CN105283206B - 包含p34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗或转移抑制癌的组合物 - Google Patents
包含p34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗或转移抑制癌的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含p34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗癌或抑制癌转移的组合物。根据本发明，在抑制(knock‑dow n)p34蛋白方面，在通过引起同源性磷酸酶‑张力蛋白(PTEN)的单泛素化来促进同源性磷酸酶‑张力蛋白的核定位(nuclear localization)的结果，抑制与肿瘤的生存、增殖、侵入性及转移性相关的蛋白激酶B(Akt)通路，从而具有使同时表达同源性磷酸酶‑张力蛋白及NEDD4‑1的各种癌细胞的肿瘤发生率及集落形成能力明显减少的效果。因此，本发明的p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂可有效用作癌的治疗剂或癌转移抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及包含P34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗癌或抑制癌转移的组合物。
背景技术
癌是危害人类健康的最大疾病之一，是一种经过一连串的突变过程，细胞以无限制、无法调整的方式增殖并不死灭而发生的疾病。引发癌的原因可有化学物质、病毒、细菌、电离辐射等的环境或外在原因和先天性基因变异等的内在原因(Klaunig&Kamendulis，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，44：239-267，2004)。在早期发现癌的情况下，可采取手术、放射治疗、化学疗法等治疗方法，但是，存在副作用大的问题，在晚期癌或癌转移的情况下，没有特殊的治疗方法，只能在已经进入倒计时的人生中渐渐结束生命。
近来，查明了各种与癌相关的生化机制，随之也研发出各种治疗剂，但到目前为止，未能提出可根治癌症的治疗方法。因此，正锐意研究识别与癌相关的多种生物体内分子，并开发以与癌相关的多种生物体内分子作为靶的药物，还努力尝试通过对这种药物中的一部分进行组合来提高癌症治疗效果。因此，另外努力研究与癌相关的靶分子可为非常重要。
周知，作为在磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K，Phosphatidylinositol-3-ki nase)信号传导过程中的重点阴性调控因子，同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN，phosphatase andtensin homolog)肿瘤抑制因子为在人类的癌症中最频繁变异或缺失的基因。根据最新研究，在调控作为肿瘤抑制因子的同源性磷酸酶-张力蛋白的功能方面，提出关于泛素化的重要问题，并正在持续研究同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化所需要的调控机制。
本发明人在研究与同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化相关的机制的过程中确认到作为NEDD4-1(Neuronal precursor cell-expressed dev elopmentally down-regulated4-1)的结合搭档的p34蛋白调控NEDD4-1蛋白的稳定性，并以此调控同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化及多聚泛素化(polyubiquitination)的转化。
更具体地，在p34的表达增加与作为E3泛素连接酶的NEDD4-1的WW1域互相作用，来提高NEDD4-1蛋白的稳定性的结果，导致同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化及同源性磷酸酶-张力蛋白的分解，相反，抑制(knock-down)p34蛋白将引起同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化来促进同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位(nuclear localizatio n)，最终抑制了与肿瘤的生存、增殖、侵入性乃至转移性相关的蛋白激酶B(Akt)通路。
因此，本发明人确认p34通过调控NEDD4-1蛋白的稳定性，来在同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化通路中起到重要调控因子的作用，尤其，在与NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白相关的癌的治疗方面，可成为有效的靶，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供用于预防或治疗癌的组合物，上述用于预防或治疗癌的组合物包含p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
并且，本发明目的在于，提供用于抑制癌转移的组合物，上述用于抑制癌转移的组合物包含p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
并且，本发明的目的在于，提供治疗癌或抑制癌转移的方法，上述治疗癌或抑制癌转移的方法包括将p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。
并且，本发明的目的在于，提供利用p34的用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法。
并且，本发明的目的在于，提供p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法，上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法包括向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂的步骤。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明提供用于预防或治疗癌的药学组合物，上述用于预防或治疗癌的药学组合物包含p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
并且，本发明提供用于抑制癌转移的药学组合物，上述用于抑制癌转移的药学组合物包含p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
并且，本发明提供治疗癌或抑制癌转移的方法，上述治疗癌或抑制癌转移的方法包括将p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。
并且，本发明提供用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法，上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法包括：步骤1)，向p34蛋白表达细胞株处理被检查物质；步骤2)在上述细胞株中测定p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度；以及步骤3)，选择上述p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度与未处理被检查物质的对照组相比减少的被检查物质。
并且，本发明提供p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法，上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法包括：步骤1)，向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂；以及步骤2)，在上述生物学试料中测定癌细胞是否增殖。
发明的效果
根据本发明，在抑制p34蛋白方面，在通过引起同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化来促进同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位的结果，抑制与肿瘤的生存、增殖、侵入性及转移性相关的蛋白激酶B通路，从而具有使同时表达同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1的各种癌细胞的肿瘤发生率及集落形成能力明显减少的效果。因此，本发明的p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂可有效用作癌的治疗剂或癌转移抑制剂。
附图说明
图1为示出在293细胞、DU145细胞及MCF-7细胞中利用NED D-1的免疫沉淀反应结果的图。
图2为示出在293细胞、DU145细胞及MCF-7细胞中通过蛋白印迹法分析p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
图3为示出在DU145细胞及MCF-7细胞的免疫沉淀物中，通过蛋白印迹法分析p34及NEDD4-1表达水平的结果的图。
图4为示出LS1034细胞及MDA-MB231细胞中的NEDD4-1蛋白的免疫沉淀反应结果的图。
图5为示出在各种结肠癌及乳腺癌细胞株中，通过蛋白印迹法分析p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
图6为示出293细胞中的p34及NEDD4-1的免疫沉淀反应结果的图。
图7为示出通过GST-Pull down(谷胱甘肽巯基转移酶拉下)分析及蛋白印迹法分析p34及NEDD4-1的表达水平的结果的图。
图8为示出通过GST-Pull down分析及蛋白印迹法分析p34、同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1的表达水平的结果的图。
图9为示出NEDD4-1变异体的基因敲除类型图，以及示出通过G ST-Pull down分析来进行的p34和NEDD4-1蛋白的相互作用分析结果的图。
图10为示出在WW1域缺失的NEDD4-1蛋白中的GST-Pull dow n分析结果的图。
图11为示出通过GST-Pull down分析来得到的p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白的相互作用分析结果的图。
图12为示出通过免疫沉淀反应来表示基于p34的表达及MG132处理条件的NEDD4-1的自泛素化的图。
图13为示出通过GST-Pull down分析来表示基于p34表达的NE DD4-1的自泛素化的图。
图14为示出通过蛋白印迹法分析p34或NEDD4-1的表达的结果及通过蛋白印迹法分析基于CHX处理条件的NEDD4-1的表达水平的结果的图。
图15为示出通过蛋白印迹法分析基于p34抑制的NEDD4-1及p34蛋白的表达水平的结果的图。
图16为示出通过蛋白印迹法分析基于p34抑制的同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的表达水平的结果的图。
图17为示出通过蛋白印迹法分析基于p34的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
图18为示出通过蛋白印迹法分析基于p34抑制及CHX处理条件的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图
图19为示出通过蛋白印迹法分析基于p34转染及MG132处理的同源性磷酸酶-张力蛋白在293细胞中的表达水平的结果的图。
图20为示出基于p34转染及MG132处理的同源性磷酸酶-张力蛋白在各个细胞中的泛素化程度的图。
图21为示出基于p34抑制的同源性磷酸酶-张力蛋白在各个细胞内的多聚泛素化程度的图。
图22为示出基于p34的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白在293细胞中的脂质磷酸分解酶活性的图。
图23为示出在转染NEDD4-1小干扰核糖核酸(siRNA)/短发夹核糖核酸(shRNA)及p34的细胞中，通过蛋白印迹法分析同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平及蛋白激酶B磷酸化的结果的图。
图24为示出通过蛋白印迹法分析基于p34、NEDD4-1小干扰核糖核酸及CHX处理的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
图25为示出基于NEDD4-1小干扰核糖核酸/短发夹核糖核酸、p34的转染及MG132处理的同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化程度的图。
图26为示出基于p34的表达及NEDD4-1抑制的同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性的图。
图27为示出通过蛋白印迹法分析在抑制X连锁凋亡抑制蛋白(X IAP)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的X连锁凋亡抑制蛋白的表达水平的结果的图。
图28为示出在抑制X连锁凋亡抑制蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，通过蛋白印迹法分析基于p34的转染结果的同源性磷酸酶-张力蛋白表达水平的结果的图。
图29为示出在抑制X连锁凋亡抑制蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，通过免疫沉淀反应及蛋白印迹法分析基于p34的转染结果的同源性磷酸酶-张力蛋白表达水平的结果的图。
图30为示出在p34抑制MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、DU145细胞及LS1034细胞中单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
图31为示出按细胞核分层/细胞溶质(cytosol)的位置表示在p34抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞中单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
图32为示出基于p34抑制或NEDD4-1抑制的MCF-7细胞中的单泛素化同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
图33为示出基于NEDD4-1的表达或p34的表达的多聚泛素化同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
图34为示出基于NEDD4-1的表达或p34的表达的多聚泛素化同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
图35为示出基于E2酶的存在及p34的表达、NEDD4-1的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化程度的图。
图36为示出基于是否抑制p34的LS1035细胞及MCF7细胞的增殖率的图。
图37为示出基于p34抑制的LS1035细胞及MCF7细胞的集落形成能力的图。
图38为示出基于是否抑制p34的LS1035细胞及MCF7细胞集落的大小的图。
图39为示出基于是否抑制p34的LS1035细胞及MCF7细胞中的p34的表达水平、周期素E2的表达水平及cdc6基因的表达水平的图。
图40为示出通过确认TetR是否表达来确立表达四环素诱导p34-短发夹核糖核酸矢量的DU145细胞株及MDA-MB-231细胞株的图。
图41为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行四环素处理后，表示p34的表达水平、同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平及磷酸化蛋白激酶B的表达水平的图。
图42为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行四环素处理后，表示同源性磷酸酶-张力蛋白磷酸分解酶活性程度的图。
图43为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行四环素处理后的集落形成能力的图。
图44为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行四环素处理后的细胞增殖率的图。
图45为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行四环素处理后的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)混合程度的图。
图46为示出同源性磷酸酶-张力蛋白在p34表达Hs578T细胞株中的表达及集落形成能力的图。
图47为示出在向小鼠注入四环素诱导DU145变异株来形成肿瘤后，基于四环素注射的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平、p34的表达水平及NEDD4-1的表达水平的图。
图48为示出在向小鼠注入四环素诱导MDA-MB-231变异株来形成肿瘤后，基于四环素注射的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平、p34的表达水平及NEDD4-1的表达水平的图。
图49为示出在向小鼠注入四环素诱导DU145变异株来形成肿瘤后，基于四环素注射的肿瘤体积变化的图。
图50为示出在向小鼠注入四环素诱导MDA-MB-231变异株来形成肿瘤后，基于四环素注射的肿瘤体积变化的图。
图51为示出在向小鼠注入四环素诱导DU145变异株来形成肿瘤后，基于四环素注射的同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位的图。
图52为示出在向小鼠注入四环素诱导MDA-MB-231变异株来形成肿瘤后，基于四环素注射的同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位的图。
图53为示出同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1蛋白在p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞中的表达水平的图。
图54为示出在p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞中，基于Ras的表达、p34的表达及NEDD4-1的表达的集落形成能力的图。
图55为示出同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1蛋白在NEDD4-1抑制p53-/-小鼠胚胎成纤维细胞细胞中的表达水平的图。
图56为示出在NEDD4-1抑制p53-/-小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，基于Ras的表达、p34的表达及NEDD4-1的表达的集落形成能力的图。
图57为示出同源性磷酸酶-张力蛋白在NEDD4-1抑制p53-/-小鼠胚胎成纤维细胞细胞中的多聚泛素化程度的图。
图58为示出p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞中的Ras活性的图。
图59为示出基于在各种乳腺癌级结肠癌细胞中的NEDD4-1/p34的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达比率的图。
图60为示出基于在各种乳腺癌级结肠癌细胞中的NEDD4-1/p34的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达比率的图。
图61为以图样化的方式示出p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白之间的综合相互作用的图。
图62为示出基于在人类乳腺癌细胞及大肠癌细胞中的p34活性抑制剂处理的同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化抑制程度的图。
图63为示出基于p34活性抑制剂处理的p34及NEDD4-1蛋白的结合抑制效果的图。
图64为示出在人类乳腺癌细胞株中，p34活性抑制剂处理对细胞死亡及蛋白表达产生的影响的图。
图65为示出在人类乳腺癌细胞株中，p34活性抑制剂处理对同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性产生的影响的图。
图66为示出在人类大肠癌细胞株中，p34活性抑制剂处理对细胞死亡及蛋白表达产生的影响的图。
图67为示出在人类大肠癌细胞株中，p34活性抑制剂处理对同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性产生的影响的图
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明提供用于预防或治疗癌的组合物，上述用于预防或治疗癌的组合物包含p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
并且，本发明提供用于抑制癌转移的组合物，上述用于抑制癌转移的组合物包含p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
上述组合物包含药学组合物。
根据本发明的p34基因的表达抑制剂可以为选自由互补结合于p34基因的信使核糖核酸(mRNA)的反义核苷酸、短发夹核糖核酸(s mall hairpin RNA，shRNA)、小干扰核糖核酸(small interfering RN A，siRNA)及核酶(ribozyme)组成的组中的一种以上，但不局限于此。
根据本发明的p34蛋白的活性抑制剂可以为选由特异结合于p34蛋白的化合物、肽、肽模拟物、底物类似物、核酸适体及抗体组成的组中的一种以上，但不局限于此。
根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对的定义，上述反义核苷酸为结合(混合)于脱氧核糖核酸(DNA)的互补性碱基序列、未成熟的信使核糖核酸的互补性碱基序列或成熟的信使核糖核酸的互补性碱基序列，从而作为蛋白质来在脱氧核糖核酸中妨碍遗传密码的流动。
上述小干扰核糖核酸由在对p34蛋白进行编码的基因的信使核糖核酸的碱基序列中选择的15序列至30序列(mer)的正义序列及与上述正义序列互补性地结合的反义序列构成，此时，上述义序列并不特别限定于此，但是，优选地由25个碱基构成。
上述化合物均包含所有特异结合于p34蛋白，来可抑制p34蛋白活性的任意化合物，优选为具有抑制p34蛋白和NEDD4-1蛋白结合的活性的化合物，但并不局限于此。在本发明的一实施例中，作为特异结合于上述p34蛋白的化合物的一例，提出以下化学式1表示的化合物或其的药学上可允许的盐。
化学式1：
在本发明中，“药学上可允许的盐”是指所具有的浓度对个体起到比较无毒、无害的有效作用，并且上述盐的副作用不使由化学式1表示的化合物的有益效能下降的上述化合物的任意的所有有机附加盐或无机附加盐。由上述化学式1表示的化合物的药学上可允许的盐在无其他条件的情况下，包含全部可存在于由化学式1表示的化合物的酸性盐或碱性盐。
上述肽模拟物(Peptide mimetics)通过抑制p34蛋白的结合域来抑制p34蛋白的活性。肽模拟物可以为肽类或非肽类，可由如psi结合等的非肽结合方式结合的氨基酸构成。并且，上述肽模拟物可以为包含“构象受限的(conformationally constrained)”肽、循环模拟物(cy clic mimetics)、至少一个的环外域(exocyclic domain)、结合部分(结合氨基酸)及活性部位的循环模拟物。肽模拟物可以以与p34蛋白的二级结构特性相类似的方式结构化，并可模仿如抗体或水溶性受体等巨大分子的抑制特性，可以为起到与天然对抗剂相同作用的新型小分子。
上述核酸适体(aptamer)作为单链脱氧核糖核酸或核糖核酸分子，可通过利用称为数富集的配基系统进化技术(SELEX，systematic evolution of ligands by exponential enrichment)的寡核苷酸(oligonucleotide)库的进化方法来分离以对特定化学分子或生物分子具有高亲和力和选择力的方式结合的低聚物而得。核酸适体可特异与靶结合，并可调控靶的活性，例如，可通过结合来阻断靶的功能。
上述抗体可特异、直接与p34蛋白结合来有效抑制p34蛋白的活性。优选地，作为与上述p34蛋白特异结合的抗体，可使用多克隆(p olyclonal)抗体或单克隆(monoclonal)抗体。通过本发明所属领域公知的方法来制作与上述p34蛋白特异结合的抗体也无妨，也可购买已商品化的p34抗体来使用。上述抗体可根据本发明所属领域公知的现有方法，通过向外部宿主注射免疫原因p34蛋白来制作。外部宿主包括小鼠、大鼠、羊、兔子等的哺乳动物。免疫原可采用肌肉注射、腹腔注射或皮下注射方法来注射，通常，可与用于提高抗原性的助剂(a djuvant)一同注射。可通过收集定期从外部宿主采集血液而形成的效价及对抗原表现出特异性的血清来分离抗体。
根据本发明，在抑制p34的情况下，通过引起同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化，来促进同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位，最终抑制与肿瘤的生存、增殖、侵入性及转移性相关的蛋白激酶B通路，从而具有使同时表达同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1的各种癌细胞的肿瘤发生率及集落形成能力明显减少的效果。因此，p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂可有效用作癌的治疗剂或癌转移抑制剂。
上述癌包括口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌、颈癌、子宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin′s disease)、食道癌、淋巴腺癌、膀胱癌，胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、一次中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤及脑垂体腺瘤，优选地，包含乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等，但并不局限于此。
并且，上述癌包含全部同时表达p34及NEDD4-1的癌，但并不局限于此。
本发明的组合物还可包含一种以上具有抗癌效果的公知的有效成分。
本发明的组合物可通过与药学上允许的载体一同以适当的形态剂型化。作为药学上允许的载体，例如有乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等的口服给药用载体及水、适当的油、食盐水，水溶性葡萄糖及乙二醇等的非口服给药用载体等，其中还可包含稳定化剂及保鲜剂。适当的稳定化剂有亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)、亚硫酸钠(sodiumsulfite)或抗坏血酸(ascorbic acid)等的抗氧化剂。适当的保鲜剂有苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)或对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)及氯丁醇(C hlorobutanol)。除此之外的药学上允许的载体可参考以下文献的记载(R emington′s Pharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack PublishingCompan y,Easton,PA,1995)。
对本发明的药学组合物，可通过所需的方法来进行口服给药或非口服给药(例如，适用于静脉注射、皮下注射、腹腔注射或局部注射)，给药量可根据个体的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、注射时间、注射方法、注射期间或间隔、排泄率、体质特性、制剂的性质等来采用多种范围。本发明的药学组合物的日给药量为约0.001～1000mg/kg，但是，可根据临床实验结果来进行增减，优选地，一日一次给药或一日分多次给药。
本发明的药学组合物可以以给药单位形态剂型化。例如，上述剂型化的给药单位可包括上述有效化合物的日个别给药量的1倍、2倍、3倍或4倍，或日给药量的1/2倍、1/3倍或1/4倍。优选地，上述个别给药量包含有效化合物的单次给药量，这相当于常规日给药量的全部给药量、1/2倍给药量、1/3倍给药量或1/4倍给药量。
并且，本发明的组合物可以多种方式用于有效预防或改善癌的药剂。
并且，本发明提供治疗癌或抑制癌转移的方法，上述治疗癌或抑制癌转移的方法包括将p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。
本发明的治疗癌或抑制癌转移方法包括以有效治疗量将本发明的p34基因的表达抑制剂或p34蛋白给药到个体的步骤。优选地，所使用的对特定个体的具体有效治疗量根据以下事项而不同：所要达到的反应的种类和程度、在根据需要是否使用其他制剂的情况下的具体组合物、个体的年龄、体重、常规健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径及组合物的分泌率、治疗期间、包括与具体组合物一同使用或同时使用的药物在内的各种因素和医学领域周知的相似因素。因此，优选地，可考虑上述事项来决定适合本发明目的的组合物的有效量。
在本发明中，个体可以为患癌的任意哺乳动物，上述哺乳动物不仅包括人类及灵长类，而且还包括牛、猪、氧、马、狗及猫等的家畜。
并且，本发明提供用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法，上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法包括：步骤1)，向p34蛋白表达细胞株处理被检查物质；步骤2)，在上述细胞株中测定p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度；以及步骤3)，选择上述p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度与未处理被检查物质的对照组相比减少的被检查物质。
在上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法中，步骤1)中的细胞株包括全部癌细胞株，上述细胞株优选为同时表达p34及NEDD4-1的癌细胞株，但不局限于此。
在上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法中，步骤2)中的基因的表达水平可通过逆转录聚合酶链式反应(Reverse Trans cription Polymerase ChainReaction)、印迹杂交(Northern blot)、c脱氧核糖核酸微阵列混合反应及原位(in situ)混合反应等的方法来测定，基因的表达水平可使用全部本发明所属领域的普通技术人员已知的测定基因量的方法来测定，但并不局限于此。
在上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法中，步骤2)中的蛋白的活性程度可通过免疫共沉淀(immunprecipitation)、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、蛋白印迹法(Western Blottiing)及流式细胞分析法(FACS)等方法来测定，蛋白的活性程度可使用全部本发明所属领域的普通技术人员已知的测定蛋白量的方法来测定，但并不局限于此。
并且，本发明提供p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法，上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法包括：步骤1)，向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂；以及步骤2)，在上述生物学试料中测定癌细胞是否增殖。
在上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法中，步骤1)中的生物学试料包括患癌的个体的血液、尿液、唾液及组织等，但并不局限于此。
上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法还包括步骤3)，预测若生物学试料中的癌细胞增殖，则p34的表达抑制剂或活性抑制剂对癌无治疗效果，若生物学试料中的癌细胞未增殖，则p34的表达抑制剂或活性抑制剂存在治疗效果。
在仅有NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白表达的癌及仅有同源性磷酸酶-张力蛋白表达的癌中，无法通过p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂处理来得到治疗效果，在NEDD4-1、同源性磷酸酶-张力蛋白及p34同时表达的癌中，可通过p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂处理来得到抗癌效果。
以下，提出用于理解本发明的优选实施例。但是，以下实施例仅用于更加容易理解本发明，本发明的内容不限定于以下实施例。
实施例1.分析在生物体内及试管内的p34及NEDD4-1之间的相互作用及p34对NEDD4-1蛋白的稳定性所产生的影响
1-1.分析内因性p34及NEDD4-1之间的相互作用
(1)为了识别与NEDD4-1相互作用的蛋白质，从细胞溶解液中利用对NEDD4-1蛋白的抗体来执行了免疫共沉淀、串联亲和纯化及质量分析。首先，为了执行免疫共沉淀，向抗-NEDD4-1抗体分别混合293细胞(HEK293细胞)细胞、作为前列腺癌细胞的DU145细胞、作为乳腺癌细胞的MCF7细胞的溶解液后，在4℃的温度下培养12小时。接着，在上述培养物加入20μl的蛋白质A/G Plus-Sepharose beads(美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotech nology，Santa Cruz，CA，USA))来混合后，追加培养2小时。用溶解缓冲液(nonidet P-40lysis buffer)对所获取的免疫沉淀物进行5次清洗，接着进行20μl的2xSDS样本缓冲液处理并加热。
并且，为了执行蛋白印迹法，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离从各细胞分离的蛋白质后，将其移动到膜结构的聚网膜(PolyScreenmembranes)(美国马萨诸塞州波士顿新英格兰核(New England Nuclear，Boston，MA，USA))，接着利用各种抗体(anti-PETN(美国加利福尼亚州贝佛利山细胞信号技术有限公司(Ce llSignaling，Beverly，CA，USA))、anti-p34(美国马萨诸塞州贝弗利恩佐生命科学公司(EnzoLifeSciences，Beverly，MA，USA))、anti-NEDD4-1及g-tubulin(圣克鲁斯生物科技，SantaCruz Biotechnolog y))，并通过现有公知的方法执行了实验。
在图1及图2中示出了实验结果。
如图1所示，确认在与NEDD4-1相互作用的各种蛋白质中存在p34(用红色箭头表示)。如图2所示，确认在3个细胞株中，p34在2个癌细胞株(DU145细胞及MCF7细胞)中表达。得知p34结合于细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4，cyclin-dependent kinase 4)及X连锁凋亡抑制蛋白。
(2)为了验证上述结果，本发明人在DU145细胞、MCF7细胞及LS1034细胞中，通过免疫共沉淀及蛋白印迹法来观察内因性p34和NEDD4-1的相互作用。并在图3及图4中示出了实验结果。
如图3及图4所示，确认在DU145细胞、MCF7细胞及LS1034细胞中存在p34-结合的NEDD4-1及NEDD4-1-结合的p34。
(3)为了在其他癌细胞株中确认上述实验结果，本发明人在各种结肠癌及乳腺癌细胞株(HT-29、HCT-116、LS174T、DLD1、CoLo201、LS1034、BT-20、MDA-MB-231、Hs578T等)中分析p34及NEDD4-1的表达。在图5中示出了分析结果。
如图5所示，在同时表达p34蛋白及NEDD4-1蛋白的LS1034细胞株和MDA-MB231细胞株中也观察到p34及NEDD4-1的相互作用。
1-2.分析外因性p34及NEDD4-1之间的相互作用
为了调查因外因性表达的p34和NEDD4-1之间的相互作用，将未通过内因性表达p34的293细胞转染到表达绿色荧光蛋白标记的p34和/或myc标记的NEDD4-1的构造物。之后，通过免疫印迹分析293细胞细胞的溶解物。在图6中示出了实验结果。
如图6所示，在上述293细胞细胞的myc标记的NEDD4-1免疫沉淀物中检测到绿色荧光蛋白标记的p34。因此，可确认外因性表达的p34和NEDD4-1之间也发生相互作用。
1-3.分析p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白之间的相互作用
为了观察p34和NEDD4-1、同源性磷酸酶-张力蛋白之间的相互作用，执行GST抑制分析。首先，准备500ng的从E.coli BL-21(DE3)株表达并纯化的GST-p34蛋白或GST蛋白(对照组)后，在反应缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，120mM NaCl)中混合其和缺失N EDD4-1的变异细胞株后，在30℃温度下培养1小时。接着，加入GS T抑制缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0，500mM NaCl，1％Triton X-100，0.02％BSA，5mM巯基乙醇)来停止反应。之后，在4℃温度下利用谷胱甘肽-琼脂糖抑制GST及有关蛋白1小时。用GST抑制缓冲液清洗6次蛋白复合体，并加入2xSDS样本缓冲液。分别通过利用抗-GST、抗-T7抗体的免疫印迹分析存在于免疫沉淀物内的P34及NEDD4-1。在图7及图8中示出了实验结果。
如图7所示，确认检测出在免疫沉淀物内结合p34的NEDD4-1蛋白。
并且，如图8所示，培养纯化的重组GST-同源性磷酸酶-张力蛋白和Myc-NEDD4-1来分析p34和同源性磷酸酶-张力蛋白的结合的结果，未检测出结合同源性磷酸酶-张力蛋白的p34蛋白，由此，确认与NED D4-1不同p34不结合于同源性磷酸酶-张力蛋白。
从而上述实验结果可知p34直接与NEDD4-1相互作用，但不与同源性磷酸酶-张力蛋白相互作用。
1-4.分析与p34相互作用的NEDD4-1范围
(1)通过实施例1-3，分析与p34相互作用的NEDD4-1蛋白的范围。为此，从表达NEDD4-1c脱氧核糖核酸的核外遗传基因，利用T7-tagged矢量，制备缺失T7-tagged野生型(wild-type)NEDD4-1和NE DD4-1的一部分范围的NEDD4-1变异体。纯化的GST-p34蛋白与表达T7-tagged野生型NEDD4-1或NEDD4-1变异体(缺失(N1)C2，WW s及HECT(homologous tothe E6-AP carboxyl terminus)范围、缺失(N2)WWs及HECT范围、缺失(N3)C2、WW3、WW4及HECT范围、缺失(N4)C2、WW1、WW2及HECT范围、缺失(N5)C2及WWs范围)的293细胞细胞的溶解液一同进行培养。之后，通过G ST抑制数组反洗结合p34的NEDD4-1的范围。在图9中示出了实验结果。
如图9所示，GST-p34在NEDD4-1-野生型及NEDD4-1-N3中被检测，其是指p34与包括NEDD4-1的WW1及WW2的范围相互作用。
根据上述实验结果，要确认有关直接结合于p34的范围是NEDD4-1的WW1或WW2范围中的一个。为此，制备了分别只具有WW1或WW2范围的NEDD4-1的2种变异体构造物(N6、N7)。将纯化的GS T-p34蛋白与表达上述NEDD4-1的变异体的细胞的溶解液一同培养后，执行GST抑制数组。在图9中示出了实验结果。
如图9所示，在NEDD4-1的WW1范围中明确检测出GST-p34，由此，确认p34直接结合于NEDD4-1的WW1范围。
(2)为了验证上述结果，制作了GST-tagged，并包括缺失WW1范围的野生型NEDD4-1的变异体(GST-delWW1)的核外遗传基因。将上述NEDD4-1的变异体蛋白与从表达His-p34的细胞分离的细胞溶解液一同培养后，执行GST抑制数组。在图10中示出了实验结果。
如图10所示，p34蛋白与野生型NEDD4-1蛋白相互作用，但是，与缺失WW1范围的NEDD4-1蛋白不相互作用。由此，确认p34直接结合于NEDD4-1的WW1范围。
1-5.分析p34对同源性磷酸酶-张力蛋白和NEDD4-1的结合的影响
为了调查p34对同源性磷酸酶-张力蛋白和NEDD4-1的结合的影响，将GST-同源性磷酸酶-张力蛋白融合蛋白与表达Myc-NEDD4-1及His-p34的细胞的溶解液一同培养后，执行GST抑制数组。利用GST蛋白作为对照组。在图11中示出了实验结果。
如图11所示，同源性磷酸酶-张力蛋白在存在/未存在p34的情况下与NEDD4-1相互作用，但是，存在p34时的相互作用强度大于未存在p34时。其暗示p34对NEDD4-1和PTE结合亲和性产生影响。
从上述结果，p34余NEDD4-1的WW1范围相互作用，但与同源性磷酸酶-张力蛋白未进行相互作用，并确认不妨碍NEDD4-1和同源性磷酸酶-张力蛋白的相互作用。并且，从上述结果，课确认通过p34的NEDD4-1蛋白的得到提高的稳定性对同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化产生影响。
1-6.分析p34对NEDD4-1的细胞内自泛素化的影响
(1)由于以前也报告NEDD4-1在细胞内自泛素化(auto-ubiquiti nation)，分析p34对NEDD4-1的自泛素化的影响。将293细胞细胞转染为NEDD4-1和/或p34后，上述细胞中处理MG132(25mM)并培养6小时。获取细胞培养物，并分析了其的抗-Myc免疫沉淀物。在表12中示出了实验结果。
如图12所示，用MG132处理的细胞中，NEDD4-1的自泛素化根据p34的存在显著减少。
(2)为了验证上述结果，在利用纯化的蛋白的细胞-消象差系统中分析了NEDD4-1的泛素化。首先，使用His-tagged矢量，从表达p34c脱氧核糖核酸的核外遗传基因制备His标记的p34。将纯化的GST-NEDD4-1蛋白与表达E1、UbcH5c及上述His标记的p34的293细胞细胞提取物一同培养后，测定自泛素化。在图13中示出了实验结果。
如图3所示，GST-NEDD4-1泛素化随p34的表达逐渐减少。由此，确认p34在完整的细胞及细胞-消象差系统中，均抑制NEDD4-1的自泛素化。
(3)分别利用表达p34的核外遗传基因转染24小时293细胞及MCF7细胞，用p34的脱氧核糖核酸转染48小时。按时间在上述细胞中处理CHX(cycloheximide，50mg/ml)，为了确认NEDD4-1蛋白，执行蛋白印迹法。在图14及图15中示出了实验结果。
如图14所示，在同时转染为绿色荧光蛋白标记的p34和myc标记的NEDD4-1的细胞中的NEDD4-1蛋白水平，比只用myc标记的NED D4-1处理的细胞中维持高的状态。
并且，图15所示，使用对于p34的脱氧核糖核酸来抑制p34抑制的细胞中的NEDD4-1蛋白水平与由混合脱氧核糖核酸处理的细胞，相当减少，由此，确认p34稳定化NEDD4-1蛋白。
这种结果暗示p34通过NEDD4-1的自泛素化来稳定化NEDD4-1蛋白。
实施例2.分析p34对调控通过NEDD4-1而介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化产生的影响
(1)使用p34的脱氧核糖核酸来分析因抑制表达p34的沉默效果(p34-脱氧核糖核酸：I：5’-GCAAGG GUCUGAAGCGGAA-3，II：5’-GGAAACGGGAGGAGGAGGA-3’，III：5’-CCGAAUUGGACUACC UCAU-3')。MDA-MB-231及MCF7细胞转染为p34-脱氧核糖核酸后，通过蛋白印迹法来分析各蛋白的表达水平。在图16中示出了实验结果。
如图16所示，确认p34-脱氧核糖核酸以浓度依赖的诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的表达增加及p-蛋白激酶B的表达减少。
并且，将293细胞及小鼠胚胎成纤维细胞细胞转染为绿色荧光蛋白标记的p34后，通过蛋白印迹法来分析各蛋白的表达水平。在图17中示出了实验结果。
如图17所示，绿色荧光蛋白标记的p34的表达在未表达内因性p34的293细胞或小鼠胚胎成纤维细胞细胞中减少同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平。并且，蛋白激酶B的磷酸化水平随p34表达水平增加，与同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平反比。
由此，确认通过p34与NEDD4-1结合，对同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平产生影响。
(2)根据上述实验结果，本发明人将MCF7细胞转染为p34-siR N后，用蛋白合成抑制剂亚胺环己酮进行处理，并根据时间测定以内因性表达的p34蛋白水平的变化，从而调控同源性磷酸酶-张力蛋白的展业员补充率，来调查p34的作用。在图18中示出了实验结果。
如图18所示，利用p34-脱氧核糖核酸抑制以内因性表达p34的M CF7细胞的p34的情况下，实际同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平没有变化，但是，在用对照组脱氧核糖核酸(混合脱氧核糖核酸)转染的细胞的情况下，同源性磷酸酶-张力蛋白的表达减少。这种结果是指p34减少同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白稳定性，良性调控PI3K信号通路。
(3)为了确认p34是否通过蛋白分解通路来调控同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的稳定性，将未以内因性表达p34的293细胞细胞转染为绿色荧光蛋白标记的p34，接着，处理蛋白酶体抑制剂的MG132。通过蛋白印迹法分析各蛋白的表达水平。在图19中示出了实验结果。
如图19所示，用外因性表达p34，并用MG132进行处理的细胞的同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平，与用对照组矢量转染的细胞相比，相当减少了。
(4)为了确认p34是否对同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化产生影响，执行泛素化分析(intracellular ubiquitination assay)。
首先，在293细胞或小鼠胚胎成纤维细胞细胞中转染绿色荧光蛋白-p34后，与MG132一同进行培养，并分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图20中示出了实验结果。
如图20所示，离巢性表达p34后，在处理MG132的293细胞细胞或小鼠胚胎成纤维细胞细胞中检测出多聚泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白。
并且，在MCF7、MDA-MB-231及DU145细胞细胞中转染p34-脱氧核糖核酸24小时后，与MG132一同进行培养，并分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图21中示出了实验结果。
如图21所示，在抑制p34的MCF7、MDA-MB231及DU145细胞细胞中逐渐减少同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。
并且，用野生型同源性磷酸酶-张力蛋白和/或p34转染293细胞细胞24小时后，测定同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性。更具体地，用包含50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、10％glycerol及蛋白酶抑制剂的1％Triton X-100缓冲液溶解上述细胞后，利用抗-同源性磷酸酶-张力蛋白抗体免疫沉淀同源性磷酸酶-张力蛋白。清洗上述免疫沉淀物后，与100mM Tris-HCl(pH8.0)的水溶性的diC8-phosphatidylinositol3，4，5-trisphosphate及10mM DTT一同在37℃温度下进行40分钟培养。之后，回收上层液，在常温下与Bio mol Green Reagent(Enzo Life Sciences)一同培养30分钟。同源性磷酸酶-张力蛋白的活性由通过测定650nm的OD值的方法来计算磷酸盐的排放。作为阴性对照组使用第123个氨基酸的半胱氨酸(Cystei n)变异为丝氨酸(Serine)的脂质磷酸分解酶-缺乏同源性磷酸酶-张力蛋白C124S细胞株。在图22中示出了实验结果。
如图22所示，同源性磷酸酶-张力蛋白的脂质磷酸分解酶活性在与对照组相比，离巢性表达p34的细胞中，明显减少。
这种结果意味着p34是指同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化及蛋白体性分解介质。
(5)最近，同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化及蛋白体性分解通过NEDD4-1调控一部分，并NEDD4-1作用为E3泛素连接酶(Wang et al.，2007)。在上述实施例1中，本发明人发现p34直接与NEDD4-1相互作用，从而调查NEDD4-1对同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化及蛋白体性分解产生的影响是否依存p34表达水平。
首先，表达内因性NEDD4-1，且p34将未表达的293细胞细胞或小鼠胚胎成纤维细胞细胞与绿色荧光蛋白标记的p34核外遗传基因(或绿色荧光蛋白对照组矢量)及NEDD4-1-脱氧核糖核酸/sh核糖核酸(或混合脱氧核糖核酸)共转染(NEDD4-1-脱氧核糖核酸：5’-TGGCGA TTTGTAAACCGAA-3’)。通过蛋白印迹法来分析各蛋白的表达水平。在图23中示出了实验结果。
如图23所示，在共转染NEDD4-1-脱氧核糖核酸/sh核糖核酸及绿色荧光蛋白标记的p34的细胞中，实际同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平基本没改变，但是，在只转染绿色荧光蛋白标记的p34的细胞中同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平明显减少。一贯，蛋白激酶B的磷酸化与同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平反比。
(6)在依存作为蛋白合成抑制剂的亚胺环己酮下，调查同源性磷酸酶-张力蛋白的展业员补充率是否受p34的离巢性表达及NEDD4-1抑制的影响。为此，将293细胞细胞转染为p34表达核外遗传基因及N EDD4-1脱氧核糖核酸后，分析同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的半衰减期。在图24中示出了实验结果。
如图24所示，同源性磷酸酶-张力蛋白的水平在NEDD4-1-抑制293细胞细胞中因外因性p34的表达而减少，处理CHX后，逐渐增加，由此，确认p34以NEDD4-1依赖的介质同源性磷酸酶-张力蛋白的蛋白体性分解。
(7)为了确认p34是否在NEDD4-1中依赖的介质同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化，用p34表达核外遗传基因转染野生型(293细胞细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)及NEDD4-1抑制细胞后，处理MG132，并执行Intact-cell ubiquitination assay，在图25中示出了实验结果。
如图25所示，多聚泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白明显在用p34表达核外遗传基因转染的野生型细胞中检测，但未在用p34表达核外遗传基因转染的NEDD4-1抑制细胞中检测。
并且，分析上述293细胞细胞的同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性。在图26中示出了实验结果。
如图26所示，当抑制将p34表达为离巢性额293细胞细胞的NE DD4-1时，维持同源性磷酸酶-张力蛋白的脂质磷酸分解酶活性，在用杂乱脱氧核糖核酸处理上述细胞的情况下，没有这种活性。
这种结果表示NEDD4-1在p34中依赖的诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。
(8)最近，报告X连锁凋亡抑制蛋白诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化(Van Themsche et al.，2009)。为了评价p34是否对通过X连锁凋亡抑制蛋白诱导的同源性磷酸酶-张力蛋白多聚泛素化产生影响，在X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞中执行多聚泛素化实验。从Dr.Duckett(University of Michigan Medical Sc hool)提供X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞。在图27至图29中示出了实验结果。
如图27所示，通过蛋白印迹法确认，在X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞中无X连锁凋亡抑制蛋白的表达。
并且，如图28所示，确认在将X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞转染为绿色荧光蛋白标记的p34的情况下，同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平明显下降。
并且，如图29所示，确认用绿色荧光蛋白标记的p34转染的X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞中同源性磷酸酶-张力蛋白强烈多聚泛素化。
从上述结果确认，p34在X连锁凋亡抑制蛋白中独立的通过NED D4-1调控同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。
实施例3.分析通过p34的调控NEDD4-1的同源性磷酸酶-张力蛋白的单多聚泛素化及多聚泛素化
(1)最近，NEDD4-1不仅介质同源性磷酸酶-张力蛋白的试管内及细胞内的多聚泛素化，而且介质单泛素化，同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化介质通过同源性磷酸酶-张力蛋白的核膜孔的核移动(nucle ar import)(Wang et al.，2007)，如上述实施例2表示，确认p34通过NEDD4-1调控同源性磷酸酶-张力蛋白多聚泛素化。根据上述结果，本发明人分析p34对同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化产生的影响。
首先，通过内因性将表达p34及NEDD4-1的4个癌细胞株(MC F7，MDA-MB231，DU145细胞及LS1034)转染为p34-脱氧核糖核酸，通过Intact-cell ubiquitination assay来调控同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化状态。在图30中示出了实验结果。
如图30所示，p34的抑制在所有癌细胞株中增加同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化。
并且，用p34-脱氧核糖核酸转染24小时MCF7细胞后，区划核和胞液。利用蛋白印迹法分析同源性磷酸酶-张力蛋白的表达。在图31中示出了实验结果。
如图31所示，同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白在p34-抑制MCF7细胞的核分解物中强烈检测，但是在用杂乱脱氧核糖核酸处理的细胞中，基本不出现同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位。而且，单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白只在p34-抑制MCF7细胞的核分解物中检测。其是指p34的表达对同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化及核定位产生影响。
(2)为了调查NEDD4-1根据p34的表达，是否对同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化产生影响，用NEDD4-1-脱氧核糖核酸、p34-脱氧核糖核酸、和/或绿色荧光蛋白tagged p34转染24小时MCF7细胞后，分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图32中示出了实验结果。
如图32所示，在p34-抑制细胞中观察单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白，但未在用NEDD4-1-脱氧核糖核酸及p34-脱氧核糖核酸共转染的细胞中观察到。
(3)为了验证其，本发明人在存在E1及E2酶的条件下，将纯化的GST-同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白与从表达Flag标记的NEDD4-1的293细胞细胞中分离的蛋白提取物和/或His标记的p34一同进行培养。之后，执行GST-同源性磷酸酶-张力蛋白的Cell-freeubiquitination ass ay。在图33及图34中示出了实验结果。
如图33所示，同源性磷酸酶-张力蛋白在只存在NEDD4-1的情况下，单泛素化，但是，均存在NEDD4-1及p34的情况下强烈多聚泛素化。
并且，如图34所示，同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化因p34依赖渐渐减少，其是指通过NEDD4-1介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的单聚泛素化及多聚泛素化依赖于p34的表达。
(4)为了调查p34在NEDD4-1-介质同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化过程中是否执行E2-类似酶作用。在存在或不存在E1及E2的条件下，将GST-同源性磷酸酶-张力蛋白与p34及NEDD4-1一同进行培养后，通过Cell-free ubiquitination assay来分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图35中示出了实验结果。
如图35所示，纯化的GST-同源性磷酸酶-张力蛋白在表达Flag标记的NEDD4-1及His标记的p34的293细胞细胞的提取物中，存在E2酶的条件下泛素化，但在无E2酶的情况系未泛素化。由此，确认p34不执行E2-类似酶的作用。因此，从上述结果可知，p34调控由NEDD4-1介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的单聚泛素化及多聚泛素化。
实施例4.分析p34和癌细胞增殖关系
通过上述实施例1至实施例3的实验，p34抑制NEDD4-1的自泛素化，从而确认良性调控NEDD4-1蛋白的稳定性，p34的抑制减少同源性磷酸酶-张力蛋白多聚泛素化，并通过NEDD4-1介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化增加同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平。
(1)为了确认p34是否在NEDD4-1/同源性磷酸酶-张力蛋白通路中执行强烈的原肿瘤基因的作用，记性表达p34-脱氧核糖核酸的MCF7及LS1034细胞的增殖检查，从而执行集落形成数组(Colony-formin g assay)及软琼脂数组。
为了执行集落性数组，每一个6孔板，以300个的浓度插入细胞后，测定克隆能力。克隆后，经过10至14天后，固定细胞并0.01％结晶紫溶液染色。
由以下方法执行软琼脂数组。利用包含10％FBS的2X DMEM或X RPMI-1640培养基制备1.6％琼脂糖后，在6孔板中添加其来准备软琼脂板。其中插入包含0.7％琼脂糖及10％FBS的2X DMEM或赋予于2X RPMI-1640培养基的细胞(1×104)。将其在37℃温度的培养箱中培养2～3周后，用显微镜计算集落。
在图36至图38中示出实验结果。
如图36所示，表达p34-脱氧核糖核酸的MCF7及LS1034细胞的生长与表达杂乱脱氧核糖核酸的细胞显著减少。
并且，如图37及图38所示，用p34-脱氧核糖核酸处理的细胞的集落形成频率与对照组相比显著减少(图37)、集落的大小也减少(图38)。
(2)通过RT-qPCR分析确认作为同源性磷酸酶-张力蛋白的目标基因的周期素E2和cdc6基因的表达水平，将细胞转染为p34-脱氧核糖核酸或杂乱脱氧核糖核酸后，利用TRIzol(Invitrogen)从上述细胞中分离总核糖核酸，利用RT预混(Bioneer，Daejeon，Korea)及益生元dT16-18引物来制备互补脱氧核糖核酸(c脱氧核糖核酸)链，之后，利用下列表1的引物集，对p34、cdc6、周期素E2基因执行RT-qPCR。在表39中示出了实验结果。
表1
如图29所示，在p34-抑制细胞中作为同源性磷酸酶-张力蛋白的目标基因的周期素E2及cdc6基因的表达水平减少。由此，确认p34的抑制降低周期素E2及cdc6基因，从而抑制癌细胞的生长。
(3)为了调查p34抑制对癌细胞增殖的效果，本发明人确立稳定的表达环周期素-诱导性p34-sh核糖核酸矢量的DU145细胞及MDA-MB231细胞株的细胞株。首先，将作为TetR-表达核外遗传基因的pc脱氧核糖核酸6.0/TR(Invitrogen)转染到DU145细胞及MDA-MB231细胞后，用杀稻瘟菌素(blasticidin 10μg/ml)选择3周。表达TetR的克隆细胞利用抗-TetR抗体通过免疫印迹分析来确认。表达2个Tet R的克隆，为了进行第二次选择，用H1-p34-sh核糖核酸矢量(5’-C CCTCTTTGACCTCTCAGT-3’)从新转染后，用博莱霉素(zeocin 300μg/ml)选择3周来确立四环周期素-诱导性(Tet-on inducible)p34细胞株。将其露出在四环周期素后，选择表达TetR的DU145细胞或M DA-MB231细胞株的克隆。在上述细胞株中处理四环周期素后，利用蛋白印迹法分析各蛋白的表达。并且，执行上述细胞株的同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性及集落行车数组。在图40至图43中示出了实验结果。
如图40所示，在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中确认TetR的表达，如图41所示，在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中处理四环周期素(Tet；1mg/ml)的情况下，确认抑制p34的表达，增加同源性磷酸酶-张力蛋白表达。磷酸化蛋白激酶B与同源性磷酸酶-张力蛋白水平反比。
并且，如图42所示，确认在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中，因用四环周期素进行处理，从而同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性增加。
并且，如图43所示，确认在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中，因用四环周期素处理，从而显著减少集落形成。
追加性地，观察上述DU145细胞或MDA-MB231细胞株的细胞生长及执行BrdU数组。在图44及图45中示出了实验结果。
如图44所示，用四环周期素处理的细胞与未使用周期素处理的细胞相比，生长显著减少。
并且，如图45所示，用四环周期素进行处理的细胞的BrdU的混性显著减少。
(4)为了制备p34稳定的过表达的细胞，未检测出p34的Hs578T细胞转染为作为逆转录聚合酶链式反应病毒载体矢量的pBabe-puro(对照组)或pBabe-puro-p34，接着，用嘌呤霉素(puromycin 2ug/ml)选择2周。通过利用抗-p34抗体的蛋白印迹法来确认p34的表达。为了分析通过上述方法制备的细胞地蛋白，执行蛋白印迹法，并观察集落形成。在图46中示出了实验结果。
如图46所示，与表达对照组矢量的细胞相比稳定表达p34的Hs578T细胞中同源性磷酸酶-张力蛋白的表达减少，集落形成显著上升。
从这种结果确认p34通过同源性磷酸酶-张力蛋白抑制癌细胞增殖。
实施例5.p34的肿瘤自发性(tumorigenicity)强化
(1)为了确认p34的表达是否对NEDD4-1的原肿瘤性产生影响，可通过在上述实施例4-(3)中确立的四环周期素来诱导，利用稳定的表达p34sh核糖核酸，从而枯耗p34的表达的DU145细胞细胞株及MDA-MB-231细胞株来执行以下实验。将确立的各细胞皮下注入于Balb/c裸鼠中，形成异种移植物(xenograft)肿瘤。在2周内，每3天观察一次肿瘤的大小，当肿瘤的大小达到180mm3时，作为0天，以10mg/kg的浓度注射四环周期素(对照组用vehicle进行水注射)，继续观察肿瘤的大小。所有动物实验牙山医疗中心附属动物管理及与利用有关的委员会认可的协议记性。在图47至图52中示出了实验结果。
如图47及图48所示，注入转染p34-sh核糖核酸的DU145细胞细胞株或转染p34-sh核糖核酸的MDA-MB-231细胞株，在注射四环周期素的组中同源性磷酸酶-张力蛋白的表达增加，NEDD4-1的表达减少。
并且，如图49及图50所示，通过注入转染p34-sh核糖核酸的DU145细胞细胞株或转染p34-sh核糖核酸的MDA-MB-231细胞株来诱导的肿瘤的生长与注射四环周期素的对照组相比显著减少。
并且，如图51及图52所示，分析各小鼠肿瘤组织的免疫组织化学的结果，确认同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白在注射四环周期素注射后，表示强的核定位。、
由这种结果确认p34强化NEDD4-1的原肿瘤活性
(2)为了验证p34对NEDD4-1的原肿瘤性或活性产生的影响，本发明人使用未表达内因性p34的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞(p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞)细胞(Millipore，Billerica，MA，USA)。NEDD4-1单独不具有原肿瘤性，但增进NEDD4-1的过表达通过Ras介质的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞的变形(Wang et al.，2007)。给予上述研究结果，本发明人最初调查p34的表达对通过Ras介质的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞的变形产生的影响。执行p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞的蛋白表达及集落形成分析。在图53及图54中示出了实验结果。
如图53所示，在p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞中分析蛋白表达的结果，p34的表达引发同源性磷酸酶-张力蛋白表达的减少及NEDD4-1表达的增加。
并且，如图54所示，在p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞中执行集落形成分析的结果，p34的表达与表达Ras的p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞相比，细胞集落数增加。
(3)在利用基于逆转录聚合酶链式反应酶病毒的sh核糖核酸矢量制备的NEDD4-1抑制-p53-null(p53-/-)小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，观察p34的原肿瘤性活性。分析NEDD4-1抑制-p53-null(p53-/-)小鼠胚胎成纤维细胞细胞的蛋白表达、集落形成及泛素化。在图55及图57中示出了实验结果。
如图55所示，在NEDD4-1抑制-p53-/-小鼠胚胎成纤维细胞细胞中p34的表达部引发同源性磷酸酶-张力蛋白的减少。
并且，如图56所示，集落形成数组结果，确认在NEDD4-1抑制-p53-/-小鼠胚胎成纤维细胞细胞中即使进行p34的表达也不可抑制细胞形成。
并且，如图57所示，泛素化数组结果，p34的表达在表达对照组sh核糖核酸的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞中诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化，但在表达NEDD4-1sh核糖核酸的NEDD4-1抑制-p53-/-小鼠胚胎成纤维细胞细胞中不引发同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。其是指p34依赖的在NEDD4-1中提高通过Ras介质的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞的变形
(4)为了确认对p34的NEDD4-1的原肿瘤性活性产生影响的效果是否依赖同源性磷酸酶-张力蛋白，利用表达同源性磷酸酶-张力蛋白sh核糖核酸的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞执行蛋白印迹法及集落形成分析。在图58中示出了实验结果。
如图58所示，在上述小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，p34的表达无法提高Ras的变形活性。这是指p34依赖同源性磷酸酶-张力蛋白来提高NEDD4-1的原肿瘤性活性。
(5)在人类的癌组织中，调差p34、NEDD4-1、和/或同源性磷酸酶-张力蛋白的临床相关性。作为良性调控通过NEDD4-1的同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化，当考虑p34的功能时，在人类的癌组织中p34的表达有可能对因NEDD4-1而诱导的同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平的减少产生影响。为了验证其，本发明人通过将135个分离的乳腺癌及19个的结肠癌的石蜡加填充剂样本组织微阵列(TMA，Tissue microarrays)来评价p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达。
在135个的乳腺癌样本中，90个(66.7％)为p34-阳性，45个(33.3％)为p34-阴性。并且，在90个p34阳性样本中的85个(94.45)样本中检测到NEDD4-1的表达，大多数(58/85；68.2％)的NEDD4-1/p34阳性样本表达同源性磷酸酶-张力蛋白。NEDD4-1在p34阴性样本(45/45；100％)中也表现出高表达。但是，在p34阳性样本中，只在一小部分(21/45；46.67％)表达同源性磷酸酶-张力蛋白。
并且，在191个的结肠癌组织中，177个(61.3％)的样本中p34个检测为阳性，在74个(38.7％)的样本中，p34表现出阴性。并且，同源性磷酸酶-张力蛋白的表达在127个的NEDD4-1/p34两种阳性(double-positive)样本中，只在少数部分(11.8％)中被检测到。相反，在未表达p34的149个的NEDD4-1阳性样本中，只在8个的样本中表达同源性磷酸酶-张力蛋白。
如图59及图60所示，在乳腺癌及结肠癌样本中，p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平之间明显存在反比例关心，但是，在结肠癌样本中，p34阴性、NEDD4-1阳性对同源性磷酸酶-张力蛋白水平未产生影响。
因此，从上所述结果可推论人类的乳腺癌及结肠癌中的p34的表达，对NEDD4-1的原肿瘤性活性依赖于同源性磷酸酶-张力蛋白。
图61以图样化的方式示出p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白之间的综合的相互作用。
实施例6.p34活性抑制剂的抗癌活性验证
如通过上述实施例1至实施例5确认，执行用于验证p34活性抑制剂是否实具有实际抗癌活性的实验。首先，筛选上市销售的化合物数据库结合于p34蛋白，并识别抑制p34的活性的化合物。如以下化学式1表示所识别的化合物，命名为化合物27(Compound 27)。
6-1.验证p34活性抑制剂对同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化产生的影响
在人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-231和大肠癌细胞株的LS1034中以1uM的浓度处理24小时p34活性抑制剂的化合物27后，利用同源性磷酸酶-张力蛋白抗体执行了免疫共沉淀。之后，用泛激素抗体执行蛋白印迹法。在图62中示出实验结果。
如图62所示，确认在人类乳腺癌及大肠癌细胞中作为p34活性抑制剂的化合物27抑制同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化活性。
6-2.验证p34活性抑制剂对p34和NEDD4-1蛋白的结合产生的影响
以1mM或3mM的浓度对纯化的NEDD4-1蛋白、p34蛋白进行反应缓冲液(20mM Tirs-HCl pH7.5，120mM NaCl)处理及作为p34活性抑制剂的化合物27处理，并在30℃的温度下进行1小时反应。之后，使用GST-pull down缓冲液(20mM Tirs-HCl pH8.0，500mM NaCl，1％Triton X-100，0.02％BSA，5mM巯基乙醇)停止反应后，在4℃的温度下用谷胱甘肽-琼脂糖进行下拉，利用抗-His、抗-GST抗体来执行蛋白印迹法。在图63中示出实验结果。
如图63所示，确认通过进行作为p34活性抑制剂的化合物27的处理，以依赖浓度的方式抑制p34蛋白和NEDD4-1蛋白的结合。
6-3.验证基于诱导作为p34活性抑制剂的同源性磷酸酶-张力蛋白重新活性化的抗癌效果
并且，在人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-231中按浓度处理作为p34活性抑制剂的化合物27，48小时后，执行台盼蓝染色及蛋白印迹法，在图64中示出实验结果。
如图64所示，确认在乳腺癌细胞中作为p34活性抑制剂的化合物27以依赖浓度的方式诱导细胞死亡，同源性磷酸酶-张力蛋白重新被活性化，由此，出现蛋白激酶B的脱磷酸化，caspase3被活性化。由此，通过p34活性抑制剂的处理，抑制了p34-NEDD4-1的蛋白质结合，从而使同源性磷酸酶-张力蛋白重新活性化，进而诱导细胞死亡。
并且，在人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-231中按浓度进行48小时的作为p34活性抑制剂的化合物27处理后，回收细胞液来用同源性磷酸酶-张力蛋白抗体实施免疫沉淀。之后，与包含water-soluble diC8-phosphatidylinositol3，4，5tri-phosphate的反应缓冲液(100mM Tris-HClpH8.0，10mM DTT)在37℃的温度下反应40分钟后，只回收上层液，并在常温下与Biomol Green溶液一同进行30分钟的反应，并在OD 650nm中测定同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性。在图65中示出实验结果。
如图65所示，确认在乳腺癌细胞中，通过作为p34活性抑制剂的化合物27的处理，使同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶的活性增加。
利用人类大肠癌细胞株的LS1034执行与上述的实验相同的实验。在表66及67中示出实验结果。
如图66所示，确认在大肠癌细胞中作为依赖p34活性抑制剂的化合物27的浓度诱导细胞死忙，同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白再活性，由此，出现蛋白激酶B的脱磷酸化，caspase3被活性化。
并且，如图67所示，确认在大肠癌细胞中通过作为p34活性抑制剂的化合物27的处理，同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性增加。
以下，说明本发明的药学组合物的制剂例，但这并不不限制本发明，仅用于于具体说明本发明。
制剂例1.药学制剂的制备
1.散剂的制备
p34表达或活性抑制剂2g
乳糖1g
混合上述成分，填充到气密布来制备散剂。
1-2.片剂的制备
p34的表达或活性抑制剂100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
混合上述成分后，根据通常的片剂的制备方法，打锭而制备片剂。
1-3.胶囊剂的制备
p34表达或活性抑制剂100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
混合上述成分后，根据通常的胶囊剂的制备方法，填充明胶胶囊来制备胶囊剂。
Claims (4)
1.一种用于预防或治疗乳腺癌或大肠癌的组合物，其包含由以下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
式1：
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗乳腺癌或大肠癌的组合物，其中所述乳腺癌或大肠癌为同时表达p34及NEDD4-1的癌。
3.一种用于抑制乳腺癌或大肠癌转移的药学组合物，其包含由以下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
式1：
4.由以下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗乳腺癌或大肠癌或抑制乳腺癌或大肠癌转移的药物中的用途，
式1：
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