CN113293140A - 一种端粒酶阴性的小鼠alt细胞模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及构建方法,本发明将Werner早老综合症模型小鼠与p53N236S基因敲入小鼠杂交后,得到Wrn‑/‑mTerc‑/‑p53S/S。该小鼠的胚胎成纤维细胞不会出现衰老表型,且其端粒长度与DKO MEF相比得到明显的恢复。说明由于mTerc以及Wrn基因缺失造成的端粒功能异常可以通过p53S的表达而得到改善。该小鼠ALT细胞模型相较于人类的ALT细胞系,其遗传背景清楚,可用于开展如ALT形成分子机制,针对端粒酶阴性的肿瘤药物筛选等工作,且获得方式简单,操作性强,有相应的动物模型作为进一步验证实验结果的支撑。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因工程领域,特别是涉及一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及其构建方法。
背景技术
端粒是位于真核生物染色体末端的结构,其功能对增殖细胞的基因组稳定性和生存至关重要。端粒在每次细胞分裂过程中都会缩短,当端粒缩短到一定程度就会导致端粒损伤和复制性衰老。而肿瘤细胞往往通过激活端粒维持机制(telomere maintenancemechanism,TMM)来保证细胞快速增殖的状态和基因组的稳定。大多数人类肿瘤选择激活端粒酶(端粒酶是一种以RNA为模板延伸端粒长度的酶)作为其端粒维持机制,以绕过复制性衰老。然而,大约10%-15%的人类肿瘤通过一种与端粒酶无关但依赖于重组的途径来维持端粒。这种途径被称为端粒延长替代机制(Alternative Lengthening of Telomeres,ALT)。
当前研究认为,ALT是一种依赖于端粒序列特异性同源重组的端粒维持机制,端粒利用其它端粒DNA作为模板延长端粒,以抵消由于连续的细胞分裂而导致的端粒缩短。研究证明,ALT的发生总是伴随着一些特征性表型的出现,包括以下几个方面:细胞具有高度异质性、端粒长度不均一、端粒姐妹染色单体互换(T-SCEs)、大量染色体外端粒重复序列DNA(ECTR)以及含有一种特殊的端粒DNA核结构,称为ALT相关的PML小体(APBs)。
由于现有的ALT细胞系大多是人类间充质来源的,少有小鼠ALT细胞系和自发ALT肿瘤小鼠模型的报道,从而限制了ALT机制的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型及其构建方法,以解决上述现有技术存在的问题,该模型以mTerc-/-Wrn-/-转基因小鼠和p53S/S转基因小鼠通过杂交,得到不同代数(指小鼠的代数,由于初代mTerc-/-Wrn-/-小鼠的端粒长度很长,因此需要将小鼠繁殖到G5代左右才会出现衰老表型)的mTerc-/-Wrn-/-p53S/S小鼠的胚胎成纤维细胞为基础,以用于研究ALT发生的分子过程。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型的构建方法,包括以下步骤:
将基因型为mTerc+/-Wrn-/-的小鼠与基因型为p53S/S的小鼠进行交配,得到基因型为mTerc+/-Wrn+/-p53S/+的杂合子小鼠;其中,所述基因型为p53S/S的小鼠为p53N236S突变基因敲入的小鼠;
将基因型为mTerc+/-Wrn+/-p53S/+的杂合子小鼠交配,获得mTerc基因敲出的纯合子代;
将mTerc基因敲出的纯合子代交配,获取小鼠胚胎成纤维细胞,作为端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型。
本发明还提供一种上述的端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型的构建方法构建得到的端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型。
本发明公开了以下技术效果:
本发明将Werner早老综合症模型小鼠(mTerc-/-Wrn-/-,敲出解旋酶Wrn基因和端粒酶Terc基因,称为Double Knock Out,简称DKO)与p53N236S(简写为p53S)基因敲入小鼠杂交后,得到Wrn-/-mTerc-/-p53S/S,即Wrn-/-mTerc-/-加p53S三基因型小鼠,称为TripleMutation,简称TM。研究中发现,TM小鼠的胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)不会出现衰老表型,且其端粒长度与DKO MEF相比得到明显的恢复。说明由于mTerc以及Wrn基因缺失造成的端粒功能异常可以通过p53S的表达而得到改善。由于此细胞模型中,端粒酶基因是敲出的,因此是一个端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型。
该端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型的优势在于:
(1)相较于人类的ALT细胞系,其遗传背景清楚,可用于开展如:ALT形成分子机制,针对端粒酶阴性的肿瘤药物筛选等工作。
(2)不同于人的端粒,小鼠有其特殊的端粒结构和端粒功能调控机制,可为了解小鼠特有的端粒酶阴性背景下的ALT机制提供重要的实验材料。
(3)获得方式简单,操作性强,且有相应的动物模型作为进一步验证实验结果的支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Q-FISH检测端粒信号的荧光图;
图2为Q-FISH检测端粒信号的定量图;
图3为疫荧光检测细胞中APBs图;
图4为疫荧光检测细胞中APBs的定量图;
图5为co-FISH检测细胞中T-SCEs的发生,其中,A为G1TM,B为G3TM,C为G5TM,D为定量图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
实施例1 杂交策略
将鼠龄大小适宜(6周龄左右)的基因型为mTerc+/-Wrn-/-(即mTerc,Wrn敲出,mTerc为端粒酶基因,Wrn为RecQ解旋酶基因)的小鼠与p53S/S(p53N236S突变基因敲入,关于p53N236S的具体信息,详见专利ZL200910095184.3)的小鼠合笼进行交配,得到基因型为mTerc+/-Wrn+/-p53S/+的杂合子小鼠,随后用此基因型的小鼠进行合笼交配得到mTerc-/-Wrn-/-p53S/S的小鼠(mTerc-/-Wrn-/-p53S/+为杂合子,mTerc-/-Wrn-/-p53S/S为纯合子,mTerc敲出的纯和子为第一代,称为G1 TM);随后用G1 TM的小鼠进行合笼交配得到第二代小鼠,即G2 TM;以此类推可以得到G3 TM、G4 TM、G5 TM的小鼠。
利用基因型为mTerc+/-Wrn-/-的小鼠进行合笼交配可以获得基因型为mTerc-/-Wrn-/-的小鼠称为G1 DKO,利用G1 DKO的小鼠进行合笼杂交可以获得第二代小鼠,即G2DKO;以此类推可以的到G3 DKO、G4 DKO、G5 DKO的小鼠。
实施例2 小鼠MEF细胞的制备
1、将鼠龄大小适宜(6周龄左右)的基因型为mTerc-/-Wrn-/-p53S/S的小鼠,雌雄各一只放在一起进行交配,待雌鼠怀孕13.5天的时断颈处死并解剖,将母体内的一串胚胎取出放入加好1×PBS缓冲液的平皿中。
2、剪取其中一个胚胎去除母体子宫组织、外膜及心脏,在1×PBS中漂洗后用70%的酒精杀菌消毒冷却后的刀片将胚胎剁碎。
3、在37℃细胞培养箱中用0.5mL 0.25%胰酶消化10min,向平皿中加入3mL含10%FBS(小牛血清)的DMEM培养基,用巴氏滴管吹打组织数次,将组织块吹打散开。
4、加入新鲜的DMEM(10%FBS)培养基补足到10mL,置于三气培养箱中37℃,5%CO2,3%O2条件下培养24h后,即制得小鼠胚胎成纤维细胞mTerc-/-Wrn-/-p53S/S,即G1 TM的MEF细胞,以此类推。
实施例3 Q-FISH
1、将生长状态良好的目的细胞正常传代,使其第二天细胞生长至约80%~90%,加秋水仙碱使其终浓度为10μg/mL,37℃培养箱处理4h。
2、观察细胞形态已发生变化,胰酶消化法收细胞,将1×PBS洗液及细胞悬液均转移至15mL。4℃、2000rpm离心5min,弃上清。
3、用1mL 1×PBS重悬,4℃、2000rpm离心5min,弃上清。在15mL离心管中加入0.06MKCl溶液低渗处理(先加1mL轻轻吹匀,再加9mL补足到10mL),37℃水浴锅处理30min。
4、时间到后在每管加入1mL固定液,进行预固定。轻轻吹打混匀后4℃、2000rpm离心8min。
5、弃上清,加入5mL固定液,室温放置10min。放入4℃离心机2000rpm离心8min,弃上清,再次加入5mL固定液重悬,常温放置10min。4℃、2000rpm离心8min,弃上清,根据沉淀多少加入300-600μL的固定液重悬样本。
6、滴片:将用固定液悬浮的细胞用200μL移液枪吹匀后,吸取200μL细胞悬液,将载玻片倾斜,于高处滴下,均匀滴至满片。将载玻片置于75℃干浴器上烤干8min。
7、将载玻片背对背贴在一起,间隔放到载玻片玻璃染缸中用1×PBS(约50mL)洗2次,每次3min,ddH2O水合1min,甩干,准备湿盒。
8、固定:4%多聚甲醛滴加在载玻片上,均匀展开,于湿盒中置于杂交炉37℃固定10min。1×PBS洗3次,5min/次。
9、准备TelG-FITC绿色探针(TelG是富含G的端粒探针,是一段TTAGGG重复序列)。绿色探针体系如表1所示,一整张载玻片约滴加35μL体系。
表1
10、盖好盖玻片,注意从此步开始避光,在85℃或90℃干浴器上变性5min,于湿盒中黑暗下常温孵育2-4h,并在湿盒底部加水。
11、用Washing buffer:50mL 2×SSC+500μL吐温(Tween),于载玻片玻璃染缸中取下盖玻片,洗15min。
12、封片:加防淬灭剂,整张载玻片用24×50mm规格盖玻片,每片滴加25μL左右即可,于湿盒中4℃保存,荧光显微镜观察,拍片并用ImageJ对图片中的荧光信号进行定量统计。
结果如图1-2所示,荧光原位杂交数据显示,G3 DKO细胞的端粒信号强于G5 DKO细胞,而且在G5 DKO细胞中几乎观察不到端粒的信号。数据说明随着小鼠代数的增加(G3-G5),DKO细胞的端粒逐渐缩短。在TM细胞中,G3 TM和G5 TM细胞的端粒探针荧光信号没有太大差异;G3 TM细胞的端粒信号明显强于相应的G3 DKO细胞;G5 TM细胞的端粒信号明显强于相应的G5 DKO细胞。说明在TM细胞中端粒功能异常情况有所缓解。
实施例4 PmL免疫荧光染色
1、实验前期准备:将24×24mm规格盖玻片提前十日放在无水乙醇中浸泡,取出一定数量盖玻片于6孔板内,1×PBS清洗两次,吸除备用。
2、将目的细胞消化计数后,每孔接种2×105个细胞,划“∞”字摇晃均匀(需显微镜下观察细胞是否分布均匀),37℃培养过夜。
3、处理完后,吸掉旧培养基,每孔加入1mL 1×PBS洗2遍,吸除废液。沿侧壁每孔加入1mL固定液常温固定10min。
4、吸走废液,每孔加1mL 1×PBS清洗3次/2min,每孔加800μL的0.5%triton X-100,晃匀静置5min。
5、吸走废液,每孔加1mL 1×PBS清洗3次/2min,每孔加入800μL的5%BSA,25℃封闭2h。
6、吸走废液,每孔加1mL 1×PBS清洗3次/2min,标一抗,用2×BSA按1:500比例稀释一抗(也可根据抗体说明书调整稀释比例),将盖玻片周围及四角处的液体吸干,防止因液体表面张力导致抗体流出盖玻片,每个玻片按5点滴样法滴加100μL抗体,铺平,将6孔板孔外凹槽内加入适量ddH2O,防止抗体挥干。于4℃水平放置过夜。
7、每孔加1mL 1×PBS清洗,每次3次/2min。标荧光二抗,稀释比例为1:1000,此步开始避光。每孔加1mL 1×PBS清洗3次/2min。
8、DAPI室温染核20min。DAPI(0.5mg/mL)用1×PBS按1:500稀释。随后每孔加1mL 1×PBS清洗3次/2min。
9、封片:滴加13μL防淬灭剂于做好标记的载破片上,用针头将盖玻片抠起,细胞面朝下缓慢盖至载玻片上,避免气泡产生。置于避光湿盒中,4℃保存。荧光显微镜拍片统计。
对不同代数(G1,G3,G5代)的DKO和TM的MEF的端粒进行IF-FISH检测,结果如图3-4所示,结果显示在不同代数的DKO细胞中,ALT相关的PML小体(APBs)水平均很低,而相应代数的TM细胞中,APBs约增加3~5倍左右,且随代数增加有递增趋势。
实施例5 co-FISH探针杂交
1、滴片:将固定液悬浮的细胞用200μL移液枪吹匀后,吸取200μL细胞悬液,将载玻片倾斜,于高处滴下,均匀滴至满片,将载玻片置于75℃干浴器上烤干8min。
2、将载玻片背对背贴在一起,间隔放到载玻片玻璃染缸中用1×PBS洗2次,每次3min,ddH2O水合1min,甩干,准备湿盒。
3、固定:4%多聚甲醛低加在载玻片上,均匀展开,于湿盒中置于杂交炉37℃固定10min。
1×PBS洗3次,5min/次,常温。
4、用2×SSC充满载玻片,整张片子约50μL,盖上24×50mm规格的盖玻片,放至UV交联仪紫外照射35min。紫外照射结束后在载玻片玻璃染缸中用1×PBS冲洗取下盖玻片,并5min洗两次,甩干。
5、制备ExoIII(1μL ExoIII+10μL buffer+89μL ddH2O),根据载玻片数量制备,盖一整张载玻片需30μL左右,室温下添加新的盖玻片放置20min。于1×PBS中取下盖玻片,洗2次/5min。
6、准备TelG-FITC绿色探针。一整张载玻片约滴加35μL绿色探针体系。
7、盖好盖玻片,注意从此步开始避光,在85℃或90℃干浴器上变性5min,于湿盒中黑暗下常温孵育2-4h,并在湿盒底部加水。
8、用Washing buffer:50mL 2×SSC+500μL吐温(Tween),于载玻片玻璃染缸中取下盖玻片,洗3次/15min。
9、准备TelC-Cyc3红色探针(TelC是富含C的端粒探针,是一段CCCTAA重复序列)。红色探针体系如表2所示。
表2
10、每张载玻片滴加35μL左右体系,盖盖玻片,置湿盒中室温放置2h,4℃过夜。
11、Washing buffer:50mL 2×SSC+500μL吐温(Tween)洗载玻片,注意将盖玻片取下后背对背放在玻璃缸中,洗4-5次,第一次10min换液,此后每次洗15min,过程避光。
12、DAPI染色,0.5mg/mL的DAPI用1×PBS按1:500倍稀释使用,每张片子滴加200μL左右,均匀铺开,常温染色20min,1×PBS洗5min/2次,甩干。
13、封片:加防淬灭剂,整张载玻片即用24×50mm规格盖玻片,每片滴加25μL左右即可,倘若拍照过程中背景过蓝,可用50%甘油:防淬灭剂=1:2稀释使用。于湿盒中4℃保存,荧光显微镜观察,拍片统计端粒姐妹单体交换的情况。
对不同代数(G1,G3,G5代)的DKO和TM的MEF的端粒进行IF-FISH检测,结果如图5所示,结果显示在不同代数的DKO细胞中,ALT相关的PML小体(APBs)水平均很低,而相应代数的TM细胞中,APBs约增加3~5倍左右,且随代数增加有递增趋势。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
将基因型为mTerc+/-Wrn-/-的小鼠与基因型为p53S/S的小鼠进行交配,得到基因型为mTerc+/-Wrn+/-p53S/+的杂合子小鼠;其中,所述基因型为p53S/S的小鼠为p53N236S突变基因敲入的小鼠;
将基因型为mTerc+/-Wrn+/-p53S/+的杂合子小鼠交配,获得mTerc基因敲出的纯合子代;
将mTerc基因敲出的纯合子代交配,获取小鼠胚胎成纤维细胞,作为端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型。
2.一种权利要求1所述的端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型的构建方法构建得到的端粒酶阴性的小鼠ALT细胞模型。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114921480A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-08-19 | 国科宁波生命与健康产业研究院 | 一种骨细胞Terc基因敲除小鼠模型的构建方法 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1571215A2 (en) * | 1997-07-01 | 2005-09-07 | Cambia Biosystems LLC | Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof |
US20090077676A1 (en) * | 2003-11-15 | 2009-03-19 | Jan Hendrik Jozef Hoeijmakers | Prematurely ageing mouse models for the role of dna damage in ageing and intervention in ageing-related pathology |
CN101805738A (zh) * | 2009-11-12 | 2010-08-18 | 昆明理工大学 | 早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用 |
CN102125698A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-07-20 | 昆明理工大学 | 具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型的建立方法 |
AU2010300082A1 (en) * | 2009-09-22 | 2012-05-17 | Children's Medical Research Institute | Methods and assays for the detection of Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) activity in cells |
CN103142621A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-06-12 | 昆明理工大学 | 四种黄杨生物碱化合物的医药用途 |
CN107447005A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-12-08 | 昆明理工大学 | p53基因突变与端粒功能异常的用途 |
CN108486248A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-09-04 | 昆明理工大学 | 肿瘤相关成纤维细胞中p53基因突变的用途 |
CN108504625A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-07 | 李晖 | 一种小鼠成纤维细胞及其用途 |
WO2021040600A1 (en) * | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Hakmed Ab | Desloratadine and/or loratadine for treatment and/or prophylactic treatment of melanoma |
WO2021178898A1 (en) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Host defense suppressing methods and compositions for modulating a genome |
-
2021
- 2021-05-25 CN CN202110568741.XA patent/CN113293140A/zh active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1571215A2 (en) * | 1997-07-01 | 2005-09-07 | Cambia Biosystems LLC | Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof |
US20090077676A1 (en) * | 2003-11-15 | 2009-03-19 | Jan Hendrik Jozef Hoeijmakers | Prematurely ageing mouse models for the role of dna damage in ageing and intervention in ageing-related pathology |
AU2010300082A1 (en) * | 2009-09-22 | 2012-05-17 | Children's Medical Research Institute | Methods and assays for the detection of Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) activity in cells |
CN101805738A (zh) * | 2009-11-12 | 2010-08-18 | 昆明理工大学 | 早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用 |
CN102125698A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-07-20 | 昆明理工大学 | 具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型的建立方法 |
CN103142621A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-06-12 | 昆明理工大学 | 四种黄杨生物碱化合物的医药用途 |
CN107447005A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-12-08 | 昆明理工大学 | p53基因突变与端粒功能异常的用途 |
CN108486248A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-09-04 | 昆明理工大学 | 肿瘤相关成纤维细胞中p53基因突变的用途 |
CN108504625A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-07 | 李晖 | 一种小鼠成纤维细胞及其用途 |
WO2021040600A1 (en) * | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Hakmed Ab | Desloratadine and/or loratadine for treatment and/or prophylactic treatment of melanoma |
WO2021178898A1 (en) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Host defense suppressing methods and compositions for modulating a genome |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
PURNIMA R. LAUD等: "Elevated telomere–telomere recombination in WRN-deficient, telomere dysfunctional cells promotes escape from senescence and engagement of the ALT pathway", 《GENES & DEVELOPMENT》 * |
刘同阳等: "突变型p53与其合成致死基因的研究进展", 《遗传》 * |
屈莲花等: "Wrn~(-/-)p53~(s/s)导致神经管缺陷的研究", 《昆明理工大学学报(自然科学版)》 * |
张永进等: "端粒延长替代机制与DNA修复途径", 《中国细胞生物学学报》 * |
张秀峰等: "衰老或肿瘤:端粒酶和p53的相互作用", 《遗传》 * |
李海丽: "p53N236S对端粒功能异常和环境毒性因子所致衰老的调控作用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 * |
毕永祥等: "小鼠不同部位体内前列腺癌骨转移模型的建立及方法改进", 《北京大学学报(医学版)》 * |
贾舒婷等: "Werner综合征小鼠模型在早衰与肿瘤研究中的应用", 《遗传》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114921480A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-08-19 | 国科宁波生命与健康产业研究院 | 一种骨细胞Terc基因敲除小鼠模型的构建方法 |
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