MX2007012668A - Metodo in vitro para identificar compuestos para terapia del cancer. - Google Patents

Metodo in vitro para identificar compuestos para terapia del cancer.

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Abstract

Metodo in vitro para identificar compuestos para terapia del cancer. La presente invencion se refiere a un metodo in vitro para identificar y evaluar compuestos utiles en el tratamiento de distintos tipos de cancer, en especial cancer de pulmon, de mama, colorrectal y de vejiga, en un individuo, para determinar el estadio o severidad de dicho cancer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cancer; a la busqueda, identificacion, desarrollo y evaluacion de la eficacia de compuestos para terapia de dicho cancer, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; asi como a agentes que inhiben la expresion y/o la actividad de la proteina Colina Quinasa Alfa y/o los efectos de esta expresion.

Description

MÉTODO IN VITRO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS PARA TERAPIA DEL CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer, especialmente para el cáncer de pulmón, de mama o colorrectal, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, y/o los efectos de esta expresión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Colina Quinasa (conocida también como CK, CHK y ChoK) es la primera enzima de la ruta de Kennedy o de síntesis de fosfatidilcolina (PC) , y fosforila la colina a fosforilcolina (PCho) en presencia de magnesio (Mg2+) , utilizando adenosina 5'-trifosfato (ATP) como dador de grupos fosfato. La transformación mediada por diversos oncogenes, induce niveles elevados de actividad Colina Quinasa, dando lugar a un incremento anormal en los niveles intracelulares de su producto, PCho, lo que apoya indirectamente el papel de la Colina Quinasa en la generación de tumores humanos. Sin embargo, existen mecanismos alternativos de generación de PCho que no implican la activación de la Colina Quinasa y que podrían explicar los niveles elevados de este metabolito en las células tumorales. Si bien existe evidencia del incremento de la actividad de la enzima Colina Quinasa en tumores y células transformadas, su relación con el proceso carcinogénico no está suficientemente demostrada al no haberse establecido una clara relación causa- efecto entre el incremento de actividad y la transformación tumoral. Por otra parte, todavía no se ha identificado la molécula responsable de este efecto. Se han identificado cerca de 200 secuencias génicas que codifican para polipéptidos con estructura primaria homologa a la Colina Quinasa designadas como Colina Quinasa alfa a, Colina Quinasa alfa b, Colina Quinasa alfa 3, Colina Quinasa beta 1, Colina Quinasa beta 2, Colina Quinasa CKB-1 Colina/etanolamina quinasa Colina Quinasa-like Etanolamina quinasa, Cots, Duff227, Cog3173, CPT1B, SF1,SH0X2, FHOD2 , FLJ12242, KRT5,FBL, ARL6IP4, etc. (ver http://www.ncbi .nlm.nih.gov/ BLAST/Blast . cgi#219541) tanto en humanos como en otros mamíferos y roedores (rata, ratón, vaca, cobaya, conejo, mono) . De hecho, desde 1982 existe evidencia bioquímica de que en diferentes tejidos aislados de rata, ratón y de humanos hay al menos tres isoenzimas con actividad Colina Quinasa que manifiestan propiedades físico-químicas diferentes. Recientemente, se han identificado en el genoma humano al menos 3 genes que codifican para proteínas con actividad Colina Quinasa demostrada, designados como ck-alfa, ck-beta, y HCEKV (USA Patent US2003186241) , y varios genes cuyas proteínas codificadas presentan homología de entre un 30-65% con las codificadas por los genes ck, como por ejemplo los genes CAI16602, CHKL, CAI16600, CAI16599, CAH56371, CAI16603, BAA91793, CAI16598 descritos en (http : //www. ncbi .nlm.nih.gov/ BLAST/ Blast. cgi), y los genes CPT1B, EKI2, SF1, SH0X2 , FH0D2 , FLJ12242, KRT5, FBL, ARI61p$, TOMM40, MLL, descritos en (http : //www. ebi . ac . uk/cgi-bin/sumtab?tool =asdblast&jobid=blast-20050412-18072127) . Una característica muy relevante de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa es que presentan propiedades bioquímicas diferentes, con importantes variaciones en su afinidad por el substrato colina o por el donante de fosfatos ATP, e incluso en su forma activa, que puede presentarse como dímeros o tetrámeros. Por tanto, es preciso definir si existe una relación directa entre alguna de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa identificadas y la capacidad tumorogénica atribuida por su sobreexpresión en tumores humanos . Por otra parte, la inhibición de la Colina Quinasa ha demostrado ser una nueva y eficaz estrategia antitumoral en células transformadas por oncogenes, lo que ha sido extrapolado a ratones desnudos in vivo . Recientemente, se ha publicado el aumento de actividad de la Colina Quinasa en diversos carcinomas de mama humanos, y se ha visto que la alteración de la Colina Quinasa es un acontecimiento frecuente en algunos tumores humanos tales como los de pulmón, colorrectales y próstata. A pesar de la correlación entre unos parámetros y otros, en la actualidad no existe evidencia que establezca de forma fehaciente que la sobreexpresión de Colina Quinasa tiene actividad oncogénica y tumoral en células humanas. Sí existen evidencias que indican que los inhibidores de la actividad colina quinasa, como el hemicolinio-3 [Cuadrado A., Carnero A., Dolfi F., Jiménez B. and Lacal J.C. Oncogene 8, 2959-2968 (1993); Jiménez B., del Peso L., Montaner S., Esteve P. and Lacal J.C. J. Cell Biochem . 57, 141-149 (1995) ; Hernández-Alcoceba, R. , Saniger, L., Campos, J., Núñez, M. C, Khaless, F., Gallo, M. Á. , Espinosa, A., Lacal, J. C. Oncogene, 15, 2289-2301 (1997)] o las metilenquinonas de toxicidad reducida descritas en la solicitud de patente ES200503263, presentan actividad antitumorogénica. Sin embargo, no existe en los mencionados documentos ni el resto de la técnica anterior evidencia concluyente de cuál de las diversas isoenzimas con actividad Colina Quinasa demostrada (ck-alfa , ck-beta, HCEKV, etc) e identificadas en tejidos humanos podría ser la responsable de la actividad enzimática detectada, ni de cuál de las isoenzimas es sensible a la inhibición por los inhibidores que han mostrado actividad antitumoral. Esta identificación es necesaria para poder establecer su potencial utilización como diana terapéutica en cáncer.
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene como objeto principal un método in vi tro para buscar, identificar y evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer, en especial para el cáncer de pulmón, mama o colorrectal. Un objeto adicional de la invención reside en el uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa alfa en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal . Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, para el tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal . Es también objeto de la invención una composición farmacéutica que comprenda uno o varios agentes terapéuticos junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal .
Es también objeto de la presente invención un método in vi tro de monitorización del efecto de una terapia administrada a un paciente de cáncer, caracterizado porque la evaluación del nivel de expresión de la proteína colina quinasa alfa en una muestra de tejido extraída del paciente al que se está suministrando un agente anti-tumoral, preferiblemente un agente según las reivindicaciones 3 - 5, mediante la determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su RNA mensajero, la concentración de dicha proteína o su actividad enzimática, y la comparación del valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal no canceroso.
Por último, otro objeto de la presente invención consiste en un kit de diagnóstico para llevar a cabo la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: A) Actividad Colina Quinasa (ChoK) en extractos de células humanas Hek293T (Human embryonic kidney cells) tras sobre-expresar Colina Quinasa Alfa y Beta (ensayo de actividad colina quinasa ex vivo) . B) Niveles intracelulares de fosforilcolina en las células vivas (ensayo de actividad Colina Quinasa in vi tro) . Figura 2: A) Actividad ChoK en células humanas Chok293T tras sobre-expresar Colina Quinasa Alfa y Beta. B) Especificidad de los anticuerpos monoclonales generados frente a Colina Quinasa Alfa en los mismos extractos que se muestrean en A. Figura 3: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en NSCLC (Non-small cell lung cáncer) .
Figura 4: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en cáncer de mama. Figura 5: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en cáncer de colon. B) Pólipo en el que se observa la tinción progresiva desde las lesiones pre-neoplásticas al alud del tumor. Figura 6: Crecimiento independiente de anclaje de células que sobre-expresan Colina Quinasa Alfa humana. Se muestran tanto el número de colonias generados como el tamaño relativo de las mismas en las dos líneas celulares analizadas, Hek293 y MDCK. Figura 7 : Capacidad oncogénica in vivo en ratones nu/nu de Colina Quinasa Alfa Figura 8: Expresión y actividad enzimática de Colina Quinasa Alfa en los tumores inducidos in vivo. Figura 9: Especificidad del inhibidor MN58b sobre Colina Quinasa Alfa. Extractos de E. coli en que se expresan las proteínas recombinantes Colina Quinasa Alfa o Colina Quinasa Beta humanas fueron analizados en ausencia (0) o en presencia de concentraciones crecientes de MN58b. Figura 10: Efecto antitumoral del inhibidor MN58b en los tumores inducidos por sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa Figura 11: Bloqueo de la expresión de Colina Quinasa Alfa por la técnica de siRNA en células humanas HeK293T. Figura 12 : Bloqueo de la expresión de Colina Quinasa Alfa mediante siRNA en células tumorales derivadas de un carcinoma de mama humano, determinada tanto por Western Blotting A) y B) como por actividad enzimática C) . Figura 13 : Muerte por apoptosis inducida por el RNA interferente específico de Colina Quinasa Alfa en células humanas tumorales de mama MDA-MB-231. A) Análisis por citometría de flujo con yoduro de propidio. B) Digestión de PARP asociada a la muerte por apoptosis. Figura 14: RNA interferente específico de Colina Quinasa Alfa en células humanas primarias epiteliales de mama HMEC. A) Niveles básales de expresión de Colina Quinasa Alfa en células normales HMEC respecto a las células tumorales MDA-MB-231. B) Interferencia con Colina Quinasa Alfa en HMEC. C) La interferencia de Colina Quinasa Alfa no induce muerte celular en células primarias humanas de HMEC. Figura 15: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa en tejido de cáncer de mama. Figura 15a: RNA mensajero de Colina Quinasa Alfa en tejidos de pacientes aquejados de cáncer de mama detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en una muestra de tejido normal. Figura 15b: valor medio de la expresión de Colina Quinasa Alfa, representado como las unidades relativas de expresión del gen calculadas a partir del nivel de mRNA con el método de 2~??ct) , en individuos sin metástasis (primera barra, marcada como "NO") o con metástasis (segunda barra, marcada como "SÍ"). Figura 15c : evolución de la probabilidad de supervivencia sin enfermedad según el número de meses transcurridos, entre los pacientes con nodulos linfáticos (línea inferior, marcada con trazos grises, ) o sin nodulos linfáticos (línea superior, marcada con trazos negros, +) • Figura 16 s Expresión de Colina Quinasa Alfa en líneas celulares derivadas de cáncer de pulmón. Figura 16a: RNA mensajero de Colina Quinasa Alfa en líneas celulares derivadas de cáncer tipo NSCLC (H1299 y H460) o SCLC (H510 y H82), detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en células normales primarias de epitelio bronquial (BEC) . Figura 16b: proteína Colina Quinasa Alfa detectada por inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal en células normales de epitelio bronquial (BEC) y en líneas celulares derivadas de cáncer de pulmón H460, H1299, H510 y H82; inmediatamente debajo se representa la señal obtenida para la tubulina en las mismas muestras. Figura 16c : actividad Colina Quinasa, representada por la señal de PCho marcada radiactivamente, detectada por microgramo de proteína, al cabo de 30 minutos, generada a partir de colina marcada en cada una de las líneas celulares indicadas bajo las barras correspondientes . Figura 17: Expresión del RNA mensajero de Colina Quinasa Alfa, en tejido de tumores extraídos de pacientes aquejados de cáncer de pulmón NSCLC en estadios tempranos, detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en una muestra de tejido normal. Figura 18: Evolución de la probabilidad de supervivencia de pacientes aquejados de cáncer de pulmón con el transcurso del tiempo, representado en meses, en el caso de que se detecte o expresión de Colina Quinasa Alfa (líneas discontinuas, - -j- - ) o no se detecte (líneas continuas, +) . Se representan la supervivencia global de pacientes en estadios I a IV (gráfico situado en la parte superior izquierda) , la supervivencia libre de enfermedad de pacientes en estadios I a IV (tiempo que transcurre desde que los pacientes son operados hasta que sufren una recaída) (gráfico situado en la parte inferior izquierda) , la supervivencia en el caso de cáncer de los estadios IA-IIIA (gráfico situado en la parte superior derecha) y la supervivencia libre de enfermedad en el caso de los estadios IA-IIIA (gráfico situado en la parte inferior derecha) . Figura 19. Expresión de Colina Quinasa Alfa en líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga. Figura 19a: RNA mensajero de Colina Quinasa Alfa en líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en células normales de vejiga inmortalizadas UrotSa; las barras corresponden, de izquierda a derecha, a las líneas HT1376, J82, SW780, TCCSup y UMVC3. Figura 19b: proteína Colina Quinasa Alfa detectada por inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal en células normales de vejiga inmortalizadas (UrotSa) y en las líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga TCCsup, J82, UMVC3 , SW789 y HT1376, así como en un control negativo (células Hek293T) y en un control positivo (células Hek-ChoK, transfectadas con un plásmido que expresa Colina Quinasa Alfa) ; inmediatamente debajo se representa la señal obtenida para la tubulina en las mismas muestras. Figura 16c : actividad Colina Quinasa, representada por la señal de PCho marcada radiactivamente, detectada por microgramo de proteína, al cabo de 30 minutos, generada a partir de colina marcada en cada una de las líneas celulares indicadas bajo las barras correspondientes. Figura 20: Expresión de Colina Quinasa Alfa en pacientes aquejados de cáncer de vejiga. Figura 20a: Valores medios de expresión obtenidos a partir de tejidos tumorales de 90 pacientes mediante el microarray U133 Plus 2.0 de Affymetrix, obtenidos en los distintos grupos clasificados según el valor del factor de inducción: una inducción de 1 a 3 veces (primera barra) , una inducción de 3 a 8 veces o una inducción de 8 a 24 veces (tercera barra) . Figura 20 b: RNA mensajero de Colina Quinasa Alfa en 20 pacientes aquejados de cáncer de vejiga, detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en células normales de vejiga inmortalizadas UrotSa; la línea horizontal representa el nivel a partir del cual hay una asociación con peor pronóstico de evolución del paciente. Figura 21: Relación entre la expresión de Colina Quinasa Alfa y la presencia de nodulos y/o metástasis. Figura 21a: Niveles medios de expresión de Colina Quinasa Alfa en los pacientes negativos y positivos respecto a la presencia de nodulos linfáticos (valores marcados con cuadrados sin relleno, D) o de metástasis (valores marcados con círculos rellenos, •) ; las líneas rectas unen los valores medios correspondientes a los individuos positivos o negativos respecto a la característica considerada para ayudar a apreciar la diferencia de nivel entre uno y otro grupo) . Figura 21b: proporción de pacientes con metástasis (barras con relleno oscuro continuo, |) y sin metástasis (barras rellenas con líneas inclinadas, //) , en grupos de pacientes clasificados según el nivel de expresión de Colina Quinasa Alfa: baja (pareja de barras de la izquierda), intermedia (pareja de barras situadas en la parte intermedia de la gráfica) o alta (pareja de barras situadas en la parte derecha de la gráfica) . Figura 22 : Esquema de funcionamiento de la construcción a partir de la cual puede sintetizarse un RNA interferente. En presencia de represor (zona izquierda, "No Expresión", se une a la construcción e impide la síntesis del RNA) ; en presencia de un inductor (doxociclina) , el mismo se une al represor, impidiendo su unión a la construcción interferente y permitiendo la síntesis del RNA interferente (zona derecha, "Expresión" ) .
Figura 23: Proliferación de células MDA-MB-231 (fila superior de placas) y Ch-ind-1 (fila inferior de placas) en condiciones permisivas de crecimiento (columna "Control") o en presencia de los inhibidores químicos de Colina Quinasa MN58b (columna intermedia) o RSM936 (columna de la derecha) . Figura 24: Comportamiento de las células MDA-MB-231 (barras marcadas como "MDA") y Ch-ind-1 (barras marcadas como "Chindl") en ausencia ("-") o presencia "+" de 10 µg/ml de doxociclina, transcurridos 10 días ("lOd") ó 20 días ("20d"). A: Influencia en la inhibición genética de Colina Quinasa Alfa según la relación entre los niveles de Colina Quinasa Alfa y GAPDH; B: Influencia en la proliferación celular, según la relación entre los niveles de pCNA y GAPDH; C: Viabilidad celular de las células Ch-ind-1 en ausencia (línea punteada) o en presencia (línea de trazo continuo) de inductor, deducida de los valores de absorbancia a 500 nm observados a distintos tiempos; D: Influencia sobre la inducción de apoptosis, según la relación entre los niveles de proteína PARP degradada respecto al total de proteína PARP (PARPdig/PARPtotal) . Figura 25: Especificidad del anticuerpo policlonal contra Colina Quinasa Beta. A: Inmunoensayo en el que se hace interaccionar un antisuero policlonal anti-Colina Quinasa beta con muestras de células transfectadas con un vector vacío (calle marcada "Vacío"), un vector de expresión de Colina Quinasa Alfa (calle marcada "ChoKA"), un vector de expresión de Colina Quinasa Beta (calle marcada "ChoKB") y un vector de expresión de una proteína quimérica Colina Quinasa Beta Proteína Verde Fluorescente (calle marcada "ChoKB5 ' GFP" ) . Las flechas indican al altura de bandeo de la Colina Quinasa Beta y de la proteína quimérica. B : Inmunoensayo en el que se hace interaccionar un anticuerpo policlonal anti-Colina Quinasa Alfa con muestras de células transfectadas con un vector vacío (calle marcada "Vacío"), un vector de expresión de Colina Quinasa Alfa (calle marcada "ChoKA"), un vector de expresión de Colina Quinasa Beta (calle marcada "ChoKB") y un vector de expresión de una proteína quimérica Colina Quinasa Beta Proteína Verde Fluorescente (calle marcada "ChoKB5' GFP" ) . Las flechas indican al altura de bandeo de la Colina Quinasa Alfa.
Figura 26: Comparación de la capacidad tumorogénica de las Colina Quinasas Alfa y Beta. Evolución del volumen tumoral, medido en centímetros cuadrados, según las semanas que se indican en abscisas, transcurridas desde la inyección a ratones de células transfectadas con: un vector vacío (datos indicados con rombos, « " ) l Un vector de expresión de Colina Quinasa Alfa (datos indicados con cuadrados, "•"), un vector de expresión de Colina Quinasa Beta (datos indicados con triángulos, "?") y un vector de expresión de Colina Quinasa Alfa + un vector de expresión de Colina Quinasa Beta (datos indicados con aspas, "X") . Figura 27: RNA mensajero de Colina Quinasa Beta en tejido de pacientes aquejados de cáncer de pulmón, detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en tejido normal.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para facilitar la comprensión de la presente solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de algunos términos y expresiones en el contexto de la invención: Los términos "sujeto" o "individuo" se refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza. El término "cáncer" se refiere a la enfermedad que se caracteriza por un crecimiento anormal o descontrolado de las células, capaces de invadir tejidos adyacentes y diseminarse a órganos lejanos. El término "carcinoma" se refiere al tejido que resulta del crecimiento celular anormal o descontrolado. El término "cáncer de mama" o "carcinoma de mama" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células de la mama . El término "cáncer de colon" o "carcinoma de colon" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células del colon. El término "cáncer de recto" o "carcinoma de recto" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células del recto. El término "tumor" se refiere a cualquier masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) . El término "gen" se refiere a una cadena molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína. El término "DNA" se refiere al ácido desoxirribonucleico . Una secuencia de DNA es una secuencia de desoxirribonucleótidos. El término "cDNA" se refiere a una secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de mRNA. El término "RNA" se refiere al ácido ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de ribonucleótidos . El término "mRNA" se refiere al ácido ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se traduce a proteínas .
La frase "mRNA transcrito de" se refiere a la transcripción del gen (DNA) en mRNA, como primer paso para que el gen se exprese y traduzca a proteína. El término "secuencia de nucleótidos" o "secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos (DNA) . El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación. Los términos "péptido" y "polipéptido" se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un fragmento proteico. Los términos "proteína" y "péptido", se usan indistintamente. El término "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una molécula diana, a la que se denomina "antígeno" . El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los "anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidos contra un único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos, que están dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos . El término "epítopo" , tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína que un anticuerpo específico reconoce.
El término "diana terapéutica" se refiere a secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto terapéutico. El término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que inhiba la actividad biológica de la molécula antagonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular inferior a 500 daltons) . El término "valores normales de referencia" , usado en la presente invención se refiere al nivel de ciertas proteínas, mRNA u otros metabolitos del cuerpo presenta un individuo sano.
El término tejido normal usado en la presente invención se refiere a un tejido no canceroso, incluyendo cultivos celulares comerciales.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de la proteína Colina Quinasa Alfa se ve incrementada en los procesos tumorales, y especialmente en los cánceres de pulmón, mama y colorrectal. Así como en el sorprendente descubrimiento de que la sobreexpresión de dicha proteína induce tumores in vivo y que consecuentemente la inhibición de la expresión y/o la actividad de esta enzima es un excelente método para el tratamiento del cáncer, especialmente para el cáncer de pulmón, de mama y colorrectal. La Colina Quinasa Alfa es, por tanto, una buena diana terapéutica potencial en tumorogénesis humana.
En este sentido, la presente invención proporciona, en primer lugar, un método in vi tro para detectar la presencia de cáncer en un individuo, preferiblemente cáncer de pulmón, mama o colorrectal, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer, que comprende: a) la detección y/o cuantificación de la proteína Colina Quinasa Alfa, del mRNA del gen colina quinasa alfa o el correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y b) la comparación de la cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa, de la cantidad de mRNA del gen colina quinasa alfa o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra de un individuo; con la cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa, con la cantidad del mRNA del gen colina quinasa alfa o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en las muestras de individuos control o en muestras anteriores del mismo individuo o con los valores normales de referencia. El método proporcionado por la presente invención es de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que sujetos o individuos diagnosticados de cánceres, preferiblemente de pulmón, mama y colorrectal, presentan niveles elevados de mRNA transcrito del gen colina quinasa alfa , o concentraciones elevadas de la proteína codificada por el gen colina quinasa alfa { Proteína Colina Quinasa Alfa) , en comparación con los correspondientes niveles en muestras procedentes de sujetos sin historial clínico de estos carcinomas. Sin embargo, la expresión en humanos del gen colina quinasa beta no se correlaciona con ninguno de los tipo de cáncer anteriormente mencionados .
El presente método comprende una etapa de obtención de la muestra del individuo. Se puede trabajar con distintas muestras fluidas como, por ejemplo: orina, sangre, plasma, suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial, bilis, jugo gástrico, líquido cefalorraquídeo, heces, saliva, broncoscopias, etc. La muestra se puede obtener por cualquier método convencional, preferiblemente resección quirúrgica. Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de un determinado tipo de cáncer; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha sido tratado previamente contra un cáncer, en particular contra cáncer de pulmón, mama o colorrectal. El presente método comprende además una etapa de extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de RNA total . Uno de estos dos extractos representa el material de trabajo para la siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total o del RNA total son bien conocidos por el experto en la materia (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532; Molina, M.A. , et al., Cáncer Res., 1999, 59: 4356-4362). Cualquier ensayo convencional se puede utilizar en el marco de la invención para detectar un cáncer, siempre que mida in vi tro los niveles de mRNA transcrito del gen colina quinasa alfa o su cDNA complementario, la concentración de Proteína Colina Quinasa Alfa en muestras recogidas de los individuos a analizar y de individuos control. Así pues, esta invención proporciona un método para detectar la presencia de cáncer, en especial de cáncer de pulmón, mama o colorrectal, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presenten dichos cánceres, basado bien en la medida de la concentración de la proteína Colina Quinasa Alfa, o bien en la medida del nivel de expresión del gen colina quinasa alfa . En el caso de que lo que se pretenda detectar sea la proteína Colina Quinasa Alfa, el método de la invención comprende una primera etapa de puesta en contacto del extracto de proteínas de la muestra con una composición de uno o más anticuerpos específicos contra uno o más epítopos de la proteína Colina Quinasa Alfa, y una segunda etapa de cuantificación de los complejos formados por anticuerpos y la proteína Colina Quinasa Alfa. Existe una amplia variedad de ensayos inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación de complejos específicos antígeno-anticuerpo; numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de estos ensayos está disponible comercialmente. Así, la proteína Colina Quinasa Alfa se puede cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos, específicos contra la proteína Colina Quinasa Alfa; siendo estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y derivados. Existe una amplia variedad de ensayos bien conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario) ; entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima) , RÍA (Radioinmunoassay o Radioinmunoensayo) , EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay o Inmunoensayo enzimático competitivo) , DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA sandwich con doble anticuerpo) , técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks . Otras maneras para detectar y cuantificar la Proteína EFNB2 o la proteína EDNRA, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina. El inmunoensayo preferido en el método de la invención es un ensayo ELISA sandwich con doble anticuerpo {DAS-ELISA) . En este inmunoensayo se puede utilizar cualquier anticuerpo o combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos de la Proteína Colina Quinasa Alfa. Como ejemplo de uno de los muchos posibles formatos de este ensayo, un anticuerpo, monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de anticuerpos, que recubren una fase sólida, se ponen en contacto con la muestra a analizar, y se incuban durante un tiempo y en condiciones apropiados para formar los complejos antígeno-anticuerpo. Después de un lavado en condiciones apropiadas para eliminar los complejos no específicos, se incuba con los complejos antígeno-anticuerpo, en condiciones y tiempo apropiados, un reactivo indicador, que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de estos anticuerpos, unidos a un compuesto generador de una señal . La presencia de la proteína Colina Quinasa Alfa en la muestra a analizar, se detecta y cuantifica, en caso de que exista, midiendo la señal generada. La cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa presente en la muestra analizar es proporcional a esa señal. En el caso de que se pretenda detectar el mRNA o el cDNA correspondiente al gen colina quinasa alfa , y no las proteínas que codifican, el método de la invención para detectar in vi tro el carcinoma posee etapas diferentes. Así, una vez obtenida la muestra y extraído el RNA total, el método de la invención, la detección del mRNA o del correspondiente cDNA del gen colina quinasa alfa, comprende una primera etapa de amplificación del mRNA presente en el extracto de RNA total, o del correspondiente cDNA sintetizado por transcripción inversa del mRNA, y una segunda etapa de cuantificación del producto de la amplificación del mRNA o del cDNA del gen colina quinasa alfa .
Un ejemplo de amplificación del mRNA, consiste en retrotranscribir el mRNA en cDNA (RT) , seguido de la Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) , ; la PCR es una técnica de amplificación de una determinada secuencia nucleotídica (diana) contenida en una mezcla de secuencias nucleotídicas. En la PCR, se utiliza un exceso de una pareja de oligonucleótidos cebadores, que hibridan con las hebras complementarias de la secuencia nucleotídica diana. A continuación, una enzima con actividad polimerasa (DNA Taq Polimerasa) extiende cada cebador, utilizando como molde la secuencia nucleotídica diana. Los productos de la extensión se convierten entonces en secuencias dianas, tras la disociación de la hebra diana original. Nuevas moléculas de cebador hibridan y la polimerasa las extiende; el ciclo se repite para aumentar exponencialmente el número de secuencias diana. Esta técnica está descrita en las patentes US 4683195 y US 4683202. Se han descrito previamente muchos métodos para detectar y cuantificar los productos de la amplificación por PCR, de los que cualquiera puede ser usado en esta invención. En un método preferido de la invención, el producto amplificado se detecta por electroforesis en gel de agarosa. En otro ejemplo la detección del mRNA se realiza transfiriendo el mRNA a una membrana de nailon, mediante técnicas de transferencia como por ejemplo Northern-blot o transferencia Northern, y detectándolo con sondas específicas del mRNA o del correspondiente cDNA del gen colina quinasa alfa . En una realización particular la amplificación y cuantificación del mRNA correspondiente al gen colina quinasa alfa, se realiza a la vez mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR) . El paso final del método de la invención para detectar in vi tro los carcinomas en cuestión, en una muestra procedente de un individuo, comprende comparar la cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa, la cantidad de mRNA del gen colina quinasa alfa o la cantidad del correspondiente cDNA de la muestra proveniente de un individuo, con la cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa, la cantidad de mRNA del gen colina quinasa alfa o la cantidad del correspondiente cDNA detectada en las muestras de sujetos control o en muestras anteriores del mismo individuo, o con los valores normales de referencia.
En su segundo objeto, la invención también proporciona un método in vi tro para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para terapia del cáncer; preferiblemente para el cáncer de pulmón, de mama o colorrectal, que comprende: a) poner en contacto un cultivo de células tumorales; preferiblemente de pulmón, mama, colon o recto, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen, b) detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen colina quinasa alfa o la proteína Colina Quinasa Alfa, y c) comparar dichos niveles de expresión con los de cultivos control de células tumorales sin tratar con el compuesto candidato. La cuantificación de los niveles de expresión del gen colina quinasa alfa o la proteína Colina Quinasa Alfa se realizan de modo semejante a como se indica en el método de la invención para detectar in vi tro la presencia de cáncer de pulmón, mama o colorrectal en un individuo. Cuando un agente disminuye los niveles de expresión del gen colina quinasa alfa o revierte los efectos de la expresión elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo los niveles de proliferación celular, este agente se convierte en candidato para la terapia del cáncer. Por tanto, otro objeto de la invención se refiere al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa alfa, en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer, en especial para el cáncer de pulmón, de mama o colorectal . Resaltar la importancia adquirida últimamente por los métodos de screening de fármacos basados en el binding, competitivo o no, de la molécula potencial fármaco a la diana terapéutica.
Otro objeto adicional de la invención se refiere al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa alfa para detectar la presencia de cáncer, en especial de cáncer de pulmón, de mama o colorrectal, para determinar el estadio o la severidad de dichos cánceres en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente alguno de estos cánceres.
Otro objeto de la invención consiste en proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa. Estos agentes, que se pueden identificar y evaluar según la presente invención, pueden ser seleccionados del grupo formado por: a) un anticuerpo, o combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína Colina Quinasa Alfa, preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o humanizado; pudiendo ser también un fragmento del anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo anti-idiotipo, b) agentes citotóxicos, tales como toxinas, moléculas con átomos radiactivos, o agentes quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, siRNAs, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, y c) compuestos antagonistas de la proteína Colina Quinasa Alfa, que inhiben una o más de las funciones de la proteína Colina Quinasa Alfa.
Constituye también un objeto de la presente invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes de los mencionados anteriormente junto con uno o más excipientes y/o sustancias transportadoras. Además dicha composición puede contener cualquier otro ingrediente activo que no inhiba la función de la proteína Colina Quinasa Alfa. Los excipientes, sustancias transportadoras y sustancias auxiliares tienen que ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa) , aunque la mejor vía de administración depende del estado del paciente. Las formulaciones pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la farmacología. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.
Un aspecto más de la presente solicitud consiste en un kit de diagnóstico para llevar a cabo la presente invención. Así, en una realización particular la presente invención incluye un kit que comprende un anticuerpo que reconoce especialmente la proteína Colina Quinasa Alfa y un carrier en un envase adecuado. En otra realización particular este kit se emplea para detectar la presencia de cáncer en un individuo, preferiblemente cáncer de pulmón, mama o colorrectal, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer.
Un aspecto final de la presente invención consiste en un método in vi tro para diagnosticar el tiempo de supervivencia de un paciente aquejado de cáncer de mama, pulmón o vejiga que comprende la evaluación del nivel de expresión de la proteína colina quinasa alfa en una muestra del de tejido cancerígeno extraída del paciente, mediante la determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su RNA mensajero, la concentración de dicha proteína o la actividad enzimática de dicha proteína, y la comparación del valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal no canceroso.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1 Actividad Colina Quinasa de las isoformas Como se demuestra en la Figura 1, ambos enzimas CKa2 (52 kDa, 457 aminoácidos) y CKßl (45 kDa, 395 aminoácidos) presentan una potente actividad Colina Quinasa, determinada por su capacidad de producir fosforilcolina a partir de colina en presencia de ATP y magnesio (Figura ÍA) . Esta actividad se manifiesta tanto en su forma recombinante, expresada en E. coli , como tras la transfección en células humanas HEK293. Sin embargo, y a pesar de que ambos enzimas tienen actividad Colina quinasa, los niveles intracelulares de fosforilcolina en células vivas no se ven igualmente alterados, siendo prácticamente indetectables en las células que sobre-expresan Colina Quinasa Beta (Figura IB) . Estos resultados sugieren que tanto la regulación fisiológica, como la función biológica de estas dos proteínas, y por tanto, su comportamiento en tumorogénesis, puede ser diferencial.
Ejemplo 2 Especificidad del anticuerpo Se han desarrollado anticuerpos policlonales y monoclonales que reconocen el enzima Colina Quinasa Alfa, proteína que ha sido semi-purificada y expresada como antígeno en la fase de generación, y como control de producción en las fases restantes del proceso. A pesar de haber sido desarrollados frente a Colina Quinasa Alfa, debido a que las dos enzimas (CKa y CKß) presentan un 65% de homología global a lo largo de su secuencia, y en algunas regiones conservadas como los dominios de unión a colina y de actividad catalítica la homología alcanza hasta un 75%, es necesario comprobar qué isoenzimas son capaces de reconocer los anticuerpos policlonales y monoclonales generados. Hemos verificado que tanto los anticuerpos policlonal como monoclonales utilizados son específicos de la Colina Quinasa Alfa, y que no reconocen Colina quinasa Beta. Para ello, hemos sobre-expresado ambas proteínas Colina quinasa Alfa y Beta en células humanas Hek293T, y tras comprobar que las dos proteínas están presentes y son activas (Figura 2A) se ha realizado su análisis por técnicas de inmunodetección ("Western blot") tanto con el anticuerpo policlonal con el que se realizaron estudios previos [Ramírez de Molina, A. , Gutiérrez, R. , Ramos, M. A. , Silva, J.
M., Silva, J. , Sánchez, J. J. , Bonilla, F., Lacal, J. C. Oncogene 21, 4317-4322 (2002); Ramírez de Molina, A., Rodríguez-González, A., Gutiérrez, R. , Martínez-Pinero, L., Sánchez, J. J. , Bonilla, F., Rosell, R. , Lacal, J. C. Biochem. Biophys . Res . Commun . 296, 580-583 (2002)], como con los nuevos anticuerpos monoclonales generados frente a Colina Quinasa Alfa. Como se muestra en la Figura 2B, en la que se presenta un ejemplo con dos de estos anticuerpos, incluso sobre-expresando Colina Quinasa Beta en condiciones en que la actividad está incrementada 80 veces, ninguno de los anticuerpos reconoce esta isoforma, siendo Colina quinasa Alfa fuertemente reconocida tanto en las mismas condiciones, como los niveles endógenos del control, en todos casos. Estos resultados indican que los estudios previos de nuestro grupo en el que se utilizó el anticuerpo policlonal definen a la Colina Quinasa Alfa como el isoenzima sobreexpresada en líneas celulares derivadas de tumores humanos y en los propios tumores analizados Estos resultados no eran esperables, dado que los anticuerpos policlonales reconocen por definición diferentes epítopos en la molécula y las secuencias de las Colina Quinasas Alfa y Beta son un 65% homologas, llegando en algunas regiones hasta un 75%, especialmente en las regiones de dominios consenso donde residen la región catalítica y la de unión al sustrato y ATP.
Ejemplo 3 Especificidad de tumores : Alteración de Colina Quinasa Alfa en distintos tumores humanos. La disponibilidad de anticuerpos de probada especificidad frente a Colina Quinasa Alfa ha permitido estudiar la posible alteración en la expresión de Colina Quinasa Alfa en algunos de los tumores más importantes en la actualidad en países desarrollados, como son el cáncer de mama, colon, y pulmón. Para llevar a cabo este estudio, se han realizado cortes de parafina de muestras de entre 38 y 50 pacientes distintos con cada uno de estos tipos de cáncer, y se ha analizado la expresión de Colina Quinasa Alfa mediante inmunohistoquímica (IHQ) , técnica que permite la detección e identificación "in situ" de componentes biomoleculares que son parte integral de células y tejidos, y que se puede realizar de forma automatizada en los Servicios de Anatomía Patológica de cualquier hospital. En las muestras de estos pacientes, tanto de mama, colon o pulmón, hemos encontrado que: - En todos los casos la tinción del tumor con el anticuerpo que reconoce Colina Quinasa Alfa es altamente especifica, permitiendo la distinción clara entre el tejido tumoral y el tejido normal adyacente. - No hay ningún caso en el que se produzca tinción del tejido normal. - El enzima Colina Quinasa Alfa se encuentra sobre- expresada con una incidencia que oscila entre el 62% y el 100% en este tipo de tumores, demostrando la alta implicación de esta isoforma, Colina Quinasa Alfa , en tumorogénesis humana.
En la Figura 3 se puede observar un ejemplo de los resultados obtenidos para cáncer de pulmón de células grandes (NSCLC) , que en la actualidad supone el 80% por ciento de los casos de cáncer de pulmón. Como se puede observar, se produce una tinción citoplasmática de Colina Quinasa Alfa, específica de los nudos tumorales y que como se indica anteriormente tiñe de forma específica un 62% de las muestras. Siguiendo esta línea, se ha realizado un estudio similar en 38 pacientes con cáncer de mama, observándose de nuevo la sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa de forma específica en el tejido tumoral en un 97% de los casos (Figura 4) . Por último, se ha realizado también el estudio de expresión de Colina Quinasa Alfa en cáncer de colon, para lo cual se han realizado cortes de parafina de 40 muestras de pacientes distintos con cáncer de colon con más de 4 años de seguimiento. El análisis se inició con carcinomas in situ en estadios I, II, III y IV. De manera similar al caso anterior, como tejido normal se ha utilizado el tejido normal de cada preparación adyacente al tejido tumoral. En ningún caso se obtuvo una tinción positiva en los tejidos normales de ninguna de las 40 muestras, confirmando la alta especificidad de la tinción de Colina Quinasa Alfa en el tejido tumoral, en el que de nuevo se observó sobreexpresión del enzima en todos los casos (Figura 5A) . Estos resultados avalan la alta implicación de esta isoforma de este enzima en cáncer de colon. Mas aún, este resultado nos llevó al análisis de lesiones pre-neoplásicas, ACFs y pólipos con distintos grados de displasia, donde los resultados muestran claramente que la sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa es un evento temprano en el proceso de tumoración del tejido de colon que se produce ya desde la displasia, sugiriendo su potencial comportamiento como gen "gate-keeper" en estos tumores y por tanto su relevancia como potencial nueva diana terapéutica. En la Figura 5B se muestra un pólipo donde se puede observar cómo la tinción en el tejido normal es prácticamente indetectable, y a medida que comienza a aparecer la displasia (células binucleares) la tinción aumenta, haciéndose muy intensa en el alud del tumor.
Ejemplo 4 Especificidad de tumores: Comportamiento oncogénico del enzima Colina Quinasa Alfa. Dada la altísima incidencia de desregulación de Colina Quinasa Alfa en algunos de los tumores humanos más importantes en la actualidad, hemos estudiado si esta proteína por sí misma tiene capacidad oncogénica, es decir, si Colina Quinasa Alfa presenta actividad oncogénica. Para llevar a cabo este estudio, en primer lugar estudiamos si este gen confiere la capacidad de crecimiento en medio independiente de anclaje, lo que supone una medida de su capacidad transformante. Se transfectaron células humanas HEK293T con un vector vacío como control y con un vector de expresión de Colina Quinasa Alfa, y se sembraron en agar blando. Como se puede observar en la Figura 6, la sobreexpresión de esta proteína es suficiente para inducir la transformación oncogénica tanto de células humanas HEK293T, como de células epiteliales de perro MDCK. Dado que la Colina Quinasa Alfa tiene actividad transformante en células humanas HEK293T, hemos analizado su potencial oncogénico in vivo. Para ello, ratones inmunodeprimidos (Nu/Nu) fueron inyectados con un millón de células humanas HEK293T que sobre-expresaban bien el vector vacío como control, o bien el vector de expresión de la Colina Quinasa Alfa. El crecimiento tumoral se monitorizó al menos dos veces por semana durante 50 días después de la inyección. Mientras que las células control no indujeron ningún tumor en ninguno de los ratones inyectados, las células que sobre-expresaban Colina Quinasa Alfa indujeron tumores en 8 de los 30 ratones inyectados (26%), que alcanzaron una media de 0.6cm3 después de 45 días (Figura 7) . Estos resultados demuestran que la sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa es suficiente para inducir tumores in vivo, y es, por tanto, una buena diana terapéutica potencial en tumorogénesis humana. Para verificar si los tumores generados por Colina Quinasa Alfa mantenían incrementada su expresión y actividad, se extrajeron quirúrgicamente los tumores, se lisaron, y se determinaron los niveles de expresión y actividad de este enzima con respecto a los de sus células parentales HEK293T como control. Como se puede observar en la Figura 8, todos los tumores analizados mantienen elevados los niveles de expresión y actividad enzimática de manera similar a la que se obtuvo antes de la inoculación, demostrando que es la sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa la que induce la tumorogénesis in vivo .
Ejemplo 5 Especificidad farmacológica Una vez comprobada la actividad oncogénica de la isoforma Alfa de la Colina Quinasa, así como su alta incidencia de sobreexpresión en tumores humanos, hemos estudiado si el efecto antitumoral del inhibidor MN58b [Hernández-Alcoceba, R. , Saniger, L., Campos, J., Núñez, M. C, Khaless, F., Gallo, M. Á. , Espinosa, A., Lacal, J. C. Oncogene, 15, 2289-2301 (1997); Hernández-Alcoceba, R. , Fernández, F., Lacal, J. C. Cáncer Res . 59 , 3112-3118 (1999); Ramírez de Molina A., Báñez-Coronel M. , Gutiérrez R. , Rodríguez-González A., Olmeda D., Megías D., Lacal J.C. Cáncer Res . 64:6732-6739 (2004)] es específico de la isoforma Colina Quinasa Alfa o si por el contrario también podría atribuirse a su posible interacción con la isoforma Colina Quinasa Beta. Esta comprobación es necesaria, puesto que las dos isoformas Colina Quinasa Alfa y Colina Quinasa Beta comparten hasta un 75% de homología en los dominios de unión al sustrato y en la región catalítica. Para ello, se han expresado las dos isoformas de Colina Quinasa (CKa y CKß) en la cepa de bacterias E. Coli , que carecen de actividad Colina Quinasa, y por tanto, toda la actividad enzimática observada es debida exclusivamente a la isoforma de Colina Quinasa expresada de forma recombinante. Como se puede observar en la Figura 9, la actividad enzimática de Colina Quinasa Alfa se ve afectada por el tratamiento con MN58b, con un efecto más acusado que el ejercido por el mismo inhibidor sobre la isoforma ß. De hecho MN58b es 20 veces más activo frente a colina quinasa alfa que frente a colina quinasa beta. Dado que se han generado tumores in vivo sobre-expresando Colina Quinasa Alfa y que MN58b es específico de esta isoforma, se ha verificado si el crecimiento de los tumores inducidos por ChoKa es susceptible a la inhibición por MN58b. Para ello, un millón de células humanas HEK293T transfectadas con el gen cka y que mostraron una alta sobreexpresión del enzima Colina Quinasa Alfa fueron inyectadas subcutáneamente en ratones inmunodeprimidos nu/nu. Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral de 0,1 cm3 , se inició el tratamiento con el inhibidor específico de Colina Quinasa Alfa, MN58b, que se administró intraperitonealmente en suero fisiológico estéril durante 5 días consecutivos y 9 de descanso, a una dosis de 5 mg/Kg. Los ratones control recibieron dosis equivalentes de vehículo, siguiendo el mismo calendario, y los tumores fueron monitorizados un mínimo de dos veces por semana. Como se muestra en la Figura 10, la inhibición de Colina Quinasa Alfa resulta en una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, alcanzando una reducción del crecimiento tumoral de un 80%. Estos resultados demuestran no solo que la sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa es suficiente para la inducción de tumores in vivo, sino que la proliferación de las células tumorales es dependiente de la actividad de Colina Quinasa Alfa.
Ejemplo 6 Especificidad genética Todos estos resultados avalan el potencial de Colina Quinasa Alfa como nueva diana terapéutica para el diseño de una nueva estrategia antitumoral. Sin embargo, los inhibidores químicos pueden ejecutar su acción antiproliferativa mediante efectos ocultos al investigador, incluso aunque estén diseñados de forma específica contra un enzima determinado, como es el caso del inhibidor MN58b. Existen numerosos casos en la literatura en el que se demuestra que inhibidores diseñados frente a una quinasa de forma específica, también afectan a otras quinasas que incluso no está estrechamente relacionadas entre sí. Existe una aproximación de reciente desarrollo en los últimos años que permite establecer de forma más precisa los efectos de interferencia con una enzima en particular, mediante el uso de siRNA (small interference RNA) que son capaces de eliminar de forma precisa y selectiva el mRNA para una determinada proteina sin afectar al resto de proteínas celulares. En nuestro caso, hemos verificado que la interferencia farmacológica mediante el uso del inhibidor MN58b, específico frente a Colina Quinasa Alfa, tiene una confirmación a nivel genético mediante la inhibición específica de Colina Quinasa Alfa por la técnica de siRNA. Esta técnica permitiría validar definitivamente a ChoKa como nueva diana terapéutica en cáncer. Con este fin, hemos generado un oligonucleótido capaz de hibridar con el RNA mensajero de Colina Quinasa Alfa (al que henos denominado siCHKA) y por tanto de bloquear de forma específica la expresión de esta proteína. En primer lugar hemos comprobado que nuestro siRNA bloquea de forma eficiente la expresión de Colina Quinasa Alfa en células humanas HEK293T, tanto la proteína endógena, como una ChoKa fusionada a GST y transfectada en las mismas células (Figura 11) • Una vez verificado que nuestro RNA interferente específico de Colina Quinasa Alfa es verdaderamente capaz de bloquear de forma eficiente la expresión de esta proteína, se ha pasado a verificar su efecto en las células tumorales derivadas de un carcinoma de mama humano, MDA-MB-231, en las que previamente se había descrito que la inhibición farmacológica de Colina Quinasa con MN58b inducía un fuerte efecto antitumoral por inducción de apoptosis. Como se muestra en la Figura 12, a pesar de la menor eficiencia de transfección que se obtiene en estas células, observamos que la transfección de siCHKA en MDA-MB-231, lleva consigo una inhibición tanto de la expresión de Colina Quinasa Alfa como de su actividad enzimática. Para verificar que el efecto de la inhibición genética de Colina Quinasa Alfa mediante siRNA es similar al que obtenemos mediante la inhibición farmacológica con MN58b, demostrando así de manera inequívoca la especificidad del efecto sobre Colina Quinasa Alfa, se ha determinado la viabilidad celular tras la transfección con el interferente siCHKA. Al igual que ocurre tras el tratamiento de las células tumorales con MN58b, se observa una disminución en la viabilidad celular, asociada a una muerte por apoptosis que es específica de las células transfectadas con el interferente de Colina Quinasa Alfa (Figura 13) . Por último, al igual que ocurre con MN58b, se ha verificado que la expresión del interferente siCHKA, específico de Colina Quinasa Alfa, no tiene ningún efecto sobre la viabilidad de células normales primarias humanas de mama HMEC (human mammary epithelial cells) . En estas células la expresión basal de esta proteína es muy baja, ya que, como hemos descrito anteriormente, las células tumorales sobre-expresan de manera constitutiva Colina Quinasa Alfa. Sin embargo, a pesar de esta baja expresión basal de Colina Quinasa Alfa en las células primarias HMEC, se consigue una clara interferencia de la expresión del enzima Colina Quinasa Alfa, y se observa cómo estas células, al contrario de lo que ocurren las células tumorales, no mueren por apoptosis, sino que son arrestadas en ciclo (Figura 14) , un resultado idéntico al observado el las mismas células tratadas con el inhibidor MN58b [Rodríguez-González A. , Ramírez de Molina A, Fernández F., Ramos M.A. , Nuñez, M. del C, Campos, J. M, Lacal J.C. Oncogene 22:8803-8812 (2003); Rodríguez-González A, Ramírez de Molina A, Fernández F., Lacal JC.. Oncogene 23:8247-8259 (2004); Rodríguez-González A., Ramírez de Molina A., Bañez-Coronel M. , Megias D. , Núñez M.C and Lacal J.C Int. J. Oncol 26:999-1008 (2005)].
Ejemplo 7 Influencia de la colina quinasa a en el cáncer de mama: Incidencia en la supervivencia Para disponer de datos cuantitativos que confirmaran la implicación de la colina quinasa a en la generación y en la evolución de tumores, se procedió a realizar ensayos adicionales de cuantificación de su expresión en pacientes aquejados por los tipos de cáncer con los que la colina quinasa a parece estar específicamente relacionada (mama, pulmón y vejiga) y de su posible relación con el pronóstico de la evolución de dicho paciente. Por un lado, se procedió a realizar el análisis cuantitativo de la expresión de la colina quinasa a aislando el RNA mensajero de muestras de pacientes. Para ello, se llevaron a cabo reacciones automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman específicas que sólo reconocen el RNA mensajero objeto del estudio, el correspondiente a ChoKa. Los datos obtenidos se representan en escala logarítimica en base 10 respecto a una muestra control de tejido normal. En el caso de los datos obtenidos referentes al cáncer de mama, los resultados obtenidos se muestran en la Figura 15a. Se observa que las muestras con niveles por encima de la mediana de activación de ChoKa corresponden a aquellos pacientes con peor pronóstico (presencia de nodulos linfáticos, desarrollo de metástasis, menor supervivencia) . Estos datos se confirman con los que aparecen en las Figuras 15b y 15c. En la Figura 15b, elaborada a partir de los datos obtenidos de 63 pacientes con cáncer de mama, se observa como el valor medio de la expresión de ChoKa (calculado como unidades relativas de expresión del gen, calculadas a partir del nivel de mRNA con el método de 2"??ct (Livak, K.J. y Schmitttgen, T. D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408)) es muy superior en los pacientes que presentan metástasis en comparación con los que no la presentan. Si se representa la probabilidad de supervivencia de estos pacientes en función de la presencia de nodulos linfáticos, la cual está asociada significativamente a un aumento de expresión de ChoKa respecto a los controles (p< 0,001), se observa en una curva clásica de Kaplan Meier (Kaplan EL, Meier P. Nonparametric estimation from incomplete observations . J. Am. Stat. Assoc, 53:457-481 (1958)) como la probabilidad de supervivencia disminuye significativamente a medida que aumenta la presencia de nodulos linfáticos positivos (p=0,046) (Figura 15c) , observándose la misma tendencia cuando se representa la supervivencia de los pacientes en función de la expresión de ChoKa (p=0, 059) .
Ejemplo 8 Influencia de la colina quinasa a en el cáncer de pulmón: Nivel de sobreexpresión e incidencia en la supervivencia Para complementar el estudio sobre la importancia de la sobreexpresión de la colina quinasa a en el cáncer de pulmón, se realizaron varias pruebas. En primer lugar, se detectaron los niveles de mRNA correspondientes a dicha enzima en líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de pulmón, de nuevo mediante reacciones automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman específicas. Se realizaron tanto sobre líneas celulares correspondientes al cáncer del pulmón más corriente (75-85%) , el no microcrítico o NSCLC {non small cell lung cáncer) , representado por las líneas H460 y H1299, así como sobre líneas correspondiente al otro tipo de cáncer, el microcítico o SCLC { small cell lung cáncer) , representado por las líneas H510 y H82, representándose los datos en escala logarítmica referidos a células normales humanas primarias de epitelio bronquial, BEC. Los resultados se muestran en la Figura 16a. Estos datos se complementaron con los de la detección de los niveles de proteína en cada una de estas líneas celulares mediante inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal (Figura 16b) y los de la actividad enzimática detectable en las mismas líneas midiendo el producto (PCho) marcada radiactivamente generado al cabo de 30 minutos a partir de sustrato (Cho) marcado (Figura 16c) . Se observa en todos los casos un incremento respecto a los controles, particularmente acusado en el caso de las líneas SCLC, especialmente H510. Adicionalmente, se comprobó el efecto antiproliferativo de la inhibición de ChoK en dichas líneas celulares provocado por la adición de MN58b, obteniéndose los resultados que se muestran en la Tabla siguiente, en la que los números entre paréntesis indican la sensibilidad de cada célula comparada con células primarias. En todos los períodos de tiempo analizados, las diferencias entre las células primarias y las cuatro líneas celulares derivadas de tumores resultaron ser significativas (p <0,001).
Tabla 1.- Efecto antiproliferativo de la inhibición de ChoK frente a lineas celulares derivadas de tumores de pulmón humanos Estos resultados se complementaron con estudios de sobreexpresión de ChoKa en muestras de tumores humanos de pacientes con cáncer de pulmón, concretamente en tejido de pacientes con NSCLC a los que se les ha extraído el tumor en estadio temprano. La Figura 17 muestra los resultados obtenidos en el análisis de PCR cuantitativa a tiempo real del RNA mensajero correspondiente a ChoKa en dichos pacientes operados en estadios tempranos, resultados en los que se aprecia que ya en un estado tan temprano de la enfermedad ChoKa está sobre-expresada respecto al tejido normal en un 53% de los casos. De nuevo, al analizar la relación entre la expresión de Choka con la gravedad del cáncer (estadio y presencia o ausencia de metástasis) , se observó que la expresión de ChoKa elevada está asociada a una mayor malignidad del tumor, como se muestran en la Tabla 2: Tabla 2. - Sobreexpresión de ChoKa según la gravedad del cáncer de pulmón a Estadios en los que el tumor es pequeño, hay poca o ninguna afectación de nodulos y no hay presencia de metástasis Estadios con tumores de mayor tamaño, con afectación de los nodulos y presencia de metástasis Como en el caso del cáncer de mama, en estadios iniciales de NSCLC la sobreexpresión de ChoKa en cáncer de pulmón está asociada a peor pronóstico, tal como puede observarse en las gráficas que se presentan en la Fig. 18. En ellas puede observarse como, en los pacientes en los que no se detecta expresión de ChoKa, la probabilidad de supervivencia se mantiene en el valor de 1 a lo largo del tiempo, mientras que en los pacientes en los que se detecta sobreexpresión de ChoKa la probabilidad va disminuyendo, presentando un valor mediano de 9 meses cuando lo que se evalúa es la supervivencia libre de enfermedad, es decir, el tiempo que transcurre desde que los pacientes son operados hasta que sufren una recaída.
Ejemplo 9 Influencia de la colina quinasa a en el cáncer de vejiga: Nivel de sobreexpresión e incidencia en la supervivencia También se realizaron estudios análogos en pacientes aquejados de cáncer de vejiga. En primer lugar, se detectaron los niveles de mRNA correspondientes a dicha enzima en líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de vejiga, de nuevo mediante reacciones automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman específicas, de manera similar a como se describió en el Ejemplo 8 para el caso del cáncer de pulmón. Se utilizaron las líneas HT1376, J82, SW780, TCCSup y UMVC3 , representándose los datos en escala logarítmica referidos a células normales de vejiga inmortalizadas, UrotSa. Los resultados se muestran en la Figura 19a. Estos datos se complementaron con los de la detección de los niveles de proteína en cada una de estas líneas celulares mediante inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal (Figura 19b) y la valoración de la actividad enzimática detectable en las mismas (Figura 19c) . Puede observarse que las diferentes líneas celulares muestran niveles incrementados de ChoKa respecto a las células normales inmortalizadas UrotSa, así como que el incremento de la expresión de la proteína en las líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga viene también acompañado por un incremento similar en la actividad de la enzima colina quinasa. Adicionalmente, se comprobó el efecto antiproliferativo de la inhibición de ChoK en estas líneas celulares provocado por la adición de MN58b, obteniéndose los resultados que se muestran en la Tabla siguiente, en la que los números entre paréntesis indican el factor de inducción con respecto a la línea celular con niveles menores de ChoK, TCCSup, pues los datos obtenidos para UrotSA no se consideraron suficientemente fiables para realizar la comparación con respecto a ellos.
Tabla 3_- Efecto antiproliferativo de la inhibición de ChoK frente a lineas celulares derivadas de cáncer de vejiga humano Adicionalmente, para establecer paralelismos con los efectos observados in vivo, se procedió a analizar la expresión de ChoKa en tejidos tumorales de 90 pacientes con cáncer de vejiga, utilizando la tecnología de los microarrays, concretamente el chip U133 Plus 2.0 de Affymetrix. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 20a. En ella puede observarse como algo más de la mitad, 49 pacientes, mostraban un factor de inducción de la expresión de entre 1 y 3 veces; 25 pacientes mostraban un factor de inducción de la expresión de entre 3 y 8 mientras que en 12 de ellos el factor de inducción de la expresión fue de 8 a 24 veces . Los datos obtenidos con el microarray se validaron mediante un ensayo de PCR cuantitativa a tiempo real (ensayo con sondas Taqman) , del cual se muestran los resultados en la Figura 20b. En dicho ensayo, se utilizó como referencia RNA comercial de tejido normal de vejiga humana, utilizándose como control endógeno GAPDH. En 18 de las 20 muestras analizadas (de las que 10 de ellas correspondían a los 10 pacientes con menor expresión de ChoKa y las otras 10 a los 10 pacientes con expresión más elevada) hubo una coincidencia de resultados en la expresión de ChoK entre el microarray de Affymetrix y el análisis son sondas Taqman. La incidencia de sobreexpresión de ChoKa en tumores fue del 55%. Los pacientes con sobreexpresión resultaron ser los más metastásicos.
La relación entre la sobreexpresión de ChoKa y la progresión de metástasis se confirmó con los datos de expresión de ChoKa de todos los pacientes obtenidos de los arrays, cuyos resultados se muestran en las Figuras 21a y 21b. La Figura 21a muestra la variación en los niveles medios de expresión de ChoKa entre los pacientes negativos y los positivos respecto a la presencia de nodulos linfáticos (valores unidos por la recta que presenta cuadrados sin relleno en los extremos) o el desarrollo de metástasis (valores unidos por la recta que presenta círculos rellenos en sus extremos) . La Figura 21b, por su parte, muestra una gráfica que representa la variación en la proporción de pacientes con metástasis (barras rellenas con relleno oscuro continuo, |) y sin metástasis (barras rellenas con líneas inclinadas, //) en los grupos de pacientes con expresión de ChoKa baja (pareja de barras de la izquierda), intermedia (pareja de barras situada en el medio de la gráfica) o alta (pareja de barras situada en la parte derecha de la gráfica), en la que se ve como, en el grupo de baja expresión, el porcentaje de pacientes con metástasis (53%) no es muy superior a la de pacientes sin metástasis (47%) , mientras que en el grupo de alta expresión de ChoKa la mayoría, el 72%, tiene metástasis y el 28% restante no la presenta. Se observa una relación entre la expresión de ChoKa y el desarrollo de metástasis que no alcanza el nivel de significación estadística . Para demostrar in vivo la relevancia de la sobreexpresión de ChoKa en cáncer de vejiga, se utilizó también un modelo ortotópico de cáncer de vejiga, que fisiológicamente es muy semejante a lo que ocurre cuando se genera un tumor en la vejiga, utilizando células tumorales MBT-2 (mouse bladder tumour) . En estas células, que ya tienen sobreexpresada ChoKa con respecto a las células normales de ratón, se sobre-expresa aún más esta proteína con el fin de evaluar si una mayor expresión de ChoKa potencia la agresividad o la invasividad de estos tumores. Para ello, se inocularon directamente en la vejiga de los ratones mediante un catéter células MBT-2 que contenían un vector vacío, carente de secuencias que permitieran expresar el gen de la ChoKa (grupo de ratones control, compuesto por tres ratones) o células MBT-2 que sobre-expresan ChoKa por habérseles transfectado un vector con la secuencia codificante de dicha enzima (grupo de ratones ChoKa, compuesto por tres ratones) . En ambos grupos, se monitorizó la generación de tumores mediante resonancia magnético nuclear con contraste de gadolinio, así como la evolución de la enfermedad en los ratones (estado físico, supervivencia, estudio histológico de los tumores, análisis de la posible invasión de riñon y otros órganos...) . 19 días después de la inoculación de las células, los ratones ChoKa se encontraban en mal estado, 2 de ellos con un tumor muy grande, mientras que los ratones que recibieron el vector vacío (grupo control) empezaron a estar en mal estado 50 días después de la inoculación de las células .
Los resultados de los Ejemplos 7, 8 y 9 confirman que ChoKa está sobre-expresada con alta incidencia en tumores humanos de mama, pulmón y vejiga. Su sobreexpresión se asocia con parámetros clínicos indicadores de mayor malignidad: presencia de nodulos linfáticos, metástasis y baja supervivencia de los pacientes.
Ejemplo 10 Especificidad genética: Modelo de interferencia inducible Dado que la interferencia de Choka en células tumorales es letal, al inducir la muerte celular por apoptosis, tal como se demostró en los ensayos descritos en el Ejemplo 6, realizados en transient, no se puede disponer en ese tipo de estudios de una población estable de células que exprese la construcción interferente. En los ensayos en transient, resulta afectado un porcentaje de la población celular variable, no afectando nunca a la población total, lo que enmascara los resultados. Sería mejor estudiar el efecto de la construcción en una población que la expresara de forma homogénea, para lo que sería necesario poder disponer de un modelo estable constitutivo. Ello hace necesario disponer de un modelo de interferencia inducible que permita obtener una población homogéneamente interferida en la expresión de ChoKa . Para lograr esto, se expresa la secuencia interferente en una construcción en la cual se encuentra bajo un represor que evita su expresión. Se efectúa la cotransfección de la construcción de interés inducible junto con un represor, que evita su expresión y, una vez seleccionada una población homogénea con esta construcción, las células son tratadas con un inductor, que permite la expresión de la construcción interferente y, por tanto, la interferencia de la expresión de la proteína. En el modelo inducible diseñado para este ensayo, la construcción interferente para ChoKa se expresa en el vector pSUPERIOR-puro (Oligoengine) y el represor en el vector pcDNA6/TR (Invitrogen) . El inductor utilizado es la doxociclina que, al unirse al represor, impide que este se una a la secuencia correspondiente, con lo que la expresión de la secuencia interferente deja de estar impedida. Un esquema de este sistema puede observarse en la Figura 22. En las Figuras 23 y 24 se muestran los resultados obtenidos en células Ch-ind-1, una línea celular derivada de MDA-MB-231, capaz de expresar la construcción interferente tras el tratamiento con el agente inductor doxociclina. La Figura 23 demuestra que esta línea inducible sigue siendo sensible a la inhibición química de ChoKa de manera similar a lo que sucede en MDA-MB-231 (la línea parental control derivada de adenocarcinoma de mama a partir de la cual se genera Ch-ind-1) , pues los resultados obtenidos tras el tratamiento con los inhibidores de colina quinasa MN58b o RSM936 son análogos en ambas líneas. La Figura 24, en cambio, muestra como la inhibición genética de ChoKa se produce sólo en Ch-ind-1 al tratar ambas líneas celulares con 10 µg/ml de doxociclina, pues la inducción del modelo interferente con doxociclina sólo puede producirse en la línea Ch-ind-1, por ser la que posee una construcción a partir de la cual puede producirse la síntesis del RNA interferente cuando se impide la unión del represor) . La inhibición genética de ChoKa se correlaciona con una disminución de la proliferación celular (determinada por pCNA) y un aumento de la muerte celular por apoptosis (determinada por PARPdig, proteína PARP degradada, que es un indicador de apoptosis) . El efecto empieza ya a verse a los 10 días, aunque es aún muy inicial, y es mucho más acusado a los 20 días del inicio del experimento (donde la población tiene ya muy poca expresión de ChoKa) . Los resultados obtenidos con el modelo inducible corroboran los datos obtenidos previamente en transient, demostrando que los efectos observados son debidos a la inhibición específica sobre ChoKa.
Ejemplo 12 Evaluación de la posible influencia de la sobreexpresión de Chokß en carcinogénesis Para evaluar la posible influencia en la carcinogénesis que pudiera tener una sobreexpresión de colina quinasa beta (ChoKß) y confirmar si el aumento de actividad colina quinasa observada en distintos tejidos cancerosos y líneas celulares derivadas de tejidos cancerosos era atribuible exclusivamente a la colina quinasa alfa o existía también una participación de la colina quinasa beta, se llevaron a cabo varios ensayos.
En primer lugar, se generó un anticuerpo policlonal anti-ChoKßl. La especificidad del mismo se comprobó en tres grupos de células Hek293T transfectadas, uno con una construcción a partir de la cual se producía la expresión de ChoKa, un segundo con una construcción que permitía la expresión en las mismas de ChoKß y el tercera con una construcción en la que se expresaba una proteína quimérica ChoKa-GFP, así como en un grupo de células control, transfectadas con un vector vacío. Tal como se muestra en la parte A de la Figura 25, los ensayos de inmunodetección demostraron la especificidad de dicho anticuerpo, que dieron lugar a señal tanto en las células que expresaban ChoKß como en las que expresaban la proteína quimérica ChoKß-GFP, sin que aparecieran señal en la calle correspondiente a las células transfectadas con la construcción para la expresión de ChoKa; en estas últimas células, sin embargo, un anticuerpo monoclonal dirigido contra ChoKa dio lugar a señal en una banda que aparecía a la altura correspondiente a ChoKa. Para comprobar el posible efecto de ChoKß en carcinogénesis, se ensayó su posible actividad transformante in vivo . Para ello, se utilizaron de nuevo ratones atímicos (Nu/Nu) a los que se inyectaron un millón de células humanas HEK293T transfectadas, bien con un vector vacío como control, con un vector de expresión de colina quinasa alfa, con un vector de expresión de colina quinasa beta y, en un último grupo, se produjo la cotransfección de los vectores que expresaban cada una de las isoenzimas, colina quinasa alfa y beta. El crecimiento tumoral se monitorizó al menos dos veces por semana durante 13 semanas después de la inyección. Como puede observarse en la Figura 26, se observó una clara inducción de tumores en los animales que habían recibido las células transfectadas con el vector de expresión de ChoKa, no observándose inducción de tumores en los ratones que recibieron las células transfectadas con el vector de expresión de ChoKß. Es llamativo observar que en los ratones que recibieron células transfectadas con ambos vectores, los de expresión de ChoKa y ChoKß, se observó una ligera inducción de tumores, de magnitud muy inferior a la observada con la expresión de ChoKa sólo y observable transcurridas más de 11 semanas desde la inyección de las células transfectadas, lo que podría indicar que ChoKß podría estar regulando ChoKa de manera directa o indirecta, de forma que inhiba su actividad oncogénica. Estos datos se complementaron viendo si existía una sobreexpresión de la enzima colina quinasa beta en tejidos extraídos de pacientes aquejados de cáncer. La Figura 27 muestra los datos obtenidos en muestras de pulmón de pacientes operados tras aislar el RNA mensajero de las mismas y llevar a cabo reacciones automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman específicas, representando los datos obtenidos en escala logarítmica en base 10 respecto a una muestra control de tejido normal. En dicha Figura puede observarse como, al contrario de lo que sucede con la ChoKa, la expresión de ChoKß disminuye con respecto a la obtenida en tejido normal en la mayor parte de las muestras analizadas. Estos datos no sugieren que exista una correlación entre la sobreexpresión de colina quinasa beta y la generación y desarrollo de tumores.
Todos los resultados indicados en los ejemplos avalan específicamente a la Colina Quinasa Alfa como una nueva diana terapéutica en el tratamiento de las enfermedades neoplásicas.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES 1. Método in vi tro para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para terapia del cáncer; preferiblemente para el cáncer de pulmón, de mama o colorrectal, que comprende: a) poner en contacto un cultivo de células tumorales; preferiblemente de pulmón, mama, colon, recto o vejiga, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen, b) detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen colina quinasa -alfa o la proteína Colina Quinasa Alfa, y c) comparar dichos niveles de expresión con los de cultivos control de células tumorales sin tratar con el compuesto candidato.
  2. 2. Uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa -alfa, en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, mama o colorrectal.
  3. 3. Agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, o porque inhiben los efectos carcinogénicos de la sobreexpresión de la proteína Colina Quinasa Alfa.
  4. 4. Agentes según la reivindicación 3 seleccionados del grupo formado por : a) un anticuerpo o combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína Colina Quinasa Alfa, preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o humanizado; un fragmento de un anticuerpo o una cadena de anticuerpo, b) agentes citotóxicos, tales como toxinas, moléculas con átomos radiactivos, o agentes quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, moléculas de triple hélice, RNA de doble hebra, siRNA, etc., que inhiben los efectos carcinogénicos de la sobreexpresión y/o de la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, y c) compuestos antagonistas de la proteína Colina Quinasa Alfa, que inhiben los efectos carcinogénicos de la expresión y/o de la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa.
  5. 5. Agentes según las reivindicaciones 3 - 4 para el tratamiento del cáncer; preferiblemente para el cáncer de pulmón, mama o colorrectal .
  6. 6. Uso de los agentes según las reivindicaciones 3 - 4 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer; preferiblemente para el cáncer de pulmón, mama, colorrectal o de vej iga .
  7. 7. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes según las reivindicaciones 3 - 5 junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  8. 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7 caracterizada porque contiene otro ingrediente activo, preferiblemente uno que no inhiba la función de la proteína Colina Quinasa Alfa.
  9. 9. Agentes según las reivindicaciones 3 - 4 para el tratamiento preferiblemente del cáncer de vejiga.
  10. 10. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes según las reivindicaciones 3, 4 y 9, junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  11. 11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10 caracterizada porque contiene otro ingrediente activo, preferiblemente uno que no inhiba la función de la proteína Colina Quinasa Alfa.
  12. 12. Método in vi tro para diagnosticar el tiempo de supervivencia de un paciente aquejado de cáncer de mama, pulmón o vejiga que comprende la evaluación del nivel de expresión de la proteína colina quinasa alfa en una muestra de tejido cancerígeno extraída del paciente, mediante la determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su RNA mensajero, la concentración de dicha proteína o su actividad enzimática, y la comparación del valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal no canceroso.
  13. 13. Método in vi tro de monitorización del efecto de una terapia administrada a un paciente de cáncer, caracterizado porque la evaluación del nivel de expresión de la proteína colina quinasa alfa en una muestra de tejido extraída del paciente al que se está suministrando un agente anti-tumoral, preferiblemente un agente según las reivindicaciones 3 - 5 y 9, o una composición farmacéutica que los contenga, según las reivindicaciones 7 - 8 y 10 - 11, mediante la determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su RNA mensajero, la concentración de dicha proteína o su actividad enzimática, y la comparación del valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal no canceroso.
  14. 14. Método in vitro según la reivindicación 1 para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para terapia preferiblemente del cáncer de vejiga.
  15. 15. Uso según la reivindicación 2, de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa-alfa, en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia preferiblemente del cáncer de vejiga.
  16. 16. Uso de los agentes según las reivindicaciones 3 - 4 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento preferiblemente del cáncer de vejiga.
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