JP3399948B2 - Ｐ９０抗体またはプローブを用いた前癌細胞または癌細胞の検出方法 - Google Patents
Ｐ９０抗体またはプローブを用いた前癌細胞または癌細胞の検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本出願は、1993年６月25日出願のPCT出願第
号の一部継続出願であり、このPCT出願は1993年２
月17日出願の米国特許出願第08/018649号の一部継続出
願である。そして、その米国特許出願は1992年６月26日
出願の米国特許出願第07/904766号の一部継続出願であ
り、その米国特許出願第07/904766号は1991年７月12日
出願の米国特許出願第07/703185号の一部継続出願であ
る。さらに、その米国出願第07/703185号は1990年６月2
7日出願の米国特許出願第07/543963号の一部継続出願で
あり、これらの出願は本出願の一部を構成するものとす
る。
号の一部継続出願であり、このPCT出願は1993年２
月17日出願の米国特許出願第08/018649号の一部継続出
願である。そして、その米国特許出願は1992年６月26日
出願の米国特許出願第07/904766号の一部継続出願であ
り、その米国特許出願第07/904766号は1991年７月12日
出願の米国特許出願第07/703185号の一部継続出願であ
る。さらに、その米国出願第07/703185号は1990年６月2
7日出願の米国特許出願第07/543963号の一部継続出願で
あり、これらの出願は本出願の一部を構成するものとす
る。
発明の背景
体細胞における癌原遺伝子における突然変異がヒトの
癌の誘発に大きな影響を与えていることが徐々に認識さ
れてきている。そのような癌遺伝子の突然変異の例とし
ては、neu、fes、fos、myc、myb、fms、Ha−rasおよびK
i−rasが挙げられる。癌原遺伝子が癌遺伝子に転換する
突然変異は点変異であることが多い。癌原遺伝子および
その発現産物がどの様にして正常な細胞を癌細胞に転換
するのかを理解するために更に検討する必要がある。
癌の誘発に大きな影響を与えていることが徐々に認識さ
れてきている。そのような癌遺伝子の突然変異の例とし
ては、neu、fes、fos、myc、myb、fms、Ha−rasおよびK
i−rasが挙げられる。癌原遺伝子が癌遺伝子に転換する
突然変異は点変異であることが多い。癌原遺伝子および
その発現産物がどの様にして正常な細胞を癌細胞に転換
するのかを理解するために更に検討する必要がある。
一般に癌遺伝子は優性的に作用すると考えられてい
る。これは、癌原遺伝子から癌遺伝子への変換により、
新しい機能、即ち強化転換が生じていることを意味する
と考えられている。
る。これは、癌原遺伝子から癌遺伝子への変換により、
新しい機能、即ち強化転換が生じていることを意味する
と考えられている。
癌に関連する別の形式の突然変異は、腫瘍抑制遺伝子
が改変されその遺伝子産物が腫瘍抑制機能を失った時に
生じる。腫瘍抑制遺伝子の例は網膜芽細胞腫感受性遺伝
子Rbである。厳密に言うと腫瘍抑制遺伝子は腫瘍の形成
に寄与しないが、腫瘍抑制遺伝子は時として劣性癌遺伝
子と呼ばれる。両対立遺伝子が突然変異した場合には、
腫瘍抑制遺伝子が無いことで腫瘍形成が促進するためそ
の表現型は劣性である。
が改変されその遺伝子産物が腫瘍抑制機能を失った時に
生じる。腫瘍抑制遺伝子の例は網膜芽細胞腫感受性遺伝
子Rbである。厳密に言うと腫瘍抑制遺伝子は腫瘍の形成
に寄与しないが、腫瘍抑制遺伝子は時として劣性癌遺伝
子と呼ばれる。両対立遺伝子が突然変異した場合には、
腫瘍抑制遺伝子が無いことで腫瘍形成が促進するためそ
の表現型は劣性である。
優性および劣性の癌原遺伝子の両方の特性を示す遺伝
子産物は53kdのリンタンパクp53である。p53遺伝子の突
然変異が種々の癌の多くのものに関連していることが徐
々に立証されてきている。例えば、Iggoら著のLancet33
5、ページ675〜679（1990年）には、p53は、肺癌におい
て突然変異を受ける最も一般的な癌原遺伝子であるとの
見解が示されている。
子産物は53kdのリンタンパクp53である。p53遺伝子の突
然変異が種々の癌の多くのものに関連していることが徐
々に立証されてきている。例えば、Iggoら著のLancet33
5、ページ675〜679（1990年）には、p53は、肺癌におい
て突然変異を受ける最も一般的な癌原遺伝子であるとの
見解が示されている。
p53について知られていることの多くは、野性型と突
然変異型のマウスp53をネズミの繊維芽細胞に移入した
場合の影響を調べることによって得たものである。この
研究は、Levineらによる「小形DNA腫瘍ウイルスによる
転換の一般的メカニズム」における“p53癌原遺伝子と
その産物”、L.Villarreal編、American Society for
Micorbiologyの第２章（1989年）；同書におけるHind
sらによる第７章；およびLevieによるBioEssays12、ペ
ージ60〜66（1990年）において見直しが行われている。
然変異型のマウスp53をネズミの繊維芽細胞に移入した
場合の影響を調べることによって得たものである。この
研究は、Levineらによる「小形DNA腫瘍ウイルスによる
転換の一般的メカニズム」における“p53癌原遺伝子と
その産物”、L.Villarreal編、American Society for
Micorbiologyの第２章（1989年）；同書におけるHind
sらによる第７章；およびLevieによるBioEssays12、ペ
ージ60〜66（1990年）において見直しが行われている。
p53遺伝子は、転写調節に関与しているようであり（F
ields,SとJang,S.K.（1990年）Science 249、ページ10
46〜1049;Raycroft,L.、Wu,H.およびLozano,G.（1990
年）Science 249、ページ1049〜1051;およびLevine,A.
J.、Momand,J.およびFinlay,C.A.（1991年）Nature 35
1、ページ453〜456）、また細胞サイクルにおける調節
上のチェックポイントとして作用し、Ｇ−１相の細胞を
捕収するようである（Martinez,J.、Georgoff,I.および
Levine,A.J.（1991年）Genes Dev.5、ページ151〜159;
Hupp,T.R.、Meek,D.W.、Midgley,C.A.およびLane,D.P.
（1992年）Cell 71、ページ875〜886;およびYin,Y.、T
ainsky,M.A.、Bischoff,F.Z.、Strong,C.C.およびWhal,
E.M.（1992年）Cell 70、ページ937〜948）。
ields,SとJang,S.K.（1990年）Science 249、ページ10
46〜1049;Raycroft,L.、Wu,H.およびLozano,G.（1990
年）Science 249、ページ1049〜1051;およびLevine,A.
J.、Momand,J.およびFinlay,C.A.（1991年）Nature 35
1、ページ453〜456）、また細胞サイクルにおける調節
上のチェックポイントとして作用し、Ｇ−１相の細胞を
捕収するようである（Martinez,J.、Georgoff,I.および
Levine,A.J.（1991年）Genes Dev.5、ページ151〜159;
Hupp,T.R.、Meek,D.W.、Midgley,C.A.およびLane,D.P.
（1992年）Cell 71、ページ875〜886;およびYin,Y.、T
ainsky,M.A.、Bischoff,F.Z.、Strong,C.C.およびWhal,
E.M.（1992年）Cell 70、ページ937〜948）。
遺伝子内突然変異、ホモ接合性欠失および構造再配置
などのp53遺伝子の遺伝子的変更はヒトの癌においてよ
く見られる（Vogelstein,B.とKinzler,K.（1992年）Cel
l 70、ページ523〜526;Baker,S.J.ら（1990年）Cancer
Res 50、ページ7717〜7722;Mori,N.ら（1989）Cance
r Res49、ページ5130〜5135;Lee,J.H.ら（1990年）Can
cer Res 50、ページ2724〜2728;Varley,J.M.ら（1991
年）Oncogene ６、ページ413〜421;Presti,J.C.ら（19
91年）Cancer Res 51、ページ5405;およびDalbangi,
G.ら（1993年）Diagnostic Molecular Pathology 2,
ページ４〜13）。これらのp53の変更形態は、機能的ホ
モテトラマーユニットの活性を減少するかまたは阻止す
る（Stenger J.E.ら（1992年）Mol Carcinog ５、ペ
ージ102〜106;Sturzbecher,H.W.ら（1992年）Oncogene
7,ページ1513〜1523）。突然変異p53タンパク質は半
減期が長く、また退化も遅いため、腫瘍細胞の核中に不
活性の複合体と自己凝集性分子が生じる（Sturzbecher,
H.W.ら（1987年）Oncogene １、ページ201〜211;Halev
y,O.ら（1989年）Mol Cell Biol ９、ページ3385〜3
392）。
などのp53遺伝子の遺伝子的変更はヒトの癌においてよ
く見られる（Vogelstein,B.とKinzler,K.（1992年）Cel
l 70、ページ523〜526;Baker,S.J.ら（1990年）Cancer
Res 50、ページ7717〜7722;Mori,N.ら（1989）Cance
r Res49、ページ5130〜5135;Lee,J.H.ら（1990年）Can
cer Res 50、ページ2724〜2728;Varley,J.M.ら（1991
年）Oncogene ６、ページ413〜421;Presti,J.C.ら（19
91年）Cancer Res 51、ページ5405;およびDalbangi,
G.ら（1993年）Diagnostic Molecular Pathology 2,
ページ４〜13）。これらのp53の変更形態は、機能的ホ
モテトラマーユニットの活性を減少するかまたは阻止す
る（Stenger J.E.ら（1992年）Mol Carcinog ５、ペ
ージ102〜106;Sturzbecher,H.W.ら（1992年）Oncogene
7,ページ1513〜1523）。突然変異p53タンパク質は半
減期が長く、また退化も遅いため、腫瘍細胞の核中に不
活性の複合体と自己凝集性分子が生じる（Sturzbecher,
H.W.ら（1987年）Oncogene １、ページ201〜211;Halev
y,O.ら（1989年）Mol Cell Biol ９、ページ3385〜3
392）。
ヒトにおいては、p53遺伝子の胚芽系突然変異は、リ
・フローメニ（Li−Fraumeni）症候群によって影響を受
けている家族に見られる。この症候群は、各個人を、軟
組織の肉腫を含む種々の腫瘍にかかり易くする稀な常染
色体優性の特徴を有する（Li,F.P.とFraumeni,J.F.（19
69年）Ann Intern Med 71、ページ747〜752;Malkin,
D.ら（1990年）N.Engl.J.Med.250、ページ1233〜123
8）。より最近では、p53胚芽系突然変異は、明らかに癌
の家系ではない癌患者においても検出されており（Togu
chida,Jら（1992年）N.Engl.J.Med.326、ページ1301〜1
308）、また、第二の一次新生物を呈する患者の小集団
においても検出されている（Malkin D.ら（1992年）N.
Engl.J.Med.326、ページ1309〜1315）。さらに、軟組織
の肉腫においてp53遺伝子の体性突然変異が発生したこ
とが報告されている（Stratton,M.R.ら（1990年）Oncog
ene ５、ページ1297〜1301;Mulligan,L.M.ら（1990
年）Proc Natl Acad Sci USA 87、ページ5863〜58
67;Toguchida,J.ら（1992年）Cancer Res 52、ページ
6194〜6199;Drobnjak,M.ら（1993年）提出済;Latres,E.
ら（1993年）提出済）。
・フローメニ（Li−Fraumeni）症候群によって影響を受
けている家族に見られる。この症候群は、各個人を、軟
組織の肉腫を含む種々の腫瘍にかかり易くする稀な常染
色体優性の特徴を有する（Li,F.P.とFraumeni,J.F.（19
69年）Ann Intern Med 71、ページ747〜752;Malkin,
D.ら（1990年）N.Engl.J.Med.250、ページ1233〜123
8）。より最近では、p53胚芽系突然変異は、明らかに癌
の家系ではない癌患者においても検出されており（Togu
chida,Jら（1992年）N.Engl.J.Med.326、ページ1301〜1
308）、また、第二の一次新生物を呈する患者の小集団
においても検出されている（Malkin D.ら（1992年）N.
Engl.J.Med.326、ページ1309〜1315）。さらに、軟組織
の肉腫においてp53遺伝子の体性突然変異が発生したこ
とが報告されている（Stratton,M.R.ら（1990年）Oncog
ene ５、ページ1297〜1301;Mulligan,L.M.ら（1990
年）Proc Natl Acad Sci USA 87、ページ5863〜58
67;Toguchida,J.ら（1992年）Cancer Res 52、ページ
6194〜6199;Drobnjak,M.ら（1993年）提出済;Latres,E.
ら（1993年）提出済）。
癌原遺伝子になる可能性があると認識されている他の
遺伝子は、マウス・ダブル・ミニッツ−２（mdm2）であ
る（Fakharzadehら（1991年）、The EMBO Journal 1
0（６）、ページ1565〜1569）。マウスとヒトのmdm2遺
伝子とタンパク質の配列は知られている。（Fakharzade
hら、The EMBO Journal 10（６）、ページ1565〜156
9（1991年）;Oliner,J.D.ら（1992年）Nature 358、ペ
ージ80〜83;およびCahilly−Snyderら、Somatic Cell
and Molecular Genetics,13（３）ページ235〜244
（1987年））。配列は、マウス、ラット、ハムスターお
よびヒトの遺伝子を含む種の間で、進化的に一定に保た
れている（Cahilly−Snyderら、Somatic Cell and M
olecular Genetics,13（３）、ページ235〜244（1987
年））。
遺伝子は、マウス・ダブル・ミニッツ−２（mdm2）であ
る（Fakharzadehら（1991年）、The EMBO Journal 1
0（６）、ページ1565〜1569）。マウスとヒトのmdm2遺
伝子とタンパク質の配列は知られている。（Fakharzade
hら、The EMBO Journal 10（６）、ページ1565〜156
9（1991年）;Oliner,J.D.ら（1992年）Nature 358、ペ
ージ80〜83;およびCahilly−Snyderら、Somatic Cell
and Molecular Genetics,13（３）ページ235〜244
（1987年））。配列は、マウス、ラット、ハムスターお
よびヒトの遺伝子を含む種の間で、進化的に一定に保た
れている（Cahilly−Snyderら、Somatic Cell and M
olecular Genetics,13（３）、ページ235〜244（1987
年））。
文献においては、mdm2遺伝子は、MDM2、1MDM20、hdm2
（ヒト種）、および1mdm20（マウス種）として呼ばれ
る。90kDのリンタンパク質であるmdm2遺伝子産物は文献
ではp90と呼ばれ、これはマウスとヒトの両方の種を示
し、また、ヒト種であるMDM2を示す。p90タンパク質
は、本出願人の関連広報であるLevineらの1991年６月27
日出願の国際出願PCT/US91/04608に記載されている。dm
2は本出願全体を通して使用されているが、これは、mdm
2遺伝子とタンパク質について文献において用いられて
いる種々の語を含むものとし、全ての種の中での同族種
のものも含む。
（ヒト種）、および1mdm20（マウス種）として呼ばれ
る。90kDのリンタンパク質であるmdm2遺伝子産物は文献
ではp90と呼ばれ、これはマウスとヒトの両方の種を示
し、また、ヒト種であるMDM2を示す。p90タンパク質
は、本出願人の関連広報であるLevineらの1991年６月27
日出願の国際出願PCT/US91/04608に記載されている。dm
2は本出願全体を通して使用されているが、これは、mdm
2遺伝子とタンパク質について文献において用いられて
いる種々の語を含むものとし、全ての種の中での同族種
のものも含む。
骨肉腫と軟組織の肉腫の両方において1MDM20の増殖と
MDM2（遺伝子産物）過発現があることが立証されている
（Oliner,J.D.ら（1992年）Nature 358、ページ80〜8
3;Ladanyi,M.ら（1993年）Cancer Res 53、ページ16
〜18;Leach,F.S.ら（1993年）Cancer Res 53、ページ
2231〜2234）。
MDM2（遺伝子産物）過発現があることが立証されている
（Oliner,J.D.ら（1992年）Nature 358、ページ80〜8
3;Ladanyi,M.ら（1993年）Cancer Res 53、ページ16
〜18;Leach,F.S.ら（1993年）Cancer Res 53、ページ
2231〜2234）。
hdm2遺伝子または1MDM20またはMDM2と呼ばれるmdm2遺
伝子のヒト種は、クローニングされた染色体12の長腕に
マッピングされた（12q13−14）（Olinerら、1992年、
“ヒト肉腫におけるp53関連タンパク質をコードする遺
伝子の増殖”、Nature 358、ページ80〜83）。この領
域には、骨肉腫と軟組織の肉腫において増殖することが
既に発見されている、２種の遺伝子SASとGLIを含有して
いる。SAS遺伝子は、確認されていない機能を有するタ
ンパク質をコードする。この遺伝子は、悪性繊維性組織
球腫（MFH）から分離され、MFHおよび脂肪肉腫において
増殖することが示された（Turc−Carel,C.ら（1986年）
Cancer Genet Cytogenet 23、ページ291〜299;Meltz
er,P.S.ら（1991年）Cell Growth Diff ２、ページ4
95〜501）。GLI遺伝子は、DNA結合ジンクフィンガータ
ンパク質をコードする。この遺伝子は最初グリア芽細胞
腫から分離されたが、横紋筋肉腫および骨肉腫にて増殖
することが報告されている（Kinzler,Kら（1984年）Sci
ence 236、ページ70〜73）。
伝子のヒト種は、クローニングされた染色体12の長腕に
マッピングされた（12q13−14）（Olinerら、1992年、
“ヒト肉腫におけるp53関連タンパク質をコードする遺
伝子の増殖”、Nature 358、ページ80〜83）。この領
域には、骨肉腫と軟組織の肉腫において増殖することが
既に発見されている、２種の遺伝子SASとGLIを含有して
いる。SAS遺伝子は、確認されていない機能を有するタ
ンパク質をコードする。この遺伝子は、悪性繊維性組織
球腫（MFH）から分離され、MFHおよび脂肪肉腫において
増殖することが示された（Turc−Carel,C.ら（1986年）
Cancer Genet Cytogenet 23、ページ291〜299;Meltz
er,P.S.ら（1991年）Cell Growth Diff ２、ページ4
95〜501）。GLI遺伝子は、DNA結合ジンクフィンガータ
ンパク質をコードする。この遺伝子は最初グリア芽細胞
腫から分離されたが、横紋筋肉腫および骨肉腫にて増殖
することが報告されている（Kinzler,Kら（1984年）Sci
ence 236、ページ70〜73）。
本発明以前においては、突然変異したp53が癌に関連
するものと考えられていた。また、mdm2の過発現が腫瘍
に関係することが本発明より以前から知られていた。し
かし、本発明以前には、変更されたp53とdm2遺伝子の関
係、細胞中における種々の発現の態様、および診断を行
うとともに、癌患者の臨床上の関連性または予後を決定
するためにその関係を如何に利用するかという点につい
ては開示されていなかった。本発明の目的は、過発現ま
たは増殖されたp53およびdm2遺伝子の関係を利用するこ
とによって、癌の診断を行うとともに、癌患者の予後を
決めることにある。
するものと考えられていた。また、mdm2の過発現が腫瘍
に関係することが本発明より以前から知られていた。し
かし、本発明以前には、変更されたp53とdm2遺伝子の関
係、細胞中における種々の発現の態様、および診断を行
うとともに、癌患者の臨床上の関連性または予後を決定
するためにその関係を如何に利用するかという点につい
ては開示されていなかった。本発明の目的は、過発現ま
たは増殖されたp53およびdm2遺伝子の関係を利用するこ
とによって、癌の診断を行うとともに、癌患者の予後を
決めることにある。
発明の概要
本発明は、生物学的試料におけるp53とdm2のレベルを
測定し、p53とdm2の内の何れか一方またはp53とdm2の両
方のレベルが上昇した場合に癌の発生を示すようにした
癌診断方法を提供するものである。
測定し、p53とdm2の内の何れか一方またはp53とdm2の両
方のレベルが上昇した場合に癌の発生を示すようにした
癌診断方法を提供するものである。
また、本発明の別の目的は、生物学的試料におけるp5
3とdm2のレベルを測定し、p53とdm2の内の何れか一方ま
たはp53とdm2の両方のレベルが上昇した場合に予後が悪
いとして癌の進行を予想することによって達成される。
3とdm2のレベルを測定し、p53とdm2の内の何れか一方ま
たはp53とdm2の両方のレベルが上昇した場合に予後が悪
いとして癌の進行を予想することによって達成される。
また、本発明は生物学的試料を３グループに分類する
方法を提供する。この方法は、試料中のp53またはdm2の
レベルが異常に上昇したか否かを測定すことを含んでお
り、第１グループはp53およびdm2のレベルは何れも異常
に上昇していない場合を含み、第２グループはp53のレ
ベルは異常に上昇しているがdm2のレベルは異常に上昇
していないか、dm2のレベルは異常に上昇しているがp53
のレベルは異常に上昇していない場合を含み、第３グル
ープはp53とdm2の両方のレベルが異常に上昇している場
合を含む。
方法を提供する。この方法は、試料中のp53またはdm2の
レベルが異常に上昇したか否かを測定すことを含んでお
り、第１グループはp53およびdm2のレベルは何れも異常
に上昇していない場合を含み、第２グループはp53のレ
ベルは異常に上昇しているがdm2のレベルは異常に上昇
していないか、dm2のレベルは異常に上昇しているがp53
のレベルは異常に上昇していない場合を含み、第３グル
ープはp53とdm2の両方のレベルが異常に上昇している場
合を含む。
さらに、本発明は生物学的試料である癌細胞、または
癌性または前癌性になる危険性のある細胞で、少なくと
も１つの正常なp53対立遺伝子を含有する細胞を測定す
る方法を提供する。この方法は、生物学的試料中におけ
るdm2のレベルが異常に上昇しているか否かを測定する
ことを含み、生物学的試料中におけるdm2のレベルが、
正常な生物学的試料と比較して上昇している場合には、
癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細
胞であることが示される。
癌性または前癌性になる危険性のある細胞で、少なくと
も１つの正常なp53対立遺伝子を含有する細胞を測定す
る方法を提供する。この方法は、生物学的試料中におけ
るdm2のレベルが異常に上昇しているか否かを測定する
ことを含み、生物学的試料中におけるdm2のレベルが、
正常な生物学的試料と比較して上昇している場合には、
癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細
胞であることが示される。
本発明は、分離されたp53/dm2タンパク質複合体とdm2
タンパク質に対する抗体をも提供する。
タンパク質に対する抗体をも提供する。
図面の簡単な説明
図1:この図は、本発明の抗p90単クーロン抗体と反応す
るp90タンパク質のエピトープを示す図である。ハイブ
リドーマ1F5、6C10、1D6、4B2、2E12、3F3、3G5、3F8、
6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、4B11、および5B10に
よって生成された抗p90単クーロン抗体が、これらの抗
体が反応するエピトープを示す位置のp90アミノ酸エピ
トープマップの下に、示されている。
るp90タンパク質のエピトープを示す図である。ハイブ
リドーマ1F5、6C10、1D6、4B2、2E12、3F3、3G5、3F8、
6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、4B11、および5B10に
よって生成された抗p90単クーロン抗体が、これらの抗
体が反応するエピトープを示す位置のp90アミノ酸エピ
トープマップの下に、示されている。
図2:このグラフは、軟組織肉腫患者211人の90か月間に
おける全体的な生存を示す。
おける全体的な生存を示す。
図3:このグラフはp53とmdm2のレベル上昇と、軟組織肉
腫患者211人（図２参照）のグループにおける生存を示
す。グラフ中に示した表現型の類型は下記の通りであ
る。グループA:dm2−/p53−（dm2、p53の何れもレベル
上昇がない）。グループB:dm2＋/p53−およびdm2−/p53
＋。グループC:dm2＋/p53＋（dm2、p53の両方ともレベ
ルが上昇）。
腫患者211人（図２参照）のグループにおける生存を示
す。グラフ中に示した表現型の類型は下記の通りであ
る。グループA:dm2−/p53−（dm2、p53の何れもレベル
上昇がない）。グループB:dm2＋/p53−およびdm2−/p53
＋。グループC:dm2＋/p53＋（dm2、p53の両方ともレベ
ルが上昇）。
図4:抗dm2抗体と抗p53抗体を使用した免疫染色パターン
を示す。上側の２個のスライドはコントロールグループ
を示す。左上のスライドは、dm2−である3T3−Balb/c細
胞系の染色パターンを示す。右上のスライドは、dm2＋
である3T3−DM細胞系の染色パターンを示す。中央の２
個のスライドは、同じ患者から採取したヒト腫瘍組織切
片の染色パターンを示す。中央左側のスライドはp53の
−の染色パターンを示し、中央右側のスライドはdm2＋
の染色パターンを示す（以下に述べるグループＢサブセ
ットp53−/dm2＋サブセットに対応する）。下側の２個
のスライドは別患者から採取したヒト腫瘍組織切片の染
色パターンを示す。左下のスライドは、p53＋の染色パ
ターンを示し、右下のスライドはdm2＋の染色パターン
を示す（以下に述べるグループＣに対応する）。
を示す。上側の２個のスライドはコントロールグループ
を示す。左上のスライドは、dm2−である3T3−Balb/c細
胞系の染色パターンを示す。右上のスライドは、dm2＋
である3T3−DM細胞系の染色パターンを示す。中央の２
個のスライドは、同じ患者から採取したヒト腫瘍組織切
片の染色パターンを示す。中央左側のスライドはp53の
−の染色パターンを示し、中央右側のスライドはdm2＋
の染色パターンを示す（以下に述べるグループＢサブセ
ットp53−/dm2＋サブセットに対応する）。下側の２個
のスライドは別患者から採取したヒト腫瘍組織切片の染
色パターンを示す。左下のスライドは、p53＋の染色パ
ターンを示し、右下のスライドはdm2＋の染色パターン
を示す（以下に述べるグループＣに対応する）。
発明の詳細な説明
定義：
p53:
本明細書中では、“野性型の"p53という語は、Matlas
hewskiら、EMBO J.13、ページ3257〜3262（1984年）;Z
akut−Houriら、EMBO J.4、ページ1251〜1255（1985
年）；およびLambとCrawford、Mol.Cell.Biol.5、ペー
ジ1379〜1385（1986年）にて報告されているヌクレオチ
ドまたはアミノ酸配列を意味する。この配列はGenBank
から入手可能である。野性型のp53は、アミノ酸72にお
けるプロリン／アルギニン多型および対応するヌクレオ
チド多型が含まれる。
hewskiら、EMBO J.13、ページ3257〜3262（1984年）;Z
akut−Houriら、EMBO J.4、ページ1251〜1255（1985
年）；およびLambとCrawford、Mol.Cell.Biol.5、ペー
ジ1379〜1385（1986年）にて報告されているヌクレオチ
ドまたはアミノ酸配列を意味する。この配列はGenBank
から入手可能である。野性型のp53は、アミノ酸72にお
けるプロリン／アルギニン多型および対応するヌクレオ
チド多型が含まれる。
野性型のp53遺伝子またはタンパク質の突然変異は前
癌または癌の状態を呈す。前癌細胞とは、通常１個の正
常なp53対立遺伝子と１個の突然変異したp53対立遺伝子
を有する細胞である。例えば、突然変異は点変異であ
る。癌細胞においては、通常p53の対立の両方が突然変
異する。例えば、一方の突然変異が点変異で、他方の突
然変異が、p53遺伝子の全てまたは大部分の欠失による
ものであるあろう。
癌または癌の状態を呈す。前癌細胞とは、通常１個の正
常なp53対立遺伝子と１個の突然変異したp53対立遺伝子
を有する細胞である。例えば、突然変異は点変異であ
る。癌細胞においては、通常p53の対立の両方が突然変
異する。例えば、一方の突然変異が点変異で、他方の突
然変異が、p53遺伝子の全てまたは大部分の欠失による
ものであるあろう。
dm2:
本発明においては、dm2は、90kDリンタンパク質（p9
0）を含むタンパク質の族、タンパク質p85（85kD）、タ
ンパク質p76（76kD）、タンパク質p74（74kD）およびタ
ンパク質p58−57（58kDと58kD）（p57はラットp58と同
等のマウス種である）などの90kDリンタンパク質の断片
または産物、およびこれらの同族種または類似種を表
す。p53タンパク質は、dm2タンパク質と共免疫沈降す
る。dm2タンパク質には、配列化されたマウス・ダブル
・ミニッツ−２（mdm2）90kDリンタンパク質が含まれ
る。また、dm2という語は、上記のdm2タンパク質をコー
ドする遺伝子を示す。mdm2遺伝子とタンパク質の配列は
Fakharzadehら、The EMBO Journal 10（６）、ペー
ジ1565〜1569（1991年）；およびCahilly−Snyderら、S
omatic Cell and Molecular Genetics,13（３）、
ページ235〜244（1987年）に開示されている。p90 dm2
と同種の配列は、ヒト“hdm2"などの幾つかの種のゲノ
ム中に存在する。ラット、マウスおよびハムスターだけ
でなく、ヒトの遺伝子も配列され、それは約90kDの分子
重量を有している（Oliner,J.D.ら（1992年）Nature 3
58、ページ80〜83）。好ましい実施態様では、dm2遺伝
子とタンパク質はヒト種である。
0）を含むタンパク質の族、タンパク質p85（85kD）、タ
ンパク質p76（76kD）、タンパク質p74（74kD）およびタ
ンパク質p58−57（58kDと58kD）（p57はラットp58と同
等のマウス種である）などの90kDリンタンパク質の断片
または産物、およびこれらの同族種または類似種を表
す。p53タンパク質は、dm2タンパク質と共免疫沈降す
る。dm2タンパク質には、配列化されたマウス・ダブル
・ミニッツ−２（mdm2）90kDリンタンパク質が含まれ
る。また、dm2という語は、上記のdm2タンパク質をコー
ドする遺伝子を示す。mdm2遺伝子とタンパク質の配列は
Fakharzadehら、The EMBO Journal 10（６）、ペー
ジ1565〜1569（1991年）；およびCahilly−Snyderら、S
omatic Cell and Molecular Genetics,13（３）、
ページ235〜244（1987年）に開示されている。p90 dm2
と同種の配列は、ヒト“hdm2"などの幾つかの種のゲノ
ム中に存在する。ラット、マウスおよびハムスターだけ
でなく、ヒトの遺伝子も配列され、それは約90kDの分子
重量を有している（Oliner,J.D.ら（1992年）Nature 3
58、ページ80〜83）。好ましい実施態様では、dm2遺伝
子とタンパク質はヒト種である。
約90kDのdm2タンパク質は明らかに、p58タンパク質は
高い確率でp53に結合する。Balb/c3T3から得られる3T3D
M細胞は、増殖したmdm2遺伝子の複写に反応して５個のm
dm2を過剰に生成する。
高い確率でp53に結合する。Balb/c3T3から得られる3T3D
M細胞は、増殖したmdm2遺伝子の複写に反応して５個のm
dm2を過剰に生成する。
dm2および／またはp53のレベル評価（dm2＋および／ま
たはp53＋）： 本明細書では、細胞内のdm2および／またはp53のレベ
ル上昇は、dm2またはp53遺伝子の増殖、または細胞など
の生物的試料におけるdm2またはp53タンパク質生成物の
過発現または蓄積を示す。dm2またはp53タンパク質のレ
ベルは、生物学的試料、好ましくは細胞におけるdm2ま
たはp53タンパク質の合計測定値であり、遊離タンパク
質であるか複合体であるかは関係ない。幾つかの場合に
おいては、dm2の増殖がないのにも関わらずdm2タンパク
質のレベルが上昇したことは、dm2と突然変異したp53生
成物との間にヘテロダイマー／ヘテロテトラマーが形成
されたことを示す。突然変異体のp53タンパク質は長い
半減期を持ち、退化が遅いため、細胞核中に蓄積する。
p53ミスセンス突然変異は、免疫化学的に検出できるp53
突然変異の少なくとも約85％で大部分を占める。しか
し、幾つかの場合には、腫瘍組織内における野性型のp5
3遺伝子とタンパク質のレベル上昇が検出される。
たはp53＋）： 本明細書では、細胞内のdm2および／またはp53のレベ
ル上昇は、dm2またはp53遺伝子の増殖、または細胞など
の生物的試料におけるdm2またはp53タンパク質生成物の
過発現または蓄積を示す。dm2またはp53タンパク質のレ
ベルは、生物学的試料、好ましくは細胞におけるdm2ま
たはp53タンパク質の合計測定値であり、遊離タンパク
質であるか複合体であるかは関係ない。幾つかの場合に
おいては、dm2の増殖がないのにも関わらずdm2タンパク
質のレベルが上昇したことは、dm2と突然変異したp53生
成物との間にヘテロダイマー／ヘテロテトラマーが形成
されたことを示す。突然変異体のp53タンパク質は長い
半減期を持ち、退化が遅いため、細胞核中に蓄積する。
p53ミスセンス突然変異は、免疫化学的に検出できるp53
突然変異の少なくとも約85％で大部分を占める。しか
し、幾つかの場合には、腫瘍組織内における野性型のp5
3遺伝子とタンパク質のレベル上昇が検出される。
生物学的試料におけるdm2および／またはp53のレベル
が、正常な生物学的試料と比べて上昇した場合、癌細
胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞で
あることを示す。生物学的試料には、組織抽出物、細胞
の試料、またはリンパ液、血液または尿などの生物学的
流体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
が、正常な生物学的試料と比べて上昇した場合、癌細
胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞で
あることを示す。生物学的試料には、組織抽出物、細胞
の試料、またはリンパ液、血液または尿などの生物学的
流体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明は生物学的試料を３グループに分類する方法を
提供する。この方法は、試料中のp53またはdm2の何れか
のレベル、またはp53とdm2の両方のレベルが異常に上昇
したか否かを測定すことを含んでいる。第１グループで
あるグループＡはp53およびdm2の何れも異常なレベル上
昇がない場合（p53−/dm2−）を含む。第２グループで
あるグループＢはdm2のレベルは異常に上昇しているがp
53のレベルは異常に上昇していない場合（p53−/dm2
＋）と、p53のレベルは異常に上昇しているがdm2のレベ
ルは異常に上昇していない（p53＋/dm2−）場合とを含
み、第３グループであるグループＣはp53とdm2の両方の
レベルが異常に上昇している場合（p53＋/dm2＋）を含
む。
提供する。この方法は、試料中のp53またはdm2の何れか
のレベル、またはp53とdm2の両方のレベルが異常に上昇
したか否かを測定すことを含んでいる。第１グループで
あるグループＡはp53およびdm2の何れも異常なレベル上
昇がない場合（p53−/dm2−）を含む。第２グループで
あるグループＢはdm2のレベルは異常に上昇しているがp
53のレベルは異常に上昇していない場合（p53−/dm2
＋）と、p53のレベルは異常に上昇しているがdm2のレベ
ルは異常に上昇していない（p53＋/dm2−）場合とを含
み、第３グループであるグループＣはp53とdm2の両方の
レベルが異常に上昇している場合（p53＋/dm2＋）を含
む。
本発明は、dm2とp53の発現の種々の態様を分類するこ
とが、種々の癌に患っている患者の臨床的な経過を診断
しまた予測するために臨床的に非常に重要であることを
示す。癌の例としては、肉腫、癌腫、白血病、またはリ
ンパ腫である。特に肉腫には軟組織肉腫、骨肉腫などが
含まれる。他の態様においては癌には膀胱癌が含まれ
る。他の態様では、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、頸部
癌、副腎皮質癌、骨癌、胸部癌、脳癌、および慢性骨髄
性白血病が対象となるがこれらに限定されるものではな
い。したがって、本発明は、被検者の前癌組織または腫
瘍から生物学的試料を得ることによって被検者の予後を
評価し、生物学的試料３つのグループの何れに属するか
を決定する方法を提供する。これらの分類の内、第３グ
ループは最も予後が悪いことを示し、第１グループは最
も予後が良いことを示す。
とが、種々の癌に患っている患者の臨床的な経過を診断
しまた予測するために臨床的に非常に重要であることを
示す。癌の例としては、肉腫、癌腫、白血病、またはリ
ンパ腫である。特に肉腫には軟組織肉腫、骨肉腫などが
含まれる。他の態様においては癌には膀胱癌が含まれ
る。他の態様では、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、頸部
癌、副腎皮質癌、骨癌、胸部癌、脳癌、および慢性骨髄
性白血病が対象となるがこれらに限定されるものではな
い。したがって、本発明は、被検者の前癌組織または腫
瘍から生物学的試料を得ることによって被検者の予後を
評価し、生物学的試料３つのグループの何れに属するか
を決定する方法を提供する。これらの分類の内、第３グ
ループは最も予後が悪いことを示し、第１グループは最
も予後が良いことを示す。
グループＣ（p53＋/dm2＋）：
本発明は、dm2のレベルが上昇しているか否かを測定
することにより、癌細胞、または癌性または前癌性にな
る危険性のある細胞で、少なくとも１個の突然変異p53
対立遺伝子を含む細胞を検出するための方法を提供す
る。
することにより、癌細胞、または癌性または前癌性にな
る危険性のある細胞で、少なくとも１個の突然変異p53
対立遺伝子を含む細胞を検出するための方法を提供す
る。
予想外にも、dm2タンパク質のレベル上昇は、p53のレ
ベルが上昇したとして、即ち、p53＋/dm2＋グループ
（図４参照）として検出されるp53の過発現野性型だけ
でなく、突然変異を含むp53タンパク質のレベル上昇と
相互作用し、生存率や腫瘍の進行などの悪い予後を示す
臨床病理的変数となる。これらのグループの内、グルー
プＣは最も予後が悪いことを示す。例２と図３は、グル
ープＡ（p53のレベルもdm2のレベルも上昇していない）
とグループＢ（これらのタンパク質の内の一方のみのレ
ベルが上昇）とを比較した時における、非常に生存率が
悪いグループで生じた同じ腫瘍部におけるdm2とp53の異
常なレベル上昇が免疫学的に検出された状態をしめす。
ベルが上昇したとして、即ち、p53＋/dm2＋グループ
（図４参照）として検出されるp53の過発現野性型だけ
でなく、突然変異を含むp53タンパク質のレベル上昇と
相互作用し、生存率や腫瘍の進行などの悪い予後を示す
臨床病理的変数となる。これらのグループの内、グルー
プＣは最も予後が悪いことを示す。例２と図３は、グル
ープＡ（p53のレベルもdm2のレベルも上昇していない）
とグループＢ（これらのタンパク質の内の一方のみのレ
ベルが上昇）とを比較した時における、非常に生存率が
悪いグループで生じた同じ腫瘍部におけるdm2とp53の異
常なレベル上昇が免疫学的に検出された状態をしめす。
これは予想外のことである。なぜならば、本発明者に
よって発見されたように、dm2タンパク質がp53の転写作
用を不活性にし、このためp53タンパク質のレベルが上
昇した細胞中においてはdm2のレベル上昇がないためで
ある。
よって発見されたように、dm2タンパク質がp53の転写作
用を不活性にし、このためp53タンパク質のレベルが上
昇した細胞中においてはdm2のレベル上昇がないためで
ある。
グループＢ（p53−/dm2＋およびp53＋/dm2−）：
グルーブＢは２つのサブセット、即ちp53のレベルは
正常であるがdm2のレベルが上昇した場合（p53−/dm2
＋）と、p53のレベルは上昇したがdm2のレベルは正常で
ある場合（p53＋/dm2−）を含む。３グループの内、グ
ループＢは、グループＡよりは悪いがグループＣよりは
良い予後を示す。
正常であるがdm2のレベルが上昇した場合（p53−/dm2
＋）と、p53のレベルは上昇したがdm2のレベルは正常で
ある場合（p53＋/dm2−）を含む。３グループの内、グ
ループＢは、グループＡよりは悪いがグループＣよりは
良い予後を示す。
グループＢのサブセットp53＋/dm2−：
突然変異や過発現による野性型p53遺伝子およびタン
パク質などのp53タンパク質のレベルが上昇したことが
検出された場合、即ち、p53＋/dm2−グループが検出さ
れた場合、前癌のまたは癌の状態を示す。p53の突然変
異体は野性型p53の機能を不活性化し、p53遺伝子の突然
変異体およびタンパク質を含有する細胞は腫瘍形成の可
能性が高い。また野性型のp53タンパク質のレベル上昇
は、予後を悪化させる一因となる。細胞中におけるDNA
の損傷またはウイルス性癌原遺伝子生成物の結合は、野
性型p53タンパク質を安定にし、その濃度が増加する。
パク質などのp53タンパク質のレベルが上昇したことが
検出された場合、即ち、p53＋/dm2−グループが検出さ
れた場合、前癌のまたは癌の状態を示す。p53の突然変
異体は野性型p53の機能を不活性化し、p53遺伝子の突然
変異体およびタンパク質を含有する細胞は腫瘍形成の可
能性が高い。また野性型のp53タンパク質のレベル上昇
は、予後を悪化させる一因となる。細胞中におけるDNA
の損傷またはウイルス性癌原遺伝子生成物の結合は、野
性型p53タンパク質を安定にし、その濃度が増加する。
グループＢのサブセットp53−/dm2＋：
本発明は、予想外にもdm2のレベルが上昇した場合に
も、BALB/c3T3細胞（3T3 DM細胞）または前癌または癌
細胞などの細胞に対してp53のレベルが上昇した場合と
同様な特性を与えること明らかにした。何れの場合にお
いても、動物においては、細胞中のdm2またはp53のレベ
ルが上昇し、腫瘍発生の可能性が高くなる。
も、BALB/c3T3細胞（3T3 DM細胞）または前癌または癌
細胞などの細胞に対してp53のレベルが上昇した場合と
同様な特性を与えること明らかにした。何れの場合にお
いても、動物においては、細胞中のdm2またはp53のレベ
ルが上昇し、腫瘍発生の可能性が高くなる。
p53−/dm2＋に関しては、細胞中における野性型p53対
立遺伝子のレベルが正常であっても、dm2のレベルが上
昇している場合には細胞の腫瘍化の可能性が高まる。
立遺伝子のレベルが正常であっても、dm2のレベルが上
昇している場合には細胞の腫瘍化の可能性が高まる。
本発明は、細胞が少なくとも２個の正常なp53対立遺
伝子、即ち野性型p53または正常レベルのp53を含む場合
において、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険
性のある細胞を検出するための方法を提供するもので、
この方法は、生物学的試料中におけるdm2のレベルが異
常に上昇したか否かを検出することを含み、このレベル
上昇は、正常な生物学的試料中におけるdm2のレベルと
比較した場合のレベル上昇を意味する（図４参照）。
伝子、即ち野性型p53または正常レベルのp53を含む場合
において、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険
性のある細胞を検出するための方法を提供するもので、
この方法は、生物学的試料中におけるdm2のレベルが異
常に上昇したか否かを検出することを含み、このレベル
上昇は、正常な生物学的試料中におけるdm2のレベルと
比較した場合のレベル上昇を意味する（図４参照）。
グループＡ（p53−/dm2−）：
グループＡは、p53とdm2の両方ともが正常のレベルで
ある場合を含む。このグループにおける前癌細胞と癌細
胞は、p52および／またはdm2のレベル上昇以外の原因に
よるものである可能性が高い。３グループの内、グルー
プＡの予後が最もよい。
ある場合を含む。このグループにおける前癌細胞と癌細
胞は、p52および／またはdm2のレベル上昇以外の原因に
よるものである可能性が高い。３グループの内、グルー
プＡの予後が最もよい。
DM2またはP53の上昇レベルの検出：
増幅：
dm2あるいはp53遺伝子の増幅は、核酸プローブ法など
の公知の方法を用いて検出できるであろう。DNAの高次
の複写数は例えばサザンブロット法によって検出でき、
増大したRNA量はノーザンブロット法によって検出でき
るであろう（George,D.L.およびPowers,V.E.、Cell24:1
17−123（1981）;George,D.L.ら、EMBOJ.,4:1199−1203
（1985）;Singh,L.およびJones,K.W.、Nucleic Acids
Res.,12:5627−5638（1984）参照）。
の公知の方法を用いて検出できるであろう。DNAの高次
の複写数は例えばサザンブロット法によって検出でき、
増大したRNA量はノーザンブロット法によって検出でき
るであろう（George,D.L.およびPowers,V.E.、Cell24:1
17−123（1981）;George,D.L.ら、EMBOJ.,4:1199−1203
（1985）;Singh,L.およびJones,K.W.、Nucleic Acids
Res.,12:5627−5638（1984）参照）。
過発現：
生物学的試料中のdm2およびp53タンパクレベルは、抗
dm2および抗p53抗体を用いた免疫組織化学染色法等の公
知の方法で検出される。免疫組織化学に基づく陽性核染
色により、p53、dm2、あるいはp53/dm2複合体レベルの
上昇が示される。過発現されたp53タンパクはp53遺伝子
の突然変異に関連付けられる。本発明の一実施態様にお
いては、dm2とp53の各種腫瘍における核の過発現は、腫
瘍細胞核染色における染色割合（％）から、次の３グル
ープのいずれかに分類される：（ａ）陰性（＜20％）、
（ｂ）異生（20−70％）、（ｃ）相同（＞70％）。
dm2および抗p53抗体を用いた免疫組織化学染色法等の公
知の方法で検出される。免疫組織化学に基づく陽性核染
色により、p53、dm2、あるいはp53/dm2複合体レベルの
上昇が示される。過発現されたp53タンパクはp53遺伝子
の突然変異に関連付けられる。本発明の一実施態様にお
いては、dm2とp53の各種腫瘍における核の過発現は、腫
瘍細胞核染色における染色割合（％）から、次の３グル
ープのいずれかに分類される：（ａ）陰性（＜20％）、
（ｂ）異生（20−70％）、（ｃ）相同（＞70％）。
本発明の他の実施態様においては、dm2レベルの上昇
の検出にあたって、前癌状態あるいは癌状態が正常な生
物学的試料（細胞など）のレベルの２−100倍であるこ
とが示される。好ましい実施態様においては、上昇した
レベルとは正常な生物学的試料（細胞など）のレベルの
５−50倍である。
の検出にあたって、前癌状態あるいは癌状態が正常な生
物学的試料（細胞など）のレベルの２−100倍であるこ
とが示される。好ましい実施態様においては、上昇した
レベルとは正常な生物学的試料（細胞など）のレベルの
５−50倍である。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は公知の方
法によって調製されるであろう。本発明の抗体には、Hu
seら、Science246:1275−1281（1989年）の方法に従っ
て調製されたリコンビナント・ポリクローナルあるいは
モノクローナルのFabフラグメントが含まれる。さらに
以下の文献を参照されたい:Burdonら編、「生化学と分
子生物学における実験室技法」第13巻、Elsevier Scie
nce Pullishers、アムステルダム（1985年）中に掲載
された、Campbell、「モノクローナル抗体技術、齧歯類
およびヒトハイブリドーマの産生と特徴」。癌遺伝子間
における一つのアミノ酸の相違に対して特異性を発現す
るポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する
方法は、McCormickらによる米国特許第4798787号に記載
されている。
法によって調製されるであろう。本発明の抗体には、Hu
seら、Science246:1275−1281（1989年）の方法に従っ
て調製されたリコンビナント・ポリクローナルあるいは
モノクローナルのFabフラグメントが含まれる。さらに
以下の文献を参照されたい:Burdonら編、「生化学と分
子生物学における実験室技法」第13巻、Elsevier Scie
nce Pullishers、アムステルダム（1985年）中に掲載
された、Campbell、「モノクローナル抗体技術、齧歯類
およびヒトハイブリドーマの産生と特徴」。癌遺伝子間
における一つのアミノ酸の相違に対して特異性を発現す
るポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する
方法は、McCormickらによる米国特許第4798787号に記載
されている。
簡単に言えばポリクローナル抗体は、突然変異体p53
と野性型p53とを区別する抗体産生能のあるp53タンパク
やそのフラグメントをウサギ、マウス、ラット、ヤギな
どの哺乳類宿主に注入して得る。注入されたペプチドや
ペプチドの断片は、野性型または突然変異型の配列を含
有しているであろう。哺乳類からの血清は抽出・スクリ
ーニング工程をかけ、そのペプチドやペプチド断片に特
異的なポリクローナル抗体を得る。同様の方法をdm2タ
ンパクにも適用できるであろう。
と野性型p53とを区別する抗体産生能のあるp53タンパク
やそのフラグメントをウサギ、マウス、ラット、ヤギな
どの哺乳類宿主に注入して得る。注入されたペプチドや
ペプチドの断片は、野性型または突然変異型の配列を含
有しているであろう。哺乳類からの血清は抽出・スクリ
ーニング工程をかけ、そのペプチドやペプチド断片に特
異的なポリクローナル抗体を得る。同様の方法をdm2タ
ンパクにも適用できるであろう。
モノクローナル抗体を産生するには、哺乳類宿主に上
記のペプチドまたはペプチド断片を接種し、これを増殖
させる。最終増殖から２、３日経過語、脾臓を被接種哺
乳類から摘出する。脾臓から得た細胞浮遊液を、Kohler
およびMilsteinによるNature256、495−497ページ（197
5年）に記載の一般的な方法によって腫瘍細胞と融合さ
せる。ペプチド断片として役に立つものであるためには
ペプチド断片は、検出されるP53またはdm2分子のエピト
ープを定めるのに充分なアミノ酸残基を含有しなければ
ならない。
記のペプチドまたはペプチド断片を接種し、これを増殖
させる。最終増殖から２、３日経過語、脾臓を被接種哺
乳類から摘出する。脾臓から得た細胞浮遊液を、Kohler
およびMilsteinによるNature256、495−497ページ（197
5年）に記載の一般的な方法によって腫瘍細胞と融合さ
せる。ペプチド断片として役に立つものであるためには
ペプチド断片は、検出されるP53またはdm2分子のエピト
ープを定めるのに充分なアミノ酸残基を含有しなければ
ならない。
もし断片が抗原性であるには短すぎる場合には、分子
担体に結合してもよい。適切な担体分子としては、キー
ホールリンペットヘモシアニン、子牛血清アルブミンが
挙げられる。結合は本分野で公知の方法によって行うこ
とができる。そのような方法の一つとして、断片のシス
テイン残基と担体分子のシステイン残基とを結合する方
法がある。
担体に結合してもよい。適切な担体分子としては、キー
ホールリンペットヘモシアニン、子牛血清アルブミンが
挙げられる。結合は本分野で公知の方法によって行うこ
とができる。そのような方法の一つとして、断片のシス
テイン残基と担体分子のシステイン残基とを結合する方
法がある。
ペプチド断片は本分野で公知の方法によって合成する
ことができる。好適な方法の幾つかがStuartとYoungに
よる「固相ペプチド合成」（第２版、Pierce Chemical
Co.、1984年）に記載されている。
ことができる。好適な方法の幾つかがStuartとYoungに
よる「固相ペプチド合成」（第２版、Pierce Chemical
Co.、1984年）に記載されている。
p53とdm2の共免疫沈降法に適する抗体としては、PAb4
21とAb2が挙げられる。PAb421は、ヒト、マウス、ラッ
トなどを含む種々の宿主から得られたp53のカルボキシ
末端を認識し、Harlowらによって“Journal of Virol
ogy"39、861−869（1981年）に記載されている。Ab2は
ヒトp53のアミノ末端に特異的であり、ニューヨーク
州、マンハセットのオンコジェンサイエンス社から入手
できる。p53を発現しないREF細胞が同じ抗体で同様に処
理されたときには、dm2タンパクは免疫沈降しない。
21とAb2が挙げられる。PAb421は、ヒト、マウス、ラッ
トなどを含む種々の宿主から得られたp53のカルボキシ
末端を認識し、Harlowらによって“Journal of Virol
ogy"39、861−869（1981年）に記載されている。Ab2は
ヒトp53のアミノ末端に特異的であり、ニューヨーク
州、マンハセットのオンコジェンサイエンス社から入手
できる。p53を発現しないREF細胞が同じ抗体で同様に処
理されたときには、dm2タンパクは免疫沈降しない。
免疫沈降物は遠心分離で回収できる。遠心分離やカラ
ムからの溶出に続き、dm2がp53/dm2複合体からSDS−PAG
E法によって分離される。90KDの単一バンドは切断さ
れ、配列される。本発明は単離されたdm2/p53複合体を
も提供するものであるが、これは種々の形質転換細胞か
らのdm2とp53を共免疫沈降することによって得られる。
ムからの溶出に続き、dm2がp53/dm2複合体からSDS−PAG
E法によって分離される。90KDの単一バンドは切断さ
れ、配列される。本発明は単離されたdm2/p53複合体を
も提供するものであるが、これは種々の形質転換細胞か
らのdm2とp53を共免疫沈降することによって得られる。
dm2を精製する他の方法は、Aebersoldらによる、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA84、6970−6974（1987年）に記載
された方法である。
c.Natl.Acad.Sci.USA84、6970−6974（1987年）に記載
された方法である。
本発明はdm2（p90）遺伝子産物に対してモノクローナ
ル抗体を発現するハイブリドーマを提供する。これらの
ハイブリドーマのあるものはAmerican Type Culture
Collection（ATCC）に寄託されている:3G5 ATCC受託
番号HB11182）、4B11（ATCC受託番号HB11183）、2A10
（ATCC受託番号HB11184）、2A9（ATCC受託番号HB1118
5）、および4B2（ATCC受託番号HB11186）。ハイブリド
ーマ3G5、4B11、2A10、2A9,および4B2は、特許手続上の
ための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約の要請に従ってこの要請を満たすべき、ATCC受託番号
HB11182,HB11183、HB11184、HB11185およびHB11186とし
てそれぞれメリーランド州20852、ロックヴィル、パー
クローン・ドライブ12301にあるAmerican TypeCulture
Collection（ATCC）に寄託された。
ル抗体を発現するハイブリドーマを提供する。これらの
ハイブリドーマのあるものはAmerican Type Culture
Collection（ATCC）に寄託されている:3G5 ATCC受託
番号HB11182）、4B11（ATCC受託番号HB11183）、2A10
（ATCC受託番号HB11184）、2A9（ATCC受託番号HB1118
5）、および4B2（ATCC受託番号HB11186）。ハイブリド
ーマ3G5、4B11、2A10、2A9,および4B2は、特許手続上の
ための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約の要請に従ってこの要請を満たすべき、ATCC受託番号
HB11182,HB11183、HB11184、HB11185およびHB11186とし
てそれぞれメリーランド州20852、ロックヴィル、パー
クローン・ドライブ12301にあるAmerican TypeCulture
Collection（ATCC）に寄託された。
細胞中のDm2のレベルを測定し調整するためのアッセ
イ： 細胞中のdm2および／またはp53のレベルは、増幅され
たまたは過発現されたdm2および／またはp53遺伝子また
はタンパクを認識できる、本分野で公知のアッセイ法で
決定される。
イ： 細胞中のdm2および／またはp53のレベルは、増幅され
たまたは過発現されたdm2および／またはp53遺伝子また
はタンパクを認識できる、本分野で公知のアッセイ法で
決定される。
標識抗体を用いてタンパクを検出するための種々のア
ッセイが利用できる。一段階アッセイにおいては、標的
分子は、もしそれが存在する場合には標識抗体で固定化
されインキュベートされる。標識抗体は固定化された標
識分子と結合する。未結合の分子を洗浄除去した後、ア
ッセイでサンプルの標識の存在を調べる。
ッセイが利用できる。一段階アッセイにおいては、標的
分子は、もしそれが存在する場合には標識抗体で固定化
されインキュベートされる。標識抗体は固定化された標
識分子と結合する。未結合の分子を洗浄除去した後、ア
ッセイでサンプルの標識の存在を調べる。
二段階アッセイにおいては、固定化された標識分子は
未標識の抗体とともにインキュベートされる。標識分子
と未標識抗体の複合体は、もしそれが存在する場合に
は、その後当該未標識抗体に特異的な第二の標識抗体に
結合する。サンプルを洗浄し、上記のように標識の存在
を調べるアッセイを行う。
未標識の抗体とともにインキュベートされる。標識分子
と未標識抗体の複合体は、もしそれが存在する場合に
は、その後当該未標識抗体に特異的な第二の標識抗体に
結合する。サンプルを洗浄し、上記のように標識の存在
を調べるアッセイを行う。
標識抗dm2抗体はイメージング法によってdm2を検出す
るのに用いることができる。イメージングの一方法とし
ては、イメージ化されるべき腫瘍細胞を検出可能なマー
カーによって標識された抗dm2抗体と接触させる方法が
ある。この方法は標識抗体がdm2に結合する条件下で行
われる。dm2に結合した抗体が検出されることで、dm2が
イメージ化され検出される。
るのに用いることができる。イメージングの一方法とし
ては、イメージ化されるべき腫瘍細胞を検出可能なマー
カーによって標識された抗dm2抗体と接触させる方法が
ある。この方法は標識抗体がdm2に結合する条件下で行
われる。dm2に結合した抗体が検出されることで、dm2が
イメージ化され検出される。
抗体を標識するのに用いられるマーカーはその用途に
よって選ぶ。当業者はマーカーを容易に選択、決定でき
る。標識された抗体は腫瘍の存在を検出するためのイム
ノアッセイや組織学的応用分野において用いることがで
きる。標識抗体はポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体であってよいがモノクローナル抗体が好まし
く、ATCCに寄託された上記の抗体が挙げられる。
よって選ぶ。当業者はマーカーを容易に選択、決定でき
る。標識された抗体は腫瘍の存在を検出するためのイム
ノアッセイや組織学的応用分野において用いることがで
きる。標識抗体はポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体であってよいがモノクローナル抗体が好まし
く、ATCCに寄託された上記の抗体が挙げられる。
本発明の好ましい実施態様においては、標識は放射性
原子、酵素あるいは発色団である。放射性原子の例とし
てはP32、I125、H3、およびC14が挙げられる。酵素の例
としてはホースラディッシュペロキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発
色団の例としてはフルオレセンやローダミンが挙げられ
る。抗体とこれらの標識との結合は公知の方法によるも
のであってよい。例えば酵素および発色団はジアルデヒ
ド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのカップリング
剤によって抗体と結合される。あるいは、結合はリガン
ド−レセプターのペアを介したものであることもでき
る。適切なリガンド−レセプターのペアの例としてはビ
オチン−アビジン、または−ストレプトアビジン、およ
ひ抗体−抗原が挙げられる。
原子、酵素あるいは発色団である。放射性原子の例とし
てはP32、I125、H3、およびC14が挙げられる。酵素の例
としてはホースラディッシュペロキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発
色団の例としてはフルオレセンやローダミンが挙げられ
る。抗体とこれらの標識との結合は公知の方法によるも
のであってよい。例えば酵素および発色団はジアルデヒ
ド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのカップリング
剤によって抗体と結合される。あるいは、結合はリガン
ド−レセプターのペアを介したものであることもでき
る。適切なリガンド−レセプターのペアの例としてはビ
オチン−アビジン、または−ストレプトアビジン、およ
ひ抗体−抗原が挙げられる。
dm2タンパクに対する抗体を用いて細胞や組織中のdm2
タンパクの上昇したレベルを検出することができる。一
実施態様においては、dm2のエピトープに向けられた抗
体は、免疫組織病理学的技法により原位置（in situ）
で用いることができる。これらの方法は、ポリープ、非
定型胸部組織、あるいは転移や再発の恐れがより高い腫
瘍細胞中などにおいて、組織が癌性となる恐れの高い場
合の診断に利用できる。
タンパクの上昇したレベルを検出することができる。一
実施態様においては、dm2のエピトープに向けられた抗
体は、免疫組織病理学的技法により原位置（in situ）
で用いることができる。これらの方法は、ポリープ、非
定型胸部組織、あるいは転移や再発の恐れがより高い腫
瘍細胞中などにおいて、組織が癌性となる恐れの高い場
合の診断に利用できる。
ハイブリドーマ1F5、6C10、1D6、4B2、2E12、3F3、3G
5、3F8、6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、4B11、およ
び5B10はdm2タンパクのエピトープ（図１参照）に対す
るモノクローナル抗体を産生する。これらハイブリドー
マのいくつかはATCC（上記参照）に寄託されている。モ
ノクローナル抗体は、ネズミおよびヒトの両者のタンパ
クのエピトープ、さらに宿主の種の間に同型なdm2配列
が保存されているかぎり他の種のものとも反応する。
5、3F8、6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、4B11、およ
び5B10はdm2タンパクのエピトープ（図１参照）に対す
るモノクローナル抗体を産生する。これらハイブリドー
マのいくつかはATCC（上記参照）に寄託されている。モ
ノクローナル抗体は、ネズミおよびヒトの両者のタンパ
クのエピトープ、さらに宿主の種の間に同型なdm2配列
が保存されているかぎり他の種のものとも反応する。
本発明の他の実施態様においては、癌細胞はdm2を放
出することがあり、これが患者の血液やリンパ液中のdm
2量を増大させる。そこでイムノアッセイなどのアッセ
イによって細胞や体液中の正常dm2値や正常値を超えたd
m2レベルを検出できる。
出することがあり、これが患者の血液やリンパ液中のdm
2量を増大させる。そこでイムノアッセイなどのアッセ
イによって細胞や体液中の正常dm2値や正常値を超えたd
m2レベルを検出できる。
野性型p53に対するdm2の結合を阻止する治療剤のスクリ
ーニング： 野性型p53に対するdm2の結合を阻止するための治療剤
のスクリーニングを各種アッセイによって行うことがで
きる。本発明は、野性型p53に対するdm2の有害な結合を
防ぐのに充分な親和性を有するdm2と複合体を形成する
治療剤を選択するための方法を開示する。方法は種々の
アッセイを包含し、一例として、dm2を支持体に固定化
して野性型のp53と標識された治療剤の双方に同時ある
いは順番に接触させ、この治療剤がdm2の野性型p53への
結合を充分に防ぐように野性型のp53と効果的に競合す
るかどうかを決定するものが挙げられる。他の態様では
野性型のp53を標識化し、治療剤には標識しない。さら
に他の態様においては、p53を支持体に固定化し標識し
たdm2と治療剤の双方（または標識しないdm2と標識した
治療剤）と接触させたうえ、p53に結合したdm2の量が治
療剤を添加しない場合と比べて減少しているかどうかを
調べる。dm2は本発明の抗dm2抗体で標識化することがで
きる。
ーニング： 野性型p53に対するdm2の結合を阻止するための治療剤
のスクリーニングを各種アッセイによって行うことがで
きる。本発明は、野性型p53に対するdm2の有害な結合を
防ぐのに充分な親和性を有するdm2と複合体を形成する
治療剤を選択するための方法を開示する。方法は種々の
アッセイを包含し、一例として、dm2を支持体に固定化
して野性型のp53と標識された治療剤の双方に同時ある
いは順番に接触させ、この治療剤がdm2の野性型p53への
結合を充分に防ぐように野性型のp53と効果的に競合す
るかどうかを決定するものが挙げられる。他の態様では
野性型のp53を標識化し、治療剤には標識しない。さら
に他の態様においては、p53を支持体に固定化し標識し
たdm2と治療剤の双方（または標識しないdm2と標識した
治療剤）と接触させたうえ、p53に結合したdm2の量が治
療剤を添加しない場合と比べて減少しているかどうかを
調べる。dm2は本発明の抗dm2抗体で標識化することがで
きる。
一態様においては、本発明方法は以下のステップを包
含する： ａ）固体支持体に所定量のdm2をdm2が支持体の表面に付
着するような条件下で接触（たとえば抗dm2抗体を用い
てdm2を固体支持体に接触）させ、ｂ）支持体に未結合
のdm2を除去し、ｃ）dm2が結合している固体支持体を、
その結合しているdm2に野性型p53が結合してこれと複合
体を形成するような条件下で野性型のp53に結合させ、
ｄ）未結合のp53を除去し、ｅ）このようにして形成さ
れたdm2/p53複合体に、サンプル中に存在する標識され
た潜在的治療剤が野性型p53と競合しながら結合dm2へと
結合するような条件下で、検出可能なマーカーで標識さ
れた所定量のサンプルを接触させ、ｆ）固体支持体に未
結合である標識化潜在的治療剤の濃度を定量的に決定
し、ｇ）dm2と特異的に結合しdm2が野性型p53に結合す
るのを阻止する潜在的治療剤のサンプル中の濃度を決定
する。
含する： ａ）固体支持体に所定量のdm2をdm2が支持体の表面に付
着するような条件下で接触（たとえば抗dm2抗体を用い
てdm2を固体支持体に接触）させ、ｂ）支持体に未結合
のdm2を除去し、ｃ）dm2が結合している固体支持体を、
その結合しているdm2に野性型p53が結合してこれと複合
体を形成するような条件下で野性型のp53に結合させ、
ｄ）未結合のp53を除去し、ｅ）このようにして形成さ
れたdm2/p53複合体に、サンプル中に存在する標識され
た潜在的治療剤が野性型p53と競合しながら結合dm2へと
結合するような条件下で、検出可能なマーカーで標識さ
れた所定量のサンプルを接触させ、ｆ）固体支持体に未
結合である標識化潜在的治療剤の濃度を定量的に決定
し、ｇ）dm2と特異的に結合しdm2が野性型p53に結合す
るのを阻止する潜在的治療剤のサンプル中の濃度を決定
する。
固体支持体は、当業者が容易に選択、決定できる。好
ましい一方法においては、固体支持体は不活性ポリマー
からなるビーズであり、また別法においては固体支持体
はマイクロウェルである。上記の方法において用いられ
るマーカーについては当業者はこれを任意に選択でき
る。検出可能なマーカーは好ましくは酵素、常磁性イオ
ン、ビオチン、蛍光体、発色団、重金属、あるいはラジ
オアイソトープである。より好ましいマーカーとしては
酵素が挙げられ、中でも最も好ましくはホースラディッ
シュペロキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼで
ある。
ましい一方法においては、固体支持体は不活性ポリマー
からなるビーズであり、また別法においては固体支持体
はマイクロウェルである。上記の方法において用いられ
るマーカーについては当業者はこれを任意に選択でき
る。検出可能なマーカーは好ましくは酵素、常磁性イオ
ン、ビオチン、蛍光体、発色団、重金属、あるいはラジ
オアイソトープである。より好ましいマーカーとしては
酵素が挙げられ、中でも最も好ましくはホースラディッ
シュペロキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼで
ある。
本発明方法の更なる態様によれば、潜在的治療剤は酵
素で標識されているとともに、ステップｆ）では固体支
持体に結合しなかった標識化潜在的治療剤を除去し、こ
れを、酵素が基質と反応して検出可能な生成物を形成す
るような条件の下で、酵素に対する特異的基質と接触さ
せる。
素で標識されているとともに、ステップｆ）では固体支
持体に結合しなかった標識化潜在的治療剤を除去し、こ
れを、酵素が基質と反応して検出可能な生成物を形成す
るような条件の下で、酵素に対する特異的基質と接触さ
せる。
本発明はさらに、マウス、ラット、ハムスター、ヒト
を含む哺乳類における癌を治療する方法を提供するもの
であり、この方法においては野性型p53へのdm2の有害な
結合が阻止される。この方法の一態様によれば、野性型
p53へのdm2の結合の阻止は、dm2を充分量の抗dm2抗体と
接触させることによってなされる。また別の態様では、
野性型p53へのdm2の結合の阻止は、dm2を過剰量の抗イ
ディオタイプp53抗体と接触させることによってなされ
る。他の態様では、p53の転写プロモーターを阻止しな
いdm2抗イディオタイプ抗体を投与してもよい。腫瘍を
治療するための他の方法においては、遺伝子治療によっ
て増幅されたdm2遺伝子を正常な数のdm2遺伝子で置き換
え、上昇したp53値レベルを正常化する。さらに別の腫
瘍治療方法においては、アンチセンス遺伝子治療によっ
て増幅されたdm2遺伝子をアンチセンスdm2遺伝子で置き
換える。
を含む哺乳類における癌を治療する方法を提供するもの
であり、この方法においては野性型p53へのdm2の有害な
結合が阻止される。この方法の一態様によれば、野性型
p53へのdm2の結合の阻止は、dm2を充分量の抗dm2抗体と
接触させることによってなされる。また別の態様では、
野性型p53へのdm2の結合の阻止は、dm2を過剰量の抗イ
ディオタイプp53抗体と接触させることによってなされ
る。他の態様では、p53の転写プロモーターを阻止しな
いdm2抗イディオタイプ抗体を投与してもよい。腫瘍を
治療するための他の方法においては、遺伝子治療によっ
て増幅されたdm2遺伝子を正常な数のdm2遺伝子で置き換
え、上昇したp53値レベルを正常化する。さらに別の腫
瘍治療方法においては、アンチセンス遺伝子治療によっ
て増幅されたdm2遺伝子をアンチセンスdm2遺伝子で置き
換える。
相対的結合親和性を決定するための方法は本技術分野
で公知の方法であってよい。たとえば、p53タンパクがh
sc70に結合しているかどうかを決定する方法は、Finley
ら、Mol.and Cell Biol.8、531−539（1988）およびH
indsら、Mol.and Cell Biol.7、2863−2869（1987）
に記載されている。これらの論文に記載の方法では、抗
p53および抗hsc70抗体を用いた共免疫沈降法が行われて
いる。
で公知の方法であってよい。たとえば、p53タンパクがh
sc70に結合しているかどうかを決定する方法は、Finley
ら、Mol.and Cell Biol.8、531−539（1988）およびH
indsら、Mol.and Cell Biol.7、2863−2869（1987）
に記載されている。これらの論文に記載の方法では、抗
p53および抗hsc70抗体を用いた共免疫沈降法が行われて
いる。
実施例
実施例１
cDNAクローンの単離：
HeLa細胞から調製されたλgt11 cDNAライブラリー
を、低緊縮下でマウスmdm2 cDNAをプローブとして用い
てスクリーニングした。cDNAインサートを陽性ファージ
から単離し、さらに特徴付けるためにブルースクリプト
ベクター中にサブクローニングした。全コード領域を含
有する完全長cDNAを二つの重複したクローンから再構築
し、Sangerの方法によって完全に配列決定した（Sanger
ら、1977年、“DNA sequencing With chain−termin
ating in hibitors"Proc.Natl.Acad.Sci.、USA14:546
3−5467）。
を、低緊縮下でマウスmdm2 cDNAをプローブとして用い
てスクリーニングした。cDNAインサートを陽性ファージ
から単離し、さらに特徴付けるためにブルースクリプト
ベクター中にサブクローニングした。全コード領域を含
有する完全長cDNAを二つの重複したクローンから再構築
し、Sangerの方法によって完全に配列決定した（Sanger
ら、1977年、“DNA sequencing With chain−termin
ating in hibitors"Proc.Natl.Acad.Sci.、USA14:546
3−5467）。
hdm2に対するモノクローナル抗体の生成：
ライブラリーのスクリーニングによって得られたcDNA
クローンは、hdm2コード領域のＮ−末端コード領域を含
有し、最初のメチオニン開始コドンでトランケートされ
ていた。このcDNAを完全長のhdm2 cDNAとリコンビナン
トしてリーダー配列と最初のメチオニンのないコード領
域を得た。このコード配列をpQE11ベクター（Quiagen）
に挿入し６個のヒスチジン残基がhdm2のＮ−末端に融合
した完全オープンリーディングフレームを得た。発現プ
ラスミドをE.Coliに導入し、ヒスチジン−hdm2融合タン
パクをNi−2+−NTA−アガロース（Quiagen）カラムクロ
マトグラフィーで精製した。精製物中の主なタンパク種
の易動度はin vitroでの翻訳されたhdm2と同等であっ
た。
クローンは、hdm2コード領域のＮ−末端コード領域を含
有し、最初のメチオニン開始コドンでトランケートされ
ていた。このcDNAを完全長のhdm2 cDNAとリコンビナン
トしてリーダー配列と最初のメチオニンのないコード領
域を得た。このコード配列をpQE11ベクター（Quiagen）
に挿入し６個のヒスチジン残基がhdm2のＮ−末端に融合
した完全オープンリーディングフレームを得た。発現プ
ラスミドをE.Coliに導入し、ヒスチジン−hdm2融合タン
パクをNi−2+−NTA−アガロース（Quiagen）カラムクロ
マトグラフィーで精製した。精製物中の主なタンパク種
の易動度はin vitroでの翻訳されたhdm2と同等であっ
た。
Balb/Cマウスをhdm2タンパクを産生するそのE.coliで
免疫した。ハイブリドーマは通常の手順により準備し
た。そしてエンザイム−リンクトイムノソルベントアッ
セイとインビトロで変換されたhdm2タンパクの免疫沈降
法によりスクリーニングした。３回のクローニングによ
り安定したクローンを確率した。
免疫した。ハイブリドーマは通常の手順により準備し
た。そしてエンザイム−リンクトイムノソルベントアッ
セイとインビトロで変換されたhdm2タンパクの免疫沈降
法によりスクリーニングした。３回のクローニングによ
り安定したクローンを確率した。
ヒトdm2 cDNAの単離：
HeLa細胞から構築したλgt11ライブラリーを、低緊縮
下でマウスmdm2 cDNAを用いてスクリーニングした。計
14個の陽性クローンが単離され、さらに分析するために
cDNAインサートをブルースクリプトベクター中にサブク
ローニングした。予備的な制限地図化と部分的な配列決
定によって、それらはヒトdm2 cDNAのクローンの一部
であることが判明した（Fakharzadeh,S.S.ら、1991年、
「マウス腫瘍細胞株中で増幅された遺伝子の亢進発現を
伴う腫瘍形成潜在能」EMBO J.10:1565−1569）。完全
長コード領域を二つの重複したcDNAクローンから構築
し、配列決定した。hdm2と呼ばれる、このcDNAクローン
のDNA配列は、文献に記載のhdm2配列と類似のものであ
り（Oliner,J.D.ら、1992年、「ヒトサルコーマにおけ
るp53−関連タンパクをコードする遺伝子の増幅」、Nat
ure358:80−83）、コード領域においては完全に同一で
非コード領域においては多少相違がある。これらの二つ
のcDNAクローンが二つの大きく異なる細胞源（HeLa細胞
と結腸カルチノーマ）から得られたにもかかわらず同等
なコード配列を有しているという事実は、それらが野性
型のhdm2コード配列を体現したものであるかあるいは異
なる癌細胞中に系統的突然変異が或ることを示唆してい
る。
下でマウスmdm2 cDNAを用いてスクリーニングした。計
14個の陽性クローンが単離され、さらに分析するために
cDNAインサートをブルースクリプトベクター中にサブク
ローニングした。予備的な制限地図化と部分的な配列決
定によって、それらはヒトdm2 cDNAのクローンの一部
であることが判明した（Fakharzadeh,S.S.ら、1991年、
「マウス腫瘍細胞株中で増幅された遺伝子の亢進発現を
伴う腫瘍形成潜在能」EMBO J.10:1565−1569）。完全
長コード領域を二つの重複したcDNAクローンから構築
し、配列決定した。hdm2と呼ばれる、このcDNAクローン
のDNA配列は、文献に記載のhdm2配列と類似のものであ
り（Oliner,J.D.ら、1992年、「ヒトサルコーマにおけ
るp53−関連タンパクをコードする遺伝子の増幅」、Nat
ure358:80−83）、コード領域においては完全に同一で
非コード領域においては多少相違がある。これらの二つ
のcDNAクローンが二つの大きく異なる細胞源（HeLa細胞
と結腸カルチノーマ）から得られたにもかかわらず同等
なコード配列を有しているという事実は、それらが野性
型のhdm2コード配列を体現したものであるかあるいは異
なる癌細胞中に系統的突然変異が或ることを示唆してい
る。
実施例２
臨床的にも病理学的にもよく特徴が把握されている成
人軟組織サルコーマ211例のコホートを分析した。73名
の患者からなる部分集団において腫瘍と正常検体が入手
できた。分子レベルおよび生物学的観点からの考察をこ
の73名の患者からなる群にもとづいておこなった。しか
しながら、臨床病理との相関付けを行うにあたっては、
免疫組織化学的手法を利用するとともに、メモリアル・
スローアン−ケタリング・癌センターにおいて患者が得
ることができ、頻繁にデータ更新がなされている臨床お
よび病理学的情報デーダベースから得た211人の軟組織
サルコーマ患者に関する情報を利用した。
人軟組織サルコーマ211例のコホートを分析した。73名
の患者からなる部分集団において腫瘍と正常検体が入手
できた。分子レベルおよび生物学的観点からの考察をこ
の73名の患者からなる群にもとづいておこなった。しか
しながら、臨床病理との相関付けを行うにあたっては、
免疫組織化学的手法を利用するとともに、メモリアル・
スローアン−ケタリング・癌センターにおいて患者が得
ることができ、頻繁にデータ更新がなされている臨床お
よび病理学的情報デーダベースから得た211人の軟組織
サルコーマ患者に関する情報を利用した。
組織
この実施例で用いられた軟組織サルコーマ（STS）に
罹患した211人の成人患者のコホート中、腫瘍卵巣の分
析結果はリポサルコーマ71例、平滑筋肉腫53例、悪性繊
維性組織球腫22例、繊維肉腫15例、末梢神経鞘腫瘍（PN
ST）15例、滑膜肉腫13例、横紋筋肉腫４例、および未分
化型肉腫18例であった。分析したSTSの多くは原発性腫
瘍であり（129例）、残る病巣は再発性（39例）あるい
は転移性（41例）であった。２例の分娩時胎位について
は不明である。分析した211例のSTSにおいては、169例
が進行したサルコーマに分類され、39例の腫瘍が進行度
の低い病変に分類された。３例の進行度については不明
である。これらの患者からなるコンホートの追跡調査期
間の中央値と平均値はそれぞれ29カ月および34カ月であ
った。完全な追跡調査データは211名の患者中209名から
得ることができた。
罹患した211人の成人患者のコホート中、腫瘍卵巣の分
析結果はリポサルコーマ71例、平滑筋肉腫53例、悪性繊
維性組織球腫22例、繊維肉腫15例、末梢神経鞘腫瘍（PN
ST）15例、滑膜肉腫13例、横紋筋肉腫４例、および未分
化型肉腫18例であった。分析したSTSの多くは原発性腫
瘍であり（129例）、残る病巣は再発性（39例）あるい
は転移性（41例）であった。２例の分娩時胎位について
は不明である。分析した211例のSTSにおいては、169例
が進行したサルコーマに分類され、39例の腫瘍が進行度
の低い病変に分類された。３例の進行度については不明
である。これらの患者からなるコンホートの追跡調査期
間の中央値と平均値はそれぞれ29カ月および34カ月であ
った。完全な追跡調査データは211名の患者中209名から
得ることができた。
腫瘍試料は凍結保存液（OCT化合物、マイルズ・ラボ
ラトリーズ、エルクハート、インディアナ州）に包埋
し、イソペンタン中で急速冷凍し−70℃で保存した。各
ブロックからヘマトキシリン−エオジンで染色された代
表的部分をとり、顕微鏡下で観察して腫瘍の存在を確認
するとともにこれらの病変部に存在する腫瘍細胞の割合
（％）と腫瘍壊死の範囲を評価した。付近の腫瘍および
正常組織試料を採集し、分子的遺伝子アッセイを211例
中73例に基づいて行った（下記参照）。これらの組織サ
ンプルは外科的に摘出されたあと直ちに凍結し−70℃で
保存後、DNAを取り出した。
ラトリーズ、エルクハート、インディアナ州）に包埋
し、イソペンタン中で急速冷凍し−70℃で保存した。各
ブロックからヘマトキシリン−エオジンで染色された代
表的部分をとり、顕微鏡下で観察して腫瘍の存在を確認
するとともにこれらの病変部に存在する腫瘍細胞の割合
（％）と腫瘍壊死の範囲を評価した。付近の腫瘍および
正常組織試料を採集し、分子的遺伝子アッセイを211例
中73例に基づいて行った（下記参照）。これらの組織サ
ンプルは外科的に摘出されたあと直ちに凍結し−70℃で
保存後、DNAを取り出した。
モノクローナル抗体と免疫組織化学
p90遺伝子でコードされた遺伝子産物に対するマウス
モノクローナル抗体の一団を用いて本研究を行った。抗
体4B2はアミノ末端領域に位置するエピトープを検出す
る。抗体2A9と2A10はp90の中央部の二つの異なるエピト
ープを同定する。抗体4B11はp90のカルボキシ末端領域
に位置する配列を認識する。p53タンパク上の異なるエ
ピトープを検出する三つのマウスモノクローナル抗体を
本研究で使用した。抗p53抗体PAb1801（Ab−２、“Onco
gene Science"、マンハセット、ニュウヨーク）は、野
性型および突然変異型双方のヒトp53タンパクのアミノ
酸（aaと略記）32−79の間に位置するエピトープを認識
する（Banks,L.ら、1986年、Eur.J.Biochem 159、529
−534）。抗体PAb240（Ab−３、“Oncogene Scienc
e"）は、突然変異体p53産物のあるものの特徴となって
いる、aa156−335の間に位置するコンフォーメーション
エピトープを認識する（Gannon,J.V.ら、1990年、EMBO.
J.9、1595−1602）。抗体PAb1620（AB−５、Oncogene
Science）は野性型のp53と特異的に反応する（Ball,R.
K.ら、1984年、EMBO.J.3、1485−1492）。抗p90及び抗p
53抗体と同じサブクラスのマウスモノクローナル抗体で
ある、MIgS−Kp Ｉを同様の稀釈率で陰性のコントロー
ルとして使用した。
モノクローナル抗体の一団を用いて本研究を行った。抗
体4B2はアミノ末端領域に位置するエピトープを検出す
る。抗体2A9と2A10はp90の中央部の二つの異なるエピト
ープを同定する。抗体4B11はp90のカルボキシ末端領域
に位置する配列を認識する。p53タンパク上の異なるエ
ピトープを検出する三つのマウスモノクローナル抗体を
本研究で使用した。抗p53抗体PAb1801（Ab−２、“Onco
gene Science"、マンハセット、ニュウヨーク）は、野
性型および突然変異型双方のヒトp53タンパクのアミノ
酸（aaと略記）32−79の間に位置するエピトープを認識
する（Banks,L.ら、1986年、Eur.J.Biochem 159、529
−534）。抗体PAb240（Ab−３、“Oncogene Scienc
e"）は、突然変異体p53産物のあるものの特徴となって
いる、aa156−335の間に位置するコンフォーメーション
エピトープを認識する（Gannon,J.V.ら、1990年、EMBO.
J.9、1595−1602）。抗体PAb1620（AB−５、Oncogene
Science）は野性型のp53と特異的に反応する（Ball,R.
K.ら、1984年、EMBO.J.3、1485−1492）。抗p90及び抗p
53抗体と同じサブクラスのマウスモノクローナル抗体で
ある、MIgS−Kp Ｉを同様の稀釈率で陰性のコントロー
ルとして使用した。
冷メタノール−アセトン（1:1稀釈）で固定した５μ
ｍの厚さの凍結組織片を用いてアビジン−ビオチンペル
オキシダーゼ法を行った。簡単に言えば、組織片を15分
間10％の正常ウマ血清（Organon Tecknika Corp.、ウ
エストチェスター、ペンシルバニア州）でインキュベー
トし、次いで適切に稀釈した一次抗体（2A9、4B2および
4B11を稀釈率1:100で、2A10を稀釈率1:1000で使用）（A
b−２は200ng/ml、Ab−３は250ng/ml、Ab−５は３μg/m
l）で２時間インキュベートした。充分に洗浄したあ
と、組織片を200倍稀釈したビオチン化ホースラディッ
シュ抗マウスIgG抗体（Vector Laboratories、バーリ
ンゲーム、カリフォルニア州）で30分間、アビジン−ビ
オチンペルオキシダーゼ複合体（Vector Laboratorie
s、1:25稀釈）で30分間インキュベートした。ジアミノ
ベンジディン（0.06％DAB）を最終色素原として、また
ヘモトキシリンを核の対比染色のために使用した。
ｍの厚さの凍結組織片を用いてアビジン−ビオチンペル
オキシダーゼ法を行った。簡単に言えば、組織片を15分
間10％の正常ウマ血清（Organon Tecknika Corp.、ウ
エストチェスター、ペンシルバニア州）でインキュベー
トし、次いで適切に稀釈した一次抗体（2A9、4B2および
4B11を稀釈率1:100で、2A10を稀釈率1:1000で使用）（A
b−２は200ng/ml、Ab−３は250ng/ml、Ab−５は３μg/m
l）で２時間インキュベートした。充分に洗浄したあ
と、組織片を200倍稀釈したビオチン化ホースラディッ
シュ抗マウスIgG抗体（Vector Laboratories、バーリ
ンゲーム、カリフォルニア州）で30分間、アビジン−ビ
オチンペルオキシダーゼ複合体（Vector Laboratorie
s、1:25稀釈）で30分間インキュベートした。ジアミノ
ベンジディン（0.06％DAB）を最終色素原として、また
ヘモトキシリンを核の対比染色のために使用した。
免疫組織化学的評価を少なくとも二人の別々の研究者
によって行い、核染色を示した腫瘍細胞の概算パーセン
トを算出した。p90とp53双方の核免疫反応性を次の三つ
のカテゴリーに分類した：陰性（＜20％の腫瘍細胞が核
染色を示す）、異生（20−79％の腫瘍細胞が核の反応性
を示す）、および相同（＞／＝80％の腫瘍細胞が強い核
染色を示す）。
によって行い、核染色を示した腫瘍細胞の概算パーセン
トを算出した。p90とp53双方の核免疫反応性を次の三つ
のカテゴリーに分類した：陰性（＜20％の腫瘍細胞が核
染色を示す）、異生（20−79％の腫瘍細胞が核の反応性
を示す）、および相同（＞／＝80％の腫瘍細胞が強い核
染色を示す）。
サザンブロッティング法とRELP分析
1.6kbのヒトdm2 cDNA断片プローブであるpHDM（EcoR
I）を用いて遺伝子増幅をサザンブロッティング法で評
価した。ｂ−アクチンプローブである（EcoR I）をコン
トロールとして用いた。二つのプローブを染色体17の短
腕の対立遺伝子欠失の解析のために用いた:PYNZ22（17p
13.3、D17S5、Taq I）およびphp53B（17p13.1、p53、Bg
l II）。サザンブロッティング法による解析は文献記載
に従った（Prestri,J.C.ら、（1991）、Cancer Res 5
1、5405;Dalbagni,Gら、（1993）、Diagnostic Molecu
lar Pathology ２、４−13）。簡単に言えば、DNAをO
ncor社によって開発された方法によって対にした正常及
び腫瘍試料から非有機的に抽出し（Oncor、ガイザーズ
バーグ、メリーランド州）、適切な制限酵素で分解し、
0.7％アガロースゲル中で電気泳動を行い、ナイロン膜
上にブロッティングした。膜は42℃で１時間、Hybrisol
Ｉ（Oncor社）で予備ハイブリダイズし、［P32］dCTP
に高い特異活性ように標識したプローブで一夜ハイブリ
ダイズした。膜を洗浄し、−70℃で増感スクリーンを使
用して放射線写真撮影した。Ultrascan XL Laser De
nsitometer（ファルマシアLKBバイオテクノロジー社、
ピスカタウェイ、ニュージャージー州）とBetascope 6
30 Blot Analyzer（ベターゲン社、ウオルサム、マサ
チューセッツ州）で濃度を測定し結果を確認した。少な
くとも５コピー遺伝子／細胞であったときにdm2増幅が
あったと考えた。異型性の喪失（LOH）については、腫
瘍試料中の対立遺伝子のシグナル強度が40％を超えて低
下したときに異型性が喪失したものと定義した（Prestr
i,J.C.ら、（1991）、Cancer Res 51、5405:Olumi,A.
F.ら、（1990）、Cancer Res 50、7081−7083）。
I）を用いて遺伝子増幅をサザンブロッティング法で評
価した。ｂ−アクチンプローブである（EcoR I）をコン
トロールとして用いた。二つのプローブを染色体17の短
腕の対立遺伝子欠失の解析のために用いた:PYNZ22（17p
13.3、D17S5、Taq I）およびphp53B（17p13.1、p53、Bg
l II）。サザンブロッティング法による解析は文献記載
に従った（Prestri,J.C.ら、（1991）、Cancer Res 5
1、5405;Dalbagni,Gら、（1993）、Diagnostic Molecu
lar Pathology ２、４−13）。簡単に言えば、DNAをO
ncor社によって開発された方法によって対にした正常及
び腫瘍試料から非有機的に抽出し（Oncor、ガイザーズ
バーグ、メリーランド州）、適切な制限酵素で分解し、
0.7％アガロースゲル中で電気泳動を行い、ナイロン膜
上にブロッティングした。膜は42℃で１時間、Hybrisol
Ｉ（Oncor社）で予備ハイブリダイズし、［P32］dCTP
に高い特異活性ように標識したプローブで一夜ハイブリ
ダイズした。膜を洗浄し、−70℃で増感スクリーンを使
用して放射線写真撮影した。Ultrascan XL Laser De
nsitometer（ファルマシアLKBバイオテクノロジー社、
ピスカタウェイ、ニュージャージー州）とBetascope 6
30 Blot Analyzer（ベターゲン社、ウオルサム、マサ
チューセッツ州）で濃度を測定し結果を確認した。少な
くとも５コピー遺伝子／細胞であったときにdm2増幅が
あったと考えた。異型性の喪失（LOH）については、腫
瘍試料中の対立遺伝子のシグナル強度が40％を超えて低
下したときに異型性が喪失したものと定義した（Prestr
i,J.C.ら、（1991）、Cancer Res 51、5405:Olumi,A.
F.ら、（1990）、Cancer Res 50、7081−7083）。
一本鎖配座多形性（SSCP）分析およびDNA塩基配列決定
これらについてはOritaら（Orita,M.ら（1989年）Gen
omics ５、874−879）によって報告された方法を僅か
にかえて行った。増幅は上述の試料から抽出した100ng
のゲノムDNAを用いて行った。使用したプライマーはヒ
トp53遺伝子のイントロン配列のフランキングエキソン
５から９から得たものであり、この配列についてはすで
に論文が発行されている（Moll,U.M.ら、（1992年）Pro
c Natl Acad Sci USA 89、7262−7266）。DNAはTh
ermal Cycler（Perkin Elmer Cetus）を用いてPCR
（94℃で30秒、エキソン８と９に対して58℃で30秒、エ
キソン５、６、７に対しては63℃で30秒、そして最後に
すべての試料に対して72℃で60秒）の30サイクル後に増
幅された。増幅された試料は変性され、10％グリセロー
ルを含有する非変性アクリルアミドゲル上に置き、室温
で12−16時間10−12ワットで処理した。ゲルは80℃、真
空下で乾燥し、−70℃で４−16時間Ｘ線フィルムに曝し
た。
omics ５、874−879）によって報告された方法を僅か
にかえて行った。増幅は上述の試料から抽出した100ng
のゲノムDNAを用いて行った。使用したプライマーはヒ
トp53遺伝子のイントロン配列のフランキングエキソン
５から９から得たものであり、この配列についてはすで
に論文が発行されている（Moll,U.M.ら、（1992年）Pro
c Natl Acad Sci USA 89、7262−7266）。DNAはTh
ermal Cycler（Perkin Elmer Cetus）を用いてPCR
（94℃で30秒、エキソン８と９に対して58℃で30秒、エ
キソン５、６、７に対しては63℃で30秒、そして最後に
すべての試料に対して72℃で60秒）の30サイクル後に増
幅された。増幅された試料は変性され、10％グリセロー
ルを含有する非変性アクリルアミドゲル上に置き、室温
で12−16時間10−12ワットで処理した。ゲルは80℃、真
空下で乾燥し、−70℃で４−16時間Ｘ線フィルムに曝し
た。
配列決定アッセイにおけるゲノムDNAの増幅はSSCP分
析において用いたものとは独立したものであり、35サイ
クル（94℃で60秒、上記の条件で58℃と63℃で60秒、さ
らに72℃で90秒）かけて増幅した。DNA断片を２％の低
融点アガロースゲルから単離し、ジデオキシ法（Sange
r,F.ら、（1977年）、Proc Natl Acad Sci USA74、
5463−5467）で精製・配列決定した。両方の鎖は、分析
した各DNAについて配列決定するとともに、野性型のp53
を含有するコントロール試料から得たゲノムDNAも突然
変異を確認するために平行して配列決定した。
析において用いたものとは独立したものであり、35サイ
クル（94℃で60秒、上記の条件で58℃と63℃で60秒、さ
らに72℃で90秒）かけて増幅した。DNA断片を２％の低
融点アガロースゲルから単離し、ジデオキシ法（Sange
r,F.ら、（1977年）、Proc Natl Acad Sci USA74、
5463−5467）で精製・配列決定した。両方の鎖は、分析
した各DNAについて配列決定するとともに、野性型のp53
を含有するコントロール試料から得たゲノムDNAも突然
変異を確認するために平行して配列決定した。
DM2の増幅とDM2タンパクの過剰生産
dm2遺伝子の増幅を73例の成人軟組織サルコーマ（ST
S）中の11例で調べたところ、５倍か35倍に増幅してい
た。dm2の増幅は、病気の進行度が低い場合（４例）よ
り病気の進行度が高い場合（７例）においてより高頻度
で検出された。転移性のSTS（11例中３例、27％）にお
いて原発性のSTS（48例中４例、８％）におけるより増
幅はより普通に観察された。
S）中の11例で調べたところ、５倍か35倍に増幅してい
た。dm2の増幅は、病気の進行度が低い場合（４例）よ
り病気の進行度が高い場合（７例）においてより高頻度
で検出された。転移性のSTS（11例中３例、27％）にお
いて原発性のSTS（48例中４例、８％）におけるより増
幅はより普通に観察された。
抗dm2抗体の免疫染色のパターンはまず3T3−Balbcと3
T3−DM細胞を用いて評価した。DM細胞においては強い核
染色が見られ、増幅dm2遺伝子を有しdm2タンパクを過発
現していることが報告されたが、一方Balb−ｃ細胞は反
応せず（図４）dm2タンパクレベルが低かった。11例の
増幅したケース中６例が、抗dm2抗体で核免疫反応性を
示す腫瘍細胞が20％を超えることを示した。しかしなが
ら、残る５例では反応は見られなかった。62例中、明ら
かに増幅されていないdm2遺伝子を有する17例におい
て、組織片を用いてdm2抗体で検出されたようにdm2タン
パクのレベルの上昇を示した（dm2陽性表現形）。
T3−DM細胞を用いて評価した。DM細胞においては強い核
染色が見られ、増幅dm2遺伝子を有しdm2タンパクを過発
現していることが報告されたが、一方Balb−ｃ細胞は反
応せず（図４）dm2タンパクレベルが低かった。11例の
増幅したケース中６例が、抗dm2抗体で核免疫反応性を
示す腫瘍細胞が20％を超えることを示した。しかしなが
ら、残る５例では反応は見られなかった。62例中、明ら
かに増幅されていないdm2遺伝子を有する17例におい
て、組織片を用いてdm2抗体で検出されたようにdm2タン
パクのレベルの上昇を示した（dm2陽性表現形）。
p53欠失、点変異、およびp53核免疫反応性
体細胞および腫瘍DNAの73個のペアを、染色体17の短
腕に対する二つの異なったプローブを用いて調べた。調
査した情報通知例51例中27例（53％）で染色体17の短腕
の欠失が見いだされた。染色体17pの異形性の喪失（LO
H）が進行度の高いサルコーマと進行度の低いサルコー
マの両者で観察された。染色体17pのLOHは原発腫瘍（33
例中13例、41％）より転移腫瘍（８例中６例、75％）に
おいてより高頻度で見いだされた。
腕に対する二つの異なったプローブを用いて調べた。調
査した情報通知例51例中27例（53％）で染色体17の短腕
の欠失が見いだされた。染色体17pの異形性の喪失（LO
H）が進行度の高いサルコーマと進行度の低いサルコー
マの両者で観察された。染色体17pのLOHは原発腫瘍（33
例中13例、41％）より転移腫瘍（８例中６例、75％）に
おいてより高頻度で見いだされた。
p53が細胞内での過発現に関連していると思われるこ
とから、p53の具体的な遺伝子内突然変異をより特徴付
けるために、73例のSTSをSSCPで（エキソン５から９）
分析し、このアッセイで陽性であったものをDNA配列決
定した。突然変異の存在が14例で確認された。これら14
例のSTSのうち11例が抗体PAb1801に対しp53核免疫反応
性を示した。点変異を11例のサルコーマ中７例におい
て、配列決定によって点変異が特徴付けられ、５例がAT
からGCの変異を、２例がGCからATへの変異を示した。４
例において移動度の変化がSSCPによって検出されたが、
突然変異を同定するための配列決定は行われなかった。
突然変異の14例中３例はPAb1801に対して陰性の免疫染
色結果を示した。突然変異の内の１例は停止コドンを産
生し、コドン165中において同定された。他の１例はコ
ドン278でＣ欠失があり、344の位置で停止コドンを産生
した。他の突然変異はスプライス供与位置に影響するエ
キソン５において起こった。一つを除いて、染色体17p
の状態に関する全ての情報提供突然変異体に随伴する短
腕欠失が認められた。加えて、13例が研究中のエキソン
に対する点変異の証拠なしに陽性の核染色を示した。
とから、p53の具体的な遺伝子内突然変異をより特徴付
けるために、73例のSTSをSSCPで（エキソン５から９）
分析し、このアッセイで陽性であったものをDNA配列決
定した。突然変異の存在が14例で確認された。これら14
例のSTSのうち11例が抗体PAb1801に対しp53核免疫反応
性を示した。点変異を11例のサルコーマ中７例におい
て、配列決定によって点変異が特徴付けられ、５例がAT
からGCの変異を、２例がGCからATへの変異を示した。４
例において移動度の変化がSSCPによって検出されたが、
突然変異を同定するための配列決定は行われなかった。
突然変異の14例中３例はPAb1801に対して陰性の免疫染
色結果を示した。突然変異の内の１例は停止コドンを産
生し、コドン165中において同定された。他の１例はコ
ドン278でＣ欠失があり、344の位置で停止コドンを産生
した。他の突然変異はスプライス供与位置に影響するエ
キソン５において起こった。一つを除いて、染色体17p
の状態に関する全ての情報提供突然変異体に随伴する短
腕欠失が認められた。加えて、13例が研究中のエキソン
に対する点変異の証拠なしに陽性の核染色を示した。
結局、分析した211例のSTS中56例が陽性核免疫染色パ
ターンをPAb1801に対して示した（表１）。p53陽性の表
現形と腫瘍の進行度の間には大きな開きがあった。さら
に、STSに罹患している患者は、20％を超える腫瘍細胞
でp53核免疫染色を示し、生存率が顕著に低かった。
ターンをPAb1801に対して示した（表１）。p53陽性の表
現形と腫瘍の進行度の間には大きな開きがあった。さら
に、STSに罹患している患者は、20％を超える腫瘍細胞
でp53核免疫染色を示し、生存率が顕著に低かった。
DM2とP53の遺伝子型と表現型の変化：臨床病理学との関
連 73例からなるサブグループ中のただ１例が増幅dm2とp
53遺伝子の突然変異体を示したが、これは転移繊維肉腫
であった。しかしながら、コホートの全211例中22例がd
m2とp53の両方のタンパクに対して連続した組織片で陽
性の核免疫反応性を示した（表１）。これらの分子の染
色パターンは、それらが共発現した場合には、一般に異
生であった。表現形の組み合わせ（グループA:dm2−/p5
3−；グループB:dm2−/p53−およびdm2−/p53＋；グル
ープC:dm2＋/p53＋）を臨床病理学的パラメーターと比
較したところ、陽性表現形と予後不良の間に相関関係が
認められた。データにより、グループＡが最も予後が良
く、グループＣが最も予後不良であることが示された
（図３参照）。
連 73例からなるサブグループ中のただ１例が増幅dm2とp
53遺伝子の突然変異体を示したが、これは転移繊維肉腫
であった。しかしながら、コホートの全211例中22例がd
m2とp53の両方のタンパクに対して連続した組織片で陽
性の核免疫反応性を示した（表１）。これらの分子の染
色パターンは、それらが共発現した場合には、一般に異
生であった。表現形の組み合わせ（グループA:dm2−/p5
3−；グループB:dm2−/p53−およびdm2−/p53＋；グル
ープC:dm2＋/p53＋）を臨床病理学的パラメーターと比
較したところ、陽性表現形と予後不良の間に相関関係が
認められた。データにより、グループＡが最も予後が良
く、グループＣが最も予後不良であることが示された
（図３参照）。
実施例３
p90の免疫沈降あるいはp90とp53の共免疫沈降のため
の抗体を調製するのにp90を用いることができる。p90は
沈降物から単離し、精製される。高p90抗体はポリクロ
ーナルでもモノクローナルでもよい。
の抗体を調製するのにp90を用いることができる。p90は
沈降物から単離し、精製される。高p90抗体はポリクロ
ーナルでもモノクローナルでもよい。
p90に対するポリクローナル抗体を調製する方法とし
て以下のものがあげられる。
て以下のものがあげられる。
ウサギにおけるp90抗体の産生手続：
p90タンパク断片は0.7mg/mlの濃度で使用する。次の
ように免疫を行う： ０日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI（アジュバン
ド）中25μｇ、 ７日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI（アジュバン
ド）中50μｇ、 14日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI（アジュバンド）
中50μｇ、 21日目：休止 28日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI中50μｇ 39日目：採血−アッセイ 52日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBIに50μｇを加え動
物に投与、 59日目：採血−最終注入後７日後におけるアッセイ 62日目：放血死 ELISA法を適用し、４℃でウェルを一夜コーティング
（200ng/ウェル）してアッセイを行った。37℃で１時間
２％BSAでブロックする。１％BSA中に血清を加え稀釈
し、37℃で２時間インキュベートする。１％BSAで調製
した第二抗体稀釈液（TAGO ヤギ抗ウサギペロキシダー
ゼ−cat＃6430）では37℃で１時間インキュベートす
る。血清抗体価は最初のアッセイで1:25000（カットオ
フ吸光度:450nmで0.400）、最終アッセイで＞50000。Ki
rkegarrd ＆ Perry TMB ペロキシダーゼ基質溶液で
展開し、450nmでの吸光度を読み取る。
ように免疫を行う： ０日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI（アジュバン
ド）中25μｇ、 ７日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI（アジュバン
ド）中50μｇ、 14日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI（アジュバンド）
中50μｇ、 21日目：休止 28日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBI中50μｇ 39日目：採血−アッセイ 52日目:200μｌのPBSと200μｌのRIBIに50μｇを加え動
物に投与、 59日目：採血−最終注入後７日後におけるアッセイ 62日目：放血死 ELISA法を適用し、４℃でウェルを一夜コーティング
（200ng/ウェル）してアッセイを行った。37℃で１時間
２％BSAでブロックする。１％BSA中に血清を加え稀釈
し、37℃で２時間インキュベートする。１％BSAで調製
した第二抗体稀釈液（TAGO ヤギ抗ウサギペロキシダー
ゼ−cat＃6430）では37℃で１時間インキュベートす
る。血清抗体価は最初のアッセイで1:25000（カットオ
フ吸光度:450nmで0.400）、最終アッセイで＞50000。Ki
rkegarrd ＆ Perry TMB ペロキシダーゼ基質溶液で
展開し、450nmでの吸光度を読み取る。
実施例４
ATCC（前述）に寄託されたハイブリドーマ、1F5、6C1
0、1D6、4B2、2E12、3F3、3G5、3F8、6H7、2A9、3G9、1
D11、2A10、1G2、4B11、および5B10はp90タンパクのエ
ピトープに対するモノクローナル抗体を産生する（図１
参照）。以下に記載のプロトコールは、これらのモノク
ローナル抗体と他の抗p90抗体を一時抗体として用い
て、DM2遺伝子コード産物であるp90タンパクを組織中、
好ましくはヒト組織中で免疫組織化学的方法によって検
出するものである。
0、1D6、4B2、2E12、3F3、3G5、3F8、6H7、2A9、3G9、1
D11、2A10、1G2、4B11、および5B10はp90タンパクのエ
ピトープに対するモノクローナル抗体を産生する（図１
参照）。以下に記載のプロトコールは、これらのモノク
ローナル抗体と他の抗p90抗体を一時抗体として用い
て、DM2遺伝子コード産物であるp90タンパクを組織中、
好ましくはヒト組織中で免疫組織化学的方法によって検
出するものである。
アビジン−ビオチン免疫パーオキシダーゼ法は、感度
が高いため適切な手法である。ヒトの正常および腫瘍組
織切片をクリオスタットで切り出し、マイクロスライド
に載置する。これらの切片を阻止血清で、次いで過酸化
水素およびアビジン−ビオチンブロック剤でインキュベ
ートする。第一抗体、即ち抗p90抗体を適切な濃度で使
用する。この適切な濃度は、各抗体について滴定を行う
ことによって経験的に決定される。次に、切片をビオチ
ン化第二ウマ抗マウス抗体、次いでアビジン−ビオチン
パーオキシダーゼ複合体でインキュベートする。ジアミ
ノベンジディンを用いて最終反応を行う。切片をヘマト
キシリンで対比染色し、載物台に載せて最終分析する。
が高いため適切な手法である。ヒトの正常および腫瘍組
織切片をクリオスタットで切り出し、マイクロスライド
に載置する。これらの切片を阻止血清で、次いで過酸化
水素およびアビジン−ビオチンブロック剤でインキュベ
ートする。第一抗体、即ち抗p90抗体を適切な濃度で使
用する。この適切な濃度は、各抗体について滴定を行う
ことによって経験的に決定される。次に、切片をビオチ
ン化第二ウマ抗マウス抗体、次いでアビジン−ビオチン
パーオキシダーゼ複合体でインキュベートする。ジアミ
ノベンジディンを用いて最終反応を行う。切片をヘマト
キシリンで対比染色し、載物台に載せて最終分析する。
上記の免疫組織化学方法においては、典型的にはp90
タンパクのみが正常レベルからはずれた上昇値で組織に
おいて検出されるが、この理由は上記の例で試験した組
織について、モノクローナル抗体は細胞中のp90の上昇
のみを検出できるからである。
タンパクのみが正常レベルからはずれた上昇値で組織に
おいて検出されるが、この理由は上記の例で試験した組
織について、モノクローナル抗体は細胞中のp90の上昇
のみを検出できるからである。
免疫組織化学的
アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ法
パラフィン埋め込み切片
１）ポリ−Ｌ−リジンで被覆したスライド上に５μｍの
組織切片を置く。
組織切片を置く。
２）切片を60Cのオーブンに30分入れてパラフィンを溶
かす。
かす。
３）スライドを室温まで冷却し、脱パラフィンおよび再
水化のための処理を行う。
水化のための処理を行う。
キシレン−３回（各回５分）
100％エタノール−３回（各回３分）
95％エタノール−３回（各回３分）
４）蒸留水中で洗浄し、PBSに移す。
５）１％のH2O2を用いて15分間冷却し、内因性のパーオ
キシダーゼ活性を除去する。
キシダーゼ活性を除去する。
６）PBS中で洗浄（３回）。
７）内因性のパーオキシダーゼ活性を除去するために、
肝臓、膵臓、脳等のビオチンを含有する細胞中に、アビ
ジン−ビオチン阻止キット（Vector）を適用する。溶液
は順番に用い（アビジンの後でビオチン）、スライドは
各溶液を用いて15分インキュベートすること。
肝臓、膵臓、脳等のビオチンを含有する細胞中に、アビ
ジン−ビオチン阻止キット（Vector）を適用する。溶液
は順番に用い（アビジンの後でビオチン）、スライドは
各溶液を用いて15分インキュベートすること。
８）PBS中で洗浄する。
９）酵素分解−酵素の選択は、各抗体に対して最適にな
るように経験的に行う。
るように経験的に行う。
共通の酵素：
ペプシン（ブタの胃の粘膜,Sigma）:HCL溶液（250mlの
蒸留水に200μｌのHClを加えたもの）に0.25グラムのペ
プシンを加え、30分インキュベートする。
蒸留水に200μｌのHClを加えたもの）に0.25グラムのペ
プシンを加え、30分インキュベートする。
トリプシン（ウシの膵臓タイプI,Sigma）:250mlのTRIS
に0.0625グラムのトリプシンを加え、５分間インキュベ
ートする。蒸留水中で洗浄し、トリプシン阻止剤（Sigm
a）（250mlのPBSと0.025グラムのトリプシン阻止剤との
混合液）を用い15分間インキュベートする。
に0.0625グラムのトリプシンを加え、５分間インキュベ
ートする。蒸留水中で洗浄し、トリプシン阻止剤（Sigm
a）（250mlのPBSと0.025グラムのトリプシン阻止剤との
混合液）を用い15分間インキュベートする。
プロナーゼ（カルビオケム・ベーリング）:250mlのTRIS
に0.0055グラムのプロナーゼを加え、４分間インキュベ
ートする。
に0.0055グラムのプロナーゼを加え、４分間インキュベ
ートする。
フィシン（懸濁液、Sigma）：そのまま使用可能。滴下
し、45分インキュベートする。
し、45分インキュベートする。
サポニン（洗剤、Sigma）:250mlの蒸留水の混合液に0.1
25グラムのサポニンを加え、30分間インキュベートす
る。
25グラムのサポニンを加え、30分間インキュベートす
る。
10）スライドを蒸留水中で洗浄し、PBSに移す。
11）阻止血清−10％の通常血清（特定の種−第２抗体と
同じ）を加え、20〜30分間インキュベート。
同じ）を加え、20〜30分間インキュベート。
12）阻止血清を真空で吸い上げ除去し、適切な希釈した
第１抗体を加え、加湿チャンバー内で４℃で一晩インキ
ュベートする。第１抗体は、1F5、6C10、1D6、4B2、2E1
2、3F3、3G5、3F8、6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、
4B11、および5B10のハイブリドーマによって生産される
抗p90モノクローナル抗体から選択する。第１抗体は最
適な濃度となるように経験的に適宜希釈する。
第１抗体を加え、加湿チャンバー内で４℃で一晩インキ
ュベートする。第１抗体は、1F5、6C10、1D6、4B2、2E1
2、3F3、3G5、3F8、6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、
4B11、および5B10のハイブリドーマによって生産される
抗p90モノクローナル抗体から選択する。第１抗体は最
適な濃度となるように経験的に適宜希釈する。
13）PBSを用いて丁寧に洗浄する。PBSを３回交換（各回
５分） 14）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、30分
間インキュベートする。
５分） 14）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、30分
間インキュベートする。
15）PBSを用いて洗浄（各５分で３回）。
16）1:25（A:Bは等割合）希釈のアビジン−ビオチン複
合体（Vector）を30分間インキュベートする。
合体（Vector）を30分間インキュベートする。
17）PBSを用いて洗浄（各５分で３回）
18）色原体基質溶液：パーオキシダーゼ−ジアミノベン
ゼディン（0.06％DAB）（5mg/DAB/100mlのPBSに100ulの
0.3％H2O2）。望ましい色強さになるまでインキュベー
トする（約５分）。
ゼディン（0.06％DAB）（5mg/DAB/100mlのPBSに100ulの
0.3％H2O2）。望ましい色強さになるまでインキュベー
トする（約５分）。
19）ヘマトキシリンを用いて対比染色を行なう。
免疫組織化学的
アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ法
冷凍組織切片
１）５μｍの冷凍組織切片を室温中に30分間置いて切片
を解凍し、乾燥する。
を解凍し、乾燥する。
２）適切な固定液を10分間加える（各抗体に最適な固定
液を選択）。
液を選択）。
３）１％のH2O2を用いて15分間冷却し、内因性のパーオ
キシダーゼ活性を除去する。
キシダーゼ活性を除去する。
４）PBS中で洗浄（３回）。
５）内因性のパーオキシダーゼ活性を除去するために、
内因性ビオチンに富む細胞中に、アビジン−ビオチン阻
止キットを加える。アビジン15分インキュベートし、PB
Sを用いて洗浄し、そしてビオチンを用いて15分インキ
ュベートする。
内因性ビオチンに富む細胞中に、アビジン−ビオチン阻
止キットを加える。アビジン15分インキュベートし、PB
Sを用いて洗浄し、そしてビオチンを用いて15分インキ
ュベートする。
６）PBS中で洗浄する（３回）。
７）阻止血清−10％の通常血清（特定の種−第２抗体と
同じ）を加え、加湿チャンバー内で10〜30分間インキュ
ベートする。
同じ）を加え、加湿チャンバー内で10〜30分間インキュ
ベートする。
８）阻止血清を真空で吸い上げ除去し、適切な希釈した
第１抗体を加えて１〜２時間インキュベートする。第１
抗体は、1F5、6C10、1D6、4B2、2E12、3F3、3G5、3F8、
6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、4B11、および5B10の
ハイブリドーマによって生産される抗p90モノクローナ
ル抗体から選択する。第１抗体は最適な濃度となるよう
に経験的に適宜希釈するが、典型的には、ハイブリドー
マの上澄みとリン酸緩衝血清（PBS）との容量比で１〜1
000である。
第１抗体を加えて１〜２時間インキュベートする。第１
抗体は、1F5、6C10、1D6、4B2、2E12、3F3、3G5、3F8、
6H7、2A9、3G9、1D11、2A10、1G2、4B11、および5B10の
ハイブリドーマによって生産される抗p90モノクローナ
ル抗体から選択する。第１抗体は最適な濃度となるよう
に経験的に適宜希釈するが、典型的には、ハイブリドー
マの上澄みとリン酸緩衝血清（PBS）との容量比で１〜1
000である。
９）PBSを用いて丁寧に洗浄。
10）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、30分
間インキュベートする。
間インキュベートする。
11）PBSを用いて洗浄（３回）
12）1:25希釈（A:Bは等割合）のアビジン−ビオチン複
合体（Vector）を30分間インキュベートする。
合体（Vector）を30分間インキュベートする。
13）PBSとPBS/Tritonを用いて洗浄（３回）。
14）色原体基質溶液：パーオキシダーゼ−ジアミノベン
ザディン（0.06％DAB）で約５分間。
ザディン（0.06％DAB）で約５分間。
15）ヘマトキシリンを用いて対比染色を行う。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
// Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(31)優先権主張番号 ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６０６３
(32)優先日 平成５年６月25日(1993．6．25)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１１１８２
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１１１８３
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１１１８４
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１１１８５
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１１１８６
(72)発明者 レビン，アーノルド，ジェー.
アメリカ合衆国 08540 ニュージャー
ジー州，プリンストン，フリッツランド
ルフ ロード 138
(72)発明者 フィンレー，キャシー，エー.
アメリカ合衆国 19067 ペンシルバニ
ア州，ヤードリー，ベイベリー レーン
660
(72)発明者 コードン−カード，カルロス
アメリカ合衆国 10021 ニューヨーク
州，ニューヨーク，イースト 63 スト
リート 504，エーピーティ 24アール
(56)参考文献 特表 平７−505294（ＪＰ，Ａ)
Ｃｅｌｌ，69（1992），ｐ．1237−
1245
Ｎａｔｕｒｅ，358（1992），ｐ．80
−83
ＥＭＢＯ Ｊ．，10（1991），ｐ.
1565−1569
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/574
C07K 16/32
C12N 5/10
C12P 21/08
G01N 33/577
C12N 15/02
C12P 21/08
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】癌患者から採取された生物学的試料を３グ
ループに分類する方法であって、試料中のp53またはdm2
のレベルが異常に上昇したか否かを測定し、p53およびd
m2のレベルが何れも異常に上昇していない第１グループ
は予後が最も良い患者由来の生物学的試料であり、p53
のレベルは異常に上昇しているがdm2のレベルは異常に
上昇していないか、dm2のレベルは異常に上昇している
がp53のレベルは異常に上昇していない第２グループは
予後が第１グループと第３グループの中間にある患者由
来の生物学的試料であり、p53とdm2の両方のレベルが異
常に上昇している第３グループは予後が最も悪い患者由
来の生物学的試料であると分類する方法。 - 【請求項２】プローブを用いてdm2遺伝子の増殖または
発現のレベルを測定する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】プローブが、抗体である請求項２に記載の
方法。 - 【請求項４】抗体が、モノクローナル抗体である請求項
３に記載の方法。 - 【請求項５】抗体が、ATCC受託番号HB11182として寄託
されたハイブリドーマ3G5によって生産されるモノクロ
ーナル抗体、ATCC受託番号HB11183として寄託されたハ
イブリドーマ4B11によって生産されるモノクローナル抗
体、ATCC受託番号HB11184として寄託されたハイブリド
ーマ2A10によって生産されるモノクローナル抗体、ATCC
受託番号HB11185として寄託されたハイブリドーマ2A9に
よって生産されるモノクローナル抗体、又はATCC受託番
号HB11186として寄託されたハイブリドーマ4B2によって
生産されるモノクローナル抗体である請求項３に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90476692A | 1992-06-26 | 1992-06-26 | |
| US1864993A | 1993-02-17 | 1993-02-17 | |
| PCT/US1993/006063 WO1994000601A1 (en) | 1992-06-26 | 1993-06-25 | Method for detecting pre-cancerous or cancerous cells using p90 antibodies or probes |
| US08/018,649 | 1993-06-25 | ||
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