CN106497866A - 一种人正常阴道上皮细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人正常阴道上皮细胞及其用途。该细胞命名为人正常阴道上皮细胞HNVEC/HL‑016，保藏编号为CCTCC NO：C2015113。其原代分离培养的方法为：去除阴道癌患者手术切除的癌旁组织样品中脂肪，经过消化后加入分散酶和DNase I作用，通过过滤、离心收集细胞，再用HL培养基重悬细胞，接种培养。其传代培养的方法为：细胞增殖至70‑90%丰度时，用胰酶‑EDTA消化，再用DMEM中和；离心收集细胞，用HL培养基重悬细胞，接种培养。本发明的细胞可用于在人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞的药物毒性研究和检测、阴道和宫颈相关疾病包括阴道癌、宫颈癌以及感染性疾病的发病机理研究中的应用。

Description

一种人正常阴道上皮细胞及其用途
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种人正常阴道上皮细胞及其用途。
背景技术
女性子宫是孕育胎儿繁衍下一代的重要场所，因此，子宫对于每一个女性而言是至关重要的，子宫一旦发生病变(一般是由宫颈癌所致)，将会严重危害女性生殖健康甚至危急生命。子宫颈是女性生殖系统中重要组织器官之一，其上端与子宫体相连，下端深入阴道，该器官是由特异性分化的上皮细胞为其组成成分(阴道上皮细胞主要属于外宫颈上皮细胞)，这种特异性分化的上皮细胞与该器官的特异性功能直接相关，如外宫颈上皮细胞(阴道上皮细胞)具有保护子宫颈免受外界环境中病毒、细菌等的伤害，从而保证子宫的完整和健康。而子宫颈一旦发生病变就会严重威胁女性健康，该器官也很难被替换，不同器官的特异性细胞更不能相互取代，除此之外，这种特异性分化的细胞也是很难再生的，更不用说在体外进行连续的培养增殖。
目前，对于分离自人和哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养(存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞)，有的只能进行有限的传代培养(1-3代，如气管/角膜等上皮细胞)，有的甚至根本不能体外培养(如肝、结肠、前列腺等上皮细胞)，只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。
正常细胞在体外培养的难题极大地限制了人们对于机体正常细胞功能的认识，甚至很多源于科技文献或教科书中的细胞生物学知识的描述也是不准确亦或是错误的，其真正原因是多数正常细胞的生物学知识来自于体外培养的“癌细胞”所得到的研究结果，而非源于真正的正常细胞。现阶段，国内外生物医学领域面临的最重要的挑战，就是缺乏一个合适的、能在体外持续传代且源于病人自身的原代细胞系来作为细胞模型，进行机体正常细胞生理功能研究，以及相关疾病的发病机理和药物毒性评价等。
为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传性操作，如通过导入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因来建立各种永生化细胞，以尝试用上述方法获得所谓“正常”的细胞系。然而，该方法虽然可以延长体外细胞存活的寿命(代数)，但是遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景及表型和真实的生理状态，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，如p53和pRB信号通路常常被抑制，因而得到的实验数据可靠性大大降低。而且，这些经遗传修饰的细胞是不可能重新再移植进机体的。但是由于目前缺乏有效的体外培养上皮细胞的技术，上述这些细胞在当今世界的医学和生命科学研究中仍然备受青睐，在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官；在癌症研究领域，它们还常常被用来作为“正常细胞”对照，而且它们的市场价格还非常昂贵。现阶段，国内外还从未有过“正常细胞”可以应用于基础和临床医学研究。
人正常阴道上皮细胞具有重要的生理功能，阴道壁主要由粘膜、肌层和外膜三部分组成，粘膜又由上皮层和固有层构成，向阴道腔内形成许多横行皱襞。其中，阴道上皮较厚，为非角化型复层扁平上皮。正常情况下，阴道内有多种细菌存在，但由于阴道与这些菌群之间能够形成生态平衡而不致病，在维持阴道的这种生态平衡中，乳酸菌、雌激素以及阴道内的PH起到了非常重要的作用。正常阴道菌群中，抗微生物因子可抑制或杀灭其他细菌，然而，阴道内的生态平衡若一旦被打破或有外源性病原体的侵入时，即可导致炎症的发生。卵巢在分泌雌性激素的作用下，在上皮细胞内会聚集大量的糖原，生理状态下，雌激素能使阴道上皮增生变厚，并增加细胞内的糖原含量，阴道上皮细胞分解糖原使其转化为单糖，阴道内的乳酸杆菌又能将单糖转化为乳酸，以此来维持阴道内正常的酸性环境(PH≤4.5，多为3.8～4.4)，抑制其他病原体的滋生，且可有效地防止病菌侵入子宫，有助于防止子宫颈病变甚至是宫颈癌的发生，上述过程称之为阴道的自净作用。除此之外，浅层细胞脱落后，阴道上皮的脱落和新生与卵巢活动周期有密切关系，因而根据阴道脱落上皮细胞类型不同可推知卵巢的功能状态。如果能够获得在体外稳定传代的人正常阴道上皮细胞，将使人们更加全面地研究女性阴道上皮以及相关生殖道上皮细胞的正常功能，涉及的相关疾病的发病机理，组织器官功能的重建或再造，以及性传播病原体对机体的侵入和感染过程机制，这些都将对基础和临床医学研究与新药研发具有重大意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人正常阴道上皮细胞，命名为人正常阴道上皮细胞HNVEC/HL-016，已于2016年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2015113。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种人正常阴道上皮细胞，命名为人正常阴道上皮细胞HNVEC/HL-016，保藏编号为CCTCC NO：C2015113。该细胞来源于中国人的正常阴道上皮细胞，染色体为二倍体，STR(短串联重复序列)基因型以22个“短串联重复序列基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，CSF1PO/11/12，D10S1248/13/14，D12S391/19/22，D13S317/12/14，D16S539/9，D18S51/13/18，D19S433/13/14，D21S11/30/31.2，D2S1338/24，D2S411/9.1/11，D3S1358/15，D5S818/10/12，D6S1043/18/20.3，D7S820/8/12，D8S1179/13/14，FGA/21/24/25，Penta D/9，PentaE/14/16，TH01/9，TPOX/8/11，vWA/14。
所述的人正常阴道上皮细胞的培养条件优选为用HL培养基于37℃、5％CO2培养；所述的HL培养基为：完全的DMEM与Ham’s F-12培养基按体积比3:1混合，同时添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/mL皮质醇，5μg/mL胰岛素，8.4ng/mL霍乱毒素，10ng/mL表皮生长因子，24μg/mL腺嘌呤，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.25μg/mL两性霉素B，30μM法舒地尔，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
上述人正常阴道上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：
(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品；
(2)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；
(3)将组织样品用消化液消化；优选的，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的HL培养基；
(4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中消化；
(5)加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；
(6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品；
(7)再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40-70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；
(8)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常阴道上皮细胞；
具体地，人正常阴道上皮细胞的原代分离培养方法
步骤(2)中，所述的预冷优选为在冰上预冷。
步骤(3)中，所述的消化液的用量优选为10倍于组织样品体积。
步骤(3)中，所述的消化的条件优选为37℃消化1-3小时。
步骤(3)中，所述的胶原酶和分散酶的浓度优选为均为0.2mg/mL。
步骤(4)中，所述的消化优选为冰上消化1小时或室温消化10分钟。
步骤(6)中，所述的温水浴优选为37℃的温水浴。
步骤(4)、(5)、(7)中，所述的离心优选为1000rpm离心5分钟。
步骤(8)中，所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
上述人正常阴道上皮细胞的传代培养方法，包括如下步骤：
(1)当人正常阴道上皮细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH7.4)洗涤细胞，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞。
(2)加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。
具体地，人正常阴道上皮细胞的传代培养方法
步骤(1)中，所述的消化的时间优选为2～5分钟。
步骤(2)中，所述的离心优选为1000rpm离心5分钟。
步骤(2)中，所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
上述人正常阴道上皮细胞可用于人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞的药物毒性研究和检测、阴道和宫颈相关疾病包括阴道癌、宫颈癌以及感染性疾病的发病机理研究中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
(1)本发明提供的人正常阴道上皮细胞，原代分离培养自人的正常阴道组织(外宫颈)，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞。经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
(2)本发明提供的人正常阴道上皮细胞，显微镜下观察细胞的形态为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞，这种均一的细胞形态一直保持超过50代，并能够继续延续。
(3)本发明提供的人正常阴道上皮细胞在三维的培养条件下具有正常的分化功能、对DNA损伤具有正常的应答能力、没有锚定-非依赖性生长的能力，在体外无异常增殖和致瘤性、表达CK14和p63两种蛋白，而不表达CK 18蛋白，具有正常细胞生物学特性且能在体外正常增殖传代的人外生殖道上皮细胞，可用于人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞的药物毒性研究和检测、阴道和宫颈相关疾病包括阴道癌、宫颈癌以及感染性疾病的发病机理研究中的应用。
附图说明
图1是人正常阴道上皮细胞的细胞形态图；
图2是人正常阴道上皮细胞的生长状态图
A.人阴道上皮细胞生长曲线；B.人阴道上皮细胞随体外持续传代而保持hTERT基因表达的稳定；
图3是人正常阴道上皮细胞的STR基因分型图；
图4是人正常阴道上皮细胞的正常生理功能鉴定
A.核型分析为正常二倍体；B.基质胶3D培养为正常分化形态；C.DNA损伤应答反应正常；D.软琼脂克隆形成实验体外不形成细胞克隆；
图5是人正常阴道上皮细胞的上皮组织特异性分子表达；
图6是人正常阴道上皮细胞的DDP(顺铂)和PTX(紫杉醇)毒性检测图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】原代人正常阴道上皮细胞的原代分离培养
(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品。
(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均0.2mg/mL的HL培养基；其中，HL培养基为：完全的DMEM(GIBCO#11965-092)与Ham’s F-12(GIBCO#GNM21700)培养基按体积比3:1混合，同时添加5％(v/v)的胎牛血清，以及0.4μg/mL皮质醇(hydrocortisone)，5μg/mL胰岛素(insulin)，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelialgrowth factor(EGF))，24μg/mL腺嘌呤(adenine)，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品1次，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。
(4)将组织样品1-2cm3放入(2)的10mL消化液的14mL或50mL离心管中，37℃消化1～3小时。
(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清。
(6)将细胞沉淀重悬于2-5mL的0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温10分钟。
(7)然后加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟，尽量将上清去除干净。
(8)加入2mL温水浴(37℃)的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟。
(9)加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。
(10)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％CO2。
按照上述方法分离培养成功的原代人正常阴道上皮细胞，显微镜下观察细胞的形态如图1(排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞)。该细胞命名为“人正常阴道上皮细胞HNBEC/HL-016”，已于2016年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C2015113。
【实施例2】人正常阴道上皮细胞的传代培养
(1)当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常阴道上皮细胞增殖至70-90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞两次，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞2-5分钟。
(2)加入10mL完全DMEM中和消化反应1～2分种。
(3)1000rmp离心5分钟，弃上清，重悬细胞沉淀于10mL HL培养基中接种培养。
(4)必要时可将1×106上皮细胞重悬于1-2mL的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。
按照上述方法传代培养人正常阴道上皮细胞，培养建系的细胞生长曲线如图2A，连续传代培养140天，本发明的人正常阴道上皮细胞仍能保持增殖状态正常生长；并用Q-PCR测定在传代过程中，每10代(p4，p14，p24，p34)之间hTERT基因的表达情况如图2B，本发明的人正常阴道上皮细胞随着传代次数的增加趋于稳定状态。
【实施例3】人正常阴道上皮细胞的基因分型分析鉴定
(1)贴壁生长的人正常阴道上皮细胞(1×106)，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟，10mL完全DMEM中和消化反应。
(2)10000rpm离心1分钟，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。
(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入200μL缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。
(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。
(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μL洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中。
(10)利用21HS系统(DC2101，promega公司)进行22个基因座(21个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增。
(11)使用ABI 3100型遗传分析仪(1.1版本数据收集软件)进行扩增片段的检测。
(12)使用和PowerTyperTM 21Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果图3，检测22个STR基因位点。以“STR基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，CSF1PO/11/12，D10S1248/13/14，D12S391/19/22，D13S317/12/14，D16S539/9，D18S51/13/18，D19S433/13/14，D21S11/30/31.2，D2S1338/24，D2S411/9.1/11，D3S1358/15，D5S818/10/12，D6S1043/18/20.3，D7S820/8/12，D8S1179/13/14，FGA/21/24/25，PentaD/9，Penta E/14/16，TH01/9，TPOX/8/11，vWA/14。
本发明的人正常阴道上皮细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
【实施例4】人正常阴道上皮细胞的核型分析鉴定
(1)当人正常阴道上皮细胞(1×106)处于指数生长期时，加秋水仙素，终浓度为0.2μg/mL，继续培养3.5小时。
(2)反复吹打细胞使其脱落，2000rpm离心5分钟收获细胞。
(3)弃上清液，加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液8mL，轻轻吹打细胞团混匀，置37℃低渗处理25分钟。
(4)加入1mL新配制的固定剂(甲醇:冰乙酸＝3:1，v/v)，小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。
(5)弃上清液，加入8mL固定剂，吹打制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。
(6)2000rpm离心5分钟，弃上清液，重复固定一次。
(7)弃上清液，加入数滴固定剂制成细胞悬液，取2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上。
(8)将载玻片置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。
(9)2.5％(质量体积比)胰酶溶液(pH6.8～7.2)5mL处理25～45秒钟。
(10)37℃预温的生理盐水漂洗，Giemsa染色5～10分钟，做G显带分析。
(11)显微镜下观察细胞核型并摄影，进行核型分析；至少观察分析20个以上有丝分裂中期细胞。代表性的细胞核型分析结果见图4A，人正常阴道上皮细胞为正常二倍体，46条染色体未见异常排列。
【实施例5】人正常阴道上皮细胞基质胶3D培养
(1)将基底胶提前置于4℃冰箱过夜预冷。
(2)将预冷的基底胶铺到4孔的chamber slide培养板中，每孔加120μL，放入37℃培养箱中15min，使之凝固。
(3)将细胞用胰酶消化，用HL培养基重悬细胞制成单细胞悬液。
(4)在细胞计数仪下计算细胞个数，向(2)中加入细胞约1x104个。
(5)每孔补充添加500μl含5％基质胶的原代上皮细胞培养基，轻轻晃动培养板，使细胞分布均匀。再放入5％CO2，37℃的湿热培养箱中，培养7天后用DAPI进行染色，荧光显微镜观察细胞生长形态。
荧光显微镜下分别观察HeLa细胞和人正常阴道上皮细胞的生长状态如图4B，HeLa细胞是以一种散乱无序且表面粗糙的聚集性方式生长，而人正常阴道上皮细胞能形成一个边界清晰且光滑的球形体，说明人正常阴道上皮细胞在三维的培养条件下具有正常的分化功能。
【实施例6】人正常阴道上皮细胞的DNA损伤应答实验
(1)将人正常阴道上皮细胞、HeLa细胞分别接种到直径60mm的细胞培养板中，接种量为8x105/孔。
(2)24h后，加入放线菌素D(Act D)，工作浓度为0.5nM，继续培养24h(未加药的细胞作为阴性对照control)。
(3)培养24h后收集细胞，做蛋白质免疫印迹(Western-blotting)分析，步骤如下：
1、细胞裂解：放线菌素D作用细胞24h后，弃培养基，预冷的PBS洗涤细胞3次，加入RIPA裂解液，冰上裂解25min，将裂解液转移至1.5ml的离心管，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。
2、BCA法测定总蛋白浓度，以BSA为标准品做标准曲线，计算各蛋白样品中总蛋白量。
3、将蛋白样品与上样缓冲液照一定比例混匀按，于沸水中煮5-10min，瞬时离心，收集上清。
4、SDS-PAGE凝胶电泳：配制10％的分离胶和5％的浓缩胶，将上步得到的上清液加入凝胶微孔，4℃冰箱中恒压80V电泳30min后，调节电压至120V约1.5h至溴酚蓝移动到凝胶底部，停止电泳。
5、转膜：PVDF膜在甲醇中浸泡30s，使之浸透，转移缓冲液中静置5min。取下凝胶，按照正→负(海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵)的顺序放入电转槽，低温条件下恒压转膜(100V，100min)。
6、封闭：5％BSA TBST溶液，室温摇床封闭60min。
7、孵育一抗：兔抗人p21抗体用封闭液稀释至(1：1000)，鼠抗人p53抗体(1:1000)，兔抗人β-actin抗体(1:1000)稀释，封闭置于摇床4℃冰箱过夜；TBST洗膜，5min 3次。
8、孵育二抗：HRP标记羊抗兔二抗(1:2000)，HRP标记羊抗鼠二抗(1:2000)，室温孵育1h；TBST洗膜，5min 3次。
9、显影：ECL底物液A液：B液(1:1)混合，加到PVDF膜上，放于凝胶成像仪中，调节曝光时间、光圈至形成清晰的图像。
凝胶成像仪中观察人正常阴道上皮细胞DNA损伤应答的Western blotting的结果如图4C，相对比对照组的HeLa细胞而言，经过Act D处理的HNVEC细胞，其p53蛋白的表达量上调，下游的信号分子p21蛋白的表达量也同时随之上调，而在HeLa细胞中，p53和p21蛋白的表达量在Act D处理前后均无变化，说明人正常阴道上皮细胞对DNA损伤具有正常的应答能力。
【实施例7】人正常阴道上皮细胞的体外软琼脂克隆形成实验
(1)用蒸馏水分别配制1.2％和0.8％两个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃的水浴中保证其不凝固。
(2)按照1:1的比例使1.2％的琼脂糖和2×DMEM或2×HL培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)在无菌离心管中混匀，取3mL混合液注入6孔板中，冷却凝固，作为底层琼脂置37℃，5％CO2培养箱中备用，每株细胞做三个复孔。
(3)再按照1:1的比例使0.8％的琼脂糖和2×DMEM或2×HL培养基在无菌离心管中混匀，再向管内加入2mL的细胞悬液(琼脂糖和2×DMEM混合液中加入含有HeLa细胞的琼脂糖细胞悬液，琼脂糖和2×HL培养基中加入含有人正常阴道上皮细胞的细胞悬液)，六孔板中每孔加3×104个细胞，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃，5％CO2培养箱中培养30天。
(4)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆的形态与细胞的致瘤性。
HeLa细胞和人正常阴道上皮细胞在软琼脂中的生长状态如图4D，HeLa细胞能在软琼脂中形成明显较大的细胞克隆，而人正常阴道上皮细胞在软琼脂中则不能形成克隆，最终发生细胞凋亡，形成了许多细胞碎片，说明人正常阴道上皮细胞没有锚定-非依赖性生长的能力，在体外无异常增殖和致瘤性。
【实施例8】人正常阴道上皮细胞的特异性表达蛋白分子的鉴定
(1)将人正常阴道上皮细胞放置六孔板中培养；
(2)弃去培养基，加入4％多聚甲醛室温处理10min，PBS漂洗四遍，每次7min(PBS用滤膜过滤，去除杂质)。
(3)加入0.5％的Triton-X-100室温处理15min使其透化，PBS漂洗4遍。
(4)加3％FBS将六孔板置于5％，37℃培养箱封闭30min(FBS用前12000rpm，4min高速离心，除去沉淀)。
(5)一抗1:100稀释，4℃孵育过夜，PBS洗4遍，每次7min。
(6)二抗1:200稀释，5％，37℃孵育1h，PBS洗4遍，每次7min。
(7)复染DAPI，用PBS稀释至浓度为0.5ug/ml，室温10min，PBS漂洗4遍，每次5min。
(8)抗淬灭剂封片，置于荧光显微镜下镜检。
荧光显微镜镜检结果如图5，人正常阴道上皮细胞表达CK14和p63两种蛋白，而不表达CK 18蛋白。以上数据表明，人正常阴道上皮细胞是一株具有正常细胞生物学特性且能在体外正常增殖传代的人外生殖道上皮细胞。
【实施例9】人正常阴道上皮细胞的毒性检测
(1)将人正常阴道上皮细胞用0.05％胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，每孔约为8000个细胞，于37℃、5％CO2培养箱培养。
(2)第二天加药(DDP和PTX处理，每孔加入10μL不同浓度的药物，药物浓度梯度(μM)为300、100、30、10、3、1、0.3、0.1，每种药物的每个梯度设置三个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不加药物处理)及只加HL培养基的空白对照组，每组设置三个复孔。
(3)药物处理(37℃、5％CO2培养箱培养)48小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10μLCKK-8检测试剂(碧云天，上海)，即10μL CCK-8+90μL HL培养基。
(4)在37℃、5％CO2细胞培养箱内继续孵育0.5-2个小时，孵育时间跟细胞量的多少相关，具体时间根据预实验结果来确定(可根据液体颜色的变化来初步判断)，吸光度范围控制在1.0-1.5之间最好。
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
人正常阴道上皮细胞对两种抗癌药物，DDP和PTX的敏感性(毒性)检测结果如图6，顺铂(DDP)对该上皮细胞的存活率的影响存在剂量-反应关系，细胞毒性随药物浓度增加而增大；在相同药物浓度时，紫杉醇(PTX)表现出比顺铂更大的细胞毒性。结果显示出人正常阴道上皮细胞对不同药物毒性检测的敏感性和区分度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种人正常阴道上皮细胞，其特征在于：分类命名为人正常阴道上皮细胞HNVEC/HL-016 ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2015113。
2.权利要求1所述的人正常阴道上皮细胞在人正常细胞的生理学研究中的应用。
3.权利要求1所述的人正常阴道上皮细胞在体外正常细胞的药物毒性研究和检测中的应用。
4.权利要求1所述的人正常阴道上皮细胞在阴道和宫颈相关疾病的发病机理研究中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的阴道和宫颈相关疾病是指阴道癌、宫颈癌以及感染性疾病。
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