CN111635912A - 一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用，所述基因组合包括TP53突变基因和c‑MYC基因。具体为利用慢病毒在肝细胞内过表达所述基因组合，即可诱导正常肝细胞形成肝癌细胞。将转入所述基因组合的人原代肝细胞移植至Fah基因突变的免疫缺陷动物如小鼠体内培养即可得到所述原发性肝癌人源化小鼠模型。该模型的肝癌细胞由正常肝细胞转化而来，且是一种正常肝脏细胞与肝癌细胞共同嵌合的体内模型，可更好地模拟人体肝癌形成过程及肝癌微环境，便于研究人员利用该模型研究肝癌的发生、发展及演变过程，为新型肝癌药物的开发、药物的药理毒理研究及肝癌治疗药物的耐药性机制探索提供了有利模型。

Description

一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用，尤其涉及一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合、利用其制备得到的人肝癌细胞和原发性肝癌人源化动物模型及构建方法和应用。
背景技术
肝癌主要分为肝细胞癌(hepa-tocellular carcinoma，HCC)和肝内胆管癌(intra-hepatic cholangiocarcinoma，ICC)和混合型肝癌，是我国高发及高死亡率的肿瘤之一，其中肝细胞癌占肝癌总量的85％-90％。由于肝癌早期发病症状不明显，极易被忽视，而一经发现半数以上病人已处于中晚期，因此，肝癌是预后最差的恶性肿瘤之一。
肝癌的发生和发展是多种因素共同作用的结果，目前肝癌的致病机理尚未十分清楚，现有的多种治疗方案也不能够有效缓解晚期肿瘤进展，因此，深入研究肝癌发病的分子及细胞机理对肝癌的治疗具有重要意义。
现有的肝癌动物模型主要包括自发性肝癌模型、诱发性肝癌动物模型、基因工程肝癌动物模型及原位移植肝癌动物模型。但是，自发性肝癌模型与人体肝癌发生环境较为接近，但发病效率低且周期长，难以得到广泛应用；诱发性肝癌动物模型具有操作简便、用时短等优势，是目前应用较多的动物模型，但动物肝癌模型与人体存在差异，因此不能很好的还原人体肝癌细胞特性，结果与人体实际情况存在差异；基因工程肝癌动物模型需要较高的技术水平，且成本高，环境要求高，限制了一般实验室的应用，且目前主要是小鼠肝癌的诱导。
除了原位移植动物模型外，以上几种模型均为小鼠或大鼠的肝癌模型，与人体存在较大差异，不能很好的反应人体肝癌细胞生存生长特性，也不能够有效的反应细胞对药物的反应，给肝癌发病机制研究及肝癌药物研发造成了极大的不便。
CN101185764A公开了一种原位移植性小鼠肝癌模型及其制备方法和应用。将稳定转染EGFP的H22细胞株注射入BALB/c小鼠腹腔扩增，从H22腹水癌小鼠腹腔内抽取腹水，分离细胞并制成细胞悬液，打开小鼠腹腔，用微量注射器抽取细胞悬液注射入小鼠肝脏，用75％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，用粘合剂封闭针孔，再以生理盐水冲洗肝脏表面，分层关腹。该模型是一种可以用于研究原发性肝癌发展及转移的机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的理想的原发性肝癌模型。
但是，原位移植细胞系的肝癌模型不能够模拟人体肝癌细胞微环境，原位移植人体肝癌细胞的小鼠则存在移植效率低，建模周期长等问题，影响了其在研究中的应用。
因此，本领域需要开发一种能够模拟人体肝癌细胞微环境且发病率高的肝癌模型，为肝癌的治疗以及致病机理的研究奠定基础。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用。利用所述基因组合得到的人肝癌细胞以及原发性肝癌模型在筛选或制备肝癌药物、诊断肝癌患者等领域具有广泛的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合，所述基因组合包括TP53突变基因和c-MYC基因。
本发明中，包括TP53突变基因和c-MYC基因在内的基因组合能够将肝细胞诱导为肝癌细胞。仅包含TP53和c-MYC其中之一或者不包含上述基因而替换成其他癌相关基因，是无法诱导人原代肝细胞癌变成为肝癌细胞的。本发明中通过所述基因组合使正常肝细胞发生癌变，为后续构建肝癌动物模型，包括肝细胞癌、肝内细胞癌以及混合型肝癌模型提供了基础。
优选地，所述肝细胞包括人原代肝细胞，即本发明提供的基因组合可以将多种来源的肝细胞癌化，包括人原代肝细胞。
作为本发明优选的技术方案，所述基因组合还包括NRAS突变基因、KRAS突变基因、Hyper-IL6基因、BRAF基因、CTNNB1基因或ERBB4基因中的任意一种或至少两种的组合，优选为NRAS突变基因和/或KRAS突变基因。
本发明所述的TP53突变基因、c-MYC基因、NRAS突变基因、KRAS突变基因、Hyper-IL6基因、BRAF基因、CTNNB1基因和ERBB4基因均为肝癌变的相关基因。在本发明中，利用慢病毒给人原代肝细胞转入上述基因的混合病毒液，实现不同基因的混合转染，而后通过脾脏注射将细胞移植至NSIF小鼠肝脏，六个月后，观察到部分小鼠肝脏生成人肝癌细胞，且基因鉴定后发现成瘤样本均有TP53和c-MYC插入。
所述基因组合可以构建于同一质粒上，也可以构建于不同的质粒上。例如可以是：将TP53/KRAS/c-MYC三个基因构建于同一载体上转入，也可以是将TP53、KRAS、c-MYC和NRAS四个基因分别构建于不同的载体上，得到混合的慢病毒溶液转入正常肝脏细胞，或者将TP53、KRAS、c-MYC、NRAS、BRAF和hyper IL6六个基因分别构建于不同的载体上，得到混合的慢病毒溶液转入正常肝脏细胞，均可得到癌变的肝脏细胞。
第二方面，本发明提供一种基因转染载体，所述慢病毒载体含有第一方面所述的基因组合。
优选地，所述基因转染载体为基因过表达载体，包括慢病毒载体、Piggybac载体或TetOn诱导性载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第三方面，本发明提供一种人肝癌细胞，所述人肝癌细胞为基因组中整合有第一方面所述的基因组合的人原代肝细胞。
优选地，所述人肝癌细胞中包括第二方面所述的基因转染载体。
第四方面，本发明提供一种人肝癌细胞的构建方法，所述方法包括如下步骤：以人原代肝细胞为母细胞，并用携带如第一方面所述的基因组合的慢病毒载体和包装质粒共转染包装细胞，得到慢病毒溶液；再将所述慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，在所述人原代肝脏细胞过表达所述基因组合，诱导肝癌形成得到所述人肝癌细胞。
本发明提供的构建方法通过慢病毒向人原代正常肝脏细胞转染基因组合，所述基因组合包括TP53突变基因与c-MYC基因，获得转染细胞后，体外培养一段时间后，正常肝脏细胞发生癌变，得到人肝癌细胞。所述构建方法通过将TP53突变基因与c-MYC基因转入正常肝脏细胞中，诱导肝脏细胞癌变，得到肝癌细胞，癌变率较高且所需时间较短；所得到的人肝癌细胞在构建肝癌模型、筛选或制备肝癌药物、诊断肝癌患者等领域具有广泛的应用前景。
优选地，所述包装细胞包括293T细胞或PlatE细胞。优选地，所述慢病毒载体与的包装质粒的质量比为(2～4):5，例如可以是2:5、2.2:5、2.5:5、3:5、3.5:5、3.8:5或4:5等，优选为3:5。优选地，所述包装质粒包括psPAX2和pMD2.G。优选地，所述psPAX2和pMD2.G的质量比为(3～5):1，例如可以是3:1、3.2:1、3.5:1、3.8:1、4:1、4.2:1、4.5:1、4.8:1或5:1等，优选为4:1。
实验中，所述慢病毒溶液与人原代肝细胞的比例为每10mL慢病毒溶液感染2×106个细胞，其中，慢病毒溶液的滴度为(0.5-10)TU，例如可以是0.5TU、1TU、2TU、4TU、5TU、6TU、8TU、9TU或10TU等，最佳为5TU。
优选地，所述混合培养的时间为36～60h，例如可以是36h、40h、44h、48h、50h、52h、54h、55h、58h或60h等，优选为48h，即混合培养大约2天后，人肝脏细胞会发生癌变，得到人肝癌细胞。
作为本发明优选的技术方案，所述人原代肝细胞与慢病毒溶液混合前经过预处理，所述预处理的操作为：将所述人原代肝细胞置于肝细胞培养基中，培养24～48小时，例如可以是24小时、25小时、28小时、30小时32小时、35小时、38小时、40小时、42小时、45小时或48小时等。
所述肝细胞培养基不包含胎牛血清和双抗，例如可以是InVitroGRO CP肝细胞培养基。
优选地，所述人原代肝细胞的培养条件为在36～37℃(例如可以是36℃、36.2℃、36.4℃、36.5℃、36.8℃或37℃等)、4.5～5.5％CO2(例如可以是4.5％、4.6％、4.8％、5％、5.2％、5.4％或5.5％等)下培养。
本发明中，所述构建方法可以按如下步骤进行：
(1)将携带基因组合的慢病毒载体、包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞，所述基因组合包括TP53突变基因、c-MYC基因、NRAS突变基因和KRAS突变基因，所述基因组合构建于不同质粒上，得到表达所述基因组合的慢病毒溶液；
(2)将人原代肝细胞预处理后与所述慢病毒溶液混合，培养8～12天后得到细胞成团聚集生长、不存在接触抑制的人肝癌细胞。
本发明中，根据上述人肝癌细胞的构建方法，本发明还提供一种构建人肝癌细胞的装置。所述装置包括转染单元和培养单元；所述转染单元用于将慢病毒载体和包装质粒混合共转染293T细胞，所述培养单元用于将慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，得到转染致癌基因的人肝癌细胞。
第五方面，一种原发性肝癌人源化动物模型，所述人肝癌模型为转移有第二方面所述的基因转染载体和人原代肝细胞的生物体。
优选地，所述生物体为肝脏自发或可诱导损伤的免疫缺陷动物，包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一种免疫缺陷小鼠，优选为NSIF小鼠。其中，所述免疫缺陷动物(例如小鼠等)均是商品化的免疫缺陷动物，可以由常规的生物实验器材厂商购得。
第六方面，一种构建原发性肝癌人源化动物模型的方法，所述方法包括：
以人原代肝细胞为母细胞，并用携带如第一方面所述的基因组合的慢病毒载体和包装质粒共转染包装细胞，得到慢病毒溶液；
再将所述慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，再经体外培养确认基因组合转入后、肝癌细胞形成前转移到免疫缺陷小鼠体内，饲养后得到所述原发性肝癌人源化动物模型。
本发明中，通过慢病毒体外向人原代正常肝脏细胞转染基因组合，所述基因组合必须包括TP53突变基因与c-MYC基因，还可以包含NRAS突变基因、KRAS突变基因、c-MYC基因、Hyper-IL6基因、BRAF基因、CTNNB1基因或ERBB4基因中的任意一种或至少两种，获得转染细胞后，体外培养确认基因转入后移植至免疫缺陷的免疫缺陷小鼠体内。在小鼠饲养期间，间断性给予NTBC(尼替西农)，培养3-6个月后，小鼠肝脏逐渐出现肝脏肿瘤细胞团块，即得到所述原发性肝癌人源化动物模型。
本发明提供的方法能够在体内将肝正常细胞诱导为肝癌细胞，与现有的肝癌模型相比，通过此方法构建得到的小鼠肝癌模型能够更好的模拟人体肝细胞转化为肝癌的过程，同时还是一种人正常肝细胞和人肝癌细胞共同嵌合的肝癌模型，与临床肝癌发展更为相像，能够为临床治疗、诊断和病理研究提供基础。
所述实验动物包括肝脏自发或可诱导损伤的免疫缺陷实验动物，均为可通过常规渠道购买得到的规范化商品，如TK-NOG(Thymidine Kinase即胸苷嘧啶激酶缺陷的NOD-Scid IL2rg-/-)免疫缺陷小鼠、uPA-SCID(urokinase-type Plasminogen Activator即尿激酶纤维蛋白融酶原激活剂缺陷的Scid)免疫缺陷小鼠、FRG(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-)、FRGN(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-NOD)免疫缺陷小鼠和NSIF(NOD-SCID IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠。其中，NSIF小鼠是一种T细胞、B细胞和NK细胞缺失，Fah基因缺陷的小鼠，饲养于SPF(Specific Pathogen Free)级别环境中，饮水添加7.5mg/L尼替西农(Nitisinone,NTBC)，NTBC撤掉后，NSIF小鼠逐渐发生肝脏损伤，于3-5周内死亡。
优选地，所述免疫缺陷小鼠为Fah(fumarylacetoacetate hydrolase，延胡索酸乙酰乙酸水解酶)基因缺陷的免疫缺陷小鼠，优选为Fah-/-小鼠，Fah基因缺失，会导致肝细胞中酪氨酸的毒性代谢产物的积累。进一步优选为NOD-SCID IL2rg-/-Fah-/-小鼠。
优选地，所述移植的方法包括脾脏注射或肝原位注射。
优选地，所述饲养的时间为60～180天，例如可以是60天、80天、100天、120天、130天、150天或180天等，优选为120～180天。
优选地，得到所述原发性肝癌人源化动物模型后还包括病理鉴定的操作。优选地，所述病理鉴定包括：肿瘤形成后，解剖剥取小鼠的肝脏组织，检测组织病理特征和肿瘤所属类型。
基于上述原发性肝癌人源化动物模型的构建方法，本发明还提供一种用于构建原发性肝癌人源化动物模型的装置。所述装置包括转染单元、导入单元和饲养单元，所述转染单元用于将慢病毒载体和包装质粒混合共转染293T细胞，所述导入单元用于将慢病毒溶液与人原代肝细胞混合，并将其转移至小鼠体内，所述饲养单元用于培养小鼠，提供小鼠所需的营养及药物，最终培养得到所述原发性肝癌人源化动物模型。
第七方面，本发明还提供一种如第一方面所述的基因组合、如第二方面所述的基因转染载体、如第三方面所述的人肝癌细胞或如第五方面所述的人肝癌模型在筛选或评估治疗肝癌药物中的应用。
示例性地，本发明可以采用如下方法构建人肝癌细胞和原发性肝癌人源化动物模型，具体步骤包括：
1、人肝癌细胞的构建
(1)人原代肝细胞培养：调整肝细胞浓度后接种于10cm培养皿中，添加InVitroGROCP肝细胞培养基，置于5％CO2的37℃的培养箱中培养4h后，更换新鲜培养基并去除未贴壁细胞，每两天更换新鲜培养基；
同时，肝细胞培养时还可以使用其他肝细胞培养基进行培养，例如可以选用含有10％FBS(胎牛血清，fetal calf serum)、1％双抗(青霉素和链霉素)、5ng/mL肝细胞生长因子(HGF，hepatocyte growth factor)的DMEM培养基；优选为转染基因前使用InVitroGROCP，转染基因后使用前述DMEM培养基。
(2)慢病毒包装：①接种状态良好的293T细胞于10cm皿中，待293T细胞生长到70％-80％汇合度时，用含有1％FBS和1％双抗的DMEM培养基饥饿培养2～6小时；
②将PEI(Polyethylenimine，聚乙烯亚胺)(72μg/皿)加入opti-MEM(无血清培养基)中，混匀，室温静置5分钟，将携带基因组合的质粒、psPAX2和pMD2.G加入opti-MEM中，所述psPAX2和pMD2.G的质量比为(3～5):1，混匀；
③按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入含有质粒的培养基中，轻轻摇晃混匀，室温静置20min；
④将步骤③所得混合液逐滴加入饥饿后的293T细胞培养皿中，轻轻摇晃混匀，37℃培养箱中培养，6-8小时后换液继续培养，24、48、72小时后分别收集上清，获得慢病毒溶液备用；同时，除最后一次外每次收集上清后加入预热的含1％FBS和1％双抗的DMEM新鲜培养基。
(3)转染肝脏细胞
将步骤(1)中的肝脏细胞分成转导实验组和GFP空白对照组，以每孔细胞数1×106培养于十厘米皿中，培养基8mL/孔：含有10％FBS和1％双抗的DMEM，置于37℃、5％CO2的条件下培养24小时；
在转导实验组和GFP空白对照组的肝脏细胞溶液中分别加入含有基因组合的慢病毒溶液和GFP慢病毒溶液各10mL，12小时后换液。
(4)结果观察：培养一段时间后，观察不同实验组的细胞增殖情况、生长形态等，发现转染GFP的空白对照组肝脏细胞生长缓慢，细胞形态不规则，不成团生长，存在接触抑制；
而转染含有所述基因组合的慢病毒溶液的肝脏细胞迅速增殖，不存在接触抑制，细胞成团聚集生长，细胞形态呈规则梭形、棱形及多边形，说明细胞出现癌变转化，所得细胞为人肝癌细胞。
2、原发性肝癌人源化动物模型的构建
(1)人肝细胞移植NSIF小鼠
人原代肝细胞在体外培养2天后，利用携带基因组合的慢病毒溶液转染得到人肝细胞；在移植人肝细胞前一周，小鼠断药NTBC，移植时，腹腔注射400μL阿佛丁麻醉小鼠，脾脏注射GFP阳性的人肝细胞(5×105/只)；
注射后用棉线轻微结扎脾脏，防止注射液倒流，同时用伤口夹缝合手术伤口，防止感染。术后三天给小鼠NTBC水，每日密切观察，待小鼠体重稳定后撤走NTBC水，如此往复，直至撤走NTBC水后小鼠体重稳定后则可完全不用给药。
(2)结果检测
①利用活体成像监测人肝细胞在小鼠肝脏中的嵌合过程；
②当小鼠出现体征较弱、弓背、腹水等发病特征，断颈法处死小鼠，解剖取其肝脏和脾脏组织后可以进行如下检测：包括荧光显微观察、H&E鉴定、免疫荧光鉴定、成瘤性鉴定或小鼠基因组的PCR鉴定等方面的检测，最终确认得到原发性肝癌人源化动物模型。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明通过慢病毒向人原代正常肝脏细胞转染包括TP53突变基因与c-MYC基因在内的基因组合，首次将人原代肝脏细胞诱导为肿瘤细胞，突破了目前无法将人原代肝脏细胞癌变的技术障碍，且与药物诱导肝癌模型相比，该模型癌变率较高、所需时间较短，所得人肝癌细胞能够用于构建肝癌模型，包括肝细胞癌、肝内细胞癌以及混合型肝癌，也能够用于筛选或制备肝癌药物、诊断肝癌患者等方面；
(2)本发明提供的构建原发性肝癌人源化动物模型方法，通过慢病毒向人原代正常肝脏细胞转染包括TP53突变基因与c-MYC基因在内的基因组合，在其癌变之前转入小鼠体内，并在小鼠体内缓慢诱导肝癌发生，获得原发性肝癌人源化动物模型，所得肝癌模型的肝癌细胞由正常肝细胞转化而来，能够更好的模拟人体肝细胞转化为肝癌的过程，而且所述模型是一种正常肝脏与肝癌细胞共同嵌合的模型，与原位移植细胞系的肝癌模型相比，能够更好地模拟人体肝癌细胞微环境，与人体肝癌更为相似，便于研究人员观察肝癌的发生和发展过程，为肝癌药物的开发和药理研究提供基础。
附图说明
图1为实施例1中实验组与空白对照组在荧光和白光下的细胞生长图。
图2为实施例2中实验组与空白对照组在荧光和白光下的细胞生长图。
图3为实施例3中实验组与空白对照组在荧光和白光下的细胞生长图。
图4为实施例3中实验组TP53/c-MYC和TP53/KRAS/c-MYC得到的肝脏细胞核型分析图。
图5为实施例4中实验组与空白对照组在荧光和白光下的细胞生长图。
图6为实施例5中利用活体成像监测人肝细胞在小鼠肝脏部的嵌合过程图。
图7为实施例5中小鼠#1-1与#5-10的肝脏组织的实物图与荧光显微观察图。
图8(a)为实施例5中H&E鉴定时实验组与对照组的组织切片图。
图8(b)为实施例5中H&E鉴定时发病小鼠和只转染GFP的肝脏细胞移植小鼠的肝脏组织切片图。(标尺20μm)
图9为实施例5中小鼠的肝脏组织切片的免疫荧光鉴定图。(标尺20μm)
图10为实施例5中原位移植成瘤小鼠解剖后的肝脏组织实物图与荧光显微观察图。
图11为实施例5中#1-1病变组织与原位移植成瘤小鼠的肿瘤组织的GFP免疫组化染色结果对比图。
图12(a)为实施例6中小鼠血清中检测到的hALB含量柱状图。
图12(b)为实施例6中小鼠血清中检测到的hAFP含量柱状图。
图13为实施例6中肝脏细胞移植的发病小鼠和只转染GFP的肝脏细胞移植小鼠的肝脏组织对比图。(标尺20μm)
图14为实施例6中发病小鼠的肝脏切片、只转染GFP的肝脏细胞移植小鼠的肝脏切片及HCC病人来源的肿瘤组织切片的免疫组化检测结果对比图。(标尺50μm)
图15为实施例6中小鼠基因组的PCR鉴定的凝胶电泳图；其中，泳道1为实验组、泳道2为阳性对照，泳道3为阴性对照，最左侧泳道表示DNA marker。
图16为实施例7中体外培养0代的肿瘤细胞转染后相关标志物的荧光抗体在共聚焦显微镜下的检测图。(标尺50μm)
图17为实施例7中体外培养1代的肿瘤细胞原位移植到小鼠肝脏后得到的发病小鼠的肝脏组织实物图与荧光显微观察图。
图18为实施例8中实验组小鼠的肝脏组织、胆管组织与肝内胆管癌患者来源的肿瘤组织对比图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，所使用的人体原代肝脏组织编号#1、#2、#3和#4均购买来源于瑞德生物，将肝脏组织剪切、研磨，并用红细胞裂解液裂解、离心，用肝细胞培养基重悬，获得#1、#2、#3和#4肝脏单细胞溶液备用。
以下实施例中，#1-1小鼠指建模的第1批小鼠，其中每批小鼠建模5～8只，第二数字指小鼠的编号，即#1-1小鼠是第1批建模小鼠中的第一只，其它编号均以此类推。
实施例1
本实施例中使用TP53/KRAS/c-MYC三转基因体外诱导#1原代肝脏细胞转化为肝癌细胞
(1)人原代肝细胞培养
调整肝细胞浓度为5×105/cm3，接种于10cm培养皿中，培养基添加InVitroGRO CP肝细胞培养基，置于5％CO2 37℃的培养箱中培养4h后，更换新鲜培养基并去除未贴壁细胞，每两天更换新鲜培养基。
(2)慢病毒包装
接种状态良好的293T细胞于10cm皿中，待293T细胞生长到70％汇合度时，用含1％FBS、1％双抗的DMEM培养基饥饿培养2小时；
将PEI(Polyethylenimine，聚乙烯亚胺)(72μg/皿)加入opti-MEM(无血清培养基)中，混匀，室温静置5分钟；
将质粒pWPXLd-TP53-2A-KRAS-2A-MYC-2A-GFP、pWPXLd-GFP(9μg/皿)分别与psPAX2(12μg/皿)和pMD2.G(3μg/皿)加入opti-MEM中，混匀；
按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入各质粒培养基中，轻轻摇晃混匀后室温静置20min；逐滴加入饥饿后的293T细胞培养皿中，轻轻摇晃混匀，37℃培养箱中培养，8小时后换液继续培养，24、48、72小时后分别收集上清，每次收集后加入预热的含1％FBS、1％双抗的DMEM新鲜培养基，分别获得TP53/KRAS/c-MYC和GFP慢病毒溶液备用。
(3)将#1肝脏细胞分成两组，TP53/KRAS/c-MYC转导实验组和GFP空白对照组，每组设置3个复孔，以每孔细胞数1×106培养于6孔板培养皿，培养基2ml：含有10％FBS和1％双抗的DMEM，置于37℃、5％CO2培养24小时，分别加入5mL TP53/KRAS/MYC和GFP慢病毒溶液，
10天后，观察不同实验组的细胞增殖情况、生长形态等，结果如图1所示。
转染GFP的空白对照组肝脏细胞生长缓慢，细胞形态不规则，不成团生长，存在接触抑制；而转染TP53/KRAS/c-MYC的肝脏细胞迅速增殖，不存在接触抑制，细胞成团聚集生长，细胞形态呈规则梭形、棱形，说明细胞出现癌变转化。
实施例2
TP53/KRAS/c-MYC三转基因体外诱导#2原代肝脏细胞转化为肝癌细胞
将#2肝脏细胞分成两组，TP53/KRAS/c-MYC转导实验组和GFP空白对照组，每组设置3个复孔，以每孔细胞数1×106培养于6孔板培养皿，培养基2mL：含有10％FBS和1％双抗的DMEM，置于37℃、5％CO2培养24小时，分别加入实施例1中步骤(2)获得的TP53/KRAS/c-MYC和GFP慢病毒溶液。
10天后，观察不同实验组的细胞增殖情况、生长形态等，结果如图2所示。
发现转染GFP的空白对照组肝脏细胞生长缓慢，细胞形态不规则，不成团生长，存在接触抑制；而转染TP53/KRAS/c-MYC的肝脏细胞迅速增殖，不存在接触抑制，细胞成团聚集生长，细胞形态呈规则梭形、棱形。
实施例3
本实施例中通过TP53/c-MYC双转基因和TP53/KRAS/c-MYC三转基因体外诱导#3原代肝脏细胞转化为肝癌细胞。
(1)慢病毒包装
接种状态良好的293T细胞于10cm皿中，待293T细胞生长到80％汇合度时，用含1％FBS、1％双抗的DMEM培养基饥饿培养2小时；
将PEI(72μg/皿)加入opti-MEM中，混匀，室温静置5分钟；将如下表1中的质粒各9μg/皿分别与psPAX2(12μg/皿)和pMD2.G(3μg/皿)加入opti-MEM中，混匀；
表1
Figure BDA0002545990790000131
按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入各质粒培养基中，轻轻摇晃混匀后室温静置20min；
逐滴加入饥饿后的293T细胞培养皿中，轻轻摇晃混匀，37℃培养箱中培养，8小时后换液继续培养，24、48、72小时后分别收集上清，每次收集后加入预热的含1％FBS、1％双抗的DMEM新鲜培养基，分别获得KRAS、TP53、c-MYC、TP53/KRAS、KRAS/c-MYC、TP53/c-MYC、TP53/KRAS/c-MYC和GFP慢病毒溶液备用。
将#3肝脏细胞分成8组，KRAS、TP53、c-MYC、TP53/KRAS、KRAS/c-MYC、TP53/c-MYC、TP53/KRAS/c-MYC转导实验组和GFP空白对照组，每组设置3个复孔，以每孔细胞数1×106培养于6孔板培养皿，培养基2mL：10％FBS+1％双抗的DMEM，置于37℃、5％CO2培养48小时，分别加入TP53/KRAS/c-MYC和GFP慢病毒溶液。
10天后，观察不同实验组的细胞增殖情况、生长形态等，结果如图3所示。
转染KRAS、TP53、c-MYC、TP53/KRAS、KRAS/c-MYC的实验组和GFP的空白对照组肝脏细胞生长缓慢，细胞形态不规则，不成团生长，存在接触抑制；而转染TP53/c-MYC、TP53/KRAS/c-MYC的肝脏细胞迅速增殖，不存在接触抑制，细胞成团聚集生长，细胞形态呈规则梭形、棱形，进一步通过染色体核型分析，如图4所示，发现转染TP53/c-MYC、TP53/KRAS/c-MYC的肝脏细胞核型为61条染色体，非正常细胞核型。
实施例4
本实施例中利用TP53/c-MYC双转基因和c-MYC/TP53/KRAS三转基因体外诱导#4原代肝脏细胞转化为肝癌细胞
将#4肝脏细胞分成8组，KRAS、TP53、c-MYC、TP53/KRAS、KRAS/c-MYC、TP53/c-MYC、TP53/KRAS/c-MYC转导实验组和GFP空白对照组，每组设置3个复孔，以每孔细胞数1×106培养于6孔板培养皿，培养基2mL：10％FBS+1％双抗的DMEM，置于37℃、5％CO2培养48小时，分别加入TP53/KRAS/c-MYC和GFP慢病毒溶液。
10天后，观察不同实验组的细胞增殖情况、生长形态等，发现转染GFP、TP53、c-MYC、KRAS、TP53/KRAS、KRAS/c-MYC的肝脏细胞生长缓慢，细胞形态不规则，不成团生长，存在接触抑制；
其中图5展示了转染GFP、TP53、TP53/c-MYC与TP53/KRAS/c-MYC的实验结果，由图上明显可以看到，转染了TP53/c-MYC、TP53/KRAS/c-MYC的肝脏细胞迅速增殖，不存在接触抑制，细胞成团聚集生长，细胞形态呈规则梭形、棱形。实施例1～4中分别使用了编号#1、#2、#3和#4的肝细胞，而这些肝细胞来源于不同个体，分别对多个不同个体来源的肝细胞进行肝癌诱导，均能诱导肝脏细胞发生癌变，说明本发明所提供的诱导方法具有普适性。此外，在将TP53和c-MYC，与CTNNB1基因和/或ERBB4基因导入肝脏细胞之后，也能够诱导肝癌细胞形成，出于篇幅和简明的考虑，此处不再赘述。
实施例5
本实施例中使用6种基因TP53/KRAS/c-MYC/NRAS/BRAF/hyper IL6诱导人源化肝癌小鼠模型。
(1)NSIF小鼠饲养：NSIF小鼠饲养于SPF级别环境中，饮水添加7.5mg/L尼替西农(Nitisinone，NTBC)。
(2)人原代肝细胞培养，其培养方法同实施例1中步骤(1)；
(3)六因子慢病毒包装：
接种状态良好的293T细胞于10cm皿中，待293T细胞生长到70％-80％汇合度时，用含1％FBS、1％双抗的DMEM培养基饥饿培养2小时；
将PEI(72μg/皿)加入opti-MEM中，混匀，室温静置5分钟；将如下表2质粒各9μg/皿分别与psPAX2(12μg/皿)和pMD2.G(3μg/皿)加入opti-MEM中，混匀；
表2
编号 质粒 编号 质粒
1 pWPXLd-NRAS-2A-GFP 4 pWPXLd-NRAS-2A-GFP
2 pWPXLd-KRAS-2A-GFP 5 pWPXLd-BRAF-2A-GFP
3 pWPXLd-TP53-2A-GFP 6 pWPXLd-hyper IL6-2A-GFP
按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入各质粒培养基中，轻轻摇晃混匀后室温静置20min；逐滴加入饥饿后的293T细胞培养皿中，轻轻摇晃混匀，37℃培养箱中培养，8小时后换液继续培养，24、48、72小时后分别收集上清，每次收集后加入预热的含1％FBS、1％双抗的DMEM新鲜培养基，混合获得了TP53/KRAS/c-MYC/NRAS/BRAF/hyperIL6病毒混合液。
(3)六因子感染人肝细胞：
肝细胞体外培养2天后，利用(2)中6种慢病毒混合液共同转染肝细胞。
(4)人肝细胞移植NSIF小鼠：
移植人肝细胞前一周，小鼠断药NTBC；移植时，腹腔注射400μL阿佛丁麻醉小鼠，脾脏注射GFP阳性的人肝细胞(5×105/只)，注射后用伤口夹缝合小鼠，术后三天给小鼠NTBC水，每日密切观察，待小鼠体重稳定后撤走NTBC水，如此往复，直至撤走NTBC水后小鼠体重稳定后则可完全不用给药。
(5)活体成像监测人肝细胞在小鼠肝脏中的嵌合：
活体成像前10min，按照150mg/kg向小鼠腹腔注射荧光素酶底物，异氟烷麻醉小鼠，置于IVIS Spectrum操作台中进行活体检测。如图6所示，荧光素酶标记的人肝细胞特异地迁移到小鼠肝脏部。当小鼠出现体征较弱、弓背、腹水等发病特征，断颈法处死小鼠，解剖取其肝脏和脾脏组织进行下一步鉴定。
(6)荧光显微观察
如图7所示，左侧a和c均为正常视野拍摄，右上b为体视荧光显微镜拍摄(非放大)，右下d为放大视野的荧光显微镜拍摄。
荧光显微镜下观察到移植了转染六因子肝脏细胞的#1-1小鼠肝脏组织中有聚集的GFP阳性细胞克隆(见图中b)，而白光观察，GFP阳性细胞聚集的区域都形成了黄白色瘤体(见图中a)；
而仅转染GFP基因的小鼠#5-10并未发病(见图中c)，且小鼠肝脏中GFP阳性细胞为均匀分布的细胞(见图中d，由于均匀分布，所以选择放大的局部视野)。证明转染六因子肝脏细胞的#1-1小鼠肝脏中确实有癌变细胞的生长，并且发病小鼠表现出病理体征。
(7)H&E鉴定：小鼠的部分肝脏和脾脏用石蜡固定后做H&E切片，镜下扫描观察是否有病变组织。
如图8(a)所示，PDX(阳性对照)为移植了人原代肝脏细胞的小鼠肝脏组织切片，NSIF(阴性对照)为移植了转染GFP基因的正常肝脏细胞的小鼠肝脏组织切片，#1-1和#1-8为移植了转染六因子的肝脏细胞的小鼠肝脏组织切片。
如图8(b)所示，转染六因子的肝脏细胞移植的发病小鼠#1-1和只转染GFP的肝脏细胞移植小鼠的肝脏组织相比，细胞排列紊乱且有一团明显异于周围肝脏细胞的组织。
其中，图8(a)和图8(b)中箭头所指处为腺腔(胆管癌的特征)、实线框表示正常肝组织，虚线框表示癌变组织，核深染、细胞排列紊乱为癌细胞
(8)免疫荧光鉴定：
取小鼠部分肝脏或脾脏做冰冻切片，对其孵育特异性的荧光一抗HLA(humanleukocyte antigen，人类白细胞抗原，在人体细胞均表达)、KRT19(Recombinant HumanCytokeratin 19，重组人细胞角蛋白-19)、GPC3和AFP，孵育二抗显色后，共聚焦显微镜下观察细胞表面抗原表达情况。
如图9所示，#1-1为转染六因子的肝脏细胞移植小鼠的肝脏组织切片，HCC组织(HCC tissue)为肝癌病人来源的原代肝癌组织切片，正常组织(normal tissue)为肝癌病人来源的正常肝脏组织切片。
小鼠肿瘤组织表现为HLA+、KRT19+、GPC3+和AFP+，人相关抗原及肝癌相关抗原为阳性，与阳性对照肝癌患者来源的肿瘤组织表现一致，区别于肝癌患者来源的正常肝脏组织。
(8)成瘤性鉴定：
诱导成功小鼠的发病组织(含GFP+克隆)原位移植到NSI小鼠体内，1个月后被移植小鼠陆续发病，如图10所示，#1-1病变组织可在免疫缺陷小鼠体内无限传代。原位移植(二代)成瘤小鼠解剖后在小鼠肝脏上看到黄白色肿瘤块，见图中a和c，荧光下看到强烈的绿色荧光，见图中b和d。即小鼠肝脏组织与原代发病小鼠一致，可观察到黄白色肿瘤组织，且在荧光显微镜下该肿瘤组织为GFP+。
对其肿瘤组织进行免疫组化鉴定，如图11所示，#1-1病变组织(含GFP+细胞克隆)与原位移植(二代)成瘤小鼠肿瘤组织的GFP免疫组化染色结果。肿瘤组织几乎来源于为GFP+细胞，右图(标尺20μm)为左图(标尺50μm)放大视野。肿瘤组织几乎全部来源于转化成功的GFP+的肝癌细胞。
实施例6
本实施例中使用4种基因TP53/KRAS/c-MYC/NRAS诱导人源化肝癌小鼠模型。
(1)人原代肝细胞培养，其培养方法同实施例1中步骤(1)；
(2)四因子慢病毒包装
接种状态良好的293T细胞接种于10cm皿中，待293T细胞生长到70％-80％汇合度时，用含1％FBS、1％双抗的DMEM培养基饥饿培养2小时；将PEI(72μg/皿)加入opti-MEM中，混匀，室温静置5分钟；将质粒pWPXLd-NRAS-2A-GFP、pWPXLd-KRAS-2A-GFP、pWPXLd-TP53-2A-GFP、pWPXLd-MYC-2A-GfFP(各9μg/皿)分别与psPAX2(12μg/皿)和pMD2.G(3μg/皿)加入opti-MEM中，混匀；
按1:1的比例加入提前预混号的opti-MEM PEI培养基，轻轻摇晃混匀后室温静置20min；逐滴加入饥饿后的293T细胞培养皿中，轻轻摇晃混匀，37℃培养箱中培养8小时后换液继续培养，24、48、72小时后分别收集上清，每次收集后加入预热的含1％FBS、1％双抗的DMEM新鲜培养基，混合获得了TP53/KRAS/c-MYC/NRAS病毒混合液。
(3)四因子感染人肝细胞：肝细胞体外培养2天后，利用(2)中4种慢病毒共同转染肝细胞。
(4)人肝细胞移植NSIF小鼠，其操作与实施例5中所述步骤(4)相同。
(5)检测小鼠血清中人AFP和ALB的水平：
定期(每两周一次)对小鼠进行眼眶采血，检测血清中人AFP和ALB的水平。如图12(a)所示，移植肝细胞后182天，小鼠血清中检测到hALB(白蛋白，albumin，是反映慢性肝损伤的指标之一)，而未移植人肝细胞的NSIF小鼠中未能检测到hALB；
如图12(b)所示，部分小鼠(#2-2、#2-4、#2-5)检测hAFP(甲胎蛋白，alphafetoprotein，肝癌阳性检测指标，临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物)，小鼠血清中检测到hAFP，而未移植人肝细胞的NSIF小鼠中未能检测到hAFP。
(6)H&E鉴定：
小鼠的部分肝脏和脾脏用石蜡固定后做H&E切片，镜下扫描观察是否有病变组织。如图13所示，转染四因子的肝脏细胞移植的发病小鼠#2-4和只转染GFP的肝脏细胞移植小鼠的肝脏组织相比，细胞排列紊乱且有一团明显异于周围肝脏细胞的组织。
(7)免疫组化检测人肝细胞在小鼠肝脏中的嵌合
对小鼠肝脏组织切片做免疫组化染人细胞标记物HLA、肝脏代谢产物hALB和肝癌标记物GPC-3、AFP。
如图14所示，从四因子转基因肝脏细胞移植的#2-4肝脏切片和只转染GFP的肝脏细胞移植小鼠的肝脏切片及病人来源的肿瘤组织(HCC tissue)切片相比，该病变组织为HLA、hALB、GPC-3、AFP均为阳性，HLA和hALB与正常肝细胞移植小鼠肝脏组织表达一致，GPC-3、AFP与病人来源的肿瘤组织表达一致，证明该病变组织来源于成功转染诱导因子的人源肝脏细胞且该组织系具有肝癌组织特性。
(8)小鼠基因组的PCR鉴定：
小鼠肝脏组织提取基因组，在过表达相应基因的pWPXLd慢病毒质粒的目的基因片段上设计正向引物，GFP片段上设计反向引物，PCR反应扩增产物跑电泳胶鉴定片段长度，同时与原质粒图谱匹配测序。如图15所示，四因子均整合到小鼠基因组中。其中，泳道1为实验组#2-4、泳道2为阳性对照即含有各基因的质粒，泳道3为阴性对照，即未转染质粒病人的样本。
实施例7
本实施例中对实施例6中制备得到的体内癌变的四因子转基因肝脏细胞进行体外培养。
发病小鼠肿瘤细胞体外培养：荧光显微镜下挑取发病小鼠脾脏或肝脏中GFP+的肿瘤组织，研磨后置于10％FBS，1％双抗的DMEM培养基中培养数日，待镜下可观察到GFP+的细胞克隆，对其进行传代。传至5代后取1×106个细胞原位移植到NSIF小鼠体内，密切观察小鼠生长情况。
如图16所示，对#3-8体外培养0代的肿瘤细胞转染肝细胞相关标志物的荧光抗体ALB，HepPar-1，肝癌相关标志物的荧光抗体GPC3，AFP，胆管癌相关标志物的荧光抗体KRT19及其他癌症相关标志物的荧光抗体CD166，EpCAM，OPN，SALL4，共聚焦显微镜下观察这些标志物均为阳性，其中KRT19为部分阳性。
如图17所示，#3-8体外培养1代的肿瘤细胞原位移植到小鼠肝脏中，移植后小鼠100％发病。解剖发病小鼠，肉眼观察(如图中a所示)到肝脏上有黄白色病变组织，荧光显微镜(如图中b所示)下观察该组织为GFP阳性。
实施例8
本实施例中利用四因子TP53/KRAS/c-MYC/NRAS诱导肝脏细胞向胆管癌细胞恶性转变，并构建肝内胆管癌人源化小鼠模型。
H&E染色鉴定：如图18所示，图中由图为左图的局部放大图，对四因子转染的肝脏细胞移植小鼠中#2-5的肝脏组织和胆管组织进行固定和石蜡切片，H&E染色后在镜下可观察到肝内胆管癌的标志结构(即图中箭头所指处的腺腔结构)，与肝内胆管癌患者来源的肿瘤组织对比，组织结构一致，证明该人源化肝内胆管癌小鼠模型构建成功。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括TP53突变基因和c-MYC基因。
2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于，所述基因组合还包括NRAS突变基因、KRAS突变基因、Hyper-IL6基因、BRAF基因、CTNNB1基因或ERBB4基因中的任意一种或至少两种的组合，优选为NRAS突变基因和/或KRAS突变基因；
优选地，所述肝细胞包括人原代肝细胞。
3.一种基因转染载体，其特征在于，所述基因转染载体含有权利要求1或2所述的基因组合；
优选地，所述基因转染载体为基因过表达载体，包括慢病毒载体、Piggybac载体或TetOn诱导性载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
4.一种人肝癌细胞，其特征在于，所述人肝癌细胞为基因组中整合有权利要求1或2所述的基因组合的人原代肝细胞；
优选地，所述人肝癌细胞中包括权利要求3所述的基因转染载体。
5.一种人肝癌细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用携带权利要求1或2所述的基因组合的慢病毒载体和包装质粒共转染包装细胞，得到慢病毒溶液；
以人原代肝细胞为母细胞，将所述慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，在所述人原代肝脏细胞过表达所述基因组合，诱导肝癌形成得到所述人肝癌细胞。
6.根据权利要求5所述的人肝癌细胞的构建方法，其特征在于，所述包装细胞包括293T细胞或PlatE细胞；
优选地，所述慢病毒载体与包装质粒的质量比为(2～4):5，优选为3:5；
优选地，所述包装质粒包括psPAX2和pMD2.G；
优选地，所述psPAX2和pMD2.G的质量比为(3～5):1，优选为4:1；
优选地，所述混合培养的时间为36～60h，优选为48h；
优选地，所述人原代肝细胞与慢病毒溶液混合前经过预处理，所述预处理的操作为：将所述人原代肝细胞置于肝细胞培养基中，培养24～48小时；
优选地，所述人原代肝细胞的培养条件为在36～37℃、4.5～5.5％CO2下培养。
7.一种原发性肝癌人源化动物模型，其特征在于，所述人肝癌模型为移植有权利要求3所述的基因转染载体感染的人原代肝细胞的生物体；
优选地，所述生物体为肝脏自发或可诱导损伤的免疫缺陷动物，包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一种免疫缺陷小鼠，优选为NSIF小鼠。
8.一种构建原发性肝癌人源化动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：
以人原代肝细胞为母细胞，并用携带权利要求1或2所述的基因组合的慢病毒载体和包装质粒共转染包装细胞，得到慢病毒溶液；
再将所述慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，再经体外培养确认基因组合转入后、肝癌细胞形成前移植到实验动物体内，饲养后得到所述原发性肝癌人源化动物模型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实验动物包括肝脏自发或可诱导损伤的免疫缺陷实验动物；
优选地，所述实验动物包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一种的免疫缺陷小鼠；
优选地，所述免疫缺陷小鼠为Fah-/-缺陷的免疫缺陷小鼠，优选为NOD-SCID IL2rg-/-Fah-/-小鼠；
优选地，所述移植的方法包括脾脏注射或肝原位注射；
优选地，所述饲养的时间为60～180天，优选为120～180天；
优选地，得到所述原发性肝癌人源化模型后还包括病理鉴定的操作；
优选地，所述病理鉴定包括：肿瘤形成后，解剖剥取小鼠的肝脏或脾脏组织，检测组织病理特征和肿瘤所属类型。
10.如权利要求1或2所述的基因组合、权利要求3所述的基因转染载体、权利要求4所述的人肝癌细胞或权利要求7所述的原发性肝癌人源化动物模型在研究肝癌发病机制、筛选肝癌药物或评估肝癌治疗手段中的应用。
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