CN112322730A - 预测肿瘤耐药、复发的标志物kifc1及其抑制剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗和耐药检测领域，公开了用于预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或肿瘤治疗的标志物KIFC1，本发明还公开了所述KIFC1第26位丝氨酸磷酸化作为预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或肿瘤治疗的分子靶点。本发明还公开了KIFC1特异性抗体，所述抗体能够作为预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期的检测指标。本发明还公开了KIFC1磷酸化抑制剂，所述抑制剂能够用于抑制KIFC1蛋白表达量，抑制KIFC1磷酸化及其功能，抑制KIFC1作为关键因子诱发的中心体凝集，能够作为抗肿瘤药物、降低肿瘤耐药和/或复发的药物。本发明旨在制定相应策略达到减少放化疗过程中肿瘤耐药和复发概率，降低肿瘤细胞存活率。本发明在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

预测肿瘤耐药、复发的标志物KIFC1及其抑制剂和应用
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和耐药检测领域，涉及用于预测肿瘤耐药、复发、治疗的标志物KIFC1及其磷酸化抑制剂，具体涉及一种辅助肿瘤放化疗过程中，减少肿瘤耐药和复发的方法，作为肿瘤耐药、复发检测的标志物KIFC1，以及 KIFC1-Ser26磷酸化的检测及其应用。
背景技术
近年来，肿瘤的发病率逐年提高。在临床治疗方面，肿瘤治疗依旧困难重重。目前放射治疗和化学药物治疗仍是肿瘤治疗的主要的、不可或缺的手段。肿瘤治疗中，最常用的手段之一为DNA损伤类放化疗方式，包括：X-射线和依托泊苷、依托泊苷、顺铂、奥沙利铂、丝裂霉素C、雌氮芥、阿霉素、吉西他滨、博来霉素和环磷酰胺等化疗药物。尽管放射治疗和化学药物治疗在最近几年里都有了很大的进展，但治疗过程中，常出现肿瘤耐药、耐射线甚至复发，肿瘤耐药、耐射线和复发等问题已经成为不可忽略的问题。肿瘤对治疗手段产生耐药性或复发与一类细胞密切相关，这类细胞呈现基因组不稳定的特性，相对于其他细胞更易获得致癌、恶化的基因突变或性状，更易成为肿瘤复发的“种子”。积极开展肿瘤耐药和复发的机制研究，阐明其生物学规律，提供药物靶标，探求有效预防与治疗肿瘤的方法与手段，将有助于提高人类健康水平。
大量研究发现，肿瘤细胞的基本特征之一是基因组的不稳定性：细胞获得高于正常情况下积累的稳定性的任何突变状态均称为基因组不稳定性。基因组不稳定的细胞更易积累基因重复、错配和丢失，从而使细胞生长失去平衡，最终导致肿瘤的发生，甚至恶化、转移[1-4]。放化疗过程中，这一类基因组不稳定的细胞是肿瘤耐药和复发的关键因素。因此，放化疗过程中杀死这一类肿瘤细胞是非常关键的步骤。
基因组不稳定性发生的主要机制是有丝分裂错误。相对于正常体细胞，肿瘤细胞拥有更高频率的有丝分裂，因而更易发生有丝分裂错误并进一步导致基因组不稳定性。中心体是动物细胞中一种重要的细胞器，它在细胞有丝分裂时负责指导形成两极化的纺锤体将染色体平均分配到两个子细胞中。有丝分裂错误关键原因之一即为中心体复制异常。而各类肿瘤中普遍存在中心体过度复制的现象[5]。拥有多余中心体的细胞会通过中心体凝集/中心体聚集(centrosome clustering)机制维持细胞存活，但活下来的细胞常伴随着基因组不稳定性的发生。而没有发生中心体凝集的细胞诱发细胞纺锤体多极化，并最终引起细胞死亡。因此，通过抑制中心体凝集从而诱发基因组不稳定的肿瘤细胞死亡，是减少肿瘤耐药和复发的有效方式，这也是目前亟待解决的问题。
发明内容
为克服现有技术存在的缺陷，本发明首次在研究肿瘤的放化疗过程中发现， DNA损伤类放化疗方式会导致肿瘤基因组不稳定，从而增加肿瘤恶化、复发的几率。而KIFC1驱动的中心体凝集是肿瘤基因组不稳定性发生的主要原因之一，因此如何抑制KIFC1蛋白量是降低肿瘤基因组不稳定性和肿瘤复发率的重要议题。
本发明深入研究了该类细胞存活的机制，发现DNA损伤类放化疗方式会导致KIFC1蛋白量增加，而ATM/ATR的相关抑制剂(VE-822等)则能阻止KIFC1 蛋白量的上升(图2B)。本发明通过进一步筛选，确定ATM/ATR的相关抑制剂是通过抑制KIFC1-S26位磷酸化，达到调控KIFC1蛋白量的目的(即，抑制 KIFC1-S26磷酸化会抑制KIFC1的多余中心体凝集)。本发明通过进一步发现， ATM/ATR的相关抑制剂(VE-822等)能够减少肿瘤耐药和复发率，延长肿瘤患者生存期。本发明旨在放化疗过程中，研究相关机制并制定相应策略达到减少肿瘤耐药和复发概率的目的。同时制备驱动蛋白KIFC1的第26位点特异性抗体，作为肿瘤耐药和复发的检测指标。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现：
目前肿瘤复发仍然是癌症治疗的关键难题。相关预示肿瘤复发的标志物也鲜有发现，本发明发现驱动蛋白KIFC1(HEST,Gene ID:3833)是肿瘤复发的重要标志物。
驱动蛋白超家族(Kinesin)有超过45个成员，在细胞内负责沿着微管，向其正极运送不同的分子货物(蛋白质、细胞器、RNA等)，对维持细胞的基本功能起到极其重要的作用[6,7]。驱动蛋白广泛地参与多种肿瘤的发生、发展，其表达水平的变化和很多肿瘤的发生、发展直接相关[8]。
其中，所述KIFC1(HEST)是细胞中非必须的驱动蛋白，直接负责多余中心体的凝集。在中心体过度复制的肿瘤细胞中，KIFC1是维持中心体凝集 (Centrosome Clustering)促进细胞生存的基本和核心因子[9]。KIFC1的缺失会导致几乎所有带有多余中心体的细胞走向死亡，而对于拥有正常两个中心体的细胞则几乎没有影响。人类的KIFC1全称为kinesin family member C1，又名HEST 或KNSL2，NCBI中基因的ID为3833。
本发明提供了一种用于预测肿瘤耐药性和/或复发率和/或生存期和/或肿瘤治疗的标志物KIFC1。
本发明还提供了KIFC1在作为预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或进行预后评价的标志物，和/或作为肿瘤治疗的分子靶点中的应用。
本发明还提供了KIFC1的检测试剂在预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或进行预后评价和/或肿瘤治疗中的应用。
本发明还提供了KIFC1作为生物标志物的应用，所述应用以KIFC1作为靶点制备预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期的诊断试剂，和/或制备肿瘤预后评价试剂，和/或制备用于肿瘤治疗或降低肿瘤耐药或延长生存期的药物。
本发明中，所述标志物为KIFC1或其编码基因；进一步地，所述标志物为第26位丝氨酸磷酸化的KIFC1。基于此，本发明还提供了KIFC1第26位丝氨酸磷酸化在作为预测肿瘤耐药性和/或复发率和/或生存期和/或进行预后评价的标志物，和/或作为肿瘤治疗的分子靶点中的应用。
本发明还提供了一种用于检测肿瘤耐药性和/或复发率和/或生存期的标志物，包括KIFC1蛋白的抗体和/或KIFC1第26位丝氨酸磷酸化的抗体。
本发明还提供了KIFC1蛋白的抗体和/或KIFC1第26位丝氨酸磷酸化的抗体在作为预测肿瘤耐药和/或复发和/或生存时间的检测指标中的应用。
本发明中，从患者获得的样本中确定KIFC1的水平，其中该水平与患者的生存时间相关。
本发明中，所述KIFC1蛋白具体特征为：
(a)：氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的蛋白质；
(b)：将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(c)：与(a)-(b)任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、 90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(d)：在(a)-(c)中任一限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
本发明中，所述肿瘤包括乳腺癌和结肠癌等。优选地，所述乳腺癌细胞为 MDA-MB-231细胞；所述结肠癌为HCT116细胞。
本发明还提供了KIFC1抑制剂，所述KIFC1抑制剂为ATM/ATR相关抑制剂，包括ATM/ATR蛋白酶的所有抑制剂、相关ATM抑制剂、ATR抑制剂之任意的一种或几种的组合。优选地，所述KIFC1抑制剂为KIFC1磷酸化抑制剂；进一步地，为KIFC1第26位丝氨酸磷酸化的抑制剂。进一步优选地，所述KIFC1 抑制剂为VE-822。
本发明还提供了所述KIFC1抑制剂在制备抗肿瘤药物、降低肿瘤耐药和/或复发和/或延长生存时间的药物中的应用。
本发明中，所述KIFC1磷酸化抑制剂在放化疗过程中用于抑制KIFC1蛋白表达量，抑制KIFC1磷酸化及其功能，抑制KIFC1作为关键因子诱发的中心体凝集。
本发明还提供了一种预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或进行预后评价的方法，所述方法包括：确定从所述患者获得的样品中KIFC1的水平，其中通过所述水平，对所述患者是否具有肿瘤耐药进行诊断，或对所述患者的生存期(生存时间)进行预测，或对所述患者进行预后评估。
具体地，所述方法包括：i)确定从所述受试者获得的样品中KIFC1的水平； ii)将在步骤i)中确定的所述水平与预定参考值进行比较；iii)当KIFC1蛋白量为高水平时(即，免疫组化实验中KIFC1染色程度打分超过8分)，肿瘤复发率超过50％，病人生存期显著减少；当KIFC1蛋白量处于低水平时(即，免疫组化实验中KIFC1染色程度打分低于5分)，肿瘤复发率低于20％。
本发明还提出了一种对患者进行肿瘤治疗的方法，所述方法包括：以所述 KIFC1作为靶点，对所述患者进行治疗。
本发明中，所述预测或预后评估包括以下步骤：i)确定从所述患者获得的样品中KIFC1的水平；ii)将在步骤i)中确定的所述水平与预定参考值进行比较；iii)当步骤i)中确定的所述水平高于所述预定参考值时，所述患者预后不良，或当步骤i)中确定的所述水平低于所述预定参考值时，所述患者预后良好。
所述治疗包括以下步骤：通过靶向生物标志物KIFC1来治疗有需要的患者的肿瘤，包括：向所述患者施用药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体，有效量的肿瘤特异性生物标志物的调节剂，以及任选的其他的治疗剂，从而治疗肿瘤。
本发明所述应用或方法中，所述调节剂包括选自抗体，以及所述抗体的生物活性片段或同源物，小分子化学剂，反义寡核苷酸，小干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)等。
本发明所述应用或方法中，是以KIFC1作为免疫原免疫动物制备抗体；和/ 或，以KIFC1为靶点制备免疫细胞、蛋白和/或小分子等。
本发明所述应用或方法中，测定KIFC1的样本是获自所述患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常组织或血液等。其包含任何储藏方式的样本。
本发明所述应用或方法中，所述KIFC1的水平是在蛋白质水平上确定的；或，所述KIFC1的水平是在核酸水平上确定的。
本发明所述应用或方法中，当所述KIFC1的水平在蛋白质水平上确定时，所述KIFC1的水平通过免疫组织化学确定；当所述KIFC1的水平在核酸水平上确定时，所述KIFC1的水平通过对编码所述KIFC1的mRNA进行定量确定，包括ELISA、实时荧光定量PCR等检测方法。
本发明所述应用或方法包括确定所述样品中KIFC1+ILC的水平。
本发明所述应用或方法中，一组结合伴侣用于确定从所述患者获得的样品中KIFC1+ILC细胞的水平，所述结合伴侣对以下细胞表面标志物具有特异性： KIFC1和KIFC1第26位丝氨酸磷酸化(KIFC1-S26位磷酸化)。
其中，所述KIFC1+ILC细胞的水平通过流式细胞术方法确定；
其中，所述KIFC1+ILC细胞的水平通过单细胞RNA测序确定。
本发明所述应用或方法中，所述KIFC1的磷酸化水平越高，所述患者拥有长的生存时间的概率越低。进一步地，所述KIFC1第26位的磷酸化水平越高，所述患者拥有长的生存时间的概率越低。
本发明的方法特别适用于预测癌症患者的整体生存期、无进展生存和/或无病生存。
本发明中，“生存时间长”表示患者的存活时间将高于在一般肿瘤患者中观察到的中位数/均值。当患者的生存时间很长时，意味着患者将有一个“良好的预后”。相反，“生存时间短”表示患者的生存时间将低于在一般肿瘤患者中观察到的中位数/均值。当患者生存时间很短时，意味着将有一个“差的预后”。
本发明中，所检测的KIFC1水平包括使用任何手段检测(可以选择性结合 KIFC1的试剂)得到的KIFC1的核酸及蛋白质水平。
本发明还提供了KIFC1特异性抗体，所述KIFC1特异性抗体为KIFC1的第 26位磷酸化抗体，所述抗体不能识别第26位丝氨酸突变后的KIFC1。
本发明中，所述抗体包括KIFC1总蛋白的抗体、KIFC1特定位点的磷酸化抗体。
KIFC1(HPA055997,Sigma-Aldrich)、anti-γH2AX(ab26350；Abcam)、Flag(F3165；Sigma-Aldrich)和β-actin(A5316；Sigma-Aldrich)，这些抗体为市场上能购买的现有抗体，根据相关编号可清楚查明其具体信息。这些抗体是本发明发现过程中使用的实验材料。
本发明还提供了KIFC1特异性抗体的制备方法，所述方法包括：针对KIFC1 第26位丝氨酸的磷酸化位点设计特异的磷酸化抗原：IKAPS(P)QLPLSGS，并用其制备特异的磷酸化抗体p-KIFC1-S26，验证该抗体的特异性，并进一步验证化疗药物处理下，细胞中p-KIFC1-S26磷酸化的变化。
本发明还提供了所述特异性抗体在作为预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或进行预后评价的检测指标中的应用。
本发明最终通过所述抗体确定KIFC1第26位点的磷酸化在DNA损伤时显著上升，这种上升可以被ATM/ATR的相关抑制剂所抑制。
本发明中，所述ATM/ATR相关抑制剂是指VE-822、CGK33、AZD1390、 AZD6738。所述ATM/ATR相关抑制剂包括ATM/ATR蛋白酶的所有抑制剂、相关ATM抑制剂、ATR抑制剂之任意的一种或几种的组合。优选地，所述ATM/ATR 相关抑制剂为VE-822。
VE-822作为ATM和ATR典型抑制剂，具有高特异性、高水溶性的特点，是很好的临床肿瘤治疗的候选药物，但现有技术完全没有记载任何关于其在降低肿瘤耐药和复发方面的功能[10-12]。
本发明还提供了所述VE-822在作为KIFC1磷酸化抑制剂中的应用。所述 VE-822可以通过抑制KIFC1磷酸化，从而抑制多余中心体的凝集(即，VE-822 通过KIFC1抑制多余中心体凝集)(图3D)，进而可以用于促进肿瘤细胞凋亡。所述肿瘤细胞包含不稳定基因组，这种不稳定基因组通过肿瘤细胞自身突变或外界物理化学条件获得(如放化疗过程中导致的DNA损伤)。
本发明所述的应用中，所述KIFC1磷酸化抑制剂在放化疗过程中用于抑制 KIFC1蛋白表达，抑制KIFC1磷酸化及其功能，抑制KIFC1作为关键因子诱发的中心体凝集。
因为多余中心体凝集能够促进肿瘤细胞的生存和使得肿瘤的基因组不稳定[13]，而多极化的有丝分裂则导致肿瘤细胞的死亡。
本发明提出VE-822可抑制多余中心体凝集，因此本发明通过进一步研究确定VE-822可以显著增敏依托泊苷引起的细胞死亡，但在KIFC1-S26A和 KIFC1-S26D细胞株中则增敏不明显，说明VE-822是通过抑制KIFC1-S26磷酸化来达到增敏效果(图4A)。
本发明所述的应用中，所述KIFC1磷酸化抑制剂在放化疗过程中用于抑制 KIFC1蛋白表达，抑制KIFC1磷酸化及其功能，抑制KIFC1作为关键因子诱发的中心体凝集，进而促进肿瘤细胞凋亡，用于治疗肿瘤，或降低肿瘤耐药、复发、延长生存期。
本发明还提供了所述KIFC1磷酸化抑制剂(包括VE-822)在制备抗肿瘤药物、降低肿瘤耐药和/或复发和/或延长生存期的药物中的应用。
本发明还提出了，用于放化疗治疗的手段，包括药物、手术等(例如诱发 DNA损伤的所有化疗药物、放射治疗)可以与KIFC1磷酸化抑制剂(ATM/ATR 相关抑制剂)联合使用。
本发明的有益效果在于：在深入研究放化疗过程中，本发明发现中心体凝集的肿瘤细胞存活的机制，并确定驱动蛋白KIFC1的第26位丝氨酸发生磷酸化是其中的关键因素。本发明在放化疗过程中，配合使用KIFC1磷酸化抑制剂，能够使肿瘤细胞存活率显著降低。本发明基于对放化疗的研究，提出了评价/评估/ 预测肿瘤耐药和/或复发的标志物，制定了新的肿瘤治疗方案，并开发新的治疗靶点。通过本发明的生物标志物或靶点、方法等能在放化疗过程中，更加有效地杀死中心体过度复制的细胞，从而减少拥有基因组不稳定性的肿瘤细胞，减少肿瘤耐药和复发概率。本发明同时制备了KIFC1特异性抗体，作为肿瘤耐药和复发的检测指标，本发明为预测、抑制肿瘤的复发，延长肿瘤患者生存期等提供了新的思路，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1.乳腺癌和结肠癌肿瘤组织中，KIFC1蛋白量与肿瘤复发率显著正相关。 (A、D)利用乳腺癌和结肠癌组织芯片，进行免疫组化分析，KIFC1抗体染色，苏木素染色DNA。并将KIFC1表达量分为低、中和高表达。(B、E)KIFC1蛋白量与肿瘤复发率正相关。(C、F)KIFC1蛋白量与病人生存期负相关。采用 TTEST测算P值。免疫组化图中比例尺＝50μm。
图2.筛选KIFC1特异性位点及其抗体制备。(A)Irradiation(IR)、ultraviolet(UV)light、依托泊苷(10μM)、顺铂(10μM)、奥沙利铂(40μM)、丝裂霉素C (2μM)、雌氮芥(20μM)、阿霉素(0.5μM)、吉西他滨(4μM)、博来霉素(10μM) 和环磷酰胺(CTX,10mM)分别处理乳腺癌MDA-MB-231细胞15小时。细胞被裂解后再进行western blot。使用了针对如下蛋白的抗体KIFC1、γH2AX和β-actin。(B)乳腺癌MDA-MB-231细胞使用AZD1390(20nM)、VE-822(5μM)、 AZD6738(25nM)、MK-8776(5μM)或C3742(10μM)预处理一个小时，再用依托泊苷和这些抑制剂处理15小时。(C)质谱鉴定KIFC1-S26位磷酸化，二级结构图。(D)293T细胞转染Flag-KIFC1质粒24小时，再用FLAG-M2 beads 进行免疫共沉淀实验。最后用Flag抗体和KIFC1S26p抗体进行western blotting。 (E)使用AZD1390或AZD6738处理293T细胞1小时，再用依托泊苷和这些抑制剂再次处理细胞4小时，最后进行western blot。
图3.ATM/ATR抑制剂VE-822通过KIFC1抑制多余中心体凝集。(A) Flag-taggedKIFC1-WT,S26A,or S26D稳转细胞株的建立。细胞裂解液使用抗体 KIFC1和β-actin进行western blot。(B)典型图片显示多余中心体凝集(centrosome clustering)和多极化有丝分裂(multipolar mitosis)，标尺显示10μm。纺锤体、中心粒和DNA分别染色α-tubulin、centrin和DAPI。插入的图放大的中心体区域。(C)统计图显示多余中心体凝集和多极化有丝分裂占全部有丝分裂期细胞的比例。每组超过100个细胞被统计。NS＝notsignificant,*P<0.05；**P<0.01. (D)稳转细胞株被VE-822(5μM)预处理1小时，再用依托泊苷和VE-822处理15小时。
图4.ATM/ATR抑制剂VE-822降低肿瘤耐药和复发。(A)稳转细胞株使用依托泊苷(0.5μM)或VE-822(5μM)处理4天，再用MTT实验分析细胞存活率。*P<0.05；**P<0.01.(B)在荷瘤小鼠模型中，ATM/ATR抑制剂VE-822 能显著增敏化疗药物依托泊苷对肿瘤的杀伤效果。对最终解剖后的小鼠的肿瘤进行拍照，右侧为肿瘤体积的统计图。**代表极显著差异，P<0.01。每组小鼠6 只。(C、D)小鼠皮下的肿瘤经化疗药物和相关抑制剂联合治疗后，观察肿瘤复发率。(C)肿瘤复发率。每组共十只小鼠，*代表显著差异，p<0.05。(D)肿瘤复发的小鼠相关图片资料，包括原位皮下复发，和肺转移的复发肿瘤。免疫组化实验检测了肿瘤形态。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。当然实施例中仪器和材料的采用并不局限于本实例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书等。
实施例1乳腺癌和结肠癌肿瘤组织中，KIFC1蛋白量与肿瘤复发率显著正相关。
人乳腺癌组织芯片购买于上海芯超生物科技有限公司(HBreD140Su04)。结肠癌肿瘤组织芯片购买于上海卓灏医药科技有限公司(COC1601)。临床资料可从相关公司网站下载。KIFC1蛋白量根据染色程度高低分为三组(低，0–4分；中，5–8分；高，9–12分)[14].为确保统计真实性，这些数据采用双盲方式进行打分并统计。
其中，肿瘤组织来自公司统一的收集和处理，相关实验过程、参数条件、测定过程与标准的免疫组化实验一致[15]。其中，特异性抗体KIFC1(HPA055997, Sigma-Aldrich)使用浓度为1：500(即抗体：抗体稀释液＝1μL：500μL)。
实验结果：在乳腺癌组织芯片(140例)、结肠癌肿瘤组织芯片(83例)中发现KIFC1表达量与乳腺癌和结肠癌的复发率正相关，与病人的生存期负相关 (图1)。当KIFC1蛋白量为高水平时(免疫组化实验中KIFC1染色程度打分超过8分)，肿瘤复发率超过50％，病人生存期显著减少；当KIFC1蛋白量处于低水平时(免疫组化实验中KIFC1染色程度打分低于5分)，肿瘤复发率低于 20％，病人生存期时间显著延长。
因此，KIFC1表达量可以作为预测肿瘤复发几率的方法，并为临床用药提供指导，降低肿瘤的复发率。
实施例2筛选KIFC1特异性位点及其抗体制备。
该实验在MDA-MB-231乳腺癌肿瘤细胞中进行。Western blot、Flag IP和质谱等实验都为常规分子生物学、细胞生物学实验。相关化疗药物都购买于 MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。使用的抗体包括KIFC1 (HPA055997,Sigma-Aldrich)、anti-γH2AX(ab26350；Abcam)、Flag(F3165； Sigma-Aldrich)和β-actin(A5316；Sigma-Aldrich)，这些抗体为市场上能购买的现有抗体，根据相关编号可清楚查明其具体信息。这些抗体是本发明发现过程中使用的实验材料。
实验结果：本实施例发现DNA损伤类放化疗方式会导致KIFC1蛋白量增加 (图2A)，而ATM/ATR的相关抑制剂(VE-822等)则能阻止KIFC1蛋白量的上升(图2B)。通过进一步的筛选，本实施例确定这些抑制剂是通过抑制 KIFC1-S26位磷酸化，达到调控KIFC1蛋白量的目的。本发明通过质谱鉴定出该重要位点(图2C)，然后制备并验证该位点的磷酸化抗体(图2D)。所述KIFC1 特异性抗体为KIFC1的第26位磷酸化抗体，所述抗体不能识别第26位丝氨酸突变后的KIFC1。本发明通过该抗体确定该位点的磷酸化在DNA损伤时显著上升，这种上升可以被ATM/ATR的相关抑制剂所抑制。
实施例3 ATM/ATR抑制剂VE-822通过KIFC1抑制多余中心体凝集。
在乳腺癌MDA-MB-231细胞中进行相关免疫荧光实验。使用抗体包括γ-tubulin(T5326；Sigma-Aldrich)、Centrin(C7736；Sigma-Aldrich)和α-tubulin (T5199；Sigma-Aldrich)。
本发明在KIFC1基因沉默的MDA-MB-231细胞基础上，首先建立了KIFC1 的野生型(WT)、模拟S26去磷酸化状态(S26A)和模拟S26磷酸化状态(S26D) 的细胞株(图3A)。DNA损伤导致多余中心体凝集(centrosome clustering)显著增多，而多极化(multipolarmitosis)显著减少。
实验结果：在KIFC1-S26A细胞株中，多余中心体凝集/多极化比例显著减少。在KIFC1-S26D细胞株中，多余中心体凝集/多极化比例则显著增多。在本发明构建的KIFC1-S26A和KIFC1-S26D稳定表达细胞株中，依托泊苷则不引起多余中心体凝集/多极化比例发生变化(图3B、3C)。这些结果说明抑制KIFC1-S26 磷酸化，是抑制KIFC1功能(多余中心体凝集)的关键步骤。
VE-822作为ATM和ATR典型抑制剂，具有高特异性、高水溶性的特点，是很好的临床肿瘤治疗的候选药物，但其在肿瘤耐药和复发方面的功能完全没有被发现[10-12]。本发明确定VE-822可以通过抑制KIFC1磷酸化，从而抑制多余中心体的凝集(图3D)。
实施例4 ATM/ATR抑制剂VE-822降低肿瘤耐药和复发。
在小鼠荷瘤模型中，本发明进一步研究了VE-822对肿瘤复发的影响。 MDA-MB-231细胞(3×106细胞数)被荷瘤至裸鼠(6周龄)左右两侧后腿处。当肿瘤体积达到150mm3时，被随机分成4组，分别为Control、依托泊苷、依托泊苷+VE-822和VE-822组。依托泊苷(20mg/kg每周)注射小鼠腹腔。 VE-822(20mg/kg，每周饲喂四天)添加到水中给小鼠饮用。最后切除肿瘤，进行拍照并计算肿瘤体积。在肿瘤复发实验中，当残余肿瘤被切除后，连续观察5 个月，并记录肿瘤复发情况。相关动物实验在华东师范大学SPF级动物房完成，并遵守相关动物实验伦理。
实验结果：本发明发现Control组出现了肿瘤复发(30％)，而VE-822组完全没有肿瘤复发，说明VE-822的确抑制了肿瘤复发，降低了肿瘤复发率(图 4C)。并且，因为肺转移是乳腺癌复发的常见转移位置，本发明在Control组中，也发现了远端复发(肺转移)的现象(图4D)。因此，在小鼠荷瘤模型中，本发明也同样证实VE-822可显著增敏依托泊苷的杀伤效果(图4B)，即ATM/ATR 抑制剂VE-822能够降低肿瘤耐药和复发。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
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SEQUENCE LISTING
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<120> 预测肿瘤耐药、复发的标志物KIFC1及其抑制剂和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asp Arg Ser Val Lys Gly Asn Ile Lys Arg Ile Lys Ala Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ser Arg Lys Arg Arg Asp Met Asp Gly Lys Lys Arg Thr Arg Gly
20 25 30
Gly Ala Thr Thr Lys Ile Thr Thr Ser His Arg Val Ser Thr Thr Val
35 40 45
Thr Gly Thr Thr Ala Lys Val Ser Lys Lys Thr Gly Arg Cys Ser Thr
50 55 60
Ala Ile Ala Thr Gly Lys Asn Lys Val Ala Val Val Lys Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ser Gly Val Met Ala Gly Gly Lys Lys Ser Lys Arg Ala Trp Asp Lys
85 90 95
Gly Cys Asp Asn Ala Lys Arg Cys Arg Arg Thr Thr Asp Asn Asp Arg
100 105 110
Asp Ala Val Lys Ala Gly Thr Arg Thr Thr Gly His Ala Lys Val Ala
115 120 125
Ala Gly Lys Asn Arg Ala Cys Val Arg Ser Thr Gly Val Lys Lys Val
130 135 140
Arg Arg Gly Met Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala
145 150 155 160
Val Ala Ser Arg Thr Val Ala Ala Ala Thr Arg Arg His Gly Met Arg
165 170 175
Arg Arg His Asn Lys Gly Asn Ile Arg Val Cys Arg Val Arg Val Gly
180 185 190
Thr Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Thr Arg Ser Ser Arg Ser Asp Arg
195 200 205
Arg Gly Thr Ser Gly Ala Ala Thr Arg His Asp Ser Asp Arg Val Gly
210 215 220
Ser Gly Asp Val Ile Ala Met Val Ser Ala Asp Gly Tyr Val Cys Ile
225 230 235 240
Ala Tyr Gly Thr Gly Ser Gly Lys Thr Thr Met Gly Gly Gly Gly Asp
245 250 255
Gly Ile Arg Ala Arg His Ser Val Ala Ser Gly Gly Trp Thr Tyr Ser
260 265 270
Val Ala Ser Tyr Val Ile Tyr Asn Thr Val Arg Asp Ala Thr Gly Thr
275 280 285
Arg Lys Gly Gly Gly Cys Ile Arg Arg Ala Gly Gly Ser Thr Val Thr
290 295 300
Asn Ala Arg Tyr Val Val Ser Cys Lys Val Asp Ala His Ala Arg Asn
305 310 315 320
Arg Ala Val Ala Arg Thr Ala Asn Arg Ser Ser Arg Ser His Ser Val
325 330 335
Ile Ser Gly His Ser Ser Arg Gly Cys Gly Ala Ser Val Asp Ala Gly
340 345 350
Ser Arg Asp Gly Ala Gly Gly Arg Arg Arg Thr Ala Ile Asn Ser Ser
355 360 365
Ser Thr Gly Val Ile Met Ala Ser Asn Lys Ser His Val Tyr Arg Asn
370 375 380
Ser Lys Thr Tyr Asn Ser Gly Gly Ser Ala Lys Met Met Val Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asn Val Ser Ser Asn Ser Arg Ala Ser Lys Val Asn Cys Val Ile
405 410 415
Gly Thr Ala Ala Asn Arg Lys
420

Claims (12)

1.一种用于预测肿瘤耐药性和/或复发率和/或生存期和/或肿瘤治疗的标志物，其特征在于，所述标志物为KIFC1或其编码基因。
2.KIFC1作为生物标志物的应用，其特征在于，所述应用以KIFC1作为靶点制备预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期的诊断试剂，和/或制备肿瘤预后评价试剂，和/或制备用于肿瘤治疗或降低肿瘤耐药或延长生存期的药物。
3.如权利要求1所述的标志物或如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标志物为第26位丝氨酸磷酸化的KIFC1。
4.如权利要求1所述的标志物或如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标志物为KIFC1蛋白或其编码基因；其中，所述KIFC1蛋白具体特征为：
(a)氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的蛋白质；
(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(c)与(a)-(b)任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(d)在(a)-(c)中任一限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
5.如权利要求1所述的标志物或如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌和结肠癌。
6.一种用于检测肿瘤耐药性和/或复发率和/或生存期的标志物，其特征在于，包括KIFC1蛋白的抗体和/或KIFC1第26位丝氨酸的磷酸化的抗体。
7.KIFC1蛋白的抗体和/或KIFC1第26位丝氨酸的磷酸化的抗体在作为预测肿瘤耐药和/或复发和/或生存时间的检测指标中的应用。
8.一种KIFC1抑制剂，其特征在于，所述KIFC1抑制剂为ATM/ATR相关抑制剂，包括ATM/ATR蛋白酶的所有抑制剂、相关ATM抑制剂、ATR抑制剂之任意的一种或几种的组合。
9.如权利要求8所述的抑制剂，其特征在于，所述KIFC1抑制剂为KIFC1第26位丝氨酸磷酸化的抑制剂，包括VE-822。
10.如权利要求8或9所述的KIFC1抑制剂在制备抗肿瘤药物、降低肿瘤耐药和/或复发和/或延长生存时间的药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述KIFC1抑制剂在放化疗过程中用于抑制KIFC1蛋白表达量，抑制KIFC1磷酸化及其功能，抑制KIFC1作为关键因子诱发的中心体凝集。
12.一种预测肿瘤耐药和/或复发率和/或生存期和/或进行预后评价的方法，其特征在于，所述方法包括：确定从所述患者获得的样品中KIFC1的水平，通过所述水平，对所述患者是否具有肿瘤耐药进行诊断，或对所述患者的生存期(生存时间)进行预测，或对所述患者进行预后评估。
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