JP2008535511A - 癌治療化合物のinvitroにおける同定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)当該個体の検体中の、コリンキナーゼαタンパク質、コリンキナーゼα遺伝子のmRNA、又は対応するcDNAを検出及び/又は定量化すること、及び
b)個体の検体中に検出された、コリンキナーゼαタンパク質の量、コリンキナーゼα遺伝子のmRNAの量、又は対応するcDNAの量を、対照の個体の検体中又は同一の個体の以前の検体中に検出されたコリンキナーゼαタンパク質の量、コリンキナーゼα遺伝子のmRNAの量、又は対応するcDNAの量と、或いは正常基準値と比較すること
を含む方法を提供する。
a)腫瘍細胞、好ましくは、肺、乳房、結腸又は直腸の腫瘍細胞の培養物を、適切な条件下で適切な期間、相互作用するように候補化合物と接触させること、
b)コリンキナーゼα遺伝子又はコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを検出及び定量化すること、及び
c)当該発現レベルを、候補化合物を用いて治療されていない腫瘍細胞の対照培養物の発現レベルと比較すること
を含む方法も提供する。
a)コリンキナーゼαタンパク質中に存在する1つ又は複数のエピトープに対して特異的である、抗体又は抗体の組合せ、好ましくは、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体(抗体の断片、一本鎖抗体又は抗イディオタイプ抗体であることもできる)、
b)コリンキナーゼαタンパク質の発現及び/又は活性を阻害する、小型の有機又は無機の分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、三重らせん分子等を含むが、それらに限定されない、毒素、放射性原子を有する分子又は化学療法剤等の細胞障害性薬剤、並びに
c)コリンキナーゼαタンパク質の1つ又は複数の機能を阻害する、コリンキナーゼαタンパク質のアンタゴニスト化合物
によって形成される群から選ぶことができる。
アイソフォームのコリンキナーゼ活性
図1に示すように、酵素CKα2(52kDa、アミノ酸457個)及びCKβ1(45kDa、アミノ酸395個)は共に、ATP及びマグネシウムの存在下でコリンからホスホリルコリンを産生するそれらの能力によって決定すると、強力なコリンキナーゼ活性を有する(図1A)。この活性は、両方の組換え体、大腸菌(Escherichia coli)中にも、ヒトHEK293細胞内への形質移入後にも、発現しているのが認められる。しかし、両方の酵素はコリンキナーゼ活性を有するという事実にも関わらず、生存している細胞のホスホリルコリンの細胞内レベルは、同等には変化せず、コリンキナーゼβを過剰発現している細胞内では、実質的に検出不可能である(図1B)。これらの結果は、これらの2種のタンパク質の生理学的な調節及び生物学的な機能、したがって、腫瘍形成におけるこれらの挙動には、差がある可能性があることを示唆している。
抗体の特異性
コリンキナーゼα酵素、半精製され、産生段階では抗原として、過程の残りの段階では産生の対照として発現させたタンパク質、を認識するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が開発されている。コリンキナーゼαに対して開発されているにもかかわらず、両方の酵素(CKα及びCKβ)は、それらの配列を通して全体で65%の相同性を有し、コリン結合ドメイン及び触媒活性ドメイン等の一部の保存領域では相同性が75%に達するという事実から、どのアイソザイムが、産生されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を認識することができるかを調べることが必要である。我々は、使用したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が、コリンキナーゼαに対して特異的であり、これらは、コリンキナーゼβを認識しないことを確認している。このために、コリンキナーゼαタンパク質及びコリンキナーゼβタンパク質を、ヒトHEK293T細胞中で過剰発現させ、これらの2種のタンパク質が存在し、活性であることを調べた(図2A)後、それらを、これを用いて過去に研究されたポリクローナル抗体[Ramirez de Molina,A.,Gutierrez,R.,Ramos,M.A.,Silva,J.M.,Silva,J.,Sanchez,J.J.,Bonilla,F.,Lacal,J.C.Oncogene 21,4317−4322(2002);Ramirez de Molina,A.,Rodriguez−Gonzalez,A.,Gutierrez,R.,Martinez−Pinero,L.,Sanchez,J.J.,Bonilla,F.,Rosell,R.,Lacal,J.C.Biochem.Biophys.Res.Commun.296,580−583(2002)]、及びコリンキナーゼαに対して産生させた新たなモノクローナル抗体の両方を用いて、免疫検出の手法(ウエスタンブロット)によって分析した。図2Bに示すように、これは、これらの抗体のうちの2種を用いた例を示すが、活性が80倍増加する条件でのコリンキナーゼβの過剰発現によってさえも、これらの抗体のうちで、このアイソフォームを認識するものはないが、コリンキナーゼαは、全ての場合において同一の条件及び内在性の対照のレベルの両方において高度に認識されている。これらの結果は、このポリクローナル抗体を使用したこのグループの過去の研究は、コリンキナーゼαを、ヒト腫瘍に由来する細胞系内及び分析した腫瘍自体の中で過剰発現したアイソザイムとして定義していることを示している。
腫瘍に対する特異性:異なるヒト腫瘍中でのコリンキナーゼαの変化。
コリンキナーゼαに対する特異性が証明されている抗体が入手可能であることから、乳癌、結腸癌及び肺癌等の先進国で今日最も重要な腫瘍のうちのいくつかにおけるコリンキナーゼαの発現の可能な変化を研究ができるようになった。本研究を行うために、各患者がこれらのタイプの癌のうちの1種を有する38から50人の異なる患者からの検体のパラフィン切片を作製し、コリンキナーゼαの発現を免疫組織化学(IHQ)、細胞及び組織の不可欠な部分である生体分子成分を「in situ(生体内原位置)」において検出及び同定することを可能にし、且つどこの病院の病理解剖部でも自動化して行うことができる手法によって分析している。これらの患者の乳房、結腸又は肺の検体から、
*いずれの症例も、コリンキナーゼαを認識する抗体を用いた腫瘍の染色は、高度に特異的であり、腫瘍組織と正常な隣接する組織とを明確に区別することができ;
*正常な組織が染色された症例は1つもなく;
*コリンキナーゼα酵素は、このタイプの腫瘍では62から100%の間の範囲の発生率で過剰発現し、ヒトの腫瘍形成においては、本アイソフォーム、コリンキナーゼα、が深く関係することを実証していること
が見出された。
腫瘍に対する特異性:コリンキナーゼα酵素の発癌挙動
今日最も重要なヒト腫瘍のうちのいくつかにおけるコリンキナーゼαの調節不全の非常に高い発生率を考慮して、本タンパク質が単独で発癌能力を有するか否か、すなわち、コリンキナーゼαに発癌活性があるか否かを決定する研究を行った。本研究を行うために、まず、本遺伝子が足場非依存性培地中で増殖能を与えるか否かを研究した。これは、形質転換能を測定することになる。ヒトHEK293T細胞に、を対照としての空のベクター及びコリンキナーゼα発現ベクターを用い形質移入し、軟寒天中に播種した。図6に認められるように、本タンパク質の過剰発現は、ヒトHEK293T細胞及びイヌ上皮MDCK細胞の両方の発癌の形質転換を誘導するのに十分である。
薬理学的特異性
ヒト腫瘍におけるコリンキナーゼαアイソフォームの発癌活性及びその高い発生率の過剰発現を確認し、次いで、阻害剤MN58b[Hernandez−Alcoceba,R.,Saniger,L.,Campos,J.,Nunez,M.C.,Khaless,F.,Gallo,M.A.,Espinosa,A.,Lacal,J.C.Oncogene,15,2289−2301(1997);Hernandez−Alcoceba,R.,Fernandez,F.,Lacal J.C.Cancer Res.59,3112−3118(1999);Ramirez de Molina A.,Banez−Coronel M.,Gutierrez R.,Rodriguez Gonzalez A.,Olmeda D.,Megias D.,Lacal J.C.Cancer Res.64:6732−6739(2004)]の抗腫瘍効果が、本コリンキナーゼαアイソフォームに対して特異的であるか、そうではなく、阻害剤がコリンキナーゼβアイソフォームと相互作用することができることにも起因する可能性があるかを研究した。コリンキナーゼα及びコリンキナーゼβの2種のアイソフォームは、基質結合ドメイン及び触媒領域において75%もの相同性を有することから、この確認は必要である。そのために、2種のコリンキナーゼアイソフォーム(CKα及びCKβ)を、大腸菌株中で発現させた。この大腸菌は、コリンキナーゼ活性を欠き、したがって、何らかの酵素活性が観察されるとすると、それは、もっぱら組換えによって発現させたコリンキナーゼアイソフォームによるものである。図9に認められるように、コリンキナーゼαの酵素活性は、MN58bを用いた処理によって、同一の阻害剤がβアイソフォームに及ぼす効果より顕著な効果で影響を受けている。事実、MN58bは、コリンキナーゼαに対して、コリンキナーゼβに対してより20倍活性が高い。
遺伝子的特異性
これらの結果は全て、新たな抗腫瘍戦略の設計のための新しい治療標的としてのコリンキナーゼαの可能性を支持している。しかし、阻害剤MN58bの場合のように、化学阻害剤が特異的に特定の酵素に対して設計されているにもかかわらず、それらの抗増殖作用は、研究者が気づいていない効果を用いてもたらされている場合がある。文献には、特異的にキナーゼに対して設計された阻害剤が、相互に密接に関連してすらいない、その他のキナーゼにも影響を与えることを示す多数の実例が存在する。siRNA(短い干渉RNA)の使用によって、特定の酵素との干渉の効果をより正確に確立することを可能にする最近の過去数年で開発されたアプローチがある。これは、特定のタンパク質に対するmRNAを、残りの細胞タンパク質に影響を与えることなく、正確に且つ選択的に排除することができる。ここでは、コリンキナーゼαに対して特異的な阻害剤MN58bの使用による薬理学的な干渉は、siRNAの手法によるコリンキナーゼαの特異的阻害によって、遺伝子レベルで確証されることを確認した。本手法は、ChoKαを、癌における新たな治療標的として決定的に確証することを可能にするであろう。この目的のために、コリンキナーゼαのメッセンジャーRNAとハイブリダイズすることができる、したがって、本タンパク質の発現を特異的に遮断することができるオリゴヌクレオチド(これは、siCHKAと呼ばれている)を生成した。まず、本siRNAが、ヒトHEK293T細胞におけるコリンキナーゼα、内在性のタンパク質及びGSTに融合させて同一の細胞に形質移入したChoKαの両方、の発現を効率的に遮断することを確認した(図11)。
コリンキナーゼαの乳癌に対する効果:生存率
コリンキナーゼαの腫瘍の発生及び発展における関与を確証する定量的なデータを得るために、コリンキナーゼαが特異的に関係すると思われるタイプの癌(乳癌、肺癌及び膀胱癌)を有する患者における発現及び当該患者の発展の予後との可能な関係を定量化する追加のアッセイを行った。
コリンキナーゼαの肺癌における効果:過剰発現レベル及び生存率
肺癌におけるコリンキナーゼαの過剰発現の重要性に関する研究を補完するために、いくつかの試験を行った。
a腫瘍が小さく、リンパ節の関与は殆ど又は全くなく、転移もない段階
b腫瘍がより大きく、リンパ節が関与し、転移がある段階
コリンキナーゼαの膀胱癌における効果:過剰発現レベル及び生存率
また、膀胱癌の患者においても、類似の研究を行った。まず、膀胱癌の患者に由来する細胞系の当該酵素に対応するmRNAのレベルを、ここでも、肺癌の場合に関する実施例8で記載したものと同様の、特異的なTaqmanプローブを用いる自動化リアルタイム定量PCR反応によって検出した。HT1376、J82、SW780、TCCSup及びUMVC3の系を使用し、データを、正常な不死化膀胱細胞UrotSaに対して対数目盛で表した。結果を、図19aに示す。データは、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法による各々のこれらの細胞系中のタンパク質のレベルに関する検出データ(図19b)、及びその中の検出可能な酵素活性の評価(図19c)で補完された。異なる細胞系は、正常な不死化UrotSa細胞と比較して増加したChoKαのレベルを示し、また、膀胱癌に由来する細胞中の本タンパク質の発現の増加にも、コリンキナーゼ酵素の活性の同様な増加が伴うことを観察することができる。
遺伝子的特異性:誘導性の干渉のモデル
トランジェントアッセイで行った、実施例6に記載したアッセイで実証したように、腫瘍細胞におけるChoKαの干渉は、アポトーシスによる細胞死を誘導し、致命的であることを考慮すると、この種の研究で干渉構築物を発現する安定した細胞集団を得ることは不可能ではない。トランジェントアッセイでは、少ないパーセントの可変性の細胞集団が影響を受けるが、全集団が影響を受けることはなく、これが、結果を覆い隠してしまう。構築物の効果を、構築物を均質に発現する集団上で研究するのがよりよいであろう。したがって、体質的に安定なモデルである必要はないであろう。このことから、ChoKαの発現が均質に干渉される集団を得ることができる誘導性の干渉モデルが必要になる。
発癌におけるChokβの過剰発現の可能な効果の評価
発癌においてコリンキナーゼβ(ChoKβ)の過剰発現が有する可能性がある効果を評価し、異なる癌性の組織及び癌性の組織に由来する細胞系に認められるコリンキナーゼの活性の増加の原因は、もっぱらコリンキナーゼαとしてもよかろうものなのか、それともコリンキナーゼβも関与する可能性があるものなのかを確証するために、いくつかのアッセイを行った。
Claims (16)
- 癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を同定及び評価するためのin vitroにおける方法であって、
a)腫瘍細胞、好ましくは、肺、乳房、結腸、直腸又は膀胱の腫瘍細胞の培養物を、適切な条件下で適切な期間、相互作用するように候補化合物と接触させること、
b)コリンキナーゼα遺伝子又はコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを検出及び定量化すること、及び
c)前記発現レベルを、候補化合物で治療されていない腫瘍細胞の対照培養物の発現レベルと比較すること
を含む方法。 - 癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を発見、同定、開発及び評価する方法における、コリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の使用。
- コリンキナーゼαタンパク質の発現及び/又は活性を阻害すること、或いはコリンキナーゼαタンパク質の過剰発現による発癌効果を阻害することを特徴とする薬剤。
- a)コリンキナーゼαタンパク質中に存在する1つ又は複数のエピトープに対して特異的な抗体又は抗体の組合せ、好ましくは、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体;抗体の断片又は抗体鎖、
b)コリンキナーゼαタンパク質の過剰発現及び/又は活性による発癌効果を阻害する、小型の有機又は無機の分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、三重らせん分子、二本鎖RNA、siRNA等を含むが、それらに限定されない、毒素、放射性原子を有する分子又は化学療法剤等の細胞障害性薬剤、並びに
c)コリンキナーゼαタンパク質の発現及び/又は活性による発癌効果を阻害する、コリンキナーゼαタンパク質のアンタゴニスト化合物
によって形成される群から選択される、請求項3に記載の薬剤。 - 癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための、請求項3及び4に記載の薬剤。
- 癌、好ましくは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌又は膀胱癌の治療のための医薬品の調製における、請求項3又は4に記載の薬剤の使用。
- 請求項3から5までに記載の治療有効量の1種又はいくつかの薬剤を、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物。
- 別の活性成分、好ましくは、コリンキナーゼαタンパク質の機能を阻害しない活性成分を含有することを特徴とする、請求項7に記載の薬学的組成物。
- 好ましくは膀胱癌の治療のための、請求項3及び4に記載の薬剤。
- 請求項3、4及び9に記載の治療有効量の1種又はいくつかの薬剤を、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物。
- 別の活性成分、好ましくは、コリンキナーゼαタンパク質の機能を阻害しない活性成分を含有することを特徴とする、請求項10に記載の薬学的組成物。
- 乳癌、肺癌又は膀胱癌の患者の生存期間を診断するためのin vitroにおける方法であって、患者から抽出した癌性の組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、前記検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーRNAのレベル、前記タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも1種のパラメータの測定によって評価すること、並びに得られた値を1つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することを含む方法。
- 癌患者に投与した治療の効果をモニターするためのin vitroにおける方法であって、抗腫瘍剤、好ましくは、請求項3から5まで及び9に記載の薬剤、又はそれを含有する、請求項7及び8並びに10及び11に記載の薬学的組成物を投与した患者から抽出した組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、前記検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーRNAのレベル、前記タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも1種のパラメータの測定によって評価すること、並びに得られた値を1つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することを特徴とする方法。
- 好ましくは膀胱癌の治療のための化合物の効力を同定及び評価するための、請求項1に記載のin vitroにおける方法。
- 好ましくは膀胱癌の治療のための化合物の効力を発見、同定、開発及び評価する方法における、コリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の請求項2に記載の使用。
- 好ましくは膀胱癌の治療のための医薬品の調製における、請求項3及び4に記載の薬剤の使用。
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