CN101405403A - 鉴定用于癌症治疗的化合物的体外方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外方法，该方法用于鉴定和评估用于治疗不同类型癌症，特别是肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和膀胱癌的化合物，目的是确定患者中所述癌症的阶段或严重程度，或用于监测对所述癌症患者中进行所述癌症的个体施用治疗的效果。本发明还涉及为了开发新型药物的目的而发现、鉴定、开发和评估癌症治疗化合物的功效；以及抑制胆碱激酶α蛋白表达和/或活性的试剂，和/或该表达引起的作用。

Description

鉴定用于癌症治疗的化合物的体外方法
发明领域
本发明涉及一种鉴定和评估用于癌症治疗，特别是用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的治疗的化合物功效的方法，目的是开发新型药物产品。本发明还涉及抑制胆碱激酶α蛋白表达和/或活性的试剂，和/或抑制此表达的作用。
发明背景
胆碱激酶(也已知为CK，CHK和ChoK)是kennedy或卵磷脂(PC)合成途径中的起始酶，其在镁离子(Mg+)存在下利用作为磷酸基团供体的5’三磷酸腺苷(ATP)将胆碱磷酸化为磷酸胆碱(PCho)。由多种致癌基因介导的这一转化诱导高水平的胆碱激酶活性，从而引起其产物PCho的细胞内水平异常升高，这些间接支持了胆碱激酶在形成人肿瘤的过程中的作用。然而，存在备选的不涉及激活胆碱激酶的PCho形成机制，并能够解释这种代谢物在肿瘤细胞中的高水平。
尽管有证据显示在肿瘤和转化了的细胞中出现了胆碱激酶活性的升高，但是由于并没有在其活力的升高和肿瘤的转化之间建立起明确的因果关系，因此它与致癌过程的关系没有得到充分的论证。另一方面，也没能鉴定出造成该结果的分子。
现已在人和其它哺乳类及啮齿类动物(大鼠、小鼠、牛、豚鼠、兔、猴)中鉴定了大约200个编码具有同源于胆碱激酶的初级结构的多肽的基因序列，且这些序列被命名为胆碱激酶αa，胆碱激酶αb，胆碱激酶α3，胆碱激酶β1，胆碱激酶β2，胆碱激酶CKB-1胆碱/乙醇胺激酶，胆碱激酶样乙醇胺激酶，Cots，Duff227，Cog3173 CPT1B，SF1，SHOX2，FHOD2，FLJ12242，KRT5，FBL，ARL6IP4等。(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi#219541)。实际上，从1982年以来，已有生化证据证明在从大鼠、小鼠和人中分离的不同组织中存在至少三种具有胆碱激酶活性和不同物化特征的同工酶。
最近在人基因组中鉴定了至少三个编码具有证实为胆碱激酶活性的蛋白质的基因，且将它们命名为ck-alpha，ck-beta，和HCEKV(美国专利US2003186241)，并且许多基因所编码的蛋白质30-65％的同源于ck基因编码的蛋白质，例如在(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)中描述的基因CAI16602，CHKL，CAI16600，CAI16599，CAH56371，CAI16603，BAA91793，CAI16598，以及在(http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/sumtab？tool＝asdblast&jobid＝blast-20050412-18072127)中描述的基因CPT1B，EKI2，SF1，SHOX2，FHOD2，FLJ12242，KRT5，FBL，ARI61pS，TOMM40，MLL。不同胆碱激酶同工酶的一个非常相关的特征就是它们具有不同的生化特性，在它们和胆碱基质及ATP磷酸供体亲和力和甚至在它们的活性形式上(即能以二聚体或四聚体的形式出现)存在重要的改变。因此，确定在任意不同的已鉴定的胆碱激酶同工酶与由于它们在人肿瘤中过表达所引起的致癌能力之间是否存在着直接联系是十分必要的。
另一方面，已证明胆碱激酶的抑制作用在经致癌基因转化了的细胞内是一种新型有效的抗肿瘤方案，已将此方案在体内外推到裸鼠中。胆碱激酶活性在几个人乳腺癌瘤中的升高已于近期被发表，还看到胆碱激酶的变化是在一些人的肿瘤，如在肺部肿瘤、结肠直肠肿瘤及前列腺肿瘤中的频繁事件。
尽管一些参数与其它参数之间的相互关系，但是目前没有证据肯定地证明胆碱激酶的过表达在人细胞中具有致癌和肿瘤的活性。有证据显示胆碱激酶活性阻抑物，例如hemicholinium-3[Cuadrado A.，Carnero A.，Dolfi F.，Jimenez B.和Lacal J.C.Oncogene 8，2959-2968(1993)；Jimenez B.，del Peso L.，Montaner S.，Esteve P.和Lacal J.C.J.CellBiochem.57，141-149(1995)；Hernandez-Alcoceba，R.，Saniger，L.，Campos，J.，Nunez，M.C.，Khaless，F.，Gallo，M.A.，Espinosa，A，Lacal，J.C.Oncogene，15，2289-2301(1997)]或西班牙专利申请ES200503263中的低毒性亚甲基醌具有抗肿瘤活性。然而，在所提及的文献或其他现有技术中都没有结论性的证据证明具有所述胆碱激酶活性(ck-alpha，ck-beta，和HCEKV等)且在人组织中鉴定了的多种同工酶能够对检测到的酶活性负责，也没有证据显示哪一个同工酶对由具抗肿瘤活性的阻抑物引起的抑制作用敏感。该鉴定对建立其作为癌症的治疗目标的潜在应用十分必要。
发明目的
本发明的主要目的是一种发现、鉴定和评估用于癌症治疗、特别是用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌治疗的化合物功效的体外方法。
本发明的另一个目的是基于来源于胆碱激酶α基因的核苷酸或肽序列在发现、鉴定、开发和评估用于癌症治疗，优选地用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌治疗的化合物功效方法中的的应用。
本发明的另一个目的由提供特征为在治疗癌症，优选地，肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌中抑制胆碱激酶α蛋白的表达和/或活性的试剂组成。
本发明的另一个目的为一种药物组合物，包括用于治疗癌症，优选肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的一个或几个治疗试剂和药用赋形剂，。
用于监测对癌症患者施用的治疗的效果的体外方法也是本发明的一个目的，所述方法特征在于，评估从施用了抗肿瘤试剂的患者提取的组织样品中胆碱激酶α蛋白表达水平，，以及比较由此获得的数值和对应于一个或多个正常非癌症组织样品数值，其中所述抗肿瘤试剂优选地为根据权利要求3-5的试剂，所述评估是通过确定所述样品中的至少一个与胆碱激酶α蛋白相关的选自下列各项中的参数来实现的：其信使RNA水平，所述蛋白质的浓度或其酶活性。
最后，本发明的另一个目的由实施本发明的诊断试剂盒组成。
附图说明
图1：A)在过表达胆碱激酶α和β后，人Hek293T细胞(人胚胎肾细胞)提取物中的胆碱激酶活性(ChoK)(先体外后体内胆碱激酶活性分析)。B)活细胞中的细胞内磷酸胆碱水平(体外胆碱激酶活性分析)。
图2：A)在过表达胆碱激酶α和β后，人ChoK293T细胞中ChoK的活性。B)形成的对抗在如A所示相同的提取物中的胆碱激酶α的单克隆抗体的特异性。
图3：通过NSCLC(非小细胞肺癌)中的免疫组化技术确定的胆碱激酶α的过表达。
图4：通过乳腺癌中的免疫组合技术确定的胆碱激酶α过表达。
图5：通过结肠癌中的免疫组合技术确定的胆碱激酶α过表达。B)从肿瘤性转化前的病变到肿瘤团中观察到渐进染色的息肉。
图6：过表达人胆碱激酶α的细胞的附着依赖性生长。如图示，分析了两个细胞品系：Hek293和MDCK的形成的克隆数量和相对尺寸。
图7：胆碱激酶α在Nu/Nu小鼠中的体内致癌活性。
图8：在体内诱导的肿瘤中胆碱激酶α的表达和酶活性。
图9：阻抑物MN58b对胆碱激酶α的特异性。在缺乏(0)或存在增高浓度的MN58b的条件下，分析表达了重组人胆碱激酶α或胆碱激酶β蛋白的大肠杆菌提取物。
图10：阻抑物MN58b对由胆碱激酶α过表达诱导的肿瘤的抗肿瘤作用。
图11：在人Hek293T细胞中利用siRNA技术阻滞胆碱激酶α的表达。
图12：利用蛋白质印迹法A)和B)以及通过酶活性C)确定来源于人乳腺癌肿瘤细胞中由siRNA引起的对胆碱激酶α表达的阻滞。
图13：在人乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231中由胆碱激酶α的特异性干扰RNA诱导的细胞凋亡导致的死亡。A)利用碘化丙锭进行的流式细胞计数分析。B)与由细胞凋亡引起的死亡相关的PARP的消化。
图14：在人初级乳腺上皮细胞HMEC中胆碱激酶α的特异性干扰RNA。A)相对于肿瘤细胞MDA-MB-231，正常HMEC细胞中胆碱激酶α的基础表达水平。B)在HMEC中与胆碱激酶α的干扰。C)对胆碱激酶α的干扰不会诱导初级人HMEC细胞的死亡。
图15：乳腺癌组织中胆碱激酶α的过表达。图15a：在乳腺癌患者的组织中通过实时定量PCR测定的胆碱激酶α信使RNA，用以10为底，由此测定的数量和正常组织样品中数量的对数表示。图15b：胆碱激酶α表达的平均值，在未转移(第一个条形柱，标记为“否”)或转移了(第二个条形柱，标记为“是”)的个体中，以利用2-ΔΔct方法从mRNA水平计算得到的所述基因的相对表达单位来表示。图15c：有淋巴结瘤(下方的线，以灰色的+标记)或无淋巴结瘤(上方的线，以黑色的+标记)患者的无病存活率随着流逝月份的个数的进展。
图16：来源于肺癌细胞品系中胆碱激酶α的表达。图16a：通过实时定量PCR测定的来源于NSCLC(H1299和H460)型或SCLC(H510和H82)型癌症细胞品系中的胆碱激酶α信使RNA，用以10为底，由此测定的数量与正常初级支气管上皮细胞(BEC)出现数量的比率的对数表示。图16b：在正常初级支气管上皮细胞(BEC)和来源于肺癌H460，H1299，H510及H82的细胞品系中，通过利用单克隆抗体的免疫测定检测到的胆碱激酶α蛋白。在这些相同样品中获得的用于微管蛋白的信号显示于其下方。图16c：以30分钟后在每微克蛋白质中检测到放射性标记的PCho信号形式表示的胆碱激酶活性，该信号由每个显示在相应条形柱下的细胞品系中标记的胆碱形成。
图17：通过实时定量PCR测定的早期提取自肺癌NSCLC患者的肿瘤组织中胆碱激酶α信使RNA的表达。用以10为底，由此测定的数量与正常组织样品中数量的比率的对数表示。
图18：肺癌患者存活率随时间的进展，以月表示，并分为检测到(断线，-+-)或未检测到(连续线，+)胆碱激酶α表达两种情况。在从阶段I到IV的患者中的总存活率(图表位于左上方)，在从阶段I到IV的患者中的无病存活率(时间从对患者进行手术开始，直到疾病复发为止)(图表位于左下方)，阶段IA到IIIA中的癌症存活率(图表位于右上方)，以及阶段IA到IIIA中的无病存活率(图表位于右下方)。
图19：来源于膀胱癌细胞品系中胆碱激酶α的表达。图19a：通过实时定量PCR测定的来源于膀胱癌细胞品系中胆碱激酶α信使RNA，用以10为底，由此测定的数量与正常无限增殖化膀胱Urotsa细胞中数量的比率的对数表示；从左向右，条形柱相应为品系HT1376，J82，SW780，TCCSuP和UMVC3。图19b：通过利用单克隆抗体的免疫测定，在正常无限增殖化膀胱细胞(Urotsa)和来源于膀胱癌的细胞品系细胞TCCSuP，J82，UMVC3，SW789，和HT1376中，以及阴性对照组(Hek293T细胞)和阳性对照组(Hek-Chok细胞，经过表达胆碱激酶α的质粒转染)中检测到的胆碱激酶α蛋白；在相同样品中获得的用于微管蛋白的信号显示于其下方。图16c：以30分钟后在每微克蛋白质中检测到放射性标记的PCho信号形式表示的胆碱激酶活性，该信号由每个显示在相应条形柱下的细胞品系中标记的胆碱形成。
图20：膀胱癌患者中胆碱激酶α的表达。图20a：通过Affymetrix微点阵U133 Plus 2.0，从90名患者的肿瘤组织中获得的平均表达值，在根据诱导因数的数值分成的不同组中获得：1-3倍的诱导(条形柱1)，3-8倍的诱导(条形柱2)或8-24倍的诱导(条形柱3)。图20b：通过实时定量PCR从20名膀胱癌患者中测定的胆碱激酶α信使RNA，用以10为底，由此测定的数量与正常无限增殖化膀胱Urotsa细胞中数量的比率的对数表示；水平线代表一种水平，且从这个水平开始就存在着与患者向更坏预后进展的关系。
图21：胆碱激酶α表达与结瘤和/或转移出现的关系。图21a：与淋巴结瘤(数值由空方格□表示)或转移(数值由实心圆●表示)的出现相关的阴性和阳性患者中胆碱激酶α的平均表达水平；直线相交在与被认为能够帮助观察各组间水平区别的特征有关的阳性或阴性个体相对应的平均值位置。图21b：在根据胆碱激酶α表达水平划分的患者的各组中进行转移的患者(连续黑色的条形柱，
Figure A20068001803000091
)和未进行转移的患者(斜线标记的条形柱，//)的比例；其中根据胆碱激酶α表达水平划分的组包括：低水平(位于左边的一对条形柱)，中等水平(位于图中间的一对条形柱)或高水平(位于图右边的一对条形柱)。
图22：建立在能够合成干扰RNA基础上的结构的作用流程图。在阻抑物存在下(左侧部分，“无表达”，它与此结构结合并抑制RNA的合成)；在诱导剂(强力霉素)存在下，它与阻抑物结合，阻止阻抑物与此干扰结构的结合，从而允许干扰RNA的合成(右侧部分，“表达”)。
图23：在生长允许条件下(“对照”栏)或胆碱激酶MN58b的化学阻抑物(中间栏)或RSM936(右侧栏)存在的条件下，MDA-MB-231细胞(上排噬斑)和Ch-ind-1细胞(下排噬斑)的增殖。
图24：10天(“10d”)或20天(“20d”)后，在缺乏(“-”)或存在(“+”)10μg/ml的强力霉素的条件下，行为或MDA-MB-231细胞(标为“MDA”的条形柱)和Ch-ind-1细胞(标为“Chind1”的条形柱)。A：根据胆碱激酶α与GAPDH水平之间的比率的对胆碱激酶α遗传抑制的作用。B：根据pCNA和GAPDH水平的比率对细胞增殖的作用。C：在吸收值为500nm时，Ch-ind-1细胞在缺乏(虚线)或存在(实线)诱导剂的条件下的不同时刻所观察到的细胞生存能力。D：根据降解的PARP蛋白质水平与总PARP蛋白质水平的比率(PARPdig/PARP总)的对细胞凋亡诱导的作用。
图25：抗胆碱激酶β的多克隆抗体的特异性。A：免疫测定，其中抗胆碱激酶β多克隆抗血清与转染了空载体(标记为“空”的泳道)，胆碱激酶α表达载体(标记为“ChoKA”的泳道)，胆碱激酶β表达载体(标记为“ChoKB”的泳道)和嵌合蛋白——胆碱激酶β-绿荧光蛋白表达载体(标记为“ChoKB5’GFP”的泳道)的细胞样品相互作用。箭头表示胆碱激酶β和嵌合蛋白的条带高度。B：免疫测定，其中抗胆碱激酶α多克隆抗体与转染了空载体(标记为“空”的泳道)，胆碱激酶α表达载体(标记为“ChoKA”的泳道)，胆碱激酶β表达载体(标记为“ChoKB”的泳道)和嵌合蛋白——胆碱激酶β-绿荧光蛋白表达载体(标记为“ChoKB5’GFP”的泳道)的细胞样品相互作用。箭头表示胆碱激酶α的条带高度。
图26：胆碱激酶α和β肿瘤发生能力的比较。从向小鼠进行注射细胞开始，随X轴显示的时间(周)，以平方厘米测量的肿瘤体积的进展，其中所述细胞转染了：空载体(数据由菱形块表示“◆”)，胆碱激酶α表达载体(数据由方形块表示“■”)，胆碱激酶β表达载体(数据由三角块表示“▲”)，以及胆碱激酶α表达载体+胆碱激酶β表达载体(数据由×表示“×”)。
图27：通过实时定量PCR在肺癌患者组织中测定的胆碱激酶β信使RNA，用以10为底，由此测定的数量与正常组织中数量的比率的对数表示。
发明详述
为帮助理解本专利申请，将本发明上下文中一些术语和表述定义如下：
术语“受试者”或“个体”指哺乳动物种类中的成员，包括但不限于驯养的动物，灵长类和人类；受试者优选为任何年龄、任何种族的男性或女性人类。
术语“癌症”指这样的疾病，其特征在于能侵袭相邻组织和向远处器官扩散的细胞的异常或无控制生长。
术语“癌瘤”指由所述异常或无控制的细胞生长导致生成的组织。
术语“乳腺癌”或“乳腺癌瘤”指任何恶性增殖乳腺细胞紊乱。
术语“结肠癌”或“结肠癌瘤”指任何恶性增殖结肠细胞紊乱。
术语“直肠癌”或“直肠癌瘤”指任何恶性增殖直肠细胞紊乱。
术语“肿瘤”指由良性(非癌的)或恶性(癌的)致瘤性过程产生的任意异常组织团块。
术语“基因”指编码蛋白质的脱氧核糖核苷酸分子链。
术语“DNA”指脱氧核糖核酸。DNA序列为脱氧核糖核苷酸序列。
术语“cDNA”指mRNA序列的互补核苷酸序列。
术语“RNA”指核糖核酸。RNA序列为核糖核苷酸序列。
术语“mRNA”指信使核糖核酸，它是总RNA中翻译蛋白质的部分。
术语“从……转录的mRNA”指作为第一步基因(DNA)向mRNA中的转录，从而表达该基因和将其翻译为蛋白质。
术语“核苷酸序列”或“nucleotidic序列”无明确区别地指核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)序列。
术语“蛋白质”指由共价或非共价键连接的分子氨基酸链。该术语包括翻译后修饰的全部形式，例如糖基化，磷酸化或乙酰化。
术语“肽”和“多肽”指代表蛋白质片段的分子氨基酸链。术语“蛋白质”和“肽”的使用无明确区别。
术语“抗体”指对目标分子表现出特异性结合活性的糖蛋白，该目标分子指“抗原”。术语“抗体”包括单克隆抗体或多克隆抗体，及其整体或片段；它包括人抗体，人源化抗体，和非人源抗体。“单克隆抗体”为定向对抗单一抗原位点或“决定子”的高特异性抗体的同源群体。“多克隆抗体”包括定向对抗不同抗原决定子的抗体异源群体。
术语“表位”，如在本发明中使用的，指蛋白质的抗原决定子，该蛋白质是为特异性抗体所识别的蛋白质的氨基酸序列。
术语“治疗目标”指能够针对其进行设计并临床使用药物或治疗化合物的核苷酸或肽序列。
术语“拮抗物”指抑制被对抗分子生物活性的任何分子。拮抗分子的实例包括，其中，蛋白质，肽，天然肽序列变异和小有机分子(具有低于500道尔顿的分子量)。
本发明中使用的术语“正常参考值”指健康个体中出现的某些蛋白质，mRNA或其他身体代谢物的水平。
本发明使用的术语正常组织指非癌症组织，包括商业细胞培养物。
本发明基于胆碱激酶α蛋白在肿瘤过程中表达增高的发现，特别是，肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌。本发明还基于过表达所述蛋白质体内诱导肿瘤且因此对该酶表达和/或活性的抑制是治疗癌症，特别是肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌的优秀方法的惊人发现。因此胆碱激酶α在人类肿瘤发生中是优秀的潜在治疗目标。
在此意义上，本发明首先提供一种检测个体中癌症，优选肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的存在，确定所述个体中癌症的阶段和严重度，或监测对患有所述癌症的个体进行治疗的效果的体外方法，该方法包括：
a)检测和/或定量所述个体样品中胆碱激酶α蛋白，胆碱激酶α基因mRNA或相应cDNA，和
b)将从所述个体样品中检测到胆碱激酶α蛋白的量，胆碱激酶α基因mRNA的量或相应cDNA的量与从对照个体样品，或从同一所述个体的早期样品检测到的胆碱激酶α蛋白的量，胆碱激酶α基因mRNA的量或相应cDNA的量，或与正常参考值进行比较。
本发明提供的方法具有高敏感性和特异性，且基于这样的受试者或个体：诊断为癌症，优选肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌，并与来源于无这些癌瘤病史受试者的样品中的相应水平相比，具有高胆碱激酶α基因转录mRNA水平或高胆碱激酶α基因编码的蛋白(胆碱激酶α蛋白)浓度。然而，胆碱激酶β基因在人体的表达与此前提到的任何癌症类型不相关联。
本发明的方法包括从个体获得样品的步骤。能够使用不同的液体样品，例如尿液、血液、血浆、血清、胸膜液、腹水、滑液、胆汁、胃液、脑脊液、粪便、唾液、支气管镜检样品液等。能够利用任意常规方法获得样品，优选地使用外科切除术。
样品能够从预先诊断或未诊断有某种癌症的受试者中获得，或者还能够从正在进行治疗的受试者，或曾经对癌症，特别是肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌，治疗过的受试者中获得。
本发明的方法进一步包括样品提取步骤，用于从样品获得蛋白质提取物或获得总RNA提取物。这两种提取物之一代表了下一阶段的工作物质。提取总蛋白质或总RNA的方案已为本领域技术人员所熟知(ChornczynskiP.et al.，Anal.Biochem.，1987，162：156；Chornczynski P.，Biotechniques，1993，15：532；Molina，M.A.，et al.，Cancer Res.，1999，59：4356-4362)。
能够在本发明的框架中使用任何常规分析，以用于检测癌症，只要该方法能够从待分析个体和对照个体收集的样品中体外测量胆碱激酶α基因转录mRNA水平或其互补cDNA水平，以及胆碱激酶α蛋白浓度。
因此，本发明提供一种用于检测癌症特别是肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的存在，确定所述癌症在个体中的阶段或严重度，或监测对患有所述癌症的个体进行治疗的效果的方法，该方法基于对胆碱激酶α蛋白浓度的测量，或基于对胆碱激酶α基因表达水平的测量。
在目的为检测胆碱激酶α蛋白的情形，本发明的方法包括将从样品获得的蛋白提取物置于与对抗胆碱激酶α蛋白一个或多个表位的一种或多种特异性抗体组合物相接触的第一步骤，以及量化由抗体和胆碱激酶α蛋白形成的复合物的第二步骤。
存在着广泛多样的用于检测并量化特意性抗原-抗体复合物形成的免疫学测定方法；此前已描述了大量的竞争性或非竞争性蛋白结合测定方法，且其中大量可商业获得。
因此，能够利用抗体来量化胆碱激酶α蛋白，所述抗体是例如单克隆抗体，多克隆抗体，它们是完整的或是其片段，特异性对抗胆碱激酶α蛋白的抗体的“combi-bodies”和Fab或ScFv片段；这些抗体是人，人源化或非人来源的抗体。这些测定方法中使用的抗体可以是标记的或未标记的；未标记抗体可以用于凝集测定；标记的抗体可以在广泛多样的测定中使用。可以用于标记抗体的标记分子包括放射性核苷酸、酶、荧光团、化学发光剂、酶促底物或辅因子，酶促阻抑物、颗粒、染料和衍生物。
存在着广泛多样的能够在本发明中使用的，利用未标记抗体(一抗)和标记抗体(二抗)的已知测定方法；这些技术包括：蛋白质印迹法，ELISA(酶联免疫吸附测定)，RIA(放射免疫测定)，竞争性EIA(竞争性酶免疫测定)，DAS-ELISA(双抗体夹心-ELISA)，免疫细胞化学和免疫组织化学技术，基于使用包括特异性抗体的蛋白质生物芯片或微点阵的技术，或基于如浸量尺(dipstick)形式胶状沉淀的测定。检测和量化蛋白EFNB2或蛋白EDNRA的其它方法包括亲和层析技术、配体结合试验或凝集素结合试验。
本发明方法中优选的免疫测定是双抗体夹心-ELISA(DAS-ELISA)测定。任何特异性对抗胆碱激酶α蛋白一个或多个表位的抗体或抗体组合能够用于该免疫测定。作为该测定的众多可能形式之一的实例，将包被固相的单克隆或多克隆抗体，或该抗体的片段，或抗体的组合置于与待分析的样品接触，并在适当的条件下孵育适当的时间，以形成抗原-抗体复合物。经在适当的条件清洗以去除非特异性复合物后，将与信号产生化合物结合的指示剂在适当的条件下，与抗原-抗体复合物孵育适当的时间，所述指示剂包括单克隆或多克隆抗体或该抗体的片段，或这些抗体的组合。如果待分析样品中存在胆碱激酶α蛋白，通过测量产生的信号来检测和量化待分析样品中出现的胆碱激酶α蛋白。待分析样品中存在的胆碱激酶α蛋白的量与该信号成比例。
在目的为检测相应于胆碱激酶α基因的mRNA或cDNA，而非它们编码的蛋白质的情形中，本发明体外检测癌瘤的方法有多种步骤。因此，一旦获得了样品并提取了总RNA，本发明检测胆碱激酶α基因mRNA或相应cDNA的方法包括：第一步，扩增总RNA提取物中存在的mRNA，或通过mRNA反转录合成的相应的cDNA；第二步，量化胆碱激酶α基因mRNA或cDNA的扩增产物。
扩增mRNA的一个实例由如下步骤组成：反转录mRNA为cDNA(RT)，随后进行聚合酶链反应(PCR)；PCR是扩增包含在核苷酸序列混合物中某特定核苷酸序列(目标)的技术。在PCR中使用过量的与目标核苷酸序列互补链杂交的寡核苷酸引物对。然后具有聚合酶活性的酶(DNA Taq聚合酶)以目标核苷酸序列作为模板延长每个引物。再将延长产物与起始目标链解离后转化为目标序列。新引物分子杂交，且聚合酶对其进行延长；重复该循环，从而使目标序列的数量呈指数增加。该技术在专利US4,683,195和US 4,683,202中有所描述。先前已经描述了许多检测和量化PCR扩增产物的方法，且本发明能够使用其中任何方法。在本发明的一个优选的方法中，利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
在另一个实施例中，通过转移技术，例如RNA印迹法，将mRNA转移到尼龙膜来进行mRNA的检测，以及利用胆碱激酶α基因mRNA或相应cDNA的特异性探针进行检测。
在一个具体的实施方案中，胆碱激酶α基因相应的mRNA的扩增和量化是利用实时定量RT-PCR(Q-PCR)同时进行的。
本发明体外检测来源于个体的样品中的问题癌瘤方法的最后步骤包括：将从个体中获得样品中的胆碱激酶α蛋白的量，胆碱激酶α基因mRNA量或相应cDNA的量，与从对照受试者样品，或从同一所述个体的早期样品检测到的胆碱激酶α蛋白的量，胆碱激酶α基因mRNA的量或相应cDNA的量进行比较，或与正常参考值进行比较。
在第二个目的中，本发明还提供一种鉴定和评估用于癌症治疗，优选地用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌治疗的化合物的攻效的体外方法，该方法包括：
a)在适合条件下，使肿瘤细胞培养物，优选的肺肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、结肠或直肠肿瘤细胞与候选化合物接触适当的时间，以允许它们相互作用，
b)检测和量化胆碱激酶α基因或胆碱激酶α蛋白的表达水平，和
c)将所述表达水平和未经候选化合物处理的对照肿瘤细胞培养物中相应的表达水平进行比较。
以类似于本发明方法中所说明的体外检测个体中存在的肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的方法，进行胆碱激酶α基因或胆碱激酶α蛋白的表达水平的量化。
当一种试剂降低胆碱激酶α基因的表达水平或逆转所述基因的高表达作用，优选地降低细胞增殖水平，该试剂成为癌症治疗的候选者。
因此，本发明的另一个目的涉及来源于胆碱激酶α基因的核苷酸或肽序列在寻找、鉴定、开发和评估用于癌症治疗，优选地用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌治疗的化合物的攻效的方法中的应用。必需指出通过基于潜在药物分子与治疗目标的竞争性或非竞争性结合的药物筛选方法而获知的重要性。
本发明的另一个附加目标涉及来源于胆碱激酶α基因的核苷酸或肽的应用，以用于检测癌症存在，特别是肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌；用于决定个体中所述癌症的阶段或严重度，或用于监测对患有所述这些任意癌症的个体进行治疗的效果。
本发明的另一个目标由提供以抑制胆碱激酶α蛋白表达和/或活性为特征的试剂组成。能够根据本发明鉴定和评估的这些试剂，所述试剂选自由下列各项组成的组：
a)特异性对抗胆碱激酶α蛋白中存在的一个或多个表位的抗体，或抗体的组合，优选地为人或人源化的单克隆抗体；还能是所述抗体的片段，单链抗体或抗独特型抗体，
b)抑制胆碱激酶α蛋白表达和/或活性的细胞毒性试剂，如毒素，具有放射活性原子的分子，或化学疗法试剂，包括但不限于小有机和无机分子，肽，磷酸肽，反义分子，核糖核酸酶，siRNAs，三螺旋分子，等，和
c)抑制胆碱激酶α蛋白一个或多个功能的胆碱激酶α蛋白的拮抗化合物。
一种包含治疗有效量的一种或多种上文所提及的试剂和一种或多种赋形剂和/或载体物质的药物组合物还构成本发明的一个目标。另外，所述组合物可包含任意其他不抑制胆碱激酶α蛋白功能的活性成分。
该赋形剂、载体物质和辅助物质必须是药用的和药理学允许的，它们从而能够与剂型或制剂的其他化合物结合，且对被处理的生物体没有不利影响。该药物组合物或剂型包括适合口服或肠胃外施药(包括皮下、皮内、肌内和静脉内)的化合物，尽管最佳施药途径依赖于患者的条件。该剂型可以是单剂量形式。该剂型可根据药学领域的已知方法制备。待施用的活性物质的量可根据治疗的特殊性而变化。
本申请的另一个方面由一种实施本发明的诊断试剂盒组成。因此，在一个具体实施方案中，本发明包括一种试剂盒，该试剂盒包括存于适当容器中的特异性识别胆碱激酶α蛋白的抗体和载体。在另一个具体的实施方案中，该试剂盒用于检测个体中癌症的存在，优选地肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌；用于决定该个体中所述癌症的阶段或严重度；或用于监测对患有所述癌症的个体进行治疗的效果。
本发明的最后一个方面由诊断患有乳腺癌、肺癌或膀胱癌的患者的存活时间的体外方法组成，该方法包括通过确定所述样品中与选自其信使RNA水平的胆碱激酶α蛋白，所述蛋白质的浓度或所述蛋白质的酶活性有关的参数中的至少一个，对胆碱激酶α蛋白在从患者提取的癌组织样品中的表达水平进行评估；以及对获得的数值与相应于一个或多个正常非癌组织样品的数值进行比较。
以下实施例例证本发明。
实施例1
同种型的胆碱激酶活性
如图1所示，通过酶CKα2(52kDa，457个氨基酸)和CKβ1(45kDa，395个氨基酸)在ATP和镁存在下，从胆碱生产磷酸胆碱的能力，确定其具有有效的胆碱激酶活性(图1A)。该活性在E.Coli中表达的重组形式和经转染的人HEK293细胞中都有所显示。然而，且尽管两种酶都具有胆碱激酶活性的事实，活细胞中磷酸胆碱的胞内水平并不是等同变化的，而是实际上在过表达胆碱激酶β的细胞中不能检测到(图1B)。这些结果暗示了这两种蛋白质的生理学调节和生物学功能，并且因此，它们在肿瘤发生中的行为可能有差别。
实施例2
抗体的特异性
开发了识别胆碱激酶α酶的多克隆和单克隆抗体，所述胆碱激酶α酶被半纯化且表达为生成阶段中的抗原和该过程的其他阶段中的生产对照的蛋白质。尽管已经针对胆碱激酶α进行了开发，但由于两种酶(CKα和CKβ)的全序列中具有65％的全面的同源性，且在一些保守的区域，如胆碱结合和催化活性结构域的同源性高达75％的事实，检查哪一个同功酶能够识别生成的多克隆和单克隆抗体是必要。我们已经证明了使用的多克隆和单克隆抗体都对胆碱激酶α具有特异性，且它们不识别胆碱激酶β。为达到目标，在人HEK293T细胞中过表达胆碱激酶α和β蛋白，且在检查到这两种蛋白是存在并且有活性(图2A)以后，利用免疫检测技术(蛋白质印迹法)对经先前研究过的多克隆抗体(Ramirez de Molina，A.，Gutiérrez，R.，Ramos，M.A.，Silva，J.M.，Silva，J.，Sanchez，J.J.，Bonilla，F.，Lacal，J.C.Oncogene 21，4317-4322(2002)；Ramirez de Molina，A.，Rodriguez-Gonzalez，A.，Gutiérrez，R.，Martinez-Pinero，L.，Sanchez，J.J.，Bonilla，F.，Rosell，R.，Lacal，J.C.Biochem.Biophys.Res.Common.296，580-583(2002))和产生的抗胆碱激酶α的新单克隆抗体进行了分析。如图2B所示，其显示用这些抗体中的两个的实施例，即使通过在使活性升高80倍的条件下过表达胆碱激酶β，也无抗体识别该同工型，而在所有情形的相同条件和内源控制水平中，均高度识别胆碱激酶α。这些结果显示先前对使用多克隆抗体小组的研究定义胆碱激酶α为在来源于人肿瘤细胞品系和被分析的肿瘤自身过表达的同工酶。
通过已给定义并没有预期到这些结果，多克隆抗体识别分子中的不同表位，且胆碱激酶α和β序列65％同源，在一些区达到75％，特别是在催化区和底物和ATP结合区所在的共有结构域。
实施例3
肿瘤的特异性：不同人肿瘤中胆碱激酶α的改变。
具有证实了的对胆碱激酶α的特异性的抗体的可用性允许了在发达国家中一些目前最重要的肿瘤如乳腺癌、结肠癌和肺癌中，研究胆碱激酶α表达的可能变化。为进行该研究，对从38-50名不同的，患有以上癌症中的一种的患者获得的样品进行石蜡切片，并利用免疫组织化学法(IHQ)分析胆碱激酶α的表达，其中IHQ是一种允许检测和确定“原位”生物分子成分，且在任何医院的病理解剖能以自动化的方式进行的技术，其中“原位”生物分子成分是细胞和组织的整体部分。在这些患者的乳腺、结肠或肺样品中，发现：
-所有情形中，用识别胆碱激酶α的抗体进行的肿瘤染色是高度特异的，从而允许了肿瘤组织和正常邻接组织间的明显区别。
-正常组织染色没有在任何情形发生。
-胆碱激酶α酶在该类型肿瘤中在62％-100％的范围内过表达，说明在人肿瘤发生过程中该同工型——胆碱激酶α的高参与性。
图3观察由目前占肺癌80％的大细胞肺癌(NSCLS)获得结果的实施例。如能观察到的，出现了特异于肿瘤结且如上文所示特异性染色样品62％的胆碱激酶α的细胞质染色。
根据该概念，对38名患有乳腺癌的患者进行了相似的研究，再一次观察到了占97％的情形中胆碱激酶α特异于肿瘤组织的过表达(图4)。
最后，还对结肠癌中胆碱激酶α的表达进行了研究，为了该目的，对从不同经历四年跟踪的结肠癌患者所获得的40个样品进行了石蜡切片分析。该分析开始于阶段I，II，III和IV的原位癌瘤。与前一种情形类似，将每个切片上的与肿瘤组织邻接的正常组织作为正常组织。没有在这40个样品中的任何一个及任何情形观察到正常组织的阳性染色，从而证实了胆碱激酶α对肿瘤组织染色的高度特异性，在所有情形中再一次观察到了该酶的过表达(图5A)。这些结果支持该酶的同工型在结肠癌中的高参与性。此外，该结果引导了对瘤前损伤，ACFs和不同程度发育异常的息肉的分析，其结果清楚地显示胆碱激酶α的过表达是在与异常发育同时发生的结肠组织肿瘤过程中的早期事件，提示它在这些肿瘤中作为“守门者(gate-keeper)”基因的潜在行为，以及由此其作为一种潜在的新的治疗目标的相关性。图5B显示了息肉，在其中能够显示出正常组织的染色几乎无法检测，随着发育异常的开始发生(双核细胞)染色增加了，在肿瘤团块中愈加强烈。
实施例4
肿瘤的特异性：胆碱激酶α酶的致癌行为。
已知在目前一些最重要的人类肿瘤中胆碱激酶α异常调控的高发生率，进行研究以确定该蛋白是否单独具有致癌能力，即胆碱激酶α是否具有致癌活性。为了进行该研究，首先研究了该基因是否在附着不依赖性培养基中赋予生长能力，这涉及到对其转化能力的测定。利用作为对照的空载体，以及胆碱激酶α表达载体转染人HEK293T细胞，并接种于软琼脂。如能在图6中所看到的，该蛋白的过表达足以诱导人HEK293T细胞和上皮狗MDCK细胞的致癌转化。
已知胆碱激酶α在人HEK293T细胞中具有转化活性，对其致癌潜力进行了体内分析。为实现该目的，向免疫抑制小鼠(Nu/Nu)注射一百万个过表达作为对照的空载体或胆碱激酶α表达载体的人HEK293T细胞。注射后对肿瘤生长进行50天的至少每周两次的监测。对照细胞没有在任何注射小鼠中诱导产生任何肿瘤，而过表达胆碱激酶α的细胞在30只注射小鼠中的8只(26％)中诱导出现了肿瘤，45天后达到平均值为0.6cm3(图7)。这些结果显示胆碱激酶α的过表达足以体内诱导肿瘤，因此在人类肿瘤发生中是一个良好的潜在治疗目标。为了证实由胆碱激酶α产生的肿瘤保持其增高的表达和活性，手术提取、溶解该肿瘤，并以它的双亲HEK293T细胞中相应的水平作为对照确定该酶的活性和表达水平。如图8所示，所有被分析的肿瘤以相似于接种前获得的形式保持其高表达和酶活性水平，从而显示胆碱激酶α的过表达诱导体内肿瘤发生。
实施例5
药理学特异性
一旦证实了胆碱激酶α同工型的致癌活性，以及在人肿瘤中过表达的高发生率，又研究了阻抑物MN58b的抗肿瘤作用是否特异于该胆碱激酶α同工型(Hernández-Alcoceba，R.，Saniger，L.，Campos，J.，
Figure A20068001803000201
M.C.，Khaless，F.，Gallo，M.A.，Espinosa，A.，Lacal，J.C.Oncogene，15，2289-2301(1997)；Hernandez-Alcoceba，R.，Fernandez，F.，Lacal J.C.Cancer Res.59，3112-3118(1999)；Ramirez de MolinaA.，
Figure A20068001803000202
-Coronel M.，Gutiérrez R.，Rodriguez Gonzalez A.，OlmedaD.，Megias D.，Lacal J.C.Cancer Res.64：6732--6739(2004))，或者相反地，是否还能归结于它与胆碱激酶β同工型可能的相互作用。因为这两个胆碱激酶α和胆碱激酶β同工型在底物结合结构域和催化域中共享高达75％的同源性，所以该证明是必要的。为实现该目的，在缺乏胆碱激酶活性的E.Coli细菌菌株中表达这两种胆碱激酶同工型(CKα和CKβ)，因此观察到的任何酶活性全部地归功于该重组表达的胆碱激酶同工型。如图9所示，胆碱激酶α的酶活性受MN58b处理的影响，该影响比同种阻抑物对该β同工型的影响更为明确。实际上，MN58b对胆碱激酶α的活性的影响是对胆碱激酶β活性影响的20倍。
已知通过胆碱激酶α的过表达能体内产生肿瘤，且MN58b对该同工型具有特异性，还证实了由ChoKα诱导的肿瘤的生长是否易受MN58b抑制的影响。为实现该目的，将一百万个显示出胆碱激酶α酶高度过表达的ckα基因转染的人类HEK293T细胞皮下注射到免疫抑制Nu/Nu小鼠中。当肿瘤达到体积为0.1cm3时，开始用特异性胆碱激酶α阻抑物——MN58b进行处理，该处理通过在无菌生理血清中腹膜施药以5mg/Kg的剂量进行了连续5天，并休息9天进行。对照小鼠获得相同的载体剂量，根据同样的日程表，每周至少两次地对肿瘤进行监测。如图10所示，胆碱激酶α的抑制导致对肿瘤生长的强烈抑制，达到80％的肿瘤生长的降低。这些结果显示不仅胆碱激酶α过表达足以体内诱导肿瘤，而且肿瘤细胞的增殖依赖于胆碱激酶α的活性。
实施例6
遗传特异性
所有这些结果支持胆碱激酶α在用于新的抗肿瘤方案的设计中作为一个新的治疗目标的潜力。然而，化学阻抑物能够通过对研究人员而言隐藏的影响发挥其抗增殖作用，即使将其设计为特异性对抗某种酶，如阻抑物MN58b的情形。文献中存在着大量这样的情形，其中显示设计为特异性对抗一种激酶的阻抑物还影响其它相互间甚至不密切相关的激酶。在过去的几年中新近开发了一种方法，该方法通过使用能够准确敏感地消除某一蛋白质的mRNA而不影响其它细胞蛋白质的siRNA(小干扰RNA)，允许了更准确地建立特定酶的干扰作用。在这种情形，证明了通过使用特异于胆碱激酶α的阻抑物MN58b实现的药理学干扰，通过利用siRNA技术实现的胆碱激酶α特异性抑制，在遗传水平上具有确定性。该技术将允许明确地确认ChoKα作为癌症新的治疗目标。为了这个目的，生产了具有与胆碱激酶α信使RNA杂交能力且因此能够特异性阻止该蛋白质表达的寡核苷酸(称为siCHKA)。首先证明了该siRNA有效地阻止了胆碱激酶α在人HEK293T细胞中的表达，该内源蛋白和ChoKα熔合于GST，并转染到相同细胞中(图11)。
一旦证明了该特异于胆碱激酶α的干扰RNA确实能够有效地阻止该蛋白的表达，就证明了它在从人乳腺癌瘤，MIDA-MI3-231获得的肿瘤细胞中的作用，在其中已描述了利用MN58b对胆碱激酶的药理学抑制诱导由细胞凋亡引起的强烈抗肿瘤作用。如图12所示，尽管在这些细胞中获得了较低的转染效率，但是观察到MDA-MB-231中siCHKA的转染暗示了对胆碱激酶α表达和其酶活性的抑制。为证明通过siRNA实现的胆碱激酶α的遗传抑制作用相似于通过用MN58b的药理学抑制获得的作用，从而明确地证明对胆碱激酶α作用的特异性，确定了经干扰siCHKA转染后细胞的生存能力。如在用MN58b处理肿瘤细胞后所发生的一样，观察到了细胞生存能力的降低，该降低与特异于经胆碱激酶α干扰试剂转染的细胞的细胞凋亡引起的死亡有关(图13)。
最后，如用RMN58b处理所发生的一样，证明了特异于胆碱激酶α的干扰siCHKA的表达，对正常初级人乳腺细胞HMEC(人乳腺上皮细胞)的生存能力没有影响。在这些细胞中，该蛋白质的基线表达水平非常低，说明如已描述的那样，肿瘤细胞有组织地过表达胆碱激酶α。然而，尽管在初级细胞HMEC中胆碱激酶α的低基线表达，但是获得了胆碱激酶α酶表达的明显干扰，且能够观察到不同于在肿瘤细胞中发生的情况，这些细胞是如何不因为细胞凋亡而死亡，而是周期性捕获的(图14)，与在经阻抑物PAN58b处理的相同细胞中观察的结果相同(Rodriguez--Gonzalez A.，Ramirez de Molina A，Fernández F.，Ramos M.A.，
Figure A20068001803000221
M.del C.，Campos，J.M，Lacal J.C.Oncogene 22：8803-8812(2003)；Rodriguez-Gonzalez A，Ramirez de Molina A，Fernandez F.，Lacal. JC.Oncogene23：8247-8259(2004)；Rodriguez-Gonzalez A.，Ramirezde Molina A.，
Figure A20068001803000222
-Coronel M.，Megias D.，
Figure A20068001803000223
M.C.和Lacal J.CInt.J.Oncol 26：999-1008(2005))。
实施例7
胆碱激酶α在乳腺癌中的作用：存活的发生率
为了拥有证实胆碱激酶α在肿瘤发生和发展中的参与性的定量数据，进行了额外测定以量化它们在患者中的表达以及它们与所述患者发展的预后间可能的关系，所述患者患有看起来与胆碱激酶α特异性相关类型的癌症(乳腺癌、肺癌和膀胱癌)。
一方面通过从患者样品中分离信使RNA进行胆碱激酶α表达的定量分析。为了实现该目的，利用仅识别本研究中对应于ChoKα的信使RNA的特异性Taqman探针，进行自动化实时定量PCR反应。获得的数据用以10为底的与正常组织的对照样品的比例的对数来表示。
在与乳腺癌相关的获取数据的情形，获得的结果如图15a所示。能观察到具有高于ChoKα中值活性水平的样品对应于具有更坏预后的患者(淋巴结瘤的出现，转移的发育，更低的存活率)。图15b和15c的数据证实了这些数据。在图15b中，由从63名乳腺癌患者获得的数据制成，能够观察到出现转移患者中ChoKα表达的平均值是如何(以基因的相对表达单位来计算，利用2-ΔΔct方法由mRNA水平计算而来(Livak，K.J.和Schmitttgen，T.D.(2001)Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(Delta-Delta C(T))Method.Methods 25，402-408)远远高于不出现转移的患者。如果根据淋巴结瘤的出现来表示这些患者存活概率，其中淋巴结瘤的出现与相对于对照ChoKα表达的增高显著相关(p＜0.001)，则能够在经典的Kaplan Meier曲线(Kaplan EL，Meier P，Nonparametric estimation from incompleteobservations.J.Am.Stat.Assoc.，53：457-481(1958))中观察到随着阳性淋巴结瘤增加的出现存活概率是如何显著降低的(p＝0.046)(图15c)，当根据ChoKα的表达来表示患者的存活时，观察到相同的趋势(p＝0.059)。
实施例8
胆碱激酶α在肺癌中的作用：过表达水平和存活发生率
为对胆碱激酶α在肺癌中的过表达重要性的研究进行补充，进行了一些测试。
首先，又一次通过利用特异性Taqman探针的自动化实时定量PCR反应检测了来源于肺癌患者细胞品系的相应于所述酶的mRNA水平。该检测在以下两类细胞品系中进行：相应于最常见肺癌类型(75％-85％)——非小红细胞或NSCLC(非小细胞肺癌)的细胞品系，以品系H460和H1299为代表；和相应于其它癌症类型——小红细胞或SCLC(小细胞肺癌)的品系，以品系H510和H82为代表。数据用以10为底的与正常初级人类支气管上皮细胞——BEC的比的对数表示。结果如图16a所示。该数据由通过利用单克隆抗体的免疫测定检测到的在每个细胞品系中的蛋白质水平的数据(图16b)和通过测量标记底物(Cho)30分钟后产生的具有放射活性的标记产物(PCho)从而在相同品系中检测到的可测酶活性的数据来补充(图16c)。在所有情形都观察到了一个与对照相比的增高，在SCLC品系特别是H510的情形中尤为可观。
还检查了在所述细胞品系中由添加MN58b所导致的ChoK抑制引起的抗增殖作用，获得的结果显示于下表中，其中圆括号内的数字表示每个细胞与初级细胞相比的敏感度。在所有分析时期内，初级细胞和这四个来源于肿瘤的细胞品系的差别是显著的(p：＜0.001)。
表1，ChoK对来源于人肺肿瘤细胞品系的抑制的抗增殖作用。
  细胞品系   48小时IC50(μM)   72小时IC50(μM)   114小时IC50(μM)
  初级   BEC   40.5±6.2   18.3±4.8   4.2±0.8
  初级   HMEC   44.7±4.95   20.9±2.7   3.4±0.13
  NSCLC   H1299   10.3±2.5(4)   2.7±0.7(8)   0.9±0.1(4)
  NSCLC   H460   7.03±2.03(6)   2.6±0.8(8)   1.1±0.1(3)
  SCLC   H510   1.1±0.1(41)   0.4+0.05(53)   0.1+0.03(27)
  SCLC   H82   1.9±0.2(24)   0.8±0.04(27)   0.27±0.01(12)
这些结果由对来源于肺癌患者的人肿瘤样品ChoKα过表达的研究来补充，特别是在从来源于NSCLC患者早期提取肿瘤的组织中。图17显示由对应于进行了所述的早期手术的患者中ChoKα的信使RNA的实时定量PCR分析获得的结果，结果显示在疾病的如此早期阶段，与正常组织相比，ChoKα已经在53％的情形中过表达了。再一次，当分析ChoKα表达与癌症的严重程度(转移的阶段和存在或缺失)的相互关系时，观察到了高ChoKα表达与高肿瘤恶性相关，如表2所示：
表2，根据肺癌严重程度的ChoKα的过表达
Figure A20068001803000251
a肿瘤很小的阶段，几乎不存在或不存在结瘤且无转移的出现
b较大的涉及结瘤和转移出现的肿瘤的阶段
在乳腺癌的情形中，肺癌中NSCLC初始阶段中ChoKα的过表达与更坏的预后有关，如在图18中显示的曲线表中能观察到的。能够在该图中看见在没检测出直接ChoKα表达的那些患者中存活概率是如何随时间维持在数值1的，而在检测到ChoKα过表达那些患者中，概率降低，显示出当评估无疾病存活时的9个月份的中值，即从患者进行手术到经历复发的时间。
实施例9
胆碱激酶α在膀胱癌中的作用：过表达水平和存活发生率
对膀胱癌患者也进行了类似的研究。首先，检测了来源于膀胱癌患者细胞品系中相应于所述酶的mRNA水平，类似于实施例8中用于肺癌情形所描述的，该检测同样通过利用特异性Taqman探针的自动化实时定量PCR反应进行。使用了品系HT1376，J82，SW780，TCCSup和UMVC3，数据用以10为底的与正常无限增殖化膀胱细胞——Urotsa的比的对数表示。结果如图19a所示。该数据由通过利用单克隆抗体的免疫测定检测到的关于在每个细胞品系中的蛋白质水平的检测数据(图19b)和其中可检测到的酶活性的估算值(图19c)来补充。能观察到不同的细胞品系，与正常无限增殖Urotsa细胞相比，显示出增高的ChoKα水平，并且观察到来源于膀胱癌细胞品系中该蛋白质表达也伴随着相似的胆碱激酶活性的增高而增高。
此外，还检查了在这些细胞品系中由MN58b的添加导致的ChoK抑制引起的抗增殖作用，获得的结果显示于下表中，其中圆括号中的数字代表与具有较低ChoK水平的细胞品系——TCCSup有关的诱导因子，因为不认为用UrotSA获得的数据对进行与其关系的比较时足够可靠。
表3，对来源于人膀胱癌细胞品系的ChoK抑制引起的抗增殖作用
  细胞品系   TCCSup   HT1376   UMUC3   J82   SW780
  IC50(μM)(96小时)   3.7(1)   2.49(1.5)   1.98(1.86)   1.08(3.4)   0.91(4.1)
  ChoK表达   2.5(1)   5(2)   5(2)   12.6(5)   12.6(5)
  ChoK活性   3,681)   7(1.9)   9(2.5)   14.5(4)   15(4.2)
此外，为了建立体内观察到的作用的平行性，利用微点阵技术，特别是Affymetrix的U133 Plus 2.0芯片，对90名膀胱癌患者肿瘤组织中ChoKα的表达进行了分析。获得的结果如图20a所示。在所述表格中能够观察到比半数多一点，49名患者是如何显示出1-3倍的表达诱导因子；25名患者显示出3-8倍的表达诱导因子，以及他们中12名的表达诱导因子为8-24倍。
通过实时定量PCR测定(利用Taqman探针测定)验证由微点阵获得的数据，其结果显示于途20b中。在所述测定中，利用正常人膀胱组织的商业RNA作为参考，利用GAPDH作为内源对照。经分析的20个样品(其中10个样品对应于10名具有较低ChoKα表达的患者；另外10个对应于10名最高表达的患者)中的18个样品中，ChoK表达结果与关于Affymetrix微点阵和利用Taqman探针的分析的结果一致。肿瘤中ChoKα过表达的发生率为55％。有此过表达的患者是最大转移的。
ChoKα过表达与转移的进行过程间的关系由从点阵获得的所有患者ChoKα表达数据来确证，其结果示于图21a和21b中。图21a显示关于淋巴结瘤出现(以空方块为末端的直线所连接的数值)或转移发展(以实心圆为末端的直线所连接的数值)的阴性和阳性患者间平均ChoKα表达水平的变化。然而，图21b显示代表了低ChoKα表达(低(左侧的一对条形柱)，中等ChoKα表达(图表中间的一对条形柱)或高ChoKα表达(图表右侧的一对条形柱)患者组中，转移患者(连续暗色组成的条形柱，
Figure A20068001803000271
)和未转移患者(斜线组成的条形柱，//)比率变化的图表，其中能观察到低表达组中转移了的患者的百分数(53％)不比未转移患者的百分数(47％)高很多。而在高ChoKα表达组中，其中大部分，72％，发生了转移，剩余的28％没有转移。观察到ChoKα表达和转移发展之间的关系，该关系没有达到统计学显著水平。
为了证明体内ChoKα表达在膀胱癌中的相关性，使用了同位膀胱癌模型，该模型生理上非常相似于当利用MBT-2(小鼠膀胱肿瘤)细胞在膀胱中产生肿瘤时所发生的情况。在这些与正常小鼠细胞相比已经过表达了ChoKα的细胞中，为评估更高的ChoKα表达是否增强这些肿瘤的攻击性和扩散性，更加过表达了该蛋白质。为实现该目的，将含有空载体的MBT-细胞(小鼠对照组，由3只小鼠组成)或经含有编码该酶的序列的载体转染的过表达ChoKα的MBT-2细胞(小鼠的ChoKα组，由3只小鼠组成)通过导管直接接种于小鼠的膀胱中，所述空载体缺少允许表达ChoKα基因的序列。通过以钆为对照的核磁共振法以及小鼠中疾病的发展(生理条件，存活，肿瘤组织学研究，对肾和其它器官可能的入侵分析……)监测两组中肿瘤的发生。接种细胞19天后，ChoKα小鼠处于不良状态，其中2只具有很大的肿瘤，而获得空载体的小鼠(对照组)在接种细胞50天后开始处于不良状态。
实施例7、8和9的结果证实了在人乳腺肿瘤、肺部肿瘤和膀胱肿瘤中高发生率地过表达ChoKα。该过表达与指示较高恶性的临床参数：淋巴结瘤的出现，转移和低患者存活相关。
实施例10
遗传特异性：可诱导的干扰模型
已知ChoKα在肿瘤细胞中的干扰是通过细胞凋亡致命地诱导细胞死亡，如在瞬时测定中进行的实施例6所描述的测试所证实，不可能在这样的研究中获得表达该干扰结构的稳定的细胞群。该易变细胞群中的一部分在瞬时分析中受影响，而总群从不受到影响，这隐藏了结果。因为如果研究该结构在其同源表达的群体中的作用将更为有利，所以并不必须要有稳定的结构模型。这使得必须要有一种允许获得在ChoKα表达中同源干扰种群的可诱导的干扰模型。
为获得该模型，以一种结构来表达干扰序列，在所述结构中，干扰序列处于阻止其表达的阻抑物的控制下。进行了感兴趣可诱导结构和阻抑其表达的阻抑物的共转染，且一旦选定了具有该结构的同源种群，则用诱导剂处理这些细胞，这允许该结构的干扰表达，以及因此形成的蛋白质表达的干扰。
在为该分析设计的可诱导模型中，将ChoKα的干扰结构表达在载体pSUPERIOR-pure(Oligoengine)中，且将阻抑物表达在载体pcDNA6/TR(Invitrogen)中。使用的诱导剂为强力霉素，当其与阻抑物结合时，阻止阻抑物与相应的序列结合，因此干扰序列的表达不再受到阻止。该系统的流程图见图22。
图23和24显示从来源于MDA-MB-231细胞品系且能在经诱导试剂强力霉素处理后表达该干扰结构的Ch-ind-1细胞中获得的结果。图23显示该可诱导品系仍然以类似于MDA-MB-231(来源于产生了Ch-ind-1的乳腺癌的双亲对照品系)中所发生的形式敏感于ChoKα的化学抑制，正如同在用胆碱激酶阻抑物MN58b或RSM936处理后获得的结果在两个品系中相似。然而，图24显示，当用10μg/ml的强力霉素处理这两个细胞品系时，ChoKα的遗传抑制仅发生在Ch-ind-1中，正如同利用强力霉素进行的对干扰模型的诱导仅发生在品系Ch-ind-1中，这是因为它具有当阻止了阻抑物的结合时能发生干扰RNA合成的结构。ChoKα的遗传抑制与细胞增殖的降低(通过pCNA决定)和由细胞凋亡引起的细胞死亡的增加(通过细胞凋亡指示剂PARPdig——退化PARP蛋白决定)相关。尽管还很初始，10天后开始看到这些作用，且在实验开始20天后更加明确(其中种群几乎无ChoKα表达)。
由可诱导模型获得的结果确证了前面从瞬时分析中获得的数据，表明观察到的作用归功于对ChoKα的特异性抑制。
实施例12
ChoKβ过表达在癌发生过程中可能引起作用的评估
为评估胆碱激酶β(ChoKβ)过表达在癌发生过程中可能具有的作用和确证在不同癌症组织和来源于癌症组织的细胞品系中观察到的胆碱激酶活性的增高是否能完全地归功于胆碱激酶α，或胆碱激酶β也参与，进行了几个测试。
首先生产了多克隆抗ChoKβ1抗体。在3组转染的Hek293T细胞以及转染了空载体的对照细胞中检查了其特异性，在所述3组转染的Hek293T细胞中，其中一组转染了产生ChoKα表达的构建体，第二组转染了允许在其中表达ChoKβ的构建体，第三组转染了其中表达嵌合蛋白ChoKα-GFP的构建体。如图25的部分A所示，免疫检测检验显示了所述抗体的特异性，表现为既在表达ChoKβ的细胞中又在表达嵌合蛋白ChoKβ-GFP的细胞中出现信号，而不在对应于转染了用于ChoKα表达的构建体的细胞的泳道中出现信号；然而，在后一组细胞中，定向对抗ChoKα的单克隆抗体在泳道中对应于ChoKα的高度处产生一个信号。
为了检查ChoKβ在癌发生中可能的作用，体内检验了其可能的转化活性。为实现该目的，再一次使用注射了一百万个转染的人类HEK293T细胞的无胸腺小鼠(Nu/Nu)，其中人类HEK293T细胞转染了作为对照的空载体、胆碱激酶α表达载体或胆碱激酶β表达载体，以及在最后一组中，进行了表达胆碱激酶α和β同工酶中各一种的载体的共转染。注射后对肿瘤的生长进行了历时13周，至少每周2次的监测。如图26所示，在获得转染了ChoKα表达载体的细胞的动物中观察到了肿瘤的明显诱导，在获得转染了ChoKβ表达载体的细胞的小鼠中没观察到肿瘤的诱导。在获得转染两种载体(ChoKα和ChoKβ表达载体)的细胞的小鼠中，惊人地观察到具有明显低于ChoKα单独表达时所观察到的数量级的肿瘤的微小诱导，所述肿瘤的微小诱导是在注射转染的细胞后多于11周观察到，这说明了ChoKβ可能直接或间接地调节ChoKα，从而抑制其致癌活性。
该数据由察看从癌症患者提取的组织中是否存在胆碱激酶β酶的过表达来补充。图27显示从来源于经过分离其信使RNA并利用特异性Taqman探针进行自动化实时定量PCR反应后的患者的肺部样品获得的数据，该获得的数据用以10为底，与正常组织对照样品的比率的对数表示。在所述图中能够观察到在大部分被分析的样品中ChoKβ的表达与正常组织中获得的表达相比是如何降低的，其不同于用ChoKα所观察的结果。
这些数据并不暗示胆碱激酶β过表达与肿瘤的发生和发展之间存在相互关系。
实施例中显示的所有结果都特别地支持胆碱激酶α在癌性疾病的治疗中作为一种新的治疗目标。

Claims (16)

1.一种鉴定和评估用于癌症治疗、优选地用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的治疗的化合物的效力的体外方法，该方法包括：
a)将肿瘤细胞的培养物，优选肺、乳腺、结肠、直肠或膀胱肿瘤细胞与候选化合物接触，在适合的条件下允许它们相互作用适当的时期，
b)检测和量化胆碱激酶α基因或胆碱激酶α蛋白的表达水平，和
c)比较所述表达水平与未经所述候选化合物处理的肿瘤细胞的对照培养物的表达水平。
2.来源于胆碱激酶α基因的核苷酸或肽序列在发现、鉴定、开发和评估用于癌症治疗，优选用于肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌的化合物的方法中的应用。
3.试剂，其特征在于：抑制胆碱激酶α蛋白的表达和/或活性，或者抑制胆碱激酶α蛋白过表达的致癌作用。
4.根据权利要求3的试剂，选自由下列各项组成的组：
a)特异性对抗胆碱激酶α蛋白中存在的一个或多个表位的抗体，或抗体的组合，优选地，人或人源化的单克隆抗体；抗体或抗体链的片段，
b)抑制胆碱激酶α蛋白的过表达和/或活性引起的致癌作用的细胞毒性试剂，如毒素，含有反射活性原子的分子，或化学治疗试剂，包括但不限于小有机和无机分子，肽，磷酸肽，反义分子，核酶，三螺旋分子，双链RNA，siRNA，等，和
c)胆碱激酶α蛋白的拮抗化合物，其抑制所述胆碱激酶α蛋白的表达和/或活性引起的致癌作用。
5.根据权利要求3-4的的试剂，用于治疗癌症优选地用于治疗肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌。
6.根据权利要求3-4的试剂在制备用于治疗癌症，优选用于治疗肺癌、乳腺癌，结肠直肠癌或膀胱癌的药物中的应用。
7.一种药物组合物，其包括治疗有效量的一种或几种根据权利要求3-5的试剂，和至少一种药用赋形剂。
8.根据权利要求7的药物组合物，其特征在于：含有另一种活性成分，优选地为不抑制胆碱激酶α蛋白功能的成分。
9.根据权利要求3-4的试剂，优选地用于治疗膀胱癌。
10.一种药物组合物，其包括治疗有效量的一种或几种根据权利要求3，4和9的试剂，和至少一种药用的赋形剂。
11.根据权利要求10的药物组合物，其特征在于：含有另一种活性成分，优选地为不抑制胆碱激酶α蛋白功能的成分。
12.一种用于诊断乳腺癌、肺癌或膀胱癌患者存活时间的体外方法，包括评估对在从患者提取的癌症组织样品中胆碱激酶α蛋白表达水平，，和比较由此获得的数据与对应于一个或多个正常非癌组织样品的数据，且所述评估是通过确定所述样品中至少一个与所述胆碱激酶α蛋白相关的选自下列各项中的参数来实现的：其信使RNA水平，所述蛋白质的浓度或其酶活性。
13.一种监测对癌症患者实施治疗的效果的体外方法，其特征在于：评估从施用了抗肿瘤试剂的患者提取的组织样品中胆碱激酶α蛋白表达水平，和比较由此获得的数据与对应于一个或多个正常非癌组织样品的数据，其中所述抗肿瘤试剂优选地为根据权利要求3-5和9的试剂，或根据权利要求7-8和10-11含有该试剂的药物组合物，且所述评估是通过确定所述样品中的至少一个与胆碱激酶α蛋白相关的选自下列各项中的参数来实现的：其信使RNA水平，所述蛋白质的浓度或其酶活性。
14.根据权利要求1的体外方法，用于鉴定和评估优选用于膀胱癌治疗的化合物功效。
15.根据权利要求2的来源于胆碱激酶α基因的核苷酸或肽序列在发现、鉴定、开发和评估优选用于膀胱癌治疗的化合物功效的方法中的应用。
16.根据权利要求3-4的试剂在优选用于膀胱癌治疗的药物制备中的应用。
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