CN108504625B - 一种小鼠成纤维细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小鼠成纤维细胞及其用途。属于细胞生物学领域。该细胞命名为小鼠成纤维细胞MFC/HL‑041，保藏编号为CCTCC NO：C201714。经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞用于正常原代上皮细胞与原代肿瘤细胞的分离和传代培养。由此获得的人肺正常和肺癌的原代上皮细胞在显微镜下观察，状态鲜活，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。可用于人或动物正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的病毒感染模型，体外正常细胞针对不同药物的药敏检测，以及癌症病人个体化治疗的药物筛选和抗癌新药的研发。

Description

一种小鼠成纤维细胞及其用途
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种小鼠成纤维细胞及其用途。
背景技术
众所周知，人体重要的器官是很难被替换的，而且这种特异性分化器官的组 成细胞也是很难再生的，更不用说在体外进行连续的培养增殖。因此，人们对于 机体正常细胞功能的认识，绝大多数主要来自于体外培养的“癌细胞”所得到的研 究结果，而非源于真正的正常细胞。为了在体外进行原代细胞的培养，目前国外 尝试通过遗传操作，如通过导入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因来 建立各种永生化细胞，获得所谓“正常”的细胞系。然而，该方法虽然可以延长体 外细胞存活的寿命(代数)，但是遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传 背景和表型，以致让这些正常细胞丢失其正常生理功能，如p53和pRB信号通 路常常被抑制，因而得到的实验数据可靠性大大降低。由于目前缺乏有效的体外 培养原代上皮细胞的技术，上述经遗传操作永生化的细胞在当今世界医学和生命 科学领域中仍然备受青睐，在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能” 性的组织或器官；在癌症研究领域，它们还常常被用来作为“正常细胞”的对照， 并且在市场上的价格还非常昂贵。综上所述，目前急需解决的问题是，如何快速、 有效地进行组织器官来源的原代上皮细胞的增殖以及这些上皮细胞的传代培养， 并且能有效地延长上皮细胞的培养代数，同时又不能改变细胞的遗传背景。
传统的人正常上皮细胞原代培养方法存在培养出的细胞活性差、培养率低、 易污染和操作繁琐等缺点。为了解决此类问题扩大人类正常上皮细胞原代培养的 研究及应用，近年来国内外的许多研究人员对哺乳动物正常上皮细胞尤其是人正 常上皮细胞的原代培养过程进行了不断改进和新的探索。此外，人类原代上皮组 织通常来源于患者组织，除基于患者对手术及实验方案知情同意外，必须通过医 院伦理委员会批准，因此人类原代上皮细胞来源非常有限。培养原代细胞是指从 活体里取得器官组织或者细胞后立即用于培养，整个过程包括活体取材、分离提 纯、细胞培养、细胞传代和生物学鉴定等基本部分。其中，人类上皮细胞的培养 是所有类型细胞中培养难度较大的，培养出的细胞在细胞数量、活性、培养周期、 传代保存上都受到诸多限制。上皮细胞是分布在体表或腔道表层的一类细胞，在 不同部位的上皮细胞功能存在差异，如在体表的上皮细胞具有保护功能，在消化 道或呼吸道表层的上皮细胞除具有保护功能外还包含分泌、排泄和吸收的作用。 有研究发现某些癌症是由上皮细胞的病变所引发的，如卵巢癌来源于卵巢表面上 皮的病变。由此可知，建立优越的原代上皮细胞的培养体系，尽可能地培养出在 结构和功能上与体细胞相近的正常上皮细胞、原代肿瘤细胞显得尤为重要。然而 就现有的上皮细胞培养技术来看，还尚未建立稳定的共培养体系用以提供大量的 优质的上皮细胞为相关实验研究提供研究模型。
目前小鼠成纤维细胞原代培养的应用主要有：(1)用于细胞保种；(2)用于 分子生物学研究；(3)用于基因治疗相关研究。以往的在体外培养小鼠或人胚胎 干细胞、诱导性多能干细胞时，有研究将小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞与干细 胞共培养，可为干细胞提供其生长和增殖过程中所需的营养。参与共培养的小鼠 成纤维细胞需要经过紫外射线照射或者药物抑制剂处理，目的是使该细胞失去增 殖能力，但是在一定时间内仍然具有对支持细胞提供营养并维持共培养环境的能 力。小鼠成纤维细胞作为饲养层是如何支持人类胚胎干细胞和全能干细胞的生 长，目前机制不十分清楚。有研究发现滋养层细胞可以分泌FGF、VEGF、IGF 等生长因子，促进干细胞的克隆生长，另外还可以分泌白血病抑制因子(LIF) 等，抑制干细胞的分化。同时也有研究发现小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞分泌 的ActivinA和LIF，支持全能干细胞的自我更新和未分化特性，表明小鼠成纤维 细胞饲养层为人类胚胎干细胞和全能干细胞生长提供了复杂的微环境。虽然目前 对于小鼠成纤维细胞饲养层的共培养益处尚无一致意见，但是，在现有方法学基 础上建立稳定的小鼠成纤维细胞饲养层与原代上皮细胞的接触式共培养模型，并 利用其分泌的生长因子促进原代上皮细胞的克隆生长、维持其生物学特性，可为 正常上皮细胞、原代肿瘤细胞相关领域的研究构建新平台。
此外，原代小鼠成纤维细胞取材容易、价格低廉，在扩增培养饲养层细胞中 最为常用。目前较规范的原代小鼠成纤维细胞分离培养方法为：采用断颈法处死 孕鼠，将孕鼠放入75％的酒精中浸泡后取出，放入无菌超净台中，用镊子和剪 刀依次剪开皮肤和内膜，找到胚胎。取出胚胎，在装有0.9％生理盐水的100mm 培养皿中洗涤3-5次，剪刀剪碎后用0.25％的胰蛋白酶消化15-20min，用终止液 终止消化，1000rpm离心5-10min。将得到的细胞沉淀用含8-10％的胎牛血清的 DMEM培养基重悬后接种到细胞预先用0.1-0.5％的明胶溶液包被0.5-2小时的细 胞培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。但是，采用该方法的饲养层细胞 获得率仍然非常低、细胞增值缓慢，且明胶溶液包被过程较繁琐。近年来原代小 鼠成纤维细胞分离培养已有诸多改良优化，例如优化消化酶条件建立消化酶组合 物、梯度密度分离或进行生物学特性鉴定获取纯度较高的原代小鼠成纤维细胞。 然而，应用于生物医学研究领域的哺乳动物细胞被错误鉴定和交叉污染是目前普 遍存在的突出问题。有数据统计，目前国外实验室有20％左右的细胞株被错误鉴 定和交叉污染，NIH和ATCC等研究机构近两年都对此发出呼吁，要求研究者对 细胞进行鉴定获得足够认定个体的遗传信息。细胞的交叉污染和遗传背景不清晰 的问题在国内也非常严重，因此对研究的细胞进行标准化的细胞鉴定显得尤为重 要。
建立新的稳定的细胞系并对其身份进行证实，使其在公共的数据库中具有专 属的基因签名，克服该细胞系交叉污染的情况，可以保证研究者的研究产品价值。 近年来，大量研究表明STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最 有效和准确的方法之一，STR基因分型应用于细胞鉴定已被ATCC等机构强烈 推荐。STR基因分型是运用多重PCR技术从可用的DNA材料中扩增短串联重 复序列来获取信息的一种分析方法，短串联重复序列是一类广泛存在于真核生物 基因组中的DNA串联重复序列，其核心序列为2-7bp，重复次数通常为10-30 次，不同个体来源的细胞在不同STR位点具有特异性的重复次数，使得不同细 胞具有其特征性的图谱。因此，建立一种高效的原代小鼠成纤维细胞作为饲养层 细胞的培养方法是人或哺乳动物原代上皮细胞培养的关键，其中更关键的是作为 饲养层细胞的原代小鼠成纤维细胞不仅在获得率、纯度、传代稳定性方面具有较 以往方法的优势，最重要的是其遗传背景清晰、排除细胞被错误鉴定和交叉污染 的情况，对其进行标准化的细胞鉴定确定特征性，保证相关研究的产品价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种小鼠成纤维细 胞，来源于Swiss小鼠正常的胚胎皮肤组织，为正常二倍体细胞，基因分型鉴定 为国内外从未登记注册过，经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤 维细胞，可用于正常原代上皮细胞或原代肿瘤细胞的分离和传代培养，共培养所 得到的上皮细胞可应用于正常细胞的生理学、药物安全性评价、再生医学等相关 研究；共培养得到的正常/肿瘤配对细胞可应用于肿瘤发病机理的研究，癌症病 人个体化治疗的药物筛选和抗癌新药的研发。
本发明的另一目的在于提供经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠 成纤维细胞用于正常原代上皮细胞与原代肿瘤细胞的分离和传代培养的方法。
本发明的又一目的在于提供上述小鼠成纤维细胞的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
第一方面，一种小鼠成纤维细胞，命名为小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714,该细胞来源 于16～18天Swiss小鼠正常的胚胎皮肤组织，STR(短串联重复序列)基因型 以10个“短串联重复序列基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，18-3/17/21， 4-2/19.3，6-7/12，9-2/15，15-3/20.3，6-4/14.3，12-1/19，5-5/13，X-1/26。
所述的小鼠成纤维细胞，显微镜下观察的细胞形态轮廓清晰，细胞贴壁生长， 为突起的纺锤形或星形的扁平状细胞。
所述的小鼠成纤维细胞的培养条件优选为用小鼠成纤维细胞培养基于 37℃、5％CO2培养；所述的小鼠成纤维细胞培养基为：完全的高糖DMEM，添 加8％的胎牛血清(FBS，Gibco)。所述的小鼠成纤维细胞与原代上皮细胞共培 养的培养条件优选为HL培养基于37℃、5％CO2培养；所述的HL培养基为： 完全的DMEM与Ham’s F-12培养基按体积比3:1混合，同时添加5％的胎牛血 清，以及0.4μg/mL皮质醇，5μg/mL胰岛素，8.4ng/mL霍乱毒素，10ng/mL表 皮生长因子，24μg/mL腺嘌呤，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.25μg/mL 两性霉素B，30μM法舒地尔，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
上述小鼠成纤维细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：
(1)收集16～18天Swiss小鼠正常的胚胎皮肤组织。
(2)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS(0.01M，pH7.4) 洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解 剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪。
(3)将组织样品用消化液消化；优选的，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的 HL培养基。
(4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25％(质量体积比)胰酶 -EDTA中消化。
(5)加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清。
(6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品。
(7)再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器 过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清。
(8)重悬细胞沉淀于步骤(5)的DMEM培养基中，接种于培养瓶培养，得到 小鼠成纤维细胞。
具体的，小鼠成纤维细胞的原代分离培养方法：
步骤(2)中，所述的预冷优选为在冰上预冷。
步骤(3)中，所述的消化液的用量优选为10倍于组织样品体积。
步骤(3)中，所述的消化的条件优选为37℃消化1～3h。
步骤(3)中，所述的胶原酶和分散酶的浓度优选为均为0.2mg/mL。
步骤(3)中，所述的消化优选为冰上消化1h或室温消化10min。
步骤(6)中，所述的温水浴优选为37℃的温水浴。
步骤(4)、(5)(7)中，所述的离心优选为1000rpm离心5min。
步骤(8)中，所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
上述小鼠成纤维细胞的传代培养方法，包括如下步骤：
(1)当小鼠成纤维细胞增殖至80～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗 涤细胞，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞；
(2)加入8％FBS的DMEM中和消化反应；离心去上清，用小鼠成纤维细胞培 养基重悬细胞沉淀，按照一定的传代比例接种于培养瓶中，培养箱内培养。
具体的，小鼠成纤维细胞的传代培养方法
步骤(1)中，所述的用1×PBS洗涤细胞3次；
步骤(1)中，所述的消化时间优选为室温消化30s；
步骤(2)中，所述的离心优选为1000rpm离心4min；
步骤(2)中，所述的一定传代比例是约1：5；
步骤(2)中，所述的培养条件优选为37℃、5％CO2。
上述小鼠成纤维细胞的冻存与复苏的方法，包括如下步骤：
(1)小鼠成纤维细胞的冻存方法
S1、当小鼠成纤维细胞增殖至80～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗 涤细胞，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞；
S2、加入8％FBS的DMEM中和消化反应；离心去上清，用小鼠成纤维细胞冻 存液重悬细胞沉淀，按照一定的比例将细胞悬液置于冻存管中；
S3、将冻存管移至冻存盒内，置于-80℃冰箱，后移放至液氮永久保存。
(2)小鼠成纤维细胞的复苏方法
S1、事先准备好一个10mL的离心管，向离心管中加入一定体积的PBS或小鼠 成纤维细胞培养基；
S2、将小鼠成纤维细胞从液氮中取出，迅速置于温水浴中快速旋转冻存管，使其在1min之内融化；
S3、将冻存管中的细胞悬液移至事先备好的离心管中，离心去上清，接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。
具体的，小鼠成纤维细胞的冻存与复苏的方法
步骤(1)S1中，所述的用1×PBS洗涤细胞3次；
步骤(1)S1中，所述的消化时间优选为室温消化30s；
步骤(1)S2中，所述的小鼠成纤维细胞冻存液比例为小鼠成纤维细胞培养基：FBS：DMSO为5：4：1；
步骤(1)S2中，所述的冻存比例是约1：4；
步骤(1)S3中，所述的置于-80℃冰箱至少2个h以上方可转移至液氮；
步骤(2)S1中，所述的一定体积的PBS或小鼠成纤维细胞培养的优选为9mL；
步骤(2)S2中，所述的温水浴优选为37℃；
步骤(2)S3中，所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
第二方面，提供上述小鼠成纤维细胞作为饲养细胞在人或动物正常上皮细胞 /癌细胞(肿瘤细胞)的培养中的应用，所述的培养为经药物丝裂酶素C或放射 线辐照处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞与人或动物 正常上皮细胞/癌细胞(肿瘤细胞)的共培养。
上述小鼠成纤维细胞用于共培养的处理方法，包括如下步骤：
(1)药物丝裂酶素C处理小鼠成纤维细胞使其失去增殖能力
S1、当小鼠成纤维细胞生长至80～90％时,培养基中加入终浓度为10μg/mL的 丝裂酶素C，置于37℃、5％CO2培养；
S2、再加入温浴的1xPBS或无血清的培养基(DMEM)洗3次，弃洗液；
S3、加入0.05％胰酶/EDTA预消化细胞后弃去，再次加入0.05％胰酶/EDTA消化，轻拍培养瓶使细胞分散，然后加入完全培养基中和反应；
S4、低速离心(1000rpm)去上清，获得细胞沉淀；
S5、沉淀下来的细胞虽然失去增殖能力仍然维持代谢活性，接种于HL培养基中 直接用作饲养细胞，或者置于小鼠完全培养基或置于HL培养基；或者长期冻存 于-80℃或液氮中备用。
具体的，小鼠成纤维细胞的药物丝裂酶素C处理的方法
步骤(1)S1中，所述的37℃、5％CO2培养2h；
步骤(1)S3中，所述的0.05％胰酶/EDTA预消化时间为30-40s，再次加入0.05％ 胰酶/EDTA消化时间为30s；
步骤(1)S3中，所述的完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM；
步骤(1)S5中，所述的药物丝裂酶素C处理后的小鼠成纤维细胞置于完全DMEM 培养基2-3h或置于HL培养基4℃储存并于1-7天之内使用；
或者，
(2)放射线辐照小鼠成纤维细胞使其失去增殖能力
S1、小鼠成纤维细胞培养于DMEM培养基中，生长至80～90％时，用不含 Ca2+/Mg2+的1×PBS洗细胞1次，加入1ml 0.05％胰酶消化细胞20-40s，然后加 入9ml完全DMEM培养基(含10％胎牛血清的DMEM)中和消化反应；
S2、4℃低速离心1000rmp收集细胞沉淀，加入10ml DMEM重悬细胞；
S3、gamma射线或者X射线辐照细胞悬液，使小鼠成纤维细胞失去增殖能力但 是仍然维持代谢活性，将辐照过的小鼠成纤维细胞接种于HL培养基中直接用作 饲养细胞；或者培养于完全完全DMEM培养基或置于HL培养基；或者长期冻 存于-80℃或液氮中备用。
具体的，小鼠成纤维细胞的放射线辐照处理的方法
步骤(2)S1中，所述的1xPBS不含Ca2+/Mg2+；
步骤(2)S1中，所述的0.05％胰酶消化时间为20-40s；
步骤(2)S1中，所述的完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM；
步骤(2)S3中，所述的放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞置于完全DMEM 培养基2-3h或置于HL培养基4℃储存并于1-7天之内使用；
上述经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后小鼠成纤维细胞可用于人或动 物正常上皮细胞/癌细胞(肿瘤细胞)的共培养，共培养所得到的原代上皮细胞 亦可应用于人或动物正常细胞/癌细胞(肿瘤细胞)的生理学、药学、以及新药 研发等方面的相关研究，体外正常细胞的病毒感染模型相关研究和检测，体外正 常细胞针对不同药物的毒性检测，涉及不同器官肿瘤发病机理的探索以及癌症病 人个体化治疗的药物筛选和抗癌新药的研发。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
(1)本发明提供的小鼠成纤维细胞，经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记 注册过的一种小鼠的正常细胞系，该细胞在体外连续培养300天细胞群体倍增数 可达383代，保持非常强的增值活力(图2)。
(2)本发明提供的经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞， 可用于正常原代上皮细胞与原代肿瘤细胞的分离和传代培养，由此获得的人肺正 常和肺癌的原代上皮细胞在显微镜下观察，状态鲜活，排列紧密、细胞界限清晰、 立体感强、多角型的上皮细胞，同时绘制的细胞生长曲线表明两株细胞连续培养 50天细胞群体倍增数分别为13、22代(图5)。
(3)本发明提供的经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞， 可用于不同动物的原代上皮细胞的分离和传代培养，显微镜下观察小鼠子宫、大 鼠食管、兔宫颈的上皮细胞均状态鲜活，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、 多角型，同时绘制的细胞生长曲线表明这三种细胞连续培养25天时细胞群体倍 增数分别为16、17、11代(图5)。
(4)本发明提供的经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞， 可用于人或动物正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的病毒感染模型，体外正 常细胞针对不同药物的药敏检测，以及癌症病人个体化治疗的药物筛选和抗癌新 药的研发。
附图说明
图1是小鼠成纤维细胞的生长形态图；
图2是小鼠成纤维细胞的生长曲线；
图3是小鼠成纤维细胞的STR基因分型图；
图4是小鼠成纤维细胞与人原代细胞共培养图；
A.小鼠成纤维细胞与人肺正常原代上皮细胞共培养；B.小鼠成纤维细胞与人肺癌原代细胞共培养；
图5是小鼠成纤维细胞共培养所得到的肺正常原代细胞与肺癌原代细胞的生长曲线；
图6是小鼠成纤维细胞与不同动物源的上皮细胞共培养图；
A.小鼠成纤维细胞与小鼠子宫原代上皮细胞共培养；B.小鼠成纤维细胞与大鼠食管原代上皮细胞共培养；C.小鼠成纤维细胞与兔宫颈原代上皮细胞共培养；
图7是小鼠成纤维细胞共培养所得到的不同动物源的上皮细胞的生长曲线；
A.小鼠子宫原代上皮细胞；B.大鼠食管原代上皮细胞；C.兔宫颈原代上皮细胞；
图8是小鼠成纤维细胞共培养所得到的人肺原代正常/肿瘤细胞的药敏检测图；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的 实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】小鼠成纤维细胞的原代分离培养及传代培养
包括如下步骤：
(1)取16～18天Swiss胚鼠，收集正常的胚胎背部皮肤组织。
(2)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS(0.01M，pH7.4) 洗3次，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，用解剖镊子和剪刀 将组织剪碎。
(3)将剪碎组织样品用消化液消化；优选的，所述的消化液为含胶原酶和分散 酶的HL培养基。
(4)消化后的组织1000rpm离心5min去上清，将细胞沉淀重悬于0.25％(质量 体积比)胰酶-EDTA中消化。
(5)加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，1000rpm离心5min去上清。
(6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品。
(7)再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用70μm孔径的过滤器过滤 细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，1000rpm离心5min去上清。
(8)重悬细胞沉淀于DMEM培养基中，接种于培养瓶培养，得到小鼠成纤维 细胞。
(9)当小鼠成纤维细胞增殖至80～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗 涤细胞3次，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA常温消化单层细胞30s；
(10)加入8％FBS的DMEM中和消化反应；1000rpm离心4min去上清，用 小鼠成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀，按照1:8的比例传代，接种于培养瓶中， 于37℃、5％CO2培养箱中培养。
按照上述方法原代分离培养及传代培养所得到的小鼠成纤维细胞，显微镜下 观察细胞的形态如图1，细胞贴壁生长，轮廓清晰，为突起的纺锤形或星形的扁 平状细胞，绘制细胞生长曲线如图2。该细胞命名为“小鼠成纤维细胞， MFC/HL-041”，其拉丁文名称为Murine Fibroblast Cells MFC/HL-041，已于2017 年2月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)， 保藏编号为CCTCC NO：C201714。
【实施例2】小鼠成纤维细胞的基因分型分析鉴定
包括如下步骤：
(1)贴壁生长的小鼠成纤维细胞(1×106)，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰 酶-EDTA消化单层细胞30s，10mL完全DMEM中和消化反应；
(2)10000rpm离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(细胞/组织基因组 DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮；
(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀；
(4)加入200μL缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根 公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心；
(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取 试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液；
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液；
(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μL洗脱缓 冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2～ 5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将提取的DNA溶液收集到离心管 中；
(10)利用
Figure BDA0001629226060000114
16HS系统(DC2101，promega公司)进行10个基因座 (9个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增；
(11)使用ABI
Figure BDA0001629226060000115
3100型遗传分析仪进行扩增片段的检测；
(12)使用
Figure BDA0001629226060000116
和PowerTyperTM 16 Macro软件分析样本数据，进行自 动基因分型，STR分型结果图3，检测10个STR基因位点。以“STR基因座/等 位基因长度”来表示：Amel/X，18-3/17/21，4-2/19.3，6-7/12，9-2/15，15-3/20.3， 6-4/14.3，12-1/19，5-5/13，X-1/26。
本发明的小鼠成纤维细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过 的一种小鼠的正常细胞系。
【实施例3】药物丝裂酶素C处理小鼠成纤维细胞使其失去增殖能力
包括如下步骤：
(1)当小鼠成纤维细胞生长至80～90％时,培养基中加入终浓度为10μg/mL的 丝裂酶素C(溶于水,储存液浓度为0.5mg/mL),37℃处理2h；
(2)再加入温浴的1xPBS或无血清的培养基(DMEM)洗3次，弃洗液；
(3)加入0.05％胰酶/EDTA预消化细胞30-40s后弃去，再次加入0.05％胰酶 /EDTA消化30s，轻拍培养皿使细胞分散，然后加入完全培养基(含10％胎牛血 清的DMEM)中和反应；
(4)低速离心(1000rpm)去上清，获得细胞沉淀；
(5)沉淀下来的细胞虽然失去增殖能力仍然维持代谢活性，接种于HL培养基 中直接用作饲养细胞，或者置于完全DMEM培养基2-3h或置于HL培养基4℃ 储存并于1-7天之内使用；或者长期冻存于-80℃或液氮中备用。
【实施例4】放射线辐照小鼠成纤维细胞使其失去增殖能力
包括如下步骤：
(1)小鼠成纤维细胞培养于DMEM培养基中，生长至80～90％时，用不含 Ca2+/Mg2+的1xPBS洗细胞1次，加入1ml 0.05％胰酶消化细胞20-40s，然后加 入9ml完全DMEM培养基(含10％胎牛血清的DMEM)中和消化反应；
(2)4℃低速离心1000rmp收集细胞沉淀，加入10ml DMEM重悬细胞；
(3)gamma射线或者X射线辐照细胞悬液，使小鼠成纤维细胞失去增殖能力但 是仍然维持代谢活性，将辐照过的小鼠成纤维细胞接种于HL培养基中直接用作 饲养细胞；或者培养于完全完全DMEM培养基2-3h或置于HL培养基4℃储存 并于1-7天之内使用；或者长期冻存于-80℃或液氮中备用。
【实施例5】小鼠成纤维细胞与原代上皮细胞的共培养方法
包括如下步骤：
(1)将经药物丝裂霉素处理或者放射线辐照后的小鼠成纤维细胞，离心去上清 后用HL培养基重悬，分装后放4℃冰箱保存备用；
(2)用95～100％(v/v)的乙醇洗涤分离的组织样品，再用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗，然后将组织样品放入装有冰上预冷的PBS的无菌培养皿中，在解剖显 微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；
(3)将组织样品用消化液消化，所述的消化液优选为0.2mg/mL含胶原酶和分 散酶的HL培养基，消化液的用量优选为10倍于组织样品体积；
(4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25％(质量体积比)胰酶 -EDTA中置于冰上消化1h或室温10min；
(5)加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化反应，低速1000rmp离 心5min，尽量将上清液去除干净；
(6)加入2mL温水浴(37℃)的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mL DNase I， 用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1min；
(7)加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过 滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5min，去除上清；
(8)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶内置于37℃、5％CO2培养箱 中培养，显微镜下观察原代上皮细胞的密度，取出4℃冰箱保存备用的药物丝裂 霉素处理或者放射线辐照过的小鼠成纤维细胞，根据上皮细胞的密度确定补加的 小鼠成纤维细胞的用量，一般补加的小鼠成纤维细胞的用量为2.0×106个/mL， 当显微镜观察发现原代上皮细胞密度(融合率)为50-90％时，补加的小鼠成纤 维细胞的用量为(80→60％)×2.0×106个/mL，两种细胞在同一个共培养体系 为负相关关系，原代上皮细胞密度越大，补加的小鼠成纤维细胞的用量越小。将 培养瓶前后轻柔晃动以混匀细胞，置于培养箱中培养。
按照上述方法成功分离培养的人肺正常和肺癌的原代上皮细胞，显微镜下观 察细胞的形态如图4，人肺正常和肺癌的原代上皮细胞状态鲜活，排列紧密、细 胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。同时绘制细胞生长曲线，发现两株 细胞在连续培养50天细胞群体倍增数分别为13、22代(如图5)。
【实施例6】小鼠成纤维细胞与原代上皮细胞的共培养及小鼠成纤维细胞的更换方法
包括如下步骤：
(1)当原代上皮细胞的生长密度未达到传代密度时，需要对小鼠成纤维细胞进 行更换，先用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞3次；
(2)加入1mL浓度为0.02％的EDTA后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接 触，20-30s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微 镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除EDTA，用1×PBS洗涤 上皮细胞3次；
(3)移除PBS后，加入HL培养基，再根据上皮细胞的密度补充添加4℃冰箱 保存备用的药物丝裂霉素处理或者放射线辐照过的小鼠成纤维细胞于培养瓶内， 置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
按照上述方法成功更换小鼠成纤维细胞之后，不同动物的原代上皮细胞与辐 照过的小鼠成纤维细胞共培养，显微镜下观察原代上皮细胞的形态如图6，小鼠 子宫、大鼠食管、兔宫颈均状态鲜活，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多 角型的上皮细胞。
【实施例7】小鼠成纤维细胞与原代上皮细胞共培养及所得到的原代上皮细胞的传代培养方法
包括如下步骤：
(1)当原代上皮细胞增殖至70～90％的丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗 涤细胞3次，加入1mL浓度为0.02％的EDTA后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细 胞充分接触，20-30s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落， 当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除EDTA，用 1×PBS洗涤上皮细胞3次；
(2)用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞3～5min；加入含10％FBS 的PBS溶液(终止液)中和消化反应；
(3)离心1000rpm，4min去上清，用1mL的HL培养基重悬细胞沉淀，再补 足培养基至6mL接种于培养瓶内，并置于显微镜下观察上皮细胞的密度，取出 4℃冰箱保存备用的药物丝裂霉素处理或者放射线辐照过的小鼠成纤维细胞，根 据上皮细胞的密度确定补加的小鼠成纤维细胞的用量，将培养瓶前后轻柔晃动以 混匀细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
按照上述方法成功传代的不同动物的原代上皮细胞，与辐照过的小鼠成纤维 细胞共培养，显微镜下观察原代上皮细胞的形态如图6，小鼠子宫、大鼠食管、 兔宫颈均状态鲜活，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。 同时绘制这3株上皮细胞的生长曲线，发现小鼠子宫、大鼠食管、兔宫颈上皮细 胞在连续培养25天时细胞群体倍增数分别为16、17、11代。(如图7)
【实施例8】小鼠成纤维细胞与原代上皮细胞共培养及所得到的原代上皮细胞 的药敏实验检测方法
包括如下步骤：
(1)将与小鼠成纤维细胞共培养获得的人肺正常和肺癌的原代上皮细胞用浓度为0.05％的胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种100μL的 细胞悬液，每孔约为8000个细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)第二天加药(阿法替尼、吉非替尼处理，每孔加入200μL含不同浓度药物 HL培养基，阿法替尼药物浓度梯度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 μM，吉非替尼药物浓度梯度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μM)， 每种药物的每个梯度设置六个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不加药物处 理)及只加HL培养基的空白对照组，每组设六个复孔；
(3)药物处理(37℃、5％CO2培养箱培养)48h后，吸去孔内溶液，每孔加入 10μLCKK-8检测试剂(碧云天，上海)，即10μL CCK-8+90μL DMEM培养基 (无血清)；
(4)在37℃、5％CO2细胞培养箱内继续孵育1.5～2个h，孵育时间跟细胞量 的多少相关，具体时间根据预实验结果来确定(可根据液体颜色的变化来初步判 断)，吸光度范围控制在1.0～1.5之间最好；
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
与辐照过的小鼠成纤维细胞共培养所得到的配对的肺正常原代上皮细胞和 肺癌原代细胞对两种不同抗癌药物(阿法替尼，吉非替尼)的药敏检测结果如图 8，A图和B图均显示出上述两种抗癌药物在低溶度范围内0.78125-6.25μM时杀 伤作用较小，随着药物浓度的增加，两种抗癌药物都对两株细胞表现出越强的杀 伤力，其中阿法替尼杀伤作用强于吉非替尼。更重要的是两种抗癌药物对该病人 的肺癌原代细胞较肺正常原代上皮细胞而言，表现出更强的杀伤力，从而提示我 们，该病人的配对细胞对不同的抗癌药物的敏感性有所差异，这种差异可作为对 该病人个体化抗癌药物临床治疗的参考依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种小鼠成纤维细胞，命名为小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714。
2.权利要求1所述的小鼠成纤维细胞作为饲养细胞在人或动物正常上皮细胞/癌细胞的培养中的应用，其特征在于，所述的培养为经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞与人或动物正常上皮细胞/癌细胞的共培养，所述人或动物正常上皮细胞/癌细胞为小鼠子宫、大鼠食管、兔宫颈的上皮细胞、人肺正常原代上皮细胞和肺癌的原代上皮细胞。
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