CN102918146A - 用于产生肿瘤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种用于通过进行基因转移到源自正常细胞的细胞中来产生肿瘤细胞的方法。本发明提供了一种用于通过将癌相关基因转移到永生化小气道上皮细胞中来产生肿瘤细胞的方法。

Description

用于产生肿瘤细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种用于通过基于小气道上皮细胞的基因转移来产生肿瘤细胞的方法、通过这种方法产生的肿瘤细胞以及一种用于使用这类肿瘤细胞筛选抗肿瘤药物的方法。

背景技术

每年有超过一百万的人死于肺癌。实际上，肺癌可以被视为男性和女性中均最常见的癌症类型。非小细胞肺癌占伴有相关联的腺癌的所有肺癌类型的80%。在大多数情况下，诊断发生在该疾病的晚期，而尽管在早期检测和治疗的方法上已经取得了进步，但是难于取得良好的预后（非专利文献1和2）。虽然非小细胞肺癌的状态和进展的分子分析有望使治疗和预防的方法得到改进，但是现在还没有建立有效的治疗和预防方法。对于寻找用于初始检测和治疗性干预的最适合的靶标来说，鉴定与细胞的致瘤性转化相关联的最少和最重要的变化是必不可少的。为了鉴定这些变化，正在开发通过正常人类细胞的基因操作而获得的体外癌症模型系统。由于现有的从肿瘤组织建立的细胞系含有未知的遗传畸变，它们不适合用于通过遗传变化研究致瘤性转化。然而，一些体外癌症模型系统据报道在直接阐明特定的遗传变化对于致瘤性转化的影响中是有用的（参见非专利文献3和4）。

许多研究小组正在进行关于人肺上皮细胞的永生化和致癌性转化的研究（非专利文献5至7）。在这些研究中，通过使用逆转录病毒进行基因操作来测试在大多数人类非小细胞肺癌中观察到的三种类型的遗传变化，即：端粒酶逆转录酶基因引入和pRB和p53途径的失活。在实质上所有肺癌中观察到端粒酶的高表达（非专利文献8），在大约50%的非小细胞肺癌中观察到p53功能缺失，并且在大约70%的非小细胞肺癌中观察到由于启动子区甲基化或纯合性缺失引起的表达p16蛋白的无能（非专利文献9）。

然而，尽管在这类研究中取得了进展，迄今为止的文献实质上缺乏关于成功的人工产生肺癌细胞的报告，这些人工产生的肺癌细胞与从实际肺癌患者分离的肺癌组织在病理上非常相似。

目前，源自癌症患者的癌细胞系被用于癌细胞研究中和抗癌药物的开发中。然而，由于实质上源自患者的大多数癌细胞系具有未详细说明的遗传损害，在细胞系之间在遗传畸变的状态方面存在一些变异性。因此，当这些细胞被用于研究关于特定分子或信号途径时，所获得的实验结果不能应用于不同的细胞系。而且，由于这些细胞具有未详细说明的遗传损害，它们不适合在实验中用来评估个体基因对致癌性转化的贡献。

非专利文献1：Meuwissen,R.等人,基因研发（Genes Dev.）19,643-664(2005)

非专利文献2：Herbst,R.S.等人,“肺癌”（“Lung cancer”）,新英格兰医学杂志（N.Engl.J.Med.）359,1367-1380(2008)

非专利文献3：Akagi,T.,分子医学进展（Trends Mol.Med.）10,542-548(2004)

非专利文献4：Zhao,J.J.等人,分子医学进展（Trends Mol.Med.）10,344-350(2004)

非专利文献5：Lundberg,A.S.等人,致癌基因（Oncogen）21,4577-4586(2002)

非专利文献6：Ramirez,R.D.等人,癌症研究（Cancer Res.）64,9027-9034(2004)

非专利文献7：Sato,M.等人,癌症研究（Cancer Res.）66,2116-2128(2006)

非专利文献8：Sekido,Y.等人,医学年评（Annu.Rev.Med.）54,73-87(2003)

非专利文献2：Herbst,R.S.等人,“肺癌”（“Lung cancer”）,新英格兰医学杂志（N.Engl.J.Med.）359,1367-1380(2008)

发明的披露

鉴于上述，对于具有确定的遗传状态的癌症模型细胞的研发期待已久。

诸位发明人通过基因操作已成功实现小气道上皮细胞的完全致瘤性转化。由于因此获得的致瘤性转化的细胞已通过正常细胞的基因操作而发生转化，已经鉴定了该遗传状态。诸位发明人在密切观察这些细胞时发现：这些细胞表现出分化的或未分化的人类肺癌细胞的组织学特征，取决于已经引入的遗传成分的组合。另外，诸位发明人已经成功地产生具有未分化和分化的人类肺癌的癌干细胞的性质的细胞。

因此，本发明涉及以下各项。

[1]一种用于通过将一种或多种癌相关基因转移至一种永生化小气道上皮细胞内来产生一种肿瘤细胞的方法，其中

该永生化小气道上皮细胞是通过使一种正常小气道上皮细胞经受以下处理(1)至(3)而产生：

(1)强制表达一种端粒逆转录酶基因；

(2)强制表达一种细胞周期蛋白依赖性激酶4基因；以及

(3)诱导p53功能缺失，并且其中

该一种或多种癌相关基因是选自以下基因中的一种或多种基因：c-Myc基因、v-Src基因、KRAS突变基因、BCL2基因、PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白D1基因、LKB1突变基因、TP63基因以及EGFR突变基因。

[2]根据[1]所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因与v-Src基因的组合。

[3]根据[1]所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因、KRAS突变基因以及BCL2基因的组合。

[4]根据[2]或[3]所述的方法，其中该肿瘤细胞是未分化癌细胞。

[5]根据[4]所述的方法，其中该肿瘤细胞是癌干细胞。

[6]根据[1]所述的方法，其中这些癌相关基因是c-Myc基因和v-Src基因，其中该c-Myc基因在该永生化小气道上皮细胞中被诱导表达。

[7]根据[6]所述的方法，其中该肿瘤细胞是低分化肺癌细胞。

[8]根据[1]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与选自PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白D1基因以及LKB1突变基因中的一种基因的组合。

[9]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与细胞周期蛋白D1基因的组合。

[10]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因、细胞周期蛋白D1基因以及TP63基因的组合。

[11]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与PIK3CA突变基因的组合。

[12]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与LKB1突变基因的组合。

[13]根据[1]所述的方法，其中该癌相关基因是EGFR突变基因与细胞周期蛋白D1基因的组合。

[14]根据[8]至[13]所述的方法，其中该肿瘤细胞是分化的肺癌细胞。

[15]根据[9]所述的方法，其中该肿瘤细胞是分化的肺癌的一种癌干细胞。

[16]根据[8]至[15]所述的方法，其中该永生化小气道上皮细胞是一种哺乳动物或灵长类动物细胞。

[17]根据[8]至[15]所述的方法，其中该永生化小气道上皮细胞是一种人类细胞。

[18]一种通过根据[1]至[17]的任一项所述的方法产生的肿瘤细胞。

[19]一种被植入有根据[15]所述的肿瘤细胞的携带肿瘤的动物模型。

[20]一种用于筛选一种抗癌药物的方法，该方法包括：

(a)使衍生自[18]所述的肿瘤细胞的一种样品与一种候选物接触；以及

(b)检测肿瘤细胞生长抑制效应。

由于通过本发明的方法产生的这些肿瘤细胞是通过正常细胞的基因操作而被致瘤性转化的细胞，已经鉴定了它们的遗传状态。因此，本发明提供了对于评估个体基因在肺癌的发展中的贡献高度有用的一种模型系统。在通过本发明的方法产生的这些肿瘤细胞中，通过只转移癌相关基因而产生的那些细胞是精确表达癌细胞的特性的细胞，并且因此被预期在如抗癌药物的开发的这类应用中是高度有效的。

附图简要说明

图1A是展示通过将c-Myc和v-Src基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞（在下文称为“4T53MS细胞”）的致瘤性的一个简图，图1B是显示4T53MS细胞的肿瘤生长潜力的一个曲线图，并且图1C显示了4T53MS细胞衍生的肿瘤组织用苏木精-伊红（H&E）染色的结果和该肿瘤组织的免疫染色的结果的图像。

图2A是显示根据在体内4T53MS细胞的致瘤性研究中植入的细胞的数量获得的结果的一个表格，并且图2B是显示在将十个4T53MS细胞植入一个NOD-SCID小鼠体内七周之后的肿瘤形成的一个简图。

图3A是显示在体外实验系统中，通过多西环素（DOX）处理在细胞（下文指示为“4T53mS细胞”，其中‘m’是小写字母）中诱导c-Myc表达的一个简图，这些细胞是通过将诱导型c-Myc基因和v-Src基因转移至HSAE/4T53细胞内而产生的，图3B是描绘一种产生低分化肺癌模型的方法的一个示意图。将4T53mS细胞植入裸小鼠体内并且这些小鼠被继续给予多西环素（DOX）。一旦观察到肿瘤形成，就停止多西环素给药。图3C是显示4T53mS细胞衍生的肿瘤组织的免疫染色（细胞角蛋白染色）的结果一个简图。

图4是显示通过将各种癌相关基因（M：c-Myc；R：KRAS^V12；B：BCL2；P：PIK3CA^H1047R；D：细胞周期蛋白D1；L：LKB1^D194A；E：EGFR^T790ML858R）中的一种或多种转移到HSAE/4T53细胞中而建立的细胞系的致瘤性的一个表格。

图5呈现了显示了在以下情况时所获得的结果的简图：将所指示的基因（M：c-Myc；R：KRAS^V12；B：BCL2）转移至HSAE/4T53细胞中来产生4T53RM细胞（用KRAS^V12和c-Myc转导）和4T53RMB细胞（用KRAS^V12、c-Myc和BCL2转导），将这些因此产生的细胞移植至裸小鼠体内，然后经受H&E染色（顶排）、抗细胞角蛋白染色（AE1/AE3：中排）以及抗波形蛋白染色（底排）。

图6呈现出显示了从衍生自4T53RP细胞（左栏）、4T53RD细胞（中间栏）以及4T53RL细胞（右栏）的异种移植物的切片的H&E染色（顶排）、抗细胞角蛋白染色（AE1/AE3：中排）以及抗波形蛋白染色（底排）获得的结果的简图。“4T53RP细胞”是通过将KRAS^V12基因和PIK3CA突变基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞。“4T53RD细胞”是通过将KRAS^V12和细胞周期蛋白D1基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞。“4T53RL细胞”是通过将KRAS^V12基因和LKB1突变基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞。

图7是显示能够根据转移至4T53细胞中的基因的组合而产生的各种类型的肺癌模型的示意图。

图8A显示了通过皮下植入来自单个4T53RD细胞的细胞克隆所获得的异种移植物的切片的抗p63染色（左图）、抗TTF1染色（中图）以及阿新蓝染色（右图）的结果，并且图8B是小鼠中气道上皮的一个示意图。

图9是显示根据植入的细胞的数量，来自单个4T53RD细胞的细胞克隆的体内致瘤性研究的结果的一个表格。

图10A和图10B分别显示了衍生自4T53RD细胞和4T53RDΔNp63细胞的异种移植物的切片的H&E染色的结果。

图11A、图11B以及图11C分别显示了衍生自4T53ED细胞的异种移植物的切片的H&E染色、阿新蓝染色以及抗细胞角蛋白染色（AE1/AE3）的结果。

实施本发明的最佳模式

下文详细描述了本发明。给出以下实施方案来展示本发明，并且以下实施方案不应当被解释为限制本发明。在不脱离本发明要旨的情况下可以按各种形式来实践本发明。

本说明书中所引用的所有参考文献和日本专利申请特许公开、日本专利公布以及其他专利文献的全部内容是通过引用结合在此。于2010年5月31日提交并且充当本申请的优先权要求的基础的日本专利申请号2010-125256的说明书和图表的全部内容也通过引用结合在此。

1.用于产生肿瘤细胞的方法

本发明提供了一种用于通过将癌相关基因转移至一种永生化小气道上皮细胞中来产生肿瘤细胞的方法。

优选地，本发明的方法的特征在于：该永生化小气道上皮细胞是通过使一种正常小气道上皮细胞经受以下处理(1)至(3)而产生：

(1)强制表达一种端粒逆转录酶基因；

(2)强制表达一种细胞周期蛋白依赖性激酶4基因；以及

(3)诱导p53功能缺失，

其中该癌相关基因是选自以下基因的一种或多种基因：一种c-Myc基因、一种v-Src基因、一种KRAS突变基因、一种BCL2基因、一种PIK3CA突变基因、一种细胞周期蛋白D1基因、一种LKB1突变基因、一种TP63基因以及一种EGFR突变基因。

癌相关基因

在本发明的方法中使用的“癌相关基因”是指一种基因，当在一个正常细胞中表达时，该基因具有致瘤地或致癌地转化该细胞的能力；或是指与控制基因的表达相关的一种基因，当在一个正常细胞中表达时，该基因具有致瘤地或致癌地转化该细胞的能力。癌相关基因的实例包括骨髓细胞瘤病癌基因（c-Myc）、v-Src基因、RAS基因、B细胞白血病/淋巴瘤2（BCL2）基因、磷脂酰肌醇3激酶催化亚单位（PIK3CA）基因、细胞周期蛋白D1基因、肝激酶B1（LKB1）基因、c-Abl基因、c-Sis基因、表皮生长因子受体（EGFR）基因、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）基因、血管内皮生长因子受体（VEGFR）基因、HER2/neu基因、Raf激酶基因、细胞周期蛋白依赖性激酶基因、肿瘤蛋白p63（TP63）基因以及它们的突变基因。

在本发明中，可以优选使用c-Myc基因、v-Src基因、RAS基因、BCL2基因、PIK3CA基因、细胞周期蛋白D1基因、LKB1基因、EGFR基因、TP63基因以及它们的突变基因和剪接同种型。

在本发明中，不是特别关注所使用的癌相关基因的类型，虽然优选的是一种哺乳动物癌相关基因，更优选的是一种灵长类动物癌相关基因并且甚至更加优选的是一种人类癌相关基因。

“c-Myc基因”是编码与调节各种基因的表达和DNA复制相关联的一种DNA结合因子（例如，一种转录因子）的一种基因。已经表明在受损的c-Myc基因表达与各种癌症之间存在着某种关联性（Dominguez-Sola,D.等人,自然（Nature）448,445-451(2007)）。

“v-Src基因”是来自作为一种类型的逆转录病毒的劳氏肉瘤病毒的一种癌相关基因。Mayer B.J.等人,病毒学杂志（J.Virol.）60(3),858-67(1986)已经对此基因的序列进行了描述。

“RAS基因”是编码传输参与细胞分化和生长的信号的小GTP酶的一种基因。已知的是，细胞因这种信号传输的异常而变得具有癌性（Goodsell,D.S,肿瘤学家（Oncologist）4(3),263-264(1999)）。在20%至30%的非小细胞肺癌中，已经报道了RAS基因突变（Aviel-Ronenv,S等人,临床肺癌（Clin.LungCancer）1,30-38(2006)）。在本发明中，RAS基因优选地是一种KRAS突变基因。在此，KRAS突变基因是由一种野生型KRAS基因突变产生的一种KRAS基因。一个实例是编码其中12位的甘氨酸残基被一个缬氨酸残基置换的突变KRAS^V12（SEQ ID NO:6）的基因。Sato,M.等人,癌症研究（CancerRes.）66(4),2116-2128(2006)中给出了关于编码KRAS^V12的基因的详情。

“BCL2基因”是具有凋亡抑制活性的一种癌相关基因，并且被暗示与黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌以及肺癌相关联（Chao,D.T.,Korsmeyer,S.J.,免疫学年鉴（Annu.Rev.Immunol.）16,395-419(1998)）。

“PIK3CA基因”是编码第I类PI3-激酶催化亚单位的一种基因，并且据报道是与乳腺癌、结肠直肠癌以及肺癌相关联的（自然-癌症评论（NatureReviews Cancer）5,921-929(2005)；科学-转化医学（Sci.Transl.Med.）2,26-25(2010)）。另外，已经提出PIK3CA基因在子宫子宫颈癌（uterocervicalcancer）的发展中作为一种癌相关基因起作用（Ma,Y.Y.,等人，癌基因（Oncogene）19(23),2739-2744(2000)）。在本发明中，PIK3CA基因优选地是一种PIK3CA突变基因。PIK3CA突变基因是已经相对于它的野生型基因发生突变的一种PIK3CA基因，说明性的实例是编码其中1047位的组氨酸残基被精氨酸置换的一种PIK3CAH1047R突变蛋白（SEQ ID NO:10）的一种基因。

“细胞周期蛋白D1基因”是编码细胞周期调节因子的一种基因。细胞周期蛋白D1基因的过度表达在甲状旁腺腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤以及肺癌的发展中起作用（Morgan,D.O.，细胞（Cell）135,764-794(2008)；肺癌（Lung Cancer）55,1-14(2007)）。

“LKB1基因”是编码肝激酶B1的一种基因，并且该基因的过度表达涉及肺癌、子宫子宫颈癌、乳腺癌、睾丸癌、胰腺癌以及皮肤癌的发展（Katajisto,P.等人,生物化学与生物物理学学报（Biochem.Biophys.Acta）1775(1),63-75(2007)）中。在本发明中，LKB1基因优选地是一种LKB1突变基因。LKB1突变基因是具有相对于它的野生型基因的突变的一种LKB1基因。例如，可以优选使用编码LKB1的一种显性阴性型突变体（LKB1-DN）的一种基因。显性阴性型LKB1突变体的一个实例是其中194位的天冬氨酸被丙氨酸置换的LKB1^D194A（SEQ ID NO:16）。

“EGFR基因”是编码一种上皮生长因子受体的一种基因。在包括乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌以及脑瘤的许多类型的癌症中已经观察到EGFR基因的表达的提高。已知的是，在肺腺癌中发现高发生率的EGFR基因突变（Sharma,S.V.等人,自然-癌症评论（Nat.Rev.Cancer）7(3),169-81(2007)）。在本发明中，EGFR基因优选地是一种EGFR突变基因。EGFR突变基因是已经相对于它的野生型基因发生突变的一种EGFR基因，一个说明性的实例是编码其中790位的苏氨酸残基被一个甲硫氨酸残基置换并且858位的亮氨酸残基被一个精氨酸残基置换的EGFR^T790M L858R突变蛋白（SEQ ID NO:18）的基因。

“TP63基因”是TP53抑癌基因的一种同系物，该基因抑制癌症的情况和该基因促进癌症的情况都是已知的。已经报道在头部和颈部以及包括肺和食管的各种器官的鳞状细胞癌中TP63基因的表达的提高（Deyoung,M.P.等人,癌基因（Oncogene）26,5169-5183(2007)）。本发明中的TP63基因优选地是编码TP63的剪接同种型的一种基因。编码TP63的剪接同种型的基因的实例是编码缺少一个N末端反式激活结构域的TP63剪接同种型的TP63^ΔN基因（SEQ ID NO:20）。

在NCBI数据库中根据下文所指示的登录号可获得人类c-Myc、BCL2以及细胞周期蛋白D1基因的对应的核苷酸序列。可以通过参考在NCBI数据库中根据下文所指示的登录号可获得的野生型基因序列连同McCoy,M.S.等人,分子细胞生物学（Mol.Cell.Biol.）4,1577-1582(1984)、Samuels,Y.,等人,科学（Science）304,554(2004)以及Scott,K.D.等人，癌症研究（CancerRes.）67,5622-5627(2007)来获得KRAS^V12、PIK3CA^H1047R以及LKB1^D194A基因的对应的核苷酸序列的详情。

表1

永生化小气道上皮细胞

在本发明中，“永生化小气道上皮细胞”不受任何特别的限制，条件是它们是衍生自小气道上皮细胞的永生化细胞。然而，优选的是来自哺乳动物小气道上皮细胞的永生化细胞，更优选的是来自灵长类动物小气道上皮细胞的永生化细胞，并且甚至更加优选的是来自人类小气道上皮细胞的永生化细胞。在这些来自小气道上皮细胞的永生化细胞中，还更加优选的是来自正常小气道上皮细胞的永生化细胞。在此，“正常”是指一种健康状态；即，无任何可检测到的疾病或异常的状态。

永生化人类小气道上皮细胞

在本发明中，“永生化人类小气道上皮细胞”不受任何特别的限制，条件是它们是来自人类小气道上皮细胞的永生化细胞。然而，优选的是来自正常人类小气道上皮细胞的永生化细胞。“正常人类小气道上皮细胞”是指来自一个健康人的人类小气道上皮细胞，如处于无任何可检测到的疾病或异常的状态的人的小气道上皮细胞。

通过使正常小气道上皮细胞或正常人类小气道上皮细胞经受以下处理(1)至(3)中的任一项或它们的组合，能够产生上文所描述的永生化小气道上皮细胞或永生化人类小气道上皮细胞，虽然优选的是实施全部处理(1)至(3)。对实施处理(1)至(3)的顺序不是特别关注：

(1)强制表达一种端粒酶基因；

(2)强制表达一种细胞周期蛋白依赖性激酶基因；

(3)诱导一种凋亡诱导蛋白的功能缺失。

关于处理(1)，端粒酶是在真核染色体的末端延伸特定的重复序列的一种酶。端粒酶是由以下亚单位组成：如端粒逆转录酶、端粒RNA组分（TERC）、角化不良蛋白以及端粒酶相关蛋白1（TEP1），它们各自在不同的基因座被编码。在处理(1)中被强制表达的端粒酶基因的例证是编码端粒逆转录酶、TERC、角化不良蛋白以及TEP1的各种基因。然而，在本发明中，可以特别优选使用端粒酶逆转录酶基因（下文称为“TERT基因”）。

关于(2)，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）参与细胞周期的周转。这族激酶由CDK1至13组成。在处理(2)中被强制表达的细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）基因可以是编码CDK1至13中任一个的基因，虽然可以优选使用编码CDK4的基因（Cdk4基因）。CDK4是细胞周期蛋白D1的结合伴侣，并且已在各种类型的肿瘤中检测到Cdk4基因的突变（Zuo,L.等人,自然-遗传学（Nature Genet.）12,97-99(1996)）。

关于(3)，凋亡诱导蛋白的实例包括：p53、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8至半胱天冬酶-10以及半胱天冬酶-12。在处理(3)中被诱导功能缺失的蛋白可以是来自p53、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8至半胱天冬酶-10以及半胱天冬酶-12之中的任一种蛋白质，虽然在本发明中优选的是p53。用于诱导p53功能缺失的方法的实例包括：添加一种p53蛋白中和抗体、将编码这种抗体的一种基因转移至细胞中、经RNA干扰敲低来敲除作为编码p53的基因的TP53基因、以及强制表达一种显性阴性型TP53基因。

关于经RNA干扰敲低TP53基因的已经公布的研究的实例是Sato,M.等人,癌症研究（Cancer Res.）66,2116-2128(2006)。Sato,M.等人已经通过实施经RNA干扰来敲低TP53基因而使人类气道上皮细胞永生化。

在上述处理(1)至(3)中，不是特别关注这些强制表达的基因的种类和被诱导功能缺失的蛋白质的种类，虽然优选的是哺乳动物基因或蛋白质，更优选的是灵长类动物的基因或蛋白质，并且甚至更优选的是人类基因或蛋白质。

在本发明中，尤其优选使用的永生化小气道上皮细胞是通过在正常小气道上皮细胞（下文称为“SAE细胞”）中强制表达TERT基因和Cdk4基因并且诱导p53功能缺失而获得永生性的细胞。甚至更加优选的实例是通过将TERT基因、Cdl4基因以及显性阴性型TP53基因转移至一种SAE细胞，并且强制表达这些基因而获得永生性的细胞。

可以更优选使用的永生化人类小气道上皮细胞是通过在正常人类小气道上皮细胞（下文称为“HSAE细胞”）中强制表达hTERT基因和Cdk4基因，并且通过诱导p53功能缺失而获得永生性的细胞。甚至更加优选的实例是通过将hTERT基因、Cdk4基因以及显性阴性型TP53基因转移至HSAE细胞，并且强制表达这些基因而获得永生性的细胞（下文称为“HSAE/4T53细胞”）。在NCBI数据库中根据以下登录号可获得hTERT基因、Cdk4基因以及TP53基因的核苷酸序列。关于显性阴性型TP53基因的核苷酸序列，可以参考Shaulian,E.等人，分子细胞生物学（Mol.Cell.Biol.）12,5581(1992)。

表2

所使用的SAE细胞可以是从一种哺乳动物收集的细胞。可替代地，可以使用可商购的细胞（来自瑞士伯尔尼的CELLnTEC）。

所使用的HSAE细胞可以是从人类收集的细胞。可替代地，可以使用可商购的细胞（来自美国马里兰州沃克斯维尔的Lonza）。

将基因转移至正常小气道上皮细胞或正常人类小气道上皮细胞的方法与下文所描述的将基因转移至永生化人类小气道上皮细胞的方法相似。

基因转移方法

在本发明中，当将一种癌相关基因转移至一种永生化人类小气道上皮细胞中时，典型地是将该癌相关基因作为一个适合的表达盒插入到表达载体中，并且用该载体转化该永生化人类小气道上皮细胞。适合的表达盒包括至少以下(i)至(iii)作为组成要素：

(i)可以在一个永生化人类小气道上皮细胞中转录的一个启动子；

(ii)与该启动子结合的一个癌相关基因；以及

(iii)编码一个RNA分子转录终止和多聚腺苷酸化信号的一个序列。

能够在永生化人类小气道上皮细胞中转录的启动子的实例包括但不限于CMV、CAG、LTR、EF-1a以及SV40启动子。

除了上述的表达盒以外，表达载体可以具有一个选择标记表达盒，用于选择转化的永生化人类小气道上皮细胞。选择标记的实例包括但不限于：阳性选择标记，如新霉素抗性基因和潮霉素B磷酸转移酶基因；表达报告基因，如LacZ、GFP（绿色荧光蛋白）以及萤光素酶基因；以及阴性选择标记，如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）和白喉毒素A片段（DTA）。

已经转化的转化永生化人类小气道上皮细胞能够容易地通过上述标记来选择。例如，在已将一种新霉素抗性基因作为一个标记转移至细胞的情况下，能够通过在添加G418的培养基中培养这些细胞来实施初级选择。可替代地，在打靶载体包括一种荧光蛋白如GFP的基因作为标记的情况下，除了通过抗药性进行选择之外，可以使用一种荧光激活细胞分选器（FACS）来进行荧光蛋白表达细胞的分选。

可以用于将一种癌相关基因转移到永生化人类小气道上皮细胞中的表达载体的例证是包括可商购的的这种类型的表达载体的能够将基因转移至细胞中的已知的表达载体。这类表达载体的实例包括：pEGFP-C1^TM（Clontech）、pCMV-HA^TM（Clontech）、pMSCVpuro^TM（Clontech）、pEF-DEST51^TM（Invitrogen）、pCEP4^TM（Invitrogen）以及ViraPower II LentiviralGateway System^TM（Invitrogen）。可以通过一种已知的基因转移方法将该表达载体转移至永生化人类小气道上皮细胞中，该已知的基因转移方法如电穿孔、显微注射、磷酸钙法、脂质转染或病毒感染。关于基因转移方法的更多细节可以参考Sambrook&Russell，分子克隆：实验室手册（Molecular Cloning:A Laboratory Manual），第3卷（冷泉港，实验室出版社，2001）。

2.肿瘤细胞

在本发明中，“肿瘤细胞”是指在体内自主过度增殖的细胞。肿瘤细胞的实例包括以下各项中所包括的细胞：(1)肉瘤，如骨肉瘤和软组织肉瘤；(2)癌，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、子宫癌、子宫颈癌以及卵巢癌；(3)淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；(4)神经母细胞瘤；(5)黑色素瘤；(6)骨髓瘤；(7)肾母细胞瘤；(8)白血病，如急性髓性白血病（AML）、慢性髓性白血病（CML）、急性淋巴细胞性白血病（ALL）以及慢性淋巴细胞性白血病（CLL）；(9)神经胶质瘤；以及(10)视网膜母细胞瘤。

在分化程度方面，“肿瘤细胞”的例证也可以是分化癌细胞和未分化癌细胞。在本发明的一些实施方案中，优选形式的肿瘤细胞包括未分化癌细胞和分化肺癌细胞。分化肺癌细胞可以进一步被分类为低分化肺癌细胞和分化肺癌细胞。低分化肺癌细胞的实例包括大细胞癌样细胞。分化肺癌细胞的实例包括鳞状癌细胞和腺癌细胞。

可以通过以下来进行细胞的致瘤性转化的证实：将一种癌相关基因转移至永生化人类小气道上皮细胞或永生化人类小气道上皮细胞中，培养这些细胞数天，然后将所培养的细胞皮下注射至适合的模型动物体内并且观察肿瘤块形成。

该模型动物优选地为除了人类以外的一种哺乳动物，并且更优选地为一种免疫抑制的哺乳动物。免疫抑制的哺乳动物的实例包括但不限于：裸大鼠、裸小鼠以及SCID小鼠。

确认细胞致瘤性转化的另一个示例性方法包括：在软琼脂上培养已转移有一种癌相关基因的永生化人类小气道上皮细胞，并且通过这些细胞观察集落形成（软琼脂集落形成测定）。具体地，这是一种永生化人类小气道上皮细胞被制备成一定细胞浓度，接种至一种软琼脂培养基上，并且观察细胞增殖速率的方法。关于软琼脂上集落形成测定的详情可以参考Tanaka,S.等人，美国科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）94,2356-2361(1997)。

肿瘤细胞的类型

在本发明的方法中，可以根据被转移的癌相关基因的组合选择性地产生未分化癌细胞、低分化肺癌细胞或分化肺癌细胞。

未分化癌细胞：

在本发明的方法中，可以通过将在以下(A)或(B)中所示的基因的组合转移至永生化人类小气道上皮细胞来产生未分化癌细胞：

(A)c-Myc基因和v-Src基因；

(B)c-Myc基因、KRAS突变基因以及BCL2基因。

在这个方法中，可以使用一种N-Myc基因或L-Myc基因来代替c-Myc基因，可以使用一种HRAS基因或一种NRAS基因来代替KRAS基因，或可以使用一种BCL-X基因来代替BCL2基因。

关于通过以上基因的组合所产生的未分化癌细胞（这些细胞在下文中称为“本发明的未分化癌细胞”），在免疫组织化学分析中，这些细胞中的大多数对上皮细胞标记细胞角蛋白（抗体克隆名称，AE1/AE3）呈阴性或弱阳性，并且对间质标记（mesenchymal marker）波形蛋白呈阳性（图1C和5）。然而，存在一些呈AE1/AE3阳性并且呈波形蛋白阴性的细胞（图1C）是可以接受的。

本发明的未分化癌细胞的特征在于高致瘤性（图2和4）。

如图在1B中所示，通过上述(A)中的基因的组合所产生的未分化癌细胞具有的致瘤性大约为NCl-H460人类非小细胞肺癌细胞（ATCC HTB-177）的致瘤性的两倍大，并且甚至能够在只有十个细胞被皮下接种到免疫缺陷小鼠中时形成肿瘤组织（图2A）。因此，根据本发明的由(A)中的基因的组合所产生的未分化癌细胞具有一个非常强的肿瘤起始能力，该能力被认为是癌干细胞的一个特征。

由上述(B)中的基因的组合所产生的未分化癌细胞能够以80%的高发生率在裸小鼠中形成肿瘤，并且因此具有一个高肿瘤形成能力（图4）。

低分化肺癌细胞：

在本发明的方法中，能够通过将下文(C)中所示的基因的组合转移至永生化人类小气道上皮细胞并且诱导表达c-Myc基因来产生低分化肺癌细胞：

(C)诱导型c-Myc基因和v-Src基因。

在此，“诱导型c-Myc基因”是指能够在外部刺激下诱导表达的一种c-Myc基因或是指它的一个表达系统。上述提及的“c-Myc基因”涵盖“诱导型c-Myc基因”。同样，“诱导表达”是指通过一种表达诱导系统控制基因表达。应当在将(C)中所指示的基因转移至永生化人类小气道上皮细胞之后开始诱导表达，并且优选地在转移至永生化人类小气道上皮细胞之后和直到确认肿瘤形成的期间内进行诱导表达。

该表达诱导系统不受任何特别的限制，条件是能够人工控制靶基因（c-Myc基因）的表达。说明性实例包括：一种使用地塞米松和一种小鼠乳房肿瘤病毒（MMTV）启动子的表达诱导系统；一种使用四环素、多西环素或类似物和一种四环素反应启动子的表达诱导系统（Tet-on系统）；一种使用如镍、钴、锰或铁的金属离子和一种金属硫蛋白启动子的表达诱导系统；以及一种使用热休克蛋白启动子的表达诱导系统。

可替代地，一旦c-Myc基因被强制诱导并且确认肿瘤形成，可以使用抑制c-Myc基因表达的一种系统（例如，一种Tet-off系统）或降解c-Myc蛋白的一种系统来破坏c-Myc功能（基于茁长素的降解决定子系统（Auxin-based degron system）:Nishimura,K.等人,自然方法（Nature Methods）,第6卷,第12期(2009年12月)）。可能有利的使用是一种Tet-on系统，其中从敏感度的观点来说，优选的是添加多西环素。

同样地，在本发明中，可以使用N-Myc基因或L-Myc基因代替c-Myc基因。

用上述基因的组合所产生的低分化肺癌细胞（这些细胞在下文中称为“本发明的低分化肺癌细胞”）表现出大细胞癌样形态学特征：对上皮细胞标记细胞角蛋白（抗体克隆名称，AE1/AE3）呈阳性（图3C）。

分化肺癌细胞：

在本发明的方法中，能够通过将在下文(D)至(H)中的任一项中所示的基因的组合转移至永生化人类小气道上皮细胞来产生分化肺癌细胞：

(D)KRAS突变基因和PIK3CA突变基因；

(E)KRAS突变基因和细胞周期蛋白D1基因；

(F)KRAS突变基因和LKB1突变基因；

(G)KRAS突变基因、细胞周期蛋白D1基因以及TP63基因；

(H)细胞周期蛋白D1基因和EGFR突变基因。

在本发明中，可以使用一种HRAS基因或一种NRAS基因代替KRAS基因，或可以使用一种细胞周期蛋白D2基因或一种细胞周期蛋白D3基因代替细胞周期蛋白D1基因。

用上述基因组合所产生的分化肺癌细胞（这些细胞在下文中称为“本发明的分化肺癌细胞”）的特征均在于具有非常高的致瘤性（图4）。

在本发明的分化肺癌细胞中，用组合(D)或(H)产生的那些细胞表现出其中混杂有鳞状上皮样细胞和腺癌样细胞的一种形态学，然而，用组合(E)或(F)细胞所产生的那些细胞各自具有腺癌样细胞的形态学。用组合(G)所产生的细胞具有鳞状上皮样细胞的形态学。

在免疫组织化学分析中，用组合(D)、(E)以及(F)中的任一项所产生的分化肺癌细胞对AE1/AE3和p63呈阳性（图6）。用组合(H)所产生的分化肺癌细胞对AE1/AE3呈阳性（图11C）并且对阿新蓝染色呈阳性（图11B）。

本发明的肿瘤细胞都具有高肿瘤发生率和增殖的能力。当这些细胞被植入模型动物并且被诱导形成肿瘤时，因此形成的肿瘤显示出与在动物种类中形成的肿瘤组织非常相似的病理学，在转移癌相关基因之前的小气道上皮细胞属于这些动物种类。例如，当使用一种人类小气道上皮细胞时，因此形成的肿瘤显示出与一种癌组织，尤其是从人类癌症患者分离的肺癌组织非常相似的病理学。因此，本发明的肿瘤细胞在广泛多种肺癌研究中非常有用，如关于肺癌细胞的重新编程、分化以及生物机制的研究，用于肺癌治疗的靶分子的鉴定以及抗癌药物的筛选。

3.荷瘤动物模型

在本发明中，“荷瘤动物模型”是指其中已经植入上述肿瘤细胞并且已经形成肿瘤块的一种非人类动物模型。

该模型动物优选地是除了人类以外的一种哺乳动物，该模型动物的实例包括但不限于：小鼠、大鼠、猪、狗、猴、仓鼠以及兔。在这些模型动物中，尤其优选的是一种免疫抑制的哺乳动物。可以通过向一个普通哺乳动物给予一种免疫抑制剂如环孢霉素来产生免疫抑制的哺乳动物，虽然优选的是由于遗传背景而免疫力先天性受抑制的哺乳动物。先天性免疫抑制的哺乳动物的实例包括但不限于：裸大鼠，裸小鼠以及SCID小鼠。

没有对将上述肿瘤细胞转移至模型动物的方法施加特别的限制。可以根据将要进行植入的模型动物充分选择在所属领域中常规使用的方法。作为在除了小鼠以外的动物中植入的一个例子，可以参考例如，“在猪体内遗传诱导肿瘤形成”（“Genetic induction of tumorigenesis in swine”），癌基因（Oncogen）26,1038-1045(2006年9月11日)。同样地，就植入时所使用的肿瘤细胞在被植入模型动物中时形成肿瘤块而论，该模型动物可以是同一种类或是不同种类。

从易于再提取被植入的肿瘤细胞的观点来说，优选的是通过皮下注射或腹膜内注射来植入。另一方面，从解剖学的观点来说，优选的是原位植入。

4.筛选抗癌药物的方法

本发明提供了一种用于筛选抗癌药物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使衍生自本发明的肿瘤细胞的一种样品与一种候选物质接触；以及

(b)检测肿瘤细胞生长抑制效应。

“衍生自肿瘤细胞的样品”是指肿瘤细胞或肿瘤组织，或是指已经被适当地制备以便在筛选方法步骤中易于使用的一种样品。

“使衍生自本发明的肿瘤细胞的一种样品与一种候选物质接触”表示候选物质趋近到一种程度，以致引起与在肿瘤细胞表面的分子相互作用、与这类分子结合或被吸收到肿瘤细胞中。在肿瘤细胞是培养的细胞的情况下，可以通过将达到至少一个给定浓度的该候选物添加至与这些细胞接触的培养基中来使这些细胞与该候选物质接触。另一方面，在已经将这些肿瘤细胞植入动物的身体内的情况下，可以通过向该动物给予一个给定量的该候选物质来使该肿瘤细胞与该候选物质接触。在这种情况下，给药途径不受特别限制，条件是它是普遍地用于给予该候选物质的途径。适合的给药途径的说明性实例包括：口服、舌下、经鼻、肺部、胃肠以及经皮给药、眼滴注、静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、局部注射以及手术植入。优选的途径是口服给药、腹膜内注射以及静脉注射。

示例性候选物质包括：已经被确认具有抗肿瘤作用的药物，以及具有潜在抗肿瘤作用的化合物、多肽、核酸、抗体和低分子量化合物。这类候选物质的说明性实例包括但不限于：抗代谢物类（例如，5-氟尿嘧啶（5-FU））；叶酸代谢拮抗剂类（例如，二氢喋酸合成酶抑制剂类：磺胺嘧啶和磺胺甲噁唑，以及二氢叶酸还原酶抑制剂类（DHFR抑制剂类）：甲氨蝶呤、甲氧苄啶以及乙胺嘧啶）；嘧啶代谢抑制剂类（例如，胸苷酸合成酶抑制剂类：5-FU和氟胞嘧啶（5-FC））；嘌呤代谢抑制剂类（例如，IMPDH抑制剂类：6-巯基嘌呤和它的药物前体硫唑嘌呤）；腺苷脱氨酶（ADA）抑制剂类（例如，喷司他丁）；核糖核苷酸还原酶抑制剂类（核糖核苷酸还原酶抑制剂：羟基脲）；核苷酸类似物类（嘌呤类似物类：硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨以及克拉屈滨；嘧啶类似物类：阿糖胞苷以及吉西他滨）；L-天门冬酰胺酶；烷化剂类（例如，氮芥、环磷酰胺、美法仑以及噻替派；铂剂类：顺铂、卡铂以及奥沙利铂；以及亚硝基脲类：达卡巴嗪、丙卡巴肼以及雷莫司汀）；抗肿瘤抗生素类（肉瘤霉素、丝裂霉素C、多柔比星、表柔比星、柔红霉素）；拓扑异构酶抑制剂类（伊立替康、诺吉替康（nogitecan）、多柔比星、依托泊苷、左氧氟沙星、环丙沙星）、微管抑制剂类（长春碱、长春新碱、长春地辛）；秋水仙碱（colhicine）；微管抑制剂类（紫杉醇、多西他赛）；分子靶向药物（曲妥珠单抗、利妥昔单抗、伊马替尼、吉非替尼、硼替佐米、埃罗替尼）；类固醇类（例如，地塞米松）；非那雄胺；芳香酶抑制剂类；他莫昔芬以及它们的组合。

为了确定肿瘤细胞生长抑制效应，可以以培养系统的形式（其中相同数量的细胞以相同的细胞浓度接种在培养组织中并且在相同的条件下培养）或以相同系的移植动物模型的形式（其中相同数量的细胞以相同细胞浓度植入）制备两种系统。使候选物质与一个系统的细胞（样品）接触，但是不与其他系统的细胞（对照）接触，并且观察两个系统中的肿瘤细胞生长。可以通过测量和比较经过一段给定时间段之后在两个系统中存在的肿瘤细胞的数量来确定生长抑制效应。

在本发明的肿瘤细胞以培养细胞的形式而用于筛选的情况下，在使候选物质与样品细胞接触之后，用一个细胞计数器或类似物来测量样品细胞的数量和对照细胞的数量，并且可以通过比较各自的细胞数量来确定肿瘤生长效应。

在本发明的肿瘤细胞通过植入一个动物模型中而用于筛选的情况下，在该候选物质已经被给予充当样品系统的该动物模型之后，将肿瘤组织从样品动物与对照动物移除，并且可以测量和比较存在于来自样品动物和来自对照动物的肿瘤组织中的细胞的数量。可替代地，可以通过移除肿瘤组织并且比较来自样品动物和对照动物的肿瘤组织的体积来确定肿瘤生长效应。可以使用以下公式来确定肿瘤体积。

肿瘤体积=ab²/2（其中a是宽度，并且b是长度）

同样可能的是，在将候选物质给予样品与对照动物之后，通过比较在样品动物和对照动物中的肿瘤细胞植入部位处的可测量的肿瘤形成的发生率来确定该肿瘤生长效应。

该动物模型与“2.肿瘤细胞”下的上述动物模型相同。没有对在动物模型中植入的方法施加特别的限制，虽然为了易于再提取被植入的肿瘤细胞，优选的是皮下注射或腹膜内注射。

在一个样品系统内的肿瘤细胞增加的速率小于一个对照系统内的肿瘤细胞增加的速率的情况下，可以推断出候选物具有一种抗肿瘤作用。可替代地，对于本发明的肿瘤细胞，在关于在给定条件下的增长率的充足数据已经存在的情况下，可以通过与源自通过这些数据的统计学处理获得的平均值、标准偏差等等的基线比较来进行这样的测定。

可以通过各种统计方法来获得肿瘤增长率的平均值、标准偏差等等。具体地，在培养细胞的情况下，通过使用在接种时的初始细胞数量和细胞密度作为参数，或在植入细胞的情况下，通过使用在植入时的动物模型的重量和被植入的肿瘤细胞的数量作为参数，可以通过双因素ANOVA分析使用统计分析软件如IBM SSPSStatistics 18（SSPS）来确定这些值。通过将从实施本发明的方法获得的在肿瘤细胞方面的增长率作为新数据添加至用于统计分析的群体中并且因此增加参数，有可能进一步提高分析准确度。

由于本发明的肿瘤细胞表现出在病理上与从患者分离的肺癌细胞非常相似的特征，预期的是通过本发明的筛选方法确认的具有肿瘤细胞生长抑制作用的抗癌药物在被用于治疗实际癌症患者、特别是肺癌患者时也将具有抗肿瘤作用。

以下通过举例对本发明进行更全面的说明，但本发明不限于在实例中所描述的模式。

实例

下文对在实例中实施的实验的程序进行描述。

逆转录病毒载体和逆转录病毒介导的基因转移

在表1所示的基因中，将v-Src（SEQ ID NO:1）和KRAS^V12（SEQ ID NO:5）插入到pCX4pur载体（基因库#：AB086386）中。将c-Myc（SEQ ID NO:3）、PIK3CA^H1047R（SEQ ID NO:11）、细胞周期蛋白D1（SEQ ID NO:13）以及LKB1^D194A(SEQ ID NO:15）插入到pCX4bleo载体（基因库#：AB086388）中。将BCL2（SEQ ID NO:7）插入到pCX4redEx载体（基因库#：AB296084）中。将EGFR^T790M L858R基因（SEQ ID NO:17）插入到pCX4pur载体（基因库登录号：AB086386）中。将TP63^ΔN基因（SEQ ID NO:19）插入到pCX4hyg载体（基因库登录号：AB086387）中。在表2中所示的基因中，将hTERT（SEQ ID NO:21）插入到pCX4neo载体（基因库#：AB086385）中，将CDK4（SEQ ID NO:23）插入到pCX4bsr载体（基因库#：AB086384）中，并且将显性阴性TP53（SEQ ID NO:25）插入到pCX4.1hisD载体（基因库#：AB086389）中。另外，针对诱导型c-Myc基因，通过将c-Myc基因插入到能够用四环素控制表达的一种pT-Rex诱导型表达载体（Invitrogen）中制备了一种诱导型表达载体。将以上逆转录病毒表达载体连同pGP和pE-eco质粒（Takara Bio；滋贺（Shiga），日本）转移至293T细胞（ATCC；马纳萨斯，美国）中产生了病毒。然后，用一种逆转录病毒感染已经表达同向性受体（Eco VR）的HSAE细胞。在杀稻瘟菌素S、G418、嘌呤霉素、博来霉素以及L-组氨醇存在下，将用病毒载体感染的细胞培养两周，从而实施选择。不管用这些药物中的哪一个进行选择，所培养的细胞都是选自被感染细胞的一个多克隆增殖群体。

细胞培养

从Lonza（沃克斯维尔，马里兰州，美国）购买来自19岁高加索人种女性的正常人类小气道上皮细胞。这些细胞被放在胶原包被的组织上并且在已添加有Lonza提供的各种生长因子的一种无血清SAGM培养基（SAGMBullet Kit；Lonza）中生长。这些细胞被保持在37°C的湿培养箱之内的低氧环境（3%O₂和5%CO₂）中。

异种移植物生长实验

对小鼠实施异种移植物生长实验。将含有1×10⁶个HSAE/4T53细胞或用各种癌相关基因转导的HSAE细胞的单细胞悬浮液悬浮在50%MATRIGEL^TM（BD Bioscience；San Jose,CA,USA）中，然后皮下注射到6或7周龄的雌性无胸腺裸小鼠(BALB/c nu/nu；日本SLC；滨松市（Hamamatsu），日本)或NOD-SCID小鼠（Charles River）的侧腹中。用游标卡尺测量肿瘤的大小并且按以下等式计算肿瘤体积，基于此估算致瘤性。

肿瘤体积=ab²/2（其中a是宽度，并且b是长度）

可替代地，在已经植入各种癌相关基因转导的HSAE/4T53细胞或HSAE细胞的部位形成的可测量的肿瘤块的比率被计算为肿瘤发生率，基于此估算致瘤性。

免疫学分析和免疫组织化学染色

将异种移植物用福尔马林固定并且用石蜡包埋，在此之后将该异种移植物切片并且根据正常方案进行苏木精-伊红（H&E）染色。根据上述文献（Sasai,K.等人，美国外科病理学杂志（Am.J.Surg.Pathol.）32,1220-1227(2008)）使用以下抗体进行免疫组织化学染色：多种细胞角蛋白（AE1/AE3；Dako；Glostrup,Denmark）、p63（4A4；Dako）、TTF-1（8G7G3/1；Dako）、p53（D07；Novocastra）以及波形蛋白（V9；Nichirei；日本东京）。用于进行免疫组织化学染色的程序如下。用二甲苯使具有4μm厚度的组织切片脱蜡，然后用乙醇使它脱水。通过在高压锅内在10mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中加热2分钟来活化抗原。用含0.01%Tween 20的磷酸盐缓冲盐水（PBST）使组织切片再水化并且用0.3%的过氧化氢孵育这些组织片层，从而使内源性过氧化物酶灭活。在4°C下在具有适当稀释浓度的一级抗体中孵育这些组织切片过夜，然后用PBST洗涤，之后在室温下在Envision Dual Link溶液（Dako；Glostrup,Denmark）中将它们孵育30分钟。然后，用二氨基联苯胺（Dako）处理这些切片，从而使抗原-抗体反应位点可视化，并且用90秒的苏木精处理进行核染色。使用Entellan Neu试剂（Merck；Whitehouse Station,NJ）安装这些组织切片的载玻片，然后用一个盖玻片密封并且供给用于观察。

如在上述文献（Steedman,H.F.，微观科学季刊（Quarterly Journal ofMicroscopic Science），第91卷，p477-479(1950)）中所述，阿新蓝染色是通过福尔马林固定、石蜡封装以及将异种移植物切片，然后将这些切片染色而进行的。

免疫印迹技术

如上述文献（Akagi,T.等人，分子细胞生物学（Mol.Cell Biol.）22,7015-7023(2002)）所描述来进行蛋白质测量、SDS-PAGE以及免疫印迹。通过化学发光法使用SuperSignal WestFemto试剂（Pierce,Rockford;IL,USA）使免疫阳性蛋白信号可视化。从Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚，美国)购买抗c-Myc单克隆抗体。

通过有限稀释技术克隆

如上述文献（Quintana,E.等人，自然（Nature）456(7222):593-8(2008年12月4日)）所描述来进行从单细胞制备细胞克隆。

实验结果

[1]用v-Src基因和c-Myc基因转导的癌细胞的产生

将通过将c-Myc基因和v-Src基因转移至HSAE/4T53细胞产生的4T53MS细胞皮下移植（1×10⁶个细胞/动物）到无胸腺的裸小鼠（BALB/cnu/nu；日本SLC；滨松市，日本）中。对所形成的肿瘤组织进行异种移植物生长实验、组织学分析以及免疫组织化学染色。在移植有4T53MS细胞的小鼠体内观察到肿瘤块形成（图1A）。4T53MS细胞具有非常高的致瘤性。即使与已知知具有高致瘤性的NCl-H460肺癌细胞相比，4T53MS细胞也具有大约两倍高的致瘤性（图1B）。移除这个肿瘤块，制备组织切片并且进行苏木精-伊红（H&E）染色，随后观察到具有非常低的分化程度并且表现出未分化的形态学的癌组织图像。免疫染色结果：对p63（一种肺上皮标记）染色呈阴性，并且对细胞角蛋白（抗体克隆名称，AE1/AE3）（它是一种上皮细胞标记）染色也呈阴性。另一方面，肿瘤细胞对间充质细胞标记波形蛋白呈强阳性。从以上推断出来自4T53MS细胞的肿瘤表现出未分化癌的性质（图1C）。在通过将仅v-Src或仅c-Myc基因转移至HSAE/4T53细胞所获得的细胞（得到的细胞在此分别称为“4T53S”和“4T53M”细胞）中，未观察到致瘤性。

4T53MS细胞具有非常强的致瘤性。甚至当皮下移植1×10⁶、1×10⁴、1×10³或1×10²数量的细胞时，在NOD-SCID小鼠中观察到概率为100%的肿瘤形成（图2A）。即使只植入十个细胞，发现50%概率的肿瘤形成是可能的（图2A、2B）。因此，由于4T53MS细胞的特征在于非常高的致瘤性并且分化成一种以上类型的细胞，这证明4T53MS细胞具有癌干细胞的特征。

通过将诱导型c-Myc基因和v-Src基因转移至HSAE/4T53细胞所产生的4T53mS细胞用多西环素（DOX）处理，从而诱导c-Myc在体外实验系统中表达（图3A）。将在DOX存在下培养的4T53mS细胞皮下移植到裸小鼠体内并且继续给予DOX。当观察到肿瘤形成时，停止DOX给药（图3B）。用细胞角蛋白将所获得的肿瘤组织染色，从而清楚地区分强阳性肿瘤细胞和阴性基质细胞。然而，未观察到在例如腺癌或鳞状细胞癌中所看到的特征图像，表明这是一种低分化大细胞癌样肿瘤（图3C）。

[2]通过转移人类基因产生癌细胞

通过转移c-Myc基因与KRAS^V12基因两者所获得的4T53RM细胞被皮下植入无胸腺裸小鼠（BALB/c nu/nu；日本SLC；滨松市，日本）中，并且对所形成的肿瘤组织进行异种移植物生长实验、组织学分析以及免疫组织化学染色。4T53RM细胞具有致瘤性。然而，肿瘤发生率为38%（图4）。通过将BCL2基因转移至这些4T53RM细胞中所获得的4T53RMB细胞被皮下植入无胸腺裸小鼠（BALB/c nu/nu；日本SLC；滨松市，日本）中，并且对所形成的肿瘤组织进行异种移植物生长实验、组织学分析以及免疫组织化学染色。4T53RMB细胞以80%的高发生率在裸小鼠体内形成肿瘤。

在免疫学检查中，在来自4T53RM细胞的肿瘤和来自4T53RMB细胞的肿瘤中均观察到未表现出鳞状细胞癌或腺癌的特征的组织学。对这些肿瘤进行免疫染色，结果是仅仅表现出对细胞角蛋白的弱阳性反应（AE1/AE3：图5）。然而，由于表现出对波形蛋白的强阳性反应，这被判断为未分化癌。

通过将KRAS^V12基因转移至HSAE/4T53细胞产生了4T53R细胞。将PIK3CA^H1047R、细胞周期蛋白-D1或LKB1^D194A基因中的一种基因转移至4T53R细胞，从而分别建立4T53RP细胞、4T53RD细胞以及4T53RL细胞。将4T53R、4T53RP、4T53RD以及4T53RL细胞皮下植入无胸腺裸小鼠（BALB/c nu/nu；日本SLC；滨松市，日本）中，并且对所形成的肿瘤组织进行异种移植物生长实验、组织学分析以及免疫组织化学染色。虽然在4T53R细胞中未看到致瘤性，但是在4T53RP细胞、4T53RD细胞以及4T53RL细胞中观察到高的肿瘤发生率（这些发生率分别为100%、100%、83%，图4）。

对来自4T53RP细胞、4T53RD细胞或4T53RL细胞的肿瘤（异种移植物）进行组织学分析，随后发现这些肿瘤表现出与实际人类肺癌组织相似的组织学。在用4T53RP细胞形成的肿瘤中，观察到含有腺癌样区域和鳞状细胞癌样区域两者的组织学（图6；H&E）在用4T53RD细胞和4T53RL细胞形成的肿瘤（异种移植物）中，由于观察到腺样结构形成并且存在大量的肿瘤基质，该肿瘤被认为是具有与人类肺腺癌相似的形态学（图6；H&E）。这些肿瘤由对上皮细胞标记细胞角蛋白呈强阳性（图6；AE1/AE3）并且对肺上皮细胞标记p63染色也呈阳性（图6；p63）的细胞组成。这些标记的表达表明来自4T53RP、4T53RD以及4T53RL细胞的肿瘤是类似于人类肺腺癌的分化肿瘤。由于来自4T53RP细胞的肿瘤也包括鳞状细胞癌样区域，这被推断为人类腺癌与鳞状细胞癌的混合物（腺鳞状细胞癌）。

[3]具有肺腺癌的癌干细胞性质的细胞的产生

来自通过将KRAS^V12与细胞周期蛋白D1基因两者转移至HSAE/4T53细胞所产生的4T53RD细胞的癌组织形成了由与肺腺癌类似的异质性细胞群体组成的腺样结构。这表明以下可能性：即，4T53RD细胞具有干细胞的性质，这些干细胞具有分化成多种类型的细胞的能力。

为了证实这种可能性，通过有限稀释方法来克隆4T53RD细胞，产生起源于单细胞的若干细胞克隆。这些细胞克隆被皮下植入NOD-SCID小鼠体内，并且对所形成的肿瘤组织进行异种移植生长实验、组织学分析以及免疫组织化学染色。来自单细胞的4T53RD细胞克隆形成肿瘤块，并且像4T53RD的亲株一样，形成在形态学上与人类肺腺癌相似的肿瘤（图8A）。

如在图8B中所示，小鼠气道上皮由若干细胞群体组成，这些细胞群体包括表达p63的基底细胞、表达TTF1的克拉拉细胞、产生粘蛋白的杯状细胞以及纤毛细胞。

在植入单细胞衍生的4T53RD细胞克隆后所形成的肿瘤组织被免疫组织化学染色，结果是在与小鼠基底接触的边界区中存在p63阳性基底细胞。然而，在内部形成腺样结构的部分为p63阴性，并且存在着对在克拉拉细胞中表达的TTF1呈阳性的细胞、以及被阿新蓝染色的粘蛋白产生细胞（图8A）。考虑到以下事实：根据Rock,J.R.等人，美国科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）106(31),12771-5(2009年8月4日)，最近已显示p63阳性基底细胞在支气管中作为干细胞起作用，这些结果表明：在通过单细胞衍生的4T53RD细胞克隆所获得的肿瘤中，当p63阳性细胞朝向内部增殖时，它们分化成克拉拉细胞和粘蛋白分泌杯状细胞，从而形成由异质性细胞群体组成的癌组织。

同样地，4T53RD细胞克隆具有强致瘤性。当1×10⁴、1×10³、1×10²以及1×10¹的这些细胞被皮下植入时，在NOD-SCID小鼠中观察到肿瘤形成的概率分别为100%、80%、60%以及13%（图9）。

根据上述结果，4T53RD被显示具有以下两种癌干细胞特性：(1)在体内形成肿瘤过程中它们具有从单一类型的细胞分化成多种类型的细胞的能力；并且(2)甚至少量的细胞也能够形成肿瘤。

[4]具有肺鳞状细胞癌的特征的细胞的产生

通过将KRAS^V12、细胞周期蛋白D1以及TP63^ΔN基因转移至HSAE/4T53细胞所产生的4T53RDΔNp63细胞被皮下植入无胸腺裸小鼠（BALB/c nu/nu；日本SLC；滨松市，日本）中，并且对所形成的肿瘤组织进行组织学分析和免疫组织化学染色。

通过将KRAS^V12基因与和细胞周期蛋白D1基因两者转移至HSAE/4T53细胞所产生的4T53RD细胞形成了具有与人类肺腺癌相似的形态学的肿瘤（图10A），然而，根据组织学分析，通过不仅转移KRAS^V12和细胞周期蛋白D1基因还转移TP63^ΔN基因所产生的细胞形成了鳞状细胞癌样肿瘤组织（图10B）。

[5]使用EGFR突变基因和细胞周期蛋白D1产生分化肺癌细胞

通过将EGFR^T790M L858R基因和细胞周期蛋白D1基因两者转移至HSAE/4T53细胞内所产生的4T53 ED细胞被皮下植入无胸腺裸小鼠（BALB/c nu/nu；日本SLC；滨松市，日本）中，并且对所形成的肿瘤组织进行异种移植物生长实验、组织学分析以及免疫组织化学染色。

4T53 ED细胞表现出100%的肿瘤发生率（图4），并且因此被发现具有高的致瘤性。同样地，来自4T53 ED细胞的肿瘤组织形成了一种特定类型的分化肿瘤组织，该分化肿瘤组织具有主要由其中散布有腺癌样细胞的鳞状上皮样细胞组成的形态学（图11A至11C）。

如上述结果所证明，通过将癌相关基因转移至永生化人类小气道上皮细胞（HSAE/4T53细胞）内，有可能调节肿瘤细胞分化的程度。即，如在图7中所示，通过基因转移有可能产生未分化癌的模型，该基因转移包括一种c-Myc基因与一种v-Src基因的组合（4T53MS细胞）或一种c-Myc基因、一种KRAS突变基因以及一种BCL2基因的组合（4T53RMB细胞）。同样地，通过转移呈一种诱导型c-Myc基因与一种v-Src基因的组合形式的基因（4T53mS细胞），有可能建立与c-Myc诱导的人类肺大细胞癌类似的一种低分化肺癌模型。另外，通过以下组合中的任一组合的基因转移，即一种KRAS突变基因与一种PIK3CA突变基因的组合（4T53RP细胞），一种KRAS突变基因与一种细胞周期蛋白D1基因的组合（4T53RD细胞），一种KRAS突变基因与一种LKB1突变基因的组合（4T53RL细胞），一种KRAS突变基因、一种细胞周期蛋白D1基因以及一种TP63基因的组合（4T53RDΔNp63细胞），或一种EGFR突变基因与细胞周期蛋白D1基因的组合（4T53ED细胞），有可能产生与腺癌或鳞状细胞癌（或它们的混合体）类似的人类肺癌模型。

工业实用性

本发明提供了表现出病理特征与人类肺癌细胞的病理特征相似的肿瘤细胞。这样的肿瘤细胞在肺癌的生物机制的研究、用于肺癌治疗的靶分子的鉴定以及抗癌药物的筛选和测试中是有用的。具体而言，通过仅仅转移癌相关人类基因所产生的肿瘤细胞如实地重现了细胞的特性，并且预期在抗癌药物的开发中是高度有用的。

Claims (19)

1.一种用于通过将一种或多种癌相关基因转移至永生化小气道上皮细胞内来产生肿瘤细胞的方法，其中

该永生化小气道上皮细胞是通过使正常小气道上皮细胞经受以下(1)至(3)处理而产生的：

(1)强制表达端粒逆转录酶基因；

(2)强制表达细胞周期蛋白依赖性激酶4基因；以及

(3)诱导p53功能缺失，并且其中

该一种或多种癌相关基因是选自以下基因的一种或多种基因：c-Myc基因、v-Src基因、KRAS突变基因、BCL2基因、PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白D1基因、LKB1突变基因、TP63基因以及EGFR突变基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因与v-Src基因的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因、KRAS突变基因以及BCL2基因的组合。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中这些肿瘤细胞是未分化癌细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中这些肿瘤细胞是癌干细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中这些癌相关基因是c-Myc基因和v-Src基因，其中该c-Myc基因在这些永生化人类小气道上皮细胞中被诱导表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其中这些肿瘤细胞是低分化肺癌细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与选自PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白D1基因以及LKB1突变基因中的一种基因的组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因与细胞周期蛋白D1基因的组合。

10.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因、细胞周期蛋白D1基因以及TP63基因的组合。

11.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因与PIK3CA突变基因的组合。

12.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因与LKB1突变基因的组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中这些癌相关基因是EGFR突变基因与细胞周期蛋白D1基因的组合。

14.根据权利要求8至13所述的方法，其中这些肿瘤细胞是分化肺癌细胞。

15.根据权利要求9所述的方法，其中这些肿瘤细胞是分化肺癌的癌干细胞。

16.根据权利要求8至15所述的方法，其中这些永生化小气道上皮细胞是哺乳动物或灵长类动物细胞。

17.通过根据权利要求1至16的任一项所述的方法产生的肿瘤细胞。

18.一种植入有根据权利要求17所述的肿瘤细胞的荷瘤动物模型。

19.一种用于筛选一种抗癌药物的方法，

该方法包括：

(a)将衍生自权利要求17所述的肿瘤细胞的一种样品与一种候选物质接触；以及

(b)检测肿瘤细胞生长抑制效应。

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