胞；
所述人正常角膜上皮细胞的传代培养方法包括以下步骤：
当人正常角膜上皮细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS洗涤细胞，再用质量体积比为0.05％的胰酶-EDTA消化单层细胞；加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。
2.权利要求1所述的人正常角膜上皮细胞在人正常细胞的生理学研究中的应用。
3.权利要求1所述的人正常角膜上皮细胞在体外正常细胞的药物毒性研究和检测中的应用。
4.权利要求1所述的人正常角膜上皮细胞在角膜和角膜相关疾病的发病机理研究中的应用。
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