KR101352142B1 - 암 치료용 조성물의 유효성 확인을 위한 체외 시험방법 - Google Patents

암 치료용 조성물의 유효성 확인을 위한 체외 시험방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개체의 폐암, 유방암 또는 직장암 등의 상이한 형태의 암치료에 유용한 화합물을 확인 및 평가하고, 개체의 암이 진행단계나 중증여부를 판정하며, 상기 암을 지니고 있는 개체의 치료효과를 모니터링하고, 상기 암에 대한 치료용 화합물의 유효성을 발견, 확인, 계발 및 평가하며, 새로운 약품을 비롯한 콜린 키나아제 알파 프로틴의 형질발현 및/또는 활성 및 또는 이러한 형질발현의 효과를 억제하는 약제를 개발하기 위한 암 치료용 조성물의 유효성 확인을 위한 체외 시험방법에 관한 것이다.
종양 치료 작용제, 콜린 키나아제 알파, 형질발현, 종양 진단

Description

암 치료용 조성물의 유효성 확인을 위한 체외 시험방법{IN VITRO METHOD FOR IDENTIFYING COMPOUNDS FOR CANCER THERAPY}
본 발명은 새로운 치료용 약제의 개발을 위하여 특히 폐암, 유방암 또는 직장암 등과 같은 암 치료용 조성물의 효유성을 확인하고 평가하는 방법 및 콜린 키나이제 알파 프로틴의 활성 및/또는 발현, 및/또는 그러한 발현의 영향을 억제하는 약제에 관한 것이다.
콜린 키나아제 (또한 CK, CHK CHK와 CHoK로도 알려진)는 캐네디(Kennedy) 혹은 포스파티딜콜린(PC, phosphatidylcholine) 합성경로에서 초기 발단효소이며 포스포레이트 콜린(phosphorylates choline)을 마그네슘(Mg2 +)의 존재하에 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)를 이용하여 인산염 그룹의 수여자로서 포스포릴콜린(PCho, phosphorylcholine)으로 전환시킨다. 여러 종양 형성 유전자에 의하여 매개되는 형질전환은 콜린 키나아제 활성을 높은 레벨으로 유도시키며, 그 산물인 포스포릴콜린의 세포 내 레벨을 비정상적으로 증가시키는바, 이때 상기 포스포릴콜린은 인체 종양을 발생시키는 콜린 키나아제의 역할을 간접적으로 지지한다. 그러나, 콜린 키나아제의 활성 작용이 포함되지 않은 상이한 포스포릴콜린 발생 메커니즘이 있는 바, 이는 종양세포 내에서 이러한 대사산물의 높은 레벨로 설명할 수 있을 것이다.
비록 종양과 형질이 전환된 세포에서 콜린 키나아제 효소의 활성이 증가한 증거가 발견되고 있지만, 종양이나 세포의 형질 전환과 콜린 키나아제 효소와의 관계가 원인과 영향이 불명확한 것처럼 종양 형성과정에 관한 효소 활성의 연관성이 충분히 설명되지 못하고 있다. 한편으로는 분자가 초래하는 이러한 영향에 관하여서도 확인되지 않고 있다.
폴리펩티드의 일차구조에서 대략 200개의 유전자 서열 인코딩이 콜린 키나아제와 일치하는 것이 발견되고, 서열들이 콜린 키나아제 알파 a, 콜린 키나아제 알파 b, 콜린 키나아제 알파 3, 콜린 키나아제 베타 1, 콜린 키나아제 베타 2, 콜린 키나아제 CKB-1 콜린/에타노라민 키나아제, 콜린 키나아제와 유사한 에타노라민 키나아제, 코츠(Cots), Duff227, Cog3173, CPT1B, SF1, SHOX2, FHOD2, FLJI12242, KRT5, FBL, ARL6IP4(참조 http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Cgi#219541) 등으로 명명되며 인간과 포유류 동물 그리고 설치류(쥐, 생쥐, 젖소, 기니아 피그, 토끼, 원숭이들)에 해당된다. 1982년 이후 실제로 쥐, 생쥐 그리고 인간의 조직으로부터 추출한 조직에서 콜린 키나아제와 함께 최소한 3개의 동질 효소들이 물리화학적 성질을 달리하는 것을 보여주는 활성이 있음이 생화학적으로 입증되었다.
인간 게놈에서 최소한 3개의 프로틴 유전자 인코딩이 상술한 콜린 키나아제의 활성에서 확인되고, 인코딩을 CK-알파, CK-베타, 그리고 HCEKV 라고 칭하였다(미국 특허 US2003186241). 그리고 프로틴 인코드된 대부분의 유전자는 30-65%가 씨케이(ck) 유전자에 의하여 인코딩된 이러한 것과 일치하며, 예를 들면 유전자 CAI16602, CHKL, CAI16600, CAI16599, CAH56371, CAI16603, BAA91793, CAI16598들이 (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)에 게재되어 있다. 그리고 유전자 CPT1B, EKI2, SF1, SHOX2, FHOD2,FLJ12242, KRT5, FBL, ARI61p$, TOMM40, MLL 들이 (http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/sumtab?tool=asdblast&jobid=blast-20050412-18072127)에 게재되어 있다. 서로 다른 콜린 키나아제의 동질 효소들 중에서 가장 많이 관련된 특징은 콜린 기질에 혹은 ATP 인산염의 수여에 대한 친화력에서, 중요한 변이로서, 2 분자체 혹은 4 분자체 형태로 활성화되어 있다고 하여도, 생화학적 성질이 다르다는 점이다. 그러므로 서로 다른 어떤 콜린 키나아제 동질효소 사이에서 직접적인 관계가 있다면, 인체 유전자의 과다 형질발현으로 인하여 종양 형성의 능력을 확인하고 지지하는 동질 효소를 규명할 필요가 있다.
한편, 콜린 키나아제의 억제가 누드 마우스의 체내 시험에서 추정된 암 형성 유전자에 의하여 새롭고도 효과적인 항암 방안으로 입증되었다. 여러 인간 유방암에서 콜린 키나아제 활성의 증가에 관하여 문헌이 최근에 발표되었으며, 인간 종양 중 폐암, 직장암 및 전립선암에서 콜린 키나아제의 변화가 종종 발생되는 것을 찾아 볼 수 있다.
몇몇의 인자들과 그 외의 인자들 사이의 상호 관련성에도 불구하고, 콜린 키나아제의 과다 형질발현이 인간 세포에서 종양형성 및 종양활성에 관련이 있음을 확정적으로 보여주는 확립된 증거는 존재하지 않는다. 콜린 키나아제 활성억제제가 항암 작용이 있음을 보여주는 증거로서는, 헤미콜리니움-3 [Cuadrado A., Carnero A., Dolfi F., Jimenez B. and Lacal J. C. Oncogene 8, 2959-2968(1993); Jimenez B., del Peso L., Montaner S., Esteve P. and Lacal J.C. J. Cell Biochem. 57 141-149(1995); Hernandez-Alcoceba, R., Saniger, L., Campos, J., Nunez, M. C., Khaless., F., Gallo, M. A., Espinosa, A, Lacal, J.C. Oncogene, 15 2289-2301(1997)]나 스페인 특허출원 ES200503263에 개시된 저독성 메틸렌퀴놀린 등이 있다. 그러나, 상기 문헌이나 그 외의 종래기술에서는 인체 조직에서 확인되고 입증된 콜린 키나아제(ck-알파, ck-베타, HCEKV 등)를 갖는 여러 동질효소 들과 관련하여 이들이 발견된 효소작용에 관여함을 보여주는 결정적인 증거는 없을 뿐 아니라, 어떤 동질 효소가 항암 활성을 보여준 억제제에 관하여 민감하다는 것도 제시되지 않고 있다. 이러한 확인은 종양 치료의 목적에서 잠재적 용도로 확립할 수 있도록 하기 위하여 필요로 한다.
발명의 목적
본 발명의 일차적인 목적은 생체 외에서, 종양 치료 특히 폐암, 유방암 및 직장암 등을 치료하기 위한 조성물의 유효성을 발견하고 확인하며 평가하는 시험 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 콜린 키나아제 알파 유전자로부터 파생된 뉴클레오티드 혹은 펩티드 서열을 적용하는 것을 토대로 하여 암치료, 우선적으로 폐암, 유방암, 직장암의 치료를 위한 조성물의 유효성을 발견하고, 확정하며, 개발함과 아울러 평가하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐암, 유방암, 직장암 등의 암을 치료함에 있어서 콜린 키나아제 알파 프로틴의 발현 및/또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하 는 약제를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐암, 유방암, 직장암 등의 암을 치료함에 있어서 약리적으로 허용가능한 첨가제가 하나 또는 다수가 포함된 치료제로 구성된 약제 조성물을 제공함에 있다.
생체 외 실험 방법에서 치료의 효과를 검정하여 종양 환자를 관리하는 것이 또한 본 발명의 목적이며. 콜린 키나아제 알파 프로틴의 메신저 RNA 레벨로부터 선택된 콜린 키나아제 알파 프로틴, 상기 프로틴의 농도 혹은 그것의 효소 활성도, 그리고 종양에 감염되지 않은 하나 혹은 하나 이상의 시료에서 확보된 수치의 비교에서 최소한 하나 이상의 인자와 관련된 시료의 측정에 의하여, 청구항3 내지 청구항5에 따른 항암제를 적용하여 치료중인 환자로부터 추출된 조직에서 콜린 키나아제 알파 프로틴의 형질발현 레벨을 평가하는 것을 특징으로 한다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명을 수행하기 위한 진단 키트를 제공함에 있다.
도1: A) 콜린 키나아제 알파와 베타로 유전자 과다 형질발현한 후 추출한 인체의 Hek293T 세포(인체의 배아 신장세포) 콜린 키나아제 활성도(ChoK)(생체내 콜린 키나아제 활성도 분석).
B) 살아 있는 세포내에서 포스포릴콜린의 함량(생체 외에서 실험한 콜린 키나아제의 활성도 분석).
도2: A) 콜린 키나아제 알파와 베타로 유전자 과다 형질발현시킨 후 인체 Chok293T 세포의 콜린 키나아제의 활성도.
B) A와 동일한 추출물에서의 콜린 키나아제 알파에 대한 모노클론 항체의 특성.
도3: 면역 조직화학적 기술에 의하여 소 단위 세포가 아닌 폐암에서 콜린 키나아제 알파 유전자 과다 형질발현 조직사진.
도4: 유방암에서 면역 조직화학적 기술에 의하여 측정되어진 콜린 키나아제 알파의 유전자 과다 형질발현 조직사진.
도5: A)대장암에서 면역 조직화학 기술에 의하여 측정된 콜린 키나아제 알파 유전자 과다 형질발현 조직사진.
B) 종양 덩어리의 초기 종양부에서 염색의 진행이 관찰되고 있는 폴립 사진.
도6: 과다 형질발현된 인체 콜린 키나아제 알파 세포의 개별착상(attachment-independent) 성장거동. 분석된 두개의 셀라인 HEK293와 MDCK 에서 생성된 콜로니의 숫자와 그 상대적인 크기를 나타내고 있다.
도7: Nu/Nu 마우스에서의 콜린 키나아제 알파의 생체내 종양 형성유전자 활성도
도8: 생체 내에서 유도된 종양에서 콜린 키나아제 알파의 형질발현과 효소활성도.
도9: 재조합 인체 콜린 키나아제 알파 또는 콜린 키나아제 베타 프로틴이 형질발현되는 콜린 키나아제 알파. E. coli 추출물에 대하여 MN58b의 농도증가가 존재하지 않는 상태(0) 또는 존재하는 상태에서 분석을 행한 억제제 MN58b의 특이성.
도10: 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현에 의해 유도된 종양에 대한 MN58b 억제제의 항 종양효과.
도11: 인체 HeK293T 세포에서 siRNA 기술에 의한 콜린 키나아제 알파 형질발현 차단거동.
도12: 인체의 유방암으로부터 추출된 암세포에서 siRNA 기술을 이용하여 콜린 키나아제 알파의 차단거동을 보인 것으로, 웨스턴 블로팅 A) 및 B), 그리고 효소적 활성 C)에 의하여 측정되었다.
도 13: 인체 유방암세포 MDA-MB-231에서 콜린 키나아제 알파의 특정 간섭 RNA에 의해 유도된 아포토시스로 인한 사멸.
A)프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)를 이용한 플로우 사이토메트리 분석결과(flow cytometry analysis).
B)아포토시스에 인한 세포사망과 연관된 PARP의 소화.
도 14: 1기 인체 유방 상피세포 HMEC에서 콜린 키나아제 알파의 특정 간섭 RNA 결과.
A) 종양세포 HMEC에 대한 정상 HMEC세포에서의 기본적인 콜린 키나아제 알파 과다발현 레벨.
B) HMEC에서 콜린 키나아제 알파의 간섭 거동.
C) 1기 HMEC 세포에서 세포사망을 유발하지 않는 콜린 키나아제 알파의 간섭거동 그래프.
도15. 유방암 조직에서 콜린 키나아제 알파의 유전자 과다 형질발현
도15a: 실시간 정량분석용 PCR에 의해 검출된 유방암 환자의 조직에서의 콜린 키나아제 알파 메신저 RNA에 대한 측정결과 그래프로서, 측정된 양과 정상조직 샘플에서 존재하는 양 사이에서 10의 대수를 베이스로 하여 표현하였다.
도15b: 콜린 키나아제 알파의 유전자 형질발현의 평균치로서, 2-ㅿㅿ ct 방법을 이용하여 mRNA 레벨로부터 계산된 상대적인 유전자 발현 단위로 표현되었으며, 암의 전이가 없는 첫 번째 막대에서 "아니오" 라고 표시된 것과 암의 전이가 있는 두 번째 막대 "예" 라고 표시되어 있는 것을 나타내었다.
도15c. 임파선 결절이 있는 환자와(아래쪽 선 회색 스트로크로 표시된 +) 결절이 없는 환자(상부선, 흑색 스트로크로 된 +)들의 경과된 개월 수에 의하여 병에 감염되지 않고 생존 가능성으로 발전된 상황을 보여 주고 있다
도16. 폐암에서 추출된 콜린 키나아제 알파 유전자 형질발현 세포라인.
도16a. 대규모 폐종양 세포(H1299와 H460)와 소규모 폐종양 세포(H510과 에H82)에서 추출된 세포 라인에서 콜린 키나아제 알파 메신저 RNA가, 실시간 정량분석용 PCR에 의하여 검출되고, 폐상피세포(BEC)에 존재하는 일차 정상적인 세포와 비 정상적인 세포의 수치 비율이 10을 기준으로 되어 있는 대수자로 표현하였다.
도16b. 정상적인 기관지 상피세포(BEC)와 폐종양 H460, H1299, H510 및 H82에서 추출된 세포라인은 모도클론 항체 면역분석법에 의하여 콜린 키나아제 알 파 프로틴이 측정되었다. 이들과 동일한 샘플에서의 튜블린에 대하여 얻어진 시그널은 그 바로 아래에 표현되고 있다.
도16c. 방사선으로 표시된 포스포릴콜린 시그널에 의하여, 프로틴을 30분 후 미크로 그램 단위로 측정하고, 상응되는 막대 아래에 지시하고 있는 각각의 세포라인에 표시된 콜린에서 발생된 콜린 키나아제 활성을 표현하였다.
도17. 소형이 아닌 폐종양 초기 환자로부터 추출된 조직에서 콜린 키나아제 알파 메신저 RNA의 유전자 형질발현이 실시간 정량분석용 PCR로 측정되고, 10을 기준으로한 대수자에 의하여 정상적인 조직시료와 환자로부터 측정된 시료의 비율이 표현되었다.
도18: 시간의 경과에 따라 폐암환자의 생존 가능성에 관한 발전 상태를 개월 수로 표현하고 콜린 키나아제 알파 유전자 형질발현이 측정된 것은 점선( - + -)으로, 측정되지 않은 것은 실선(- )으로 표시하였다.
I-IV 단계에 이르는 환자의 전체적인 생존거동 (그래프 왼쪽 윗부분에 해당), 질병없는 환자의 I-IV 단계까지 생존거동(환자가 수술한 후 재발할 때까지의 시간 경과)(그래프 왼쪽 아랫 부분), IA -IIIA 단계에 있는 암 환자 경우의 생존거동(그래프 오른쪽 윗부분에 해당), 그리고 IA-III 단계인 경우 질병이 없는 생존거동을(그래프 오른쪽 아랫부분)을 보여주고 있다.
도19: 방광암으로부터 추출된 셀라인에서의 콜린 키나아제 알파 형질발현 거동.
도19a: 실시간 정량분석용 PCR 증폭기에 의하여 방광암으로부터 추출된 세 포라인에서 측정된 콜린 키나아제 알파메신저 RNA 결과를 보인 그래프로서, 10을 기준 한 대수자에 의하여 종양 세포와 정상적이며 항구적인 방광 유알오티에스에이 세포의 비율이 산출되어 나타내었다; 왼쪽 막대로부터 각각 HT1376, J82, SW780, TCCSup 및 UMVC3 라인에 해당된다.
도19b: 콜린 키나아제 알파 프로틴은 단일클론 항체 면역 분석에 의하여 정상적이며 항구적인 방광세포 UrotSa와 방광암 TCCsup, J82, UMVC3, SW789 및 HT1376로부터 추출된 셀라인에서, 뿐만 아니라 네가티브 콘트롤(HK293T 세포)와 포지티브 콘트롤(Hek-Chok 세포, 플라스미드 유전자 형질발현 콜린 키나아제 알파에 감염된)에서 검출되었다. 이들과 동일한 샘플에서의 튜블린에 대하여 얻어진 시그널은 그 바로 아래에 표현되고 있다.
도19c: 콜린으로부터 생성된지 30분이 경과한 때에 매 프로틴 마이크로그램 당 측정된 포스포릴콜린 시그널을 방사선을 이용하여 마킹한 콜린 키나아제 활성도로서, 상응하는 바(bar) 아랫쪽에 표시된 각각의 셀라인에 마크되어 있다.
도20: 방광암 환자에서 콜린 키나아제 알파 유전자 형질발현을 보인 그래프.
도20a: 90명의 종양 환자 조직으로부터 확보된 유전자 형질발현 평균치가 마이크로어레이 U113 플러스 2.0 에피매트릭스(Affymetrix)를 이용하여 유도 인자(induction factor) 값에 따라 상이한 그룹으로 분류되어 얻어진 90명의 환자 종양조직으로부터 얻어진 형질발현 평균값을 보인 것으로, 첫번째 바(bar)는 1 내지 3회의 유도이고, 두번째 바는 3 내지 8회의 인덕션이며, 세번째 바는 8 내지 24회 의 인덕션이다.
도20 b: 방광암이 발생된 20명의 환자의 콜린 키나아제 알파 메신저 RNA가 실시간 정량분석 PCR에 의하여 측정된 결과로서, 10을 기준으로 한 대수자를 환자의 시료에서 측정된 수치와 정상적이며 항구적인 방광 유알오티에스에이 세포에 존재하는 수치와의 관계에서 비율로 나타내었다. 수평선은 악화된 환자의 예후와 관련된 레벨을 나타내고 있다.
도21: 콜린 키나아제 알파 유전자 형질발현과 결절 또는 암 전이의 존재와 상호 관계를 보인 그래프.
도21a: 네가티브 혹은 포지티브한 환자들의 임파결절(중공 사각형 □) 또는 암 전이 (검은색 원으로 표시된 값 ●)의 존재와 관련한 네가티브 또는 포지티브한 환자의 평균 콜린 키나아제 알파 형질발현 레벨; 직선은, 그룹들 사이의 레벨 차이를 보는데 도움이 되는 것으로 여겨지는 특성과 관련하여 포지티브 또는 네거티브한 환자에 상응하는 평균값과 만난다.
도 21b: 콜린 키나아제 알파 형질발현 레벨에 따라서 분류된 환자그룹에서 전이가 있거나(흑색 사각형 바 ■), 전이가 없는 (슬래쉬 마크바 ／／) 환자의 비율로서, 콜린 키나아제 알파 형질발현 레벨에 따라 분류된 환자그룹으로부터 측정되었는바, 하위(좌측의 한 쌍의 바), 중간(그래프 중앙에 위치하는 한 쌍의 바) 고위(그래프 우측에 위치하는 한 쌍의 바).
도22: 간섭 RNA의 합성이 이루어지게 될 조성기반의 조작개념도. 억제제의 존재하에서(왼쪽 영역 "형질발현 없음"은 구조에 결합하여 RNA 합성을 방지한다.); 유도체(독시사이클린 항생제)의 존재하에서 억제제에 연결되며, 간섭구조에 연결되는 것을 방해하고 간섭 RNA의 합성을 허락한다 (오른쪽 영역 "형질발현")
도23: 성장 허용조건("콘트롤: 칼럼)에서 또는 콜린 키나아제 MN58b(중앙 칼럼)이나 RSM936(오른쪽 칼럼)의 화학적 억제제의 존재하에 MDA-MB-231(플라크의 윗쪽열) 및 Ch-ind-1(플라크의 아랫쪽 열)의 세포증식을 보여주는 사진.
도24: 10일("10d") 또는 20일("20d")의 경과 후, 10㎛/ml의 독시싸이클린(dixycyline) 존재하에("+") 또는 없는 상태에서("-")의 MDA-MB0231의 거동. A.콜린 키나아제 알파와 GAPDH 레벨 사이의 비율에 따른 콜린 키나아제 알파의 유전적 억제에 미치는 영향.; B. pCNA와 GAPDH 사이의 비율에 따른 세포 증식에 미치는 영향.; C. 유도체가 존재하는 경우(실선)나 존재하지 않는 경우(점선)에서 Ch-ind-1 세포의 생존력은 시간을 달리하여 관찰된 500nm의 흡수값(absorbance value)으로부터 추정된, 유도체의 존재(실선)하에 또는 무존재하에 Ch-ind-1의 세포 생명력; D. PARP 프로틴 총 수치와 비교한 붕괴된 PARP 프로틴 수치의 상대적인 비율에 따른 아포토시스 유도(PARPdig/PARPtotal)에 미치는 영향.
도25: 콜린 키나아제 베타에 대한 폴리클론 항체의 특이성. A.폴리클론 항 콜린 키나아제 베타 항 혈청이 세포시료와 공(empty) 벡터("공" 레인)로 감염된 시료와 상호 작용, 콜린 카나아제 알파 형질발현 벡터("ChoKA" 레인) 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터("ChoKB" 레인) 그리고 키메릭 프로틴, 콜린 키나아제 베타- 녹색 형광 프로틴, 형질발현 벡터(노선을 소위 "ChoKB5' GFP")들과 함께 상호작용시킴. 화살표는 콜린 키나아제 베타와 키메릭간 프로틴 벤딩 높이를 나타낸다. B.폴 리클론 항 콜린 키나아제 베타 항 혈청이 세포시료와 공(empty) 벡터("공" 레인)로 감염된 시료와 상호 작용, 콜린 카나아제 알파 형질발현 벡터("ChoKA" 레인) 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터("ChoKB" 레인) 그리고 키메릭 프로틴, 콜린 키나아제 베타- 녹색 형광 프로틴, 형질발현 벡터(노선을 소위 "ChoKB5' GFP")들과 함께 상호작용시킴. 화살표는 콜린 키나아제 베타와 키메릭간 프로틴 벤딩 높이를 나타낸다.
도26: 콜린 키나아제 알파와 베타에서 암 유전 능력의 상호비교. 종양의 크기가 진행된 것은 평방 센티 메타의 단위로 크기를 측정; X축은 매 주별로 표시 주사주입이 생쥐 세포에 빈 벡터(데이터는 다이아몬드 기호로 표시 "◆"), 콜린 키나아제 알파 형질발현 벡터(데이터는 네모로 표시 " ■", 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터(데이터는 삼각형 표시 "△" 그리고 콜린 키나아제 알파 형질 표현 벡터 + 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터(데이터는 x, "X" 표시됨).
도27: 폐암 환자의 조직에서 콜린 키나아제 베타 메신저 RNA를 실시간 정량분석용 PCR을 이용하여 측정하고, 측정된 수치와 정상적인 조직에 존재하는 수치의 상대비를 로그 단위로 나타내었다.
본 특허 출원을 용이하게 이해하기 위하여, 발명의 전후관계 범위 내에서 일부 용어와 표현의 의미가 다음과 같이 규정되어 진다:
"대상(subject)" 또는 "개체(indiviual)"는 포유동물의 종류에서 구성원과 관련되어 가축, 영장류 동물 혹은 인간으로 한정되어 있는 것이 아니며, 대상은 나이와 인종을 불문하고 남성 혹은 여성 인간을 말한다.
"암(cancer)"이란 인접조직을 침투하고 멀리 떨어진 기관으로 전이될 수 있는 비정상적이거나 통제되지 않는 세포 성장이라는 특성을 갖는 병을 말한다.
"종양(carcinoma)"는 비정상적인 또는 통제할 수 없는 세포 성장의 결과로생성된 조직을 일컫는다.
"유방암" 혹은 "유방종양"은 어떤 악성의 유방 세포가 분열되는 병을 말한다.
"대장암" 혹은 "대장종양"은 어떤 악성 분열성 장 세포의 병을 말한다.
"직장암" 혹은 "직장종양"은 어떤 악성 분열성 직장세포의 병을 의미한다.
"종양"은 어떤 비정상 조직 덩어리이며, 양성 혹은 악성의 종양이 진행하고 있는 결과를 말한다.
"유전자"란 디옥시리보뉴클레오티드 분자 사슬이 인코드된 하나의 프로틴이다. "DNA"는 디옥시리보뉴클레인산 , DNA 서열은 디옥시리보뉴클레오티드 서열이다.
"cDNA"는 mRNA의 상보적 뉴클레오티드 서열로 설명할 수 있다.
"RNA"는 리보뉴클레인산을 말하며 알앤에이 서열은 리보뉴클레오티드 서열이다.
"mRNA"는 메신저 리보뉴클레인 산이며 프로틴로 전환되는 전체 RNA 중 일부분에 해당된다.
"로부터 전사된 mRNA"는 mRNA에서 유전자 전사가 첫째 번 단계에 발생 되고 그 다음에 유전자는 형질이 발현되고 프로틴로 변화됨을 의미한다.
"뉴클레오티드 서열" 혹은 "뉴클레오티드적 서열"은 RNA 혹은 DNA 관하여 명확하지 않게 언급한 것이다.
"프로틴"이라고 하는 용어는 아미노산 체인으로 되어 있는 분자이며 공유결합 또는 비 공유결합에 의하여 결합 되어져 있다. 용어는 전사 후 수정의 모든 형태를 포함한다, 예를 들면 글리코실 반응, 인산화 반응, 아세틸 반응이 포함된다.
"펩티드" 혹은 "폴리펩티드"는 아미노산으로 구성된 분자이며 프로틴 분자를 의미한다. "프로틴"과 "펩티드"라는 용어는 별 차이 없이 사용된다.
"항체" 라고 하는 용어는 항원이라고 언급된 표적 분자에 특수하게 결합하는 활성을 보여주는 당프로틴에 관한 것이다. "항체"은 단일 클론 항체 혹은 폴리클론 항체로 구성되며, 그것의 완전한 상태이나 하나의 조각으로 존재하며 인체로부터 유래된 것과 인체로부터 유래 되지 않은 것이 있다. "모노클론 항체" 들은 단순 항원 장소에서 혹은 "결정소"에서 유래된 고도의 특수항체이며 동일한 집단들이다.
"폴리클론 항체"는 서로 다른 항원 결정소에서 대항하여 유래되는 혼합 집단이다.
"에피토프(epitope)"는 본 발명에서 사용되는 것처럼 프로틴의 항원 결정소에 관한 것이며, 특수 항체가 인식하는 프로틴 아미노산 서열인 프로틴 항원 결정소를 말한다.
"치료 표적(therapeutic target)"이란 약제 혹은 치료 조성물이 계획되고 임상에 적용되는 뉴클레오티드 혹은 펩티드 서열을 말하고 있다.
"안타고니스트(antagonist)"는 역행하는 분자의 생물학적 활성을 나타내는 어떤 분자를 말하고 있다. 안타고니스트 분자는 그 중에서도 특히 프로틴, 펩티드, 천연 페프티드 서열상 변이들이며, 소단위 유기 분자(500 달톤 이하)가 이에 속한다.
"정상 표준치(normal reference value)"는 용어는 본 발명에서는 어떠한 프로틴, mRNA 혹은 건강한 사람의 신체에 존재하는 대사산물의 레벨을 이른다. 정상 조직이라는 용어는 본 발명에서는 암이 없는 조직을 뜻하며 유통되고 있는 세포 배양물이 여기에 포함된다. 본 발명은 콜린 키나아제 알파 프로틴 형질발현이 특히 폐암, 유방암 및 직장암 발생에서 증가한다는 점을 발견한 것을 기초로 하고 있다. 이러한 놀라운 발견에서 언급한 프로틴의 과다 형질발현이 생체시험에서 종양을 발생시키므로 이 효소의 형질발현 또는 효소활성의 억제는 특히 폐암, 유방암 및 직장암의 치료 방법에 탁월하다.
따라서 콜린 키나아제 알파는 인체의 종양 발생기원에서 잠재적인 치료 목적으로 적합하다.
이와 같은 측면에서 본 발명은 개체의 폐암, 유방암 또는 직장암의 존재를 발견해 내거나, 상기 각 개인의 암이 진행단계나 중증여부를 판정하거나, 상기 암을 지니고 있는 개체의 치료효과를 모니터링하는 시험방법을 제공함에 주안점을 두고 있는 것으로 다음과 같이 이루어져 있다:
a) 상기 개체로부터 추출된 샘플로부터의 콜린 키나아제 알파 유전자의 mRNA나 이에 상응하는 cDNA의 콜린 키나아제 알파 프로틴 검출 및/또는 정량분석, 그리고
b) 콜린 키나아제 알파 프로틴을 가지고, 콜린 키나아제 알파 유전자의 mRNA의 양을 가지고, 제어대상 개체의 샘플이나 동일 개체의 이전 샘플로부터 검출된 상응하는 cDNA의 양을 가지고 또는 정상 참고값을 가지고, 이들을 콜린 키나아제 알파 프로틴의 양이나 콜린 키나아제 알파 유전자의 mRNA양 또는 개체의 샘플에서 검출된 상응하는 cDNA의 양과 비교하는 과정을 포함한다.
본 발명의 방법은 고도의 민감성과 특이성을 제공하며, 콜린 키나아제 알파 유전자의 mRNA 레벨이 고도로, 혹은 콜린 키나아제 알파 유전자(콜린 키나아제 알파 프로틴)에 의한 인코딩된 프로틴이 고농도로 동반되는 이러한 종양은 의학적 이력이 없는 대상의 시료와 상응하는 레벨의 비교에서, 대상들과 종양들, 바람직하기로는 폐암. 유방암 또는 직장암으로 진단된 개체들에 기초를 두고 있다. 그러나, 콜린 키나아제 베타 인체 유전자의 형질발현은 상술한 바와 같이 어떤 종양 형태와도 상관 관계가 없다.
본 발명의 방법은 개체에서 시료를 확보하는 단계가 포함된다. 서로 다른 유동성 시료들이 취급될 수 있는바, 예를 들면 소변, 혈액, 혈장, 늑막 액, 유장 액, 척수 액, 복수, 활 액, 담즙, 소화액 ,뇌척수, 땀, 타액, 기관지 경 시료 액 이러한 것들이 여기에 속한다. 어떤 전통적인 방법으로도 시료가 확보될 수 있고 바람직하기로는 외과적 절제법으로 확보될 수도 있다.
이전에 이미 진단을 받았거나 혹은 어떤 암으로부터 진단되지 않은 시료가 또는 누군가가 특히 폐 종양, 유방 종양, 직장 종양을 이전에 치료하였든 사람, 현재 어떤 주제로 치료를 하고 있는 사람들의 시료들이 확보되어질 수 있다.
본 발명의 방법은 추출하는 단계에서, 시료에서 프로틴을 추출하여 확보하는 것과 모든 RNA 추출물을 확보하는 것을 포함하고 있다. 두 추출물 중의 하나는 다음 단계를 위한 작업 자료임을 제시한다. 모든 프로틴 혹은 모든 DNA를 추출하기 위한 방법의 프로토콜에 관해서는 이 분야에서 통상의 지식을 가진자들에게 잘 알려져 있다(Chorneczynski P et al. Anal. Biochem., 1987,162: 156; Chornczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532; Molina, M.A., et al., Cancer Res., 1999, 59:4356-4362).
어떤 전통적인 분석도 종양을 탐색하기 위한 방법으로 본 발명의 기본적인 작업에 적용될 수 있으며, 생체 외에서 콜린 키나아제 알파 유전자의 전사된 mRNA 레벨이나 그에 상응하는 cDNA를, 대조군 개체와 콜린 키나아제 알파 프로틴의 농도를 측정하는 것을 제공한다.
그러므로, 본 발명은 암의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 특히 폐암, 유방암 혹은 직장암을 개체에서 분기별로 혹은 병의 경중을 측정하기 위하여 혹은 개별적으로 치료된 성과를 검정하기 위하여 콜린 키나아제 알파 프로틴의 농도를 측정하는데 기초를 두거나, 콜린 키나아제 알파 유전자 형질발현 레벨을 측정하는데 기초를 두고 있다.
결과적으로 본 발명의 의의는 콜린 키나아제 알파 프로틴을 측정하는 것이며, 본 발명의 방법에서 첫 단계는 콜린 키나아제 알파 프로틴의 하나 또는 그 이상의 에피토프(epitopes)에 대항하는 하나 또는 그 이상의 특수 항체의 조성과 접촉하고 있는 프로틴 시료 상황을 파악하고, 두 번째 단계는 항체와 콜린 키나아제 알파 프로틴에 의하여 형성된 복합체의 양을 정량하는 것이다.
특수하게 형성된 항원-항체 복합체를 검출하고 정량분석하는 다양하고 광범위한 면역분석 방법이 존재한다: 많은 경합적 혹은 비 경합적 프로틴 결합 분석은 이미 이전에 설명하였고, 그리고 대다수의 이러한 분석은 일반 시중에서도 분석이 가능하다.
그러므로, 콜린 키나아제 알파 프로틴은 항체, 예를 들면: 단순 클론항체, 폴리클론 항체, 결점이 없거나 조각이며 그것의 "조합체(combi-body)"와 Fab 혹은 콜린 키이나아제 알파 프로틴에 대항하는 특수 항체 scFv 조각들이다. 이 항체는 인체에 존재하거나, 인체와 조화된 것 그리고 인체로부터 유래 된 것이 아닌 것들이 있다. 이 항체는 이런 분석용으로 표시를 할 수 있는 것과 표시를 할 수 없는 것이 있다; 표시를 하지 않은 항체는 응집분석에 사용된다; 표시된 항체는 다양하고 폭넓게 사용된다. 항체를 표시하기 위하여 사용되는 표지 분자는 방사선 뉴클레오티드, 효소, 형광성을 가진 물질, 화학적 발광시약, 효소 기질 혹은 보조인자, 효소 억제제, 색소 그리고 유도체들이 여기에 포함될 수 있다. 표시되지 않은 항체(일차 항체)와 표시된(이차 항체) 항체가 본 발명의 용도에서 사용할 수 있는 폭 넓고 광범위하게 알려진 분석 방법들이 있다; 이 방법은 웨스턴 블롯, 병소 감염진단 일라이저(ELISI, Enzyme-Linked Immunosorbent assay), 경합적 면역 검정법(RIA, Radioimmunoassay), 이중 항체 샌드위치-일라이저(DAS-ELISA, Double antibody sandwich-ELISA), 면역 조직화학적 기술, 면역 세포화학적 기술, 이러한 기술들은 특수 항체를 포함하여 프로틴 바이오칩 혹은 마이크로어레이의 활용에 기초가 되며 분석은 티프스틱 형태로 되어있고 콜로이드 침전에 기초를 둔 분석 방법이다. 그 외 다른 검출 혹은 정량분석 방법은 친화도 크로마토그래피 기술, 리간드 결합 분석, 렉틴 결합분석 방법들이 포함되어 EFNB2 프로틴 혹은 EDNRA 프로틴의 탐색이나 분석이 가능하다.
본 발명의 방법에서 우선적으로 선택한 면역 분석방법은 이중 항체 샌드위치 일라이저(DAS-ELISA) 방법이다. 콜린 키나아제 알파 프로틴의 하나 혹은 하나 이상의 에피토프에 대하여 대항하는 어떤 항체들이나 항체 복합체도 본 발명의 면역 분석방법으로 사용할 수 있다. 이러한 분석에서 가능한 형태들 중 하나의 예를 들면 모노클론 혹은 폴리클론 항체거나, 항체의 한 조각, 혹은 분석할 시료와 접촉하여 고체를 코팅하는 조합형 항체들이, 항원-항체 복합체를 형성하기 위하여 적합한 시간과 적합한 조건으로 배양한다. 비특이적인 복합물을 제거하기 위하여 합당한 조건하에서 세척한 후 지시약, 모노클론 혹은 폴리클론, 혹은 항체의 조각 혹은 항체의 조합들을 포함하여 적합한 조건과 적합한 시간 조건하에서 항원-항체 복합물과 함께 시그널을 생성시키는 조성물에 결합하였다. 분석될 시료에 존재하는 콜린 키나아제 알파 프로틴의 존재가 있는지의 여부는, 생성된 시그널의 측정을 통해서 검출되고 정량분석이 되었다. 분석될 시료에 존재하는 콜린 키나아제 알파 프로틴의 함량은 시그널과 비례한다.
결과적으로 본 발명은 프로틴 인코드의 측정이 아닌 콜린 키나아제 알파 유전자에 상응하는 mRNA 혹은 cRNA를 측정하는 것으로서, 본 발명의 방법에서 종양의 생체 외 측정 방법은 여러 단계를 거친다. 따라서 일단 시료가 확보되면 모든 RNA가 추출되고, 콜린 키나아제 알파 유전자의 mRNA와 상응되는 cRNA의 측정은, 첫 단계에서 추출된 모든 RNA에 존재하고 있는 mRNA의 증폭, 혹은 mRNA의 역 전사에 의하여 합성되는 cDNA의 증폭이며, 두 번째 단계에서는 콜린 키나아제 알파 유전자의 증폭된 mRNA 혹은 cRNA의 정량분석이 포함된다.
폴리머라아제 서열 반응(PCR)에 의하여 수행되는 mRNA를 증폭하는 한가지 예로서 mRNA가 cRNA로 변하는 역전사(RT)가 있다; PCR은 뉴클레오티드 서열의 혼합물에 포함된 어떤 한가지 뉴클레오티드의 서열을 표적(target)으로 하여 증폭시키는 하나의 기술이다. 표적 뉴클레오티드 서열과 상보적 가닥이 혼성화된 올리고 뉴클레오티드 프라이머의 초과된 쌍이 PCR에 사용된다.
이때 폴리머라아제 활성을 가진 효소(DNA Taq Polymerase)는 몰드로 사용되는 표적 뉴클레오티드 서열에서 프라이머들을 각각 확장시킨다. 확장된 생성물들은 원래 표적 가닥이 분산된 후 표적 서열로 전환된다. 새로운 프라이머 분자들은 혼성화되고 폴리머라아제는 그들을 확장시킨다; 표적 서열들을 가속적으로 증가시키기 위하여 이러한 주기가 반복된다. 이 기술은 미국특허 제4,683,195호와 제683,202호에 개시되어 있다. PCR 증폭에 의하여 생성된 생성물을 검출하고 정량 분석하는 여러 가지 방법이 이미 알려진 바 있고, 그 중 어떠한 방법이든 본 발명에 적용할 수 있다. 상기한 발명의 방법에서 증폭된 생성물은 아가로즈 젤 전기영동법(agarose gel electrophoresis)에 의하여 측정되었다.
다른 예로서 mRNA의 측정은 mRNA를 나일론 멤브레인에 예를 들면 노던 블롯(Northern blot) 이동 방법에 의하여 mRNA를 이동시켜 수행되고, mRNA나 콜린 키나아제 알파 유전자의 상응하는 cDNA의 특별한 탐침자를 이용하여 측정하였다.
구체적인 실시예에서, 콜린 키나아제 알파 유전자에 해당되는 mRNA의 정량분석과 증폭에는 실시간 정량분석용 RT-PCR(Q-PCR)이 사용되어 진다.
본 발명 방법의 마지막 단계에서는, 개체에서 분리된 시료에서 의심되는 종양은 생체외 시험에서 콜린 키나아제 알파 프로틴의 함량, 콜린키나아제 알파 유전자의 mRNA 혹은 이에 상당하는 cRNA의 함량들이 대조군 대상에서 또는 동일한 시료를 조기에 검출한 혹은 정상적으로 관련된 수치에서의 콜린 키나아제 알파 프로틴의 함량, 콜린 키나아제 알파 유전자의 mRNA 혹은 이에 상당하는 cRNA의 함량비교가 포함된다.
본 발명의 두 번째 목적은, 특히 폐암, 유방암 또는 직장암 등의 암치료를 위한 조성물의 효능을 식별하고 평가하는 방법을 생체 외에서 제공하는 것으로 이는 아래와 같이 구성되어 있다:
a) 폐암, 유방암 또는 직장암 등의 종양세포 배양체를 후보 조성물(candidate compound)과 적절한 조건과 적정한 시간하에서 접촉시켜 서로 반응하도록 하는 단계와,
b) 콜린 키나아제 알파 유전자나 콜린 키나아제 알파 프로틴의 형질발현 레벨을 검출하고 정량분석하는 단계와, 및
c) 상기 형질발현 레벨을 후보 조성물로 처리되지 않은 종양세포의 제어 배양체 형질발현 레벨과 비교하는 단계로 이루어진다.
콜린 키나아제 알파 유전자 혹은 콜린 키나아제 알파 프로틴의 형질발현 레벨의 정량분석은, 본 발명의 방법에서 개체에 존재하는 폐암, 유방암 또는 직장암을 생체 외에서 검출하는 방법과 유사하게 수행된다.
어떠한 제제가 콜린 키나아제 알파 유전자의 형질발현 레벨을 감소시키거나, 상기한 유전자의 높은 형질발현을 역전시킨다면, 바람직하게는 세포증식 레벨을 감소시키게 되면, 이러한 제제는 종양 치료의 후보 조성물로 된다.
그러므로, 본 발명의 다른 목적은 암치료, 특히 폐암, 유방암 또는 직장암의 치료를 위하여 조성물의 효력을 발견하고, 식별하며, 개발함과 아울러 평가하는 방법에서 콜린 키나아제 알파 유전자로부터 파생된 뉴클레오티드 혹은 펩티드 서열을 이용하는 데 있다. 잠재적 약물분자를 치료 표적과 경합적 또는 비경합적으로 결합시키는 것에 기초한 약물 선별법(screening method)이 최근에 개발되었다는 사실에 대한 중요성을 지적하지 않을 수 없다.
본 발명의 또 다른 목적은, 콜린 키나아제 알파 유전자로부터 추출된 뉴클레오티드나 펩티드 서열을 이용하여, 폐암, 유방암 또는 직장암 등의 암 존재를 발견해 내고, 개체의 상기 암의 단계 또는 경중여부를 판정하며, 이러한 암을 지니고 있는 개체의 치료효과를 모니터링하는데 있다.
발명의 또 다른 목적은 콜린 키나아제 알파 프로틴의 형질발현 또는 활성을 저지하는 것을 특징으로 하는 약제를 제공하는 데 있다. 본 발명에 의하여 확인되고 평가되는 이러한 약제는 아래와 같이 형성된 그룹으로부터 선택되어질 수 있다:
a) 콜린 키나아제 알파 프로틴에 존재하는 하나 또는 하나 이상의 에피토프에 특이하게 대항하는 하나의 항체 혹은 항체 조합, 바람직하기로는 인체 혹은 인체와 조화된 모노클론 항체; 또한 항체의 조각, 단쇄(single-chain)항체, 혹은 항-유전자형 항체가 가능하다.
b) 독소나 방사능 미립자를 갖는 분자 등과 같은 세포살상제 또는 펩티드 , 포스포펩티드, 악성 유전자의 활성을 막는 분자, 리보자임, siRNAs, 삼중 헬릭스 분자 등의 콜린 키나아제 알파 프로틴의 발현 및/또는 활성을 억제하는 유기물 또는 무기물 분자를 포함하는 화학치료 약제, 및
c) 콜린 키나아제 알파 프로틴의 하나 또는 그 이상의 기능을 억제시키는 콜린 키나아제 알파 프로틴의 길항제 화합물,
약제의 조성은 상술한 하나 또는 그 이상의 약제가 치료에 효과적인 분량과 함께, 하나 또는 그 이상의 첨가제 또는 매개 물질이 포함되어 본 발명의 목적에서 구성요소로 된다. 더 나아가 상술한 약제의 조성은 콜린 키나아제 알파 프로틴의 기능을 억제하지 않는 다른 활성요소를 포함하고 있다,
약제 첨가물, 매개 물질 그리고 보조물질들은 제약학상 혹은 약리학상 내구성이 있어야 하므로, 조제된 화합물 또는 약제 화합물과 결합 될 수 있고, 치료되는 유기체에 역행되는 작용을 하지 않는다. 제약학상 조성 혹은 형태로 보면 구강으로 투입하거나 비 경구투약(피하주사, 피부내 주사, 근육주사, 정맥주사)이 가능하며,가장 좋은 투약 방법은 환자의 조건에 의존되어 있다. 약제의 조성 형태는 1회 분으로 만들어져 있고, 약학 분야에서 잘 알려진 방법으로 약제가 조성된다. 치료의 특성에 따라서 활성 물질이 투여되는 분량은 변동될 수 있다.
본 발명의 또 다른 기술적 특징으로서, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위한 진단 킷트를 제공한다. 따라서 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 특별히 콜린 키나아제 알파 프로틴을 인식하는 항체와, 적절한 용기 내부에 수납되는 캐리어로 구성되는 킷트를 포함한다. 또 따른 구체적인 실시형태에서, 상기 킷트는 폐암, 유방암 또는 직장암 등의 암 존재를 발견해 내고, 개체의 상기 암의 단계 또는 중증여부를 판정하며, 이러한 암을 지니고 있는 개체의 치료효과를 모니터링하는데 사용된다.
본 발명의 최종적인 기술적 특징은, 암환자의 조직으로부터 추출된 샘플에서 메신저 RNA의 레벨, 콜린 키나아제 알파 프로틴의 농도 또는 상기 프로틴의 효소 활성도로부터 선택되는 콜린 키나아제 알파 프로틴과 관련된 적어도 하나의 파라메타를 판정함으로써 샘플내의 콜린 키나아제 알파 프로틴을 평가하는 과정과 상기 얻어진 값을 상응하는 하나 또는 그 이상의 정상적인 암발생이 없는 조직 샘플과 비교하는 과정을 통해서 폐암, 유방암 또는 직장암 환자의 생존기간을 진단하는 시험방법이라는 데에 있다.
본 발명의 실시예는 다음과 같다.
실시예 1
동위 형태( isoforms )의 콜린 키나아제 활성도
도1에 도시된 바와 같이, 두 개의 효소 CKα2(52 kDa, 457개의 아미노산)과 씨케이β1(45kDa, 395개의 아미노산)은 유력한 콜린 키나아제 활성을 가지며, ATP와 마그네슘의 존재하에서 콜린으로부터 포스포릴콜린을 형성할 수 있는 능력에 의하여 활성도를 측정하였다(도1A). 상기 활성도는, 인체 HEK293 세포에 감염시킨 후이. 콜리(E. Coli)로 표현되는 재조합 형태로 나타나 있다. 이들 두 효소는 콜린 키나아제 활성이 있음에도 불구하고 살아있는 세포에서 포스포릴콜린의 세포간 레벨은 동일하게 변경되지 않았고 콜린 키나아제 베타의 과다 형질발현된 세포에서는 사실상 검출할 수 없었다 (도1B).
이 결과는 두 가지 프로틴의 생리조절과 생물학적 기능을 암시하고 있으며, 따라서 그들의 종양발생 거동은 서로 차이를 보이는 것으로 보여진다.
실시예2 .
항체의 특이성
콜린 키나아제 알파 효소를 인식하는 폴리클론이나 모노클론 항체, 일부 정제되고, 발생단계에서 항원으로서 그리고 후속 제조공정에서 생산 통제 제품으로서 표현되는 프로틴이 개발되었다. 콜린 키나아제 알파가 개발되었음에도 불구하고 두 가지 효소(CKα와 CKβ)가 그들의 서열 전체에서 65%가 동종이며, 어떤 보존된 구역에서 예를 들면 콜린 결합이나 촉매활성구역에서 동종이 75%에 해당된다는 사실로 인하여, 동질효소는 발생된 폴리클론과 단일클론 항체를 인식할 수 있다는 것을 체크할 필요가 있다.
본원발명의 발명자들은, 사용된 폴리클론과 모노클론 항체 모두가 콜린 키 나아제 알파에 대하여 특이하게 작용한다는 사실과 이들 두 항체는 콜린 키나아제 베타를 인식하지 못한다는 사실을 입증하였다. 그에 따라 두 가지 콜린 키나아제 알파와 베타 프로틴이 인체 HEK293T 세포에서 유전자 과다 형질발현이 되었고, 이 두 가지 프로틴이 존재하며 활성이 있다(도2A)는 점을 확인한 후, 이전에 연구가 수행된바 있는(Ramirez de Molina, A., Gutierez. R., Ramos, M. A., Silva, J.M., Silva, J., Sanchez, R., Martinez-Pinero, L., Sanchez, J.J., Bonilla, F., Rosell, R., Lacal, J. C. Oncogene 21.4312-4322 (2002); Ramirez de Molina A., Rodriguez-Gonzalez-Gonzalez A., Gutierrez, R., Martinez-Pinero, L., Sanchez, J.J., Bonilla, F., Rosell, R., Lacal, J. C. Biochem. Biophys. Res. Commun 296, 580-583(2002) 두 폴리클론 항체와 콜린 키나아제 알파에 대항하여 생성된 새로운 모노클론 항체를 가지고 면역측정 방법(웨스턴 블롯방식)을 이용하여 이들에 대한 분석을 행하였다.
도2B에 나타나 있는 두 가지 항체에서 보여주듯이, 활성이 80배 증가한 조건에서 콜린 키나아제 베타가 과다 형질발현되어도, 어떤 항체들도 이러한 동질형태를 인식하지 못하지만, 콜린 키나아제 알파는 동일한 두 조건에서 그리고 내부 통제 레벨에서 모두 고도로 인식할 수 있다. 이 결과는, 폴리클론 항체가 사용되었던 그룹에 대한 이전의 연구는 콜린 키나아제 알파를 인체 종양으로부터 추출된 세포라인 및 분석된 종양 그 자체에서 과다 형질발현된 동질효소로 규정지울 수 있음을 제시한다.
폴리클론 항체가 분자에서 다른 에피토프를 인식하고, 그리고 콜린 키나아 제 알파 및 베타 서열이 65%가 동종이며, 특히 촉매영역 및 기질과 ATP 결합영역이 위치하고 있는 일부 영역에서는 75%까지 도달한다고 하더라도 이론적으로 상기와 같은 결과는 예측되어 지지 않는다.
실시예 3
종양의 특이성 : 서로 다른 인체의 종양에서 콜린 키나아제의 변화
콜린 키나아제 알파의 입증된 특이성을 이용한 항체의 적용가능성에 대하여 최근 선진국에서는 유방암, 대장암 및 폐암 등과 같은 가장 중요한 일부 종양에 있어서 콜린 키나아제 알파 형질발현의 잠재적인 변화를 연구해 오고 있다. 이같은 연구를 수행하기 위하여, 상기의 암에 걸린 38-50명의 서로 다른 환자로부터 추출된 샘플의 파라핀 영역을 마련하여 연구가 수행되었으며, 면역조직화학법(IHQ)를 이용하여 콜린 키나아제 알파 형질발현에 대한 분석이 이루어졌는바, 이때 IHQ는 세포와 조직의 핵심부분인 생물분자 요소 그대로를 검출하고 확인가능하게 하는 기술이며, 병원의 병리 해부학과에서 자동화된 방법으로 수행되어 진다.
환자들의 유방암, 폐암 또는 대장암 샘플에서 아래와 같은 사항이 발견되었다:
- 모든 경우, 콜린 키나아제 알파를 인식하는 항체를 갖는 종양의 염색은 매우 특이하여 종양 조직과 인접된 정상적인 조직과의 사이에 뚜렷한 구별을 가능하게 한다.
- 정상적인 조직이 염색되는 경우는 없다.
- 콜린 키나아제 알파 효소는 이러한 형태의 종양에서는 62% 내지 100% 사이의 범위에서 과다 형질발현이 발생되어, 인체 종양 형성원에서 동질 형태와 콜린 키나아제 알파가 관련성이 높다는 사실을 보여준다.
도3에서는, 폐암의 80%를 차지하는 대형세포 폐암(NSCLC)에 대하여 얻어진 결과치를 관찰할 수 있다. 관찰되는 바와 같이, 종양 결절에 대하여 특이성을 나타내며 앞서 지적하였듯이 특히 샘플의 62%를 염색시키는 콜린 키나아제 알파의 세포질 염색이 발생한다.
이와 같은 개념을 바탕으로 해서, 유사한 연구가 38명의 유방암 환자들에게 시행되었고, 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현이 종양 조직의 경우 97%가 다시 관찰되었다(도4). 마지막으로 대장암의 콜린 키나아제 알파 형질발현에 대한 연구가 수행되었는바, 이를 위해 서로 다른 대장암 환자로부터 추출된 40개 샘플의 파라핀 시편을 마련하여 4년 이상의 추적관찰이 행해졌다. 분석은 암종을 분기별로 I, II, III, IV로 분류하여 시행하였다. 이전의 경우와 마찬가지로 정상적인 조직은 종양 조직에 인접한 정상 조직을 시료로 준비하여 적용하였다. 정상조직의 포지티브 염색은 40개의 시료 중 어떤 시료에서도, 그리고 어떤 경우에서도 관찰되지 않았고, 모든 경우에 있어서 효소의 과다 형질발현된 종양 조직에서 콜린 키나아제 알파 염색이 고도로 특이성이 있음을 재차 확인하였다(도5A). 이와 같은 결과로부터 대장암에서 상기 효소의 동질 형태가 상당히 밀접한 관련성이 있음을 시사하는 것으로 볼 수 있다. 더욱이 이 결과는 여러 등급의 형성장애로 나타나는 종양의 초기종양 진행 부위, ACFs 그리고 폴립들의 분석을 요구하며, 콜린 키나아제 알파 의 유전자 과다 형질발현은 형성 장애 시기에 발생되는 대장조직의 종양 진행에서 초기 현상이라는 점을 명백히 보여주고 있고, 종양에서 "게이트-키퍼(gate-keeper)" 유전자로서의 잠재적인 거동과 그에 따른 잠재적인 신규의 치료 타겟으로서의 관련성을 제시하고 있다. 도5B는 폴립을 보여주고 있는 것으로, 이로부터 정상적인 조직에서는 염색이 근본적으로 관찰되지 않음을 알 수 있음과 아울러 형성장애의 발생이 시작됨에 따라(이중핵 세포) 종양 덩어리에서 염색이 증가되고, 더욱 강해지게 된다.
실시예 4.
종양의 특이성 : 콜린 키나아제 알파 효소의 종양 형성 유전자 거동
오늘날 가장 중요한 인체 종양의 일부에서 콜린 키나아제 알파의 조절장해가 대단히 높은 빈도로 발생한다면, 프로틴이 단독적으로 종양 형성 유전자 능력이 있는지 여부, 즉 콜린 키나아제 알파가 종양 형성 유전자 활성이 있는지를 알아보기 위한 실험이 수행되었다. 이 연구를 수행하기 위하여, 상기 유전자가 독립된 배양에서 성장능력을 부여할 수 있는지 여부에 대한 연구를 우선적으로 수행하였으며, 상기 연구에서는 전환능력을 측정하는 것을 포함한다. 인체 HEK293T 세포는 대조군으로서 공벡터와 콜린 키나아제 알파 형질발현 벡터로 트랜스펙트(transfect)된 다음에 부드러운 한천에 접종되었다. 도6에 도시된 바와 같이, 이 프로틴의 유전자 과다 형질발현은 두 가지 인체 HEK293T 세포와 도그 MDCK 상피 세포에서 종양형성 유전자를 유도하기에 충분하다.
인체 HEK293T 세포에서 콜린 키나아제 알파가 활성을 전환시킨다는 전제하에서, 종양 형성 유전자의 잠재력이 분석되었다. 이를 위해서, 면역이 억제된 생쥐(Nu/Nu)에게 공벡터가 대조시료로서 주입되고 콜린 키나아제 알파 형질발현 벡터로서 유전자 과다 형질발현된 HEK293T 수백 만개의 인체세포들이 주입되었다.
주사한 후 최소한 한 주에 두 번씩 50일 동안 종양의 성장이 감시되었는바, 어떠한 대조세포의 생쥐에도 종양의 성장이 관찰되지 아니하였음에 반해서 콜린 키나아제 알파로 유도된 유전자 과다 형질발현된 세포는 주사한 생쥐 30마리 중 8마리(26%)가 평균 0.6 ㎤ 크기 종양이 45일 후에 유도되었다(도7). 이 결과로부터, 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현은 생체 내에서 충분히 종양 형성을 유도하므로, 인체의 종양 형성 유전자에서 충분히 잠재적으로 치료 표적으로 정할 수 있다. 콜린 키나아제 알파에 의하여 종양이 발생하고 종양의 형질발현과 활성이 유지된다는 것을 입증하기 위하여 종양은 외과적으로 추출되고, 용출되어 이 효소의 활성과 형질발현된 레벨을 측정하기 위하여 모체(parent) HEK 293T 세포들이 대조군으로서 함께 레벨 측정되었다. 도8에서 보는 바와 같이 분석된 모든 종양에서 고도의 형질발현과 효소 활성 레벨이 접종하기 전에 확보된 것과 유사하게 유지되고 있다는 것은 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현은 생체에서 종양 형성 유전자를 유도하고 있는 것을 보여 준다.
실시예 5.
약리적인 특이성
콜린 키나아제 알파 동질 형태의 종양 형성 유전적인 활성과 함께 인체 종 양에서 과다 형질발현 빈도가 높다는 사실이 입증되자, 그 다음으로 억제제 MN58b[Hernandez-Alcoceba, R., Saniger, L., Campos, J., N峽ez, M.C., Khaless, F., Gallo, M. A., Espinosa, A., Lacal,J. C., Oncogene, 15, 2289-2301(1997); Hernandez-Alcoceba., Fernandez, F., Lacal J. C. Cancer Res. 59, 3112-3118(1999); Raminez de Molina A., Banez-CoronelEz-Coronel M., Gutierrez R., Rodriquez Gonzalez A., Olmeda D., Megias D., Lacal J. C. Cancer Res. 64:6732-6739(2004)]의 항-종양 효과가 상기 콜린 키나아제 알파 동질형태에 대하여 특이성이 있는지의 여부 또는 반대로 콜린 키나아제 베타 동질형태도 잠재적인 상호작용에 기여할 수 있는지의 여부에 대해 연구하였다. 상기 두 가지 콜린 키나아제 알파와 콜린 키나아제 베타는 기질 결합구역(substrate binding domain)과 촉매구역에서 최대 75%의 상동관계를 보이기 때문에 상기의 검증을 필요로 한다. 이 때문에 두 개의 콜린 키나아제 동질형태(CKα 및 CKβ)들은 콜린 키나아제 활성이 결핍된 이.콜리(E. Coli) 박테리아 스트레인에서 발현되고, 재조합적으로 형질발현된 콜린 키나아제 동질 형태로 인하여 어떤 효소의 활성도에 있어서도 독점적으로 관찰할 수 있다. 도9에서와 같이, 콜린 키나아제 알파의 효소활성은 Mn58b에 의하여 영향을 받고 베타 동질형태에 동일한 억제제에 의하여 효과를 얻기 위하여 노력하였던 것보다 더 많이 표명된 효과를 MN58b에 의하여 영향을 받는다. 실제로, MN58b는 콜린 키나아제 베타 보다도 콜린 키나아제 알파에 대하여 20배나 더 강화된 활성을 보여준다.
과다 형질발현한 콜린 키나아제 알파에 의하여 생체에 종양이 발생된 것과 MN58b가 이러한 동질형태에 대하여 특이성이 있다면, 콜린 키나아제 알파에 의하여 유도되는 종양의 성장은 MN58b에 의하여 억제될 수 있다는 것이 입증되었다. 이에 따라, 콜린 키나아제 알파 효소의 과다 형질발현을 고도로 보여주는 콜린 키나아제 알파가 감염된 수백 만개의 인체 HEK293T 세포들이 면역이 억제된 생쥐(Nu/Nu) 피하에 주사되었다. 종양크기가 0.1㎤에 도달하면 특수 콜린 키나아제 알파 억제제 MN58b를 복강 내에 5일간 연속 투여하며, 9일째 나머지 5 mg/Kg의 멸균된 생리 유장액의 투여가 시작되었다. 대조군 생쥐는 동등하게 상응되는 매개 분량을 전달받고, 동일한 달에 종양은 일주일에 최소한 두 번의 점검이 수행되었다. 도10에서 와 같이 콜린 키나아제 알파의 억제는 종양성장에 강력한 효과가 있고 약 80% 정도의 종양 성장이 억제되었다. 이러한 결과는 콜린 키나아제 알파 과다 형질발현이 생체에서 충분히 종양을 유도할 뿐만 아니라, 종양 세포의 세포 증식이 콜린 키나아제 알파 활성에 의존하고 있음을 보여 준다.
실시예 6
유전적 특이성
이들 모든 결과들에 의해서, 잠재적인 콜린 키나아제 알파는 새로운 항종양 정책의 수립을 위한 새로운 치료 표적으로 뒷받침되고 있다. 한편, 화학적 억제제는 MN58b의 경우에서와 같이 특정한 효소에 대하여 특이성을 나타내도록 제조되는 경우에 있어서도 연구자들에게는 알려지지 않은 효과에 의하여 항증식 작용을 수행할 수 있다. 키나아제에 대하여 특별하게 작용하도록 제조된 억제제 역시도 서로 밀접한 관련을 가지고 있지 아니한 다른 키나아제에 영향을 미침을 보여주는 많은 다수의 연구논문이 존재하고 있다. 특정한 단백질에 대하여 나머지 세포 프로틴에 에 영향을 미치지 아니한 채 정확하고도 선택적으로 mRNA를 제거할 수 있는 siRNA(스몰 간섭 RNA)를 사용함으로써 특정한 효소에 대한 간섭효과를 보다 정확하게 확보할 수 있도록 하는 기술이 최근에 개발되었다. 이 경우 콜린 키나아제 알파에 대하여 특이성을 나타내는 억제제 MN58b를 사용한 약리학적 간섭은 siRNA 기 술을 이용한 콜린 키나아제 알파의 특정한 억제를 통해서 유전적인 레벨에서 확립 되었음이 입증되었다. 상기 기술은 콜린 키나아제 알파(ChoKα)를 확실하게 암분야에서 새로운 치료 표적으로 각인시키게 될 것이다. 이 목적을 달성시키기 위하여, 콜린 키나아제 알파 메신저 알앤에이(siCHKA로 불리워짐)와 혼성화할 수 있는 능력이 있는 올리고 뉴클레오티드와 그것에 의하여 특별히 프로틴의 형질발현을 차단하는 방법이 개발되었다. 상기 siRNA는 인체세포 HEK293T에서 콜린키나아제 알파의 형질발현을 효과적으로 차단하는 것을 처음으로 입증하였다. 내부 프로틴과 콜린 키나아제 알파를 지에스티에 연결하였고 동일한 세포에 감염시켰다(도11).
간섭 RNA가 콜린 키나아제 알파에 특이하게 작용하고 이 프로틴의 형질발현을 차단하는 효과적인 능력이 있다는 점이 이전에 입증되고, 아포토시스 유도에 의하여 강력한 항-종양 효과가 콜린 키나아제와 MN58b의 약리학적인 방해로 인하여 발생된다고 전술한 사실이 MIDA-MI3-231 인체유방 종양으로부터 유도된 종양세포에서 그 효력이 입증되었다. 도12에서 보는 바와 같이, 이 세포에서 확보된 저조한 세포 감염율에도 불구하고, siCHKA의 감염이 MDA-MB-231에서 두 가지 사항인 콜린 키나아제 알파 형질발현과 콜린 키나아제 효소활성이 저지되었다는 것을 암시하고 있다고 할 수 있다. siRNA에에 의하여 콜린 키나아제 알파의 유전적 억제효과를 입증하는 것은 MN58b의 약리학적 억제에 의하여 확보되어진 것과 유사하다. 그에 따라 명확하게 콜린 키나아제 알파에 대한 영향의 특이성을 설명하고 있으며 간섭 siCHKA를 감염시킨 후 세포의 생존율이 측정되었다. MN58b를 종양세포에 처리한 후 세포 사멸이 발생하는 것처럼, 콜린 키나아제 알파의 간섭 약제에 감염된 세포에 특이성을 나타내는 아포토시스로 인한 세포 사멸과 관련되어서 세포의 생존율이 감소하는 것을 관찰할 수 있다(도13).
최종적으로 RMN58b에 의해 발생하는 것처럼, 콜린 키나아제 알파에 대하여 특이하게 작용하는 간섭 siCHKA의 형질발현은 정상적인 일차 인체의 모체 세포 HMEC(인체 모체 에피델리얼 세포)의 생존능력에는 영향을 미치지 않음이 입증되었다.
이 세포들은 이미 설명되었듯이 기초라인에서 형질발현이 저조하여 종양세포는 본질적으로 콜린 키나아제 과다 형질발현을 한다. 그러나, 유방조직의 일차 상피세포에서의 이 같은 저조한 기초라인의 형질발현에도 불구하고, 콜린 키나아제 알파 효소의 형질발현에서 명백한 간섭이 발생되고, 어떻게 해서 이들 세포가, 종양세포에서 발생되는 것과는 달리, 아포토시스에 의하여 사멸되지 않고 주기가 정지되어 있을 뿐이다(도14). 이때, 동일한 세포에서 관찰되어 지는 동일한 결과는 억제제 PAN58b로 처리된 것이다.( Rodriguez-Gonzalez A., Ramirez de Molina A, Fernandez F., Lacal JC. Oncogene 22:8803-8812(2003); Rodriguez-Gonzalez A., Ramirez de Molina A., Banez-Coronel M., Megias D., Nunez M.C and Lacal J. C. Int. J. Oncol 26:999-1008(2005).
실시예7 .
콜린 키나아제알파의 유방 종양에 대한 영향: 생존 빈도
종양의 발생과 발전에서 콜린 키나아제 알파를 포함하여 확신할만한 자료를 확보하기 위하여, 콜린 키나아제 알파가 특별히 관계되는 타입(유방암, 폐암 또는 방광암)의 환자들을 대상으로 하여 그들의 형질발현을 정량하는 추가적인 분석과 상기 환자의 진행 가능성에 관한 예후에 관련된 사항을 알아보기 위한 연구가 추가적으로 수행되었다. 한편으로는, 환자의 샘플로부터 메신저 알앤에이를 분리시켜 콜린 키나아제 알파 형질발현에 관한 정량분석이 수행되었다. 이를 위하여, 연구 목표인 메신저 RNA와 콜린 키나아제 알파에 해당하는 메신저 RNA를 인식하는 특수 태퀴만(Taqman) 시험을 통해서 자동화된 실시간 PCR 정량분석이 수행되었다. 확보된 자료는 정상 조직의 대조군 샘플과 대비하여 로드 단위로 나타내었다.
유방종양과 관련하여 확보된 자료의 경우에 있어서 확보된 결과는 도15A에서 보여주고 있다. 시료가 중앙 치수보다 상위하는 콜린 키나아제 알파 활성이 있는 시료는 나쁜 예후를 나타내는 환자(임파선 결절이 있거나, 전이가 발전되고 있거나, 생존율이 저하된 경우)들에게 해당된다는 것을 관찰할 수 있다. 이 자료는 도15B와 도15C에 있는 자료를 확신시켜준다. 도15B는 63명의 유방종양 환자로부터 확보된 자료이며 콜린 키나아제 알파 형질발현의 평균치가 2-2ㅿㅿ ct 방법(Livak, K.J. and Schmittgen, T. D(2001)의 mRNA 레벨로 계산된,(유전자의 상대적인 발현 단위로 계산된 것에서) 콜린 키나아제 알파의 평균치를 관찰할 수 있다. 상대적인 유전자 형질 표현의 분석에서 실시간 PCR에 의한 정량분석과 2-2ㅿㅿ ct 방법은 (Method. Methods 25, 402-408) 전이된 환자가 그렇지 않은 환자에 비하여 결과 수치가 훨씬 더 높다. 이 환자의 생존 가능성은 임파 결절의 존재 상태에서 나타나며 대조 시료와 비교하여 보면 콜린 키나아제 알파의 형질발현이 유의성 있게(p<0.001) 증가 추세로 설정된 전통적인 캐프린 마이어 곡선(Kaplan EL, Meier P, Nonparametric estimation from incomplete observation J. Am. Stat.Assoc., 53:457-481(1958))에서 어떻게 임파 결절이 증가(p=0.046)하는 상황에서 생존율이 큰폭으로 감소하는지를 관찰할 수 있다(도15C). 환자의 생존이 콜린 키나아제 알파 형질발현에 의하여 환자의 생존을 표현할 때에도 동일한 경향을 관찰할 수 있다.
실시예 8.
폐 종양에 대한 콜린 키나아제의 효력: 과다 형질발현 레벨과 생존 빈도
폐 종양에서 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현의 중요성에 관하여 충실하게 연구하기 위하여 여러 가지 시험이 시행되었다. 첫째로 자동화된 실시간 피씨알 반응으로 특수 태퀴만 시험과 정량분석을 시행하여 폐암 환자로부터 추출된 세포 라인에서 상술한 효소에 해당하는 mRNA의 함량 레벨이 측정되었다. 일반적으로 해당되는 대부분의 폐암(75-85%)의 세포라인과 소 적혈구가 아닌 또는 소규모 세포가 아닌 폐암의 세포라인으로 H460과 H1299가 이를 대표하며, 다른 종양에 해당하는 라인은 소 적혈구나 소규모 세포가 대표하는 라인으로서 H510 및 H82를 대표하여 시험이 수행되었다. 자료는 상용 로그 단위와 관련된 정상적인 일차 인체 기관지 상피 세포를 보여준다. 결과는 도16A에서 보여준다. 이 자료는 프로틴의 레벨을 면역 분석법(도16B)에 의하여 각각의 세포 라인에서 검출한 자료를 완성하였고, 동일한 라인에서 효소 활성을 검출한 자료는 표시된 기질(콜린)에서 30분이 지난 후 발생되는 방사능으로 표시된 생성물의 측정에 의하여 완성되었다(도16C). 소단위 폐 종양의 세포 라인의 경우 특히 H510에서 대조시료에 비하여 상당히 증가된 것을 모든 경우에서 관찰할 수 있다. 특히 H510을 비롯한 SCLC 라인의 모든 경우에 있어서 대조군에 비하여 월등한 증가가 관찰되고 있다.
언급한 세포라인에서 MN58b의 첨가에 의하여 콜린 키나아제 저해-항-증식 영향이 점검하였으며, 아래의 표1과 같은 결과를 얻었다. 표1에서 괄호안의 숫자는 일차세포와 비교된 각 세포의 민감도를 표시하고 있다. 분석이 행해진 모든 시간대에 있어서 일차 세포와 종양으로부터 추출된 4가지 세포라인의 차이는 상당히 크게(p:<0.001) 나타났다.
표1. 인체 폐 종양으로부터 파생된 세포 라인에 대한 콜린 키나아제 억제로 인한 항- 증식-효과
세포라인 48시간, IC50(μM) 72시간,IC50(μM) 114시간, IC50(μM)
일차 세포 BEC 40.5 ±6.2 18.3 ±4.8 4.2 ±0.8
일차 세포 HMEC 44.7 ±4.95 2.9 ±2.7 3.4 ±0.13
NSCLC H1299 10.3 ±2.5 (4) 2.7 ±0.7(8) 0.9 ±0.1(4)
NSCLC H460 7.03 ±2.03 (6) 2.6 ±0.8(8) 1.1 ±0.1(3)
SCLC H510 1.1 ±0.1(41) 0.4 ±0.05(53) 0.1 ±0.03(27)
SCLC H82 1.9 ±0.2(24) 0.8 ±0.04(27) 0.27 ±0.01(12)
상기 결과는 폐암 환자의 종양시료에서 특별히 초기에 대형 폐 종양세포를 지닌 환자로부터 추출된 조직에서 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현 연구를 통해서 보완되었다. 도17은 초기에 수술이 행해진 환자에서 콜린 키나아제 알파에 상당하는 메신저 RNA의 실시간 PCR 정량분석에서 얻어진 초기 상태의 결과이며, 콜린 키나아제 알파는 정상적인 조건에 비하여 53%의 경우 이미 과다 형질발현을 보여주고 있다. 다시 말하면, 콜린 키나아제 알파 형질발현과 종양의 경중상태(분기별과 전이가 되었던 혹은 되지 않았던 경우)의 관계가 분석되어 졌고, 그 결과는 아래의 표2에서 보여주는 바와 같이 콜린 키나아제 알파의 형질발현이 많을수록 종양이 악성 형태로 관계지워진다는 점을 관찰할 수 있다.
표2. 폐 종양의 경중에 따른 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현.
콜린 키나아제 알파(ChoKα)
정상레벨의 환자들의 숫자와 % 과다 형질발현된 환자들의 숫자와 %
P

분기		 IA-IIIAa
18(60%)
12(40%)
0.019

분기		 IIIB-IVb
0(0%)
6(100%)
전이 아니오 18(69.2%) 8(30.8%) 0.0015
전이 예 0(0%) 7(100%)
a 종양의 크기가 작은 분기이며 거의 혹은 전혀 결절을 가지고 있지 않고 전이된 것도 없다.
b 종양의 크기가 큰 분기이며 결절을 포함하며 전이가 되었다.
유방 종양인 경우와 마찬가지로 대형 폐 종양 세포의 초기에는 콜린 키나아제 알파 과다 형질발현이 있는 폐 종양은 도18에서 보여주는 그래프에서 나쁜 예후와 관련된 것임을 알 수 있다. 상기 도면에서 콜린 키나아제 알파 과다 형질발현이 직접 검출지 않은 사람 중 치수 1에서 오랜 시간의 생존을 유지하여온 환자들을 볼 수 있다. 한편으로는 콜린 키나아제 알파 과다 형질발현이 검출된 환자들이 이러한 환자들에게 질병 없이 생존하는 것이 측정된 9개월의 평균치를, 다시 말하면 환자가 수술 후 재발될 때까지의 경과된 시간을 보여주면서 예후가 감소 됨을 알 수 있다.
실시예9
콜린 키나아제 알파의 방광종양에 미치는 영향: 과다 형질발현에서 생존빈도
방광 종양환자들에 대해서도 상기와 유사한 연구가 시행되었다. 먼저 방광 종양환자의 세포라인에서 언급된 효소에 해당하는 mRNA 레벨이 측정되고, 다시 실시예8에서 설명된 폐암의 경우와 유사하게 실시간 자동 PCR 반응 정량분석과 태퀴만 시험에 의하여 검출되었다.
세포라인 HT1376, J82, SW780, TCCSup와 UMVC3가 활용되고, 상용대수가 정 상적이며 항구적인 방광세포 UrotSa가 산출되었다. 결과는 도19A에 나타내었다. 자료는 단일클론 항체(도19B)에 의한 면역분석과 효소활동의 평가(도19C)에 의한 각각의 세포 라인에 존재하는 프로틴 레벨을 측정함으로써 완성되었다. 서로 다른 여러 세포 라인은 정상적이고 항구적인 UrotSa 세포에서 콜린 키나아제 알파 레벨이 증가된 것을 보여주고 있고, 뿐만 아니라 방광암으로부터 추출된 세포라인에서 프로틴의 형질발현이 증가된 것은 콜린 키나아제 효소의 활성이 증가한 것과 유사하게 결부되어 있다.
다시 말하면, MN58b의 첨가에 의하여 세포라인에서 콜린 키나아제 억제 작용에 의한 항-증식-효과가 역시 점검되었고, UrotSa에서 확보된 자료들은 그것과의 관계에서 비교할 수 있는 믿을 만한 충분한 자료라고 할 수 없는 것처럼, 레벨이 낮은 콜린 키나아제의 티씨씨에스유피에서의 세포 라인에 관련한 유도 요소를 나타내는 괄호 사이의 숫자들은 다음의 표3에서 확보된 결과를 보여준다.
표3. 인체의 방광 종양으로부터 파생된 세포 라인에 대한 콜린 키나아제를 저해하는 항-증식-영향.
세포라인 TCCSup HT1376 UNUC3 J82 SW780
IC50(㎛)
(96시간)		 3.7(1) 2.49(1.5) 2.98(1.86) 1.08(3.4) 0.91(4.1)
ChoK
형질발현		 2.5(1) 5(2) 5(2) 12.6(5) 12.6(5)
ChoK
활성		 3.6(1) 7(1.9) 9(2.5) 14.5(4) 15(4.2)
한편, 생체 내에서 관찰된 평행 효과를 확립하기 위하여, 90명의 방광암 환자들의 종양 조직에서 콜린 키나아제 알파의 형질발현을 마이크로 어레이기술을 응 용한 아피메트릭스사의 U133 플러스 2.0 칩을 적용하여, 이 기술로 확보된 결과를 도20A에서 보여주고 있다. 상기 표3은 절반을 약간 상회하는 49명의 환자가 1배와 3배 사이에서 형질발현 유도 요소를 보여주고; 25명의 환자는 3배와 8배 사이의 형질발현 유도 요소를 보여주고 있는 반면 환자들 중 12명은 형질발현 유도 요소 8배에서 20배에 해당하는 숫자를 보여주고 있다.
마이크로 어레이에서 확보된 결과는 실시간 정량 분석용 피씨알 분석과 태퀴만 시험에 의하여 도20B에서 보여주는 결과에서와 같이 상기 분석에서 내생의 대조시료로서 GAPDH 시료에서 상용되는 정상적인 상용 RNA가 사용되었다. 20개 중 18개의 시료들이 분석되었다(낮은 레벨의 형질발현 10명에 해당하며 나머지 10명은 높은 레벨의 콜린 키나아제 형질발현). 콜린 키나아제 형질발현 결과는 아피메트릭스 마이크로어레이와 태퀴만 시험 분석 결과와 일치된다. 종양에서 콜린 키나아제 알파 과다 형질발현된 경우는 55%에 해당되었다. 종양에서 콜린 키나아제 알파 과다 형질발현 환자들은 대부분 전이가 발생된 환자들이었다.
콜린 키나아제 알파 과다 형질발현과 종양 전이와의 상관 관계는 마이크로어레이로부터 확보된 환자의 콜린 키나아제 알파 형질발현 자료에서 입증되었다. 도21은 임파결절의 존재와(단부에 있는 빈 사각형의 라인에 관련된 치수) 혹은 종양이 전이에 의하여 발전된 것(단부에 있는 검은색 원형으로 된 선으로 관련된 치수)에 관하여 포지티브하고 네가티브한 환자들 사이에서 콜린 키나아제 알파 형질발현 레벨의 평균치의 변이를 보여주고 있다. 도21B는 그러나 전이가 된 환자의 변이를 비율로(연속된 막대표시가 검은 색,■■ 으로 표시 ) 전이가 되지 않은 환자 (빗줄로 표시된 // )가 낮은 레벨의 콜린 키나아제 알파 형질발현(왼쪽의 낮은 한 쌍의 막대)된 환자 그룹에서 환자들의 비율을 변이로 나타내는 그래프를 보여주고 있고, 콜린 키나아제 알파 형질발현(막대의 쌍이 그래프의 중앙에 위치) 혹은 고도의 콜린 키나아제 알파 형질발현(막대의 쌍이 그래프의 오른 쪽에 위치함)을 보여주고, 낮은 레벨의 형질 전환된 환자의 백분비(53%)가 전이가 없는(47%) 환자들 보다는 그다지 높지 않으며, 반면에 콜린 키나아제 알파 형질발현이 높은 대부분의 경우에 있어서(72%)는 전이가 되고 나머지 28%는 전이가 되지 않았다 는 사실을 보여주고 있다. 콜린 키나아제 알파 형질발현과 통계학적 유의성 레벨에 도달하지 않은 전이와의 관계가 관찰되어 졌다. 방광 종양에서 콜린 키나아제 알파의 과다 형질발현 관계를 생체에서 설명하기 위하여 생리적으로 아주 흡사한 앰비티-2(생쥐의 방광 종양 세포)를 이용하여 방광에서 종양이 발생 될 때 오르토토픽 방광 종양 견본이 역시 사용되었다. 정상적인 생쥐세포에 있어서 콜린 키나아제 알파로 인하여 과다 형질이 발현된 세포에서, 세포의 프로틴을 측정할 목적으로 한층 많은 콜린 키나아제 알파의 형질발현이 종양의 공격성이나 번식성을 조장하였다면, 보다 많은 과다 형질이 발현되었다. 이 때문에 공벡터를 포함한 MBT-2 세포들은 콜린 키나아제 알파 유전자(생쥐의 대조군, 세마리의 생쥐로 구성됨)의 형질발현을 허락된 서열 혹은 상술한 효소(콜린 키나아제 알파 그룹의 생쥐, 세 마리로 구성된)에서 인코딩된 서열 벡터가 감염된 MBT-2 세포들의 과다형질발현하는 콜린 키나아제 알파들은 삽입관을 통하여 생쥐의 방광에 직접 접종되었다. 종양의 발생은 가돌리움(gadolinium) 대조로 만들어진 핵자기공명에 의하여 두 가지 그룹뿐만 아니라, 역시 생쥐의 질병에서 진행(육체적 상태, 생존 여부, 조직적인 조사. 신장과 그 외 기관의 침범 가능성에 관한 분석)이 점검되었다.
세포에 접종한 지 19일 후 콜린 키나아제 알파가 접종된 생쥐들은 19일이 지난 후 무기력한 상태를 보였고, 그들 중 두 마리는 대형의 종양이 발생되었는바, 공벡터를 투입한 생쥐(대조군)는 50일 이후에 무기력한 상태를 보였다.
실시예 7, 8, 및 9의 결과에서 콜린 키나아제 알파는 인체의 유방, 폐,방광의 종양 발생에 높은 빈도를 지니며 과다 형질발현한다는 점을 확인할 수 있다. 과다 형질발현은 임상학적으로 임파 결절, 전이 생존율 저하를 일으키는 상당히 악성임을 제시하는 요인이다.
실시예 10
유전적 특이성: 유도적 간섭 기준
종양 세포에서 콜린 키나아제 알파의 간섭은 아포토시스에 의한 세포 사멸로 유도되는 사실이 실시예6에서 설명된 분석에서 알 수 있으며, 잠정적인 분석에서, 이러한 형태의 연구에서 간섭 구조를 표현하는 안정된 세포의 집단을 가진다는 것은 불가능하다. 가변적인 세포 집단의 백분비는 잠정적인 분석에서 영향을 받으며, 결과들이 숨겨져 있는 총 집단은 영향을 받지 않는다. 오히려 그것을 균일하게 표현된 집단에서 구성의 영향을 연구함으로써 구조상 안전한 모델을 얻는 것이 필수적이지만은 않다. 이것은 콜린 키나아제 알파 형질발현에서 간섭된 균일한 집단을 확보하는 것이 허용된 유도적 간섭 모델을 가지는 것을 필수적으로 만든다.
이를 확보하기 위하여, 간섭 서열이 그것의 형질발현을 방지하는 유전자 억제 물질의 구조에서 발현된다. 형질발현을 방지하는 억제제와 함께 흥미있게 유도되는 구조의 공동 감염이 수행되고, 구조에서 균일한 집단이 한번 선택되었고, 세포들은 구조의 간섭에서 발현과 그로 인한 프로틴의 형질발현을 간섭하는 유도체와 함께 처리되었다.
유도 모델은 상기 분석에서 계획되었고 콜린 키나아제 알파의 간섭 구조는 벡터 pcDNA6/TR-pure(Oliggongine)과 pcDNA6/TR(Invitrogen) 벡터에 존재하는 억제제에서 발현되었다. 유도자는 리프레서와 결합시 대응하는 유전자 배열과 결합하는 것을 방지한다. 그러므로 간섭 배열의 형질발현은 이 이상 더 방지되지 않는다. 이러한 시스템의 구조는 도22에서 관찰되어 진다.
도23 및 도24는 유도 작용제 독시클린으로 처리한 후 간섭 구조를 형질발현할 수 있는 MDA-MB-23에서 추출된 세포라인으로서의 Ch-ind-1 세포에서 얻어진 결과를 보여주고 있다. 도23은 상기 유도라인의 활동이 MDA-M B231에서 발생하는 거동과 유사한 콜린 키나아제 알파의 화학적 억제에 여전히 민감한 점은(모체 대조라인은 Ch-ind-1이 발생되는 유방 종양으로부터 유도됨.) 마치 콜린 키나아제 억제제 MN58b 혹은 RSM936으로 처리한 후 확보된 결과들이 두 가지 라인에서 유사한 것과 마찬가지이다. 도24는 그렇지만, 마치 간섭 모델의 유도가 독시클린에 의하여 단지 Ch-ind-1 라인에서만 발생되듯이, 독시클린 10 μg/ml을 두 개의 세포 라인에 처리하였을때 어떻게 해서 Ch-ind-1에서만 콜린 키나아제 알파의 유전적 저해가 발생하는지 보여준다. 왜냐하면 리프레서의 결합이 저지될 때 간섭 알앤에이의 합성 에서 구조를 동반하는 한 가지이므로. 세포증식의 감소(pCNA의 측정에 의하면)와 아포토시스로 말미암아 세포의 사멸이 증가(PARPdig로 측정된, 아포토시스의 지표인 PARP 프로틴의 붕괴)는 유전적 콜린 키나아제 알파의 저해와 상관관계가 발생된다. 효소가 아직 초기이지만, 10일이 지나야 발생이 되며 실험이 시작된 후 20일이 지나면 한층 더 명확해 진다(집단은 거의 콜린 키나아제를 지니고 있지 않음).
결과는 이전에 일시적으로 확보된 자료로 보강된 유도 모델과 콜린 키나아제 알파에 대하여 특유한 저해로 인하여 효과를 보여주는 것을 확보하였다.
실시예 11
종양 형성에 있어서 콜린 키나아제 베타과다 형질발현의 효과에 대한 평가
콜린 키나아제 베타의 과다 형질발현이 아마 종양형성에 관련되고, 콜린 키나아제 활성이 다른 종양 조직에서도 발견되는지 그리고 종양 조직으로부터 유래된 세포라인이 독점적으로 콜린 키나아제 알파 혹은 콜린 키나아제 베타 역시 관련되는지를 확인하고 가능성이 있는 효과를 검정하기 위하여 여러 가지 분석이 실행되었다.
먼저, 폴리클론 anti-ChoKβ1 항체가 생성되었다. 그들의 특성이 감염된 Hek293T 세포에 3가지 그룹으로 나누어 검정되었고 그 중 하나는 콜린 키나아제 알파 형질이 생산된 구조에 감염된 것과 두 번째는 그 콜린 키나아제 베타의 형질발현이 허용되어 감염된 것과 세 번째는 치메릭(chimeric) 프로틴 ChoKβ-GFP가 발현된 구조에 감염된 것뿐만 아니라 동시에 대조군 세포 그룹에 빈 벡터가 감염되었 다. 도25A에서는 관찰할 수 있는 면역 검출 분석에서 언급한 항체의 특이성을 보여주며, 콜린 키나아제 베타 형질발현의 구조에 발현된 세포와 키머 프로틴 ChoKβ-GFP의 형질이 발현된 모두 두 가지 세포에 표시하는 방법이 주어지고, 콜린 키나아제 알파 형질 표현된 구조가 세포에 감염된 해당 노선에는 시그널이 없이; 후자의 세포들은, 그러나, 단일 클론 항체가 콜린 키나아제 알파에 해당되는 높이에서 발생된 밴드에 시그널이 발생되는 콜린 키나아제 알파를 향하여 방향을 돌리고 있다.
종양 형성에 관한 콜린 키나아제 베타의 가능성에 대한 효과를 점검하기 위하여, 생체 내에서 유전자 변화 활성이 검출되었다. 이를 위해서, 실험용 아씨믹(athymic) 생쥐(Nu/Nu)에 또다시 인체 HEK293T 세포 수백 만개를 주사하였다. 공 벡터가 대조시료로서 콜린 키나아제 알파 형질발현 벡터, 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터, 마지막으로 공동 감염으로 콜린 키나아제 알파와 콜린 키나아제 베타 동질 효소가 생산되었다. 종양의 성장은 주사한 후 13주 동안 매 주마다 최소한 2번씩 진행이 점검되었다. 도26에서 관찰되는 바와 같이 명백히 유도된 종양이 콜린 키나아제 알파 형질발현 벡터에 감염된 세포를 공급받은 동물들에게서 관찰되었고, 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터에 감염된 세포를 공급받은 생쥐에서 유도된 종양은 관찰되지 않았다. 두 개의 콜린 키나아제 알파와 콜린 키나아제 베타 형질발현 벡터로부터 감염된 세포를 공급받은 생쥐에게서 관찰하면 종양이 현저하게 나타난다. 소수의 종양이 유도되는 것이 단순히 콜린 키나아제 알파 형질발현을 관찰 하는 것보다 크기가 훨씬 적고 감염된 세포를 주사한 지 11주 이상을 관찰 할 수 있었다. 콜린 키나아제 베타는 아마도 직접 혹은 간접적으로 콜린 키나아제 알파를 조정하여 콜린 키나아제 베타는 종양 형성 활성을 저지할 수 있는 가능성을 제시한다.
상기 데이터는 종양환자의 조직에서 추출된 콜린 키나아제 베타 효소의 과다 형질발현이 있는지를 조사하여 완성하였다. 도27은 환자의 폐에서 수술하여 시료에서 메신저 알앤에이를 확보한 후 그것으로부터 실시간 자동 피씨알 반응 정량분석이 특수 태퀴만 시험에 의하여 수행되고 대조시료인 정상 조직에 관하여서도 로그 단위로 표현되었다. 상기 도면에서 대부분 분석한 시료들은 정상적인 시료에서 확보된 것에 비하여 콜린 키나아제 베타의 형질발현은 얼마나 감소하였는지를 관찰할 수 있고, 콜린 키나아제 알파에서 발생하는 것과 같지는 않다.
이 자료는 콜린 키나아제 베타 과다 형질발현과 종양 발생 및 발전과 상관 관계가 성립된다고 추론할 수는 없다.
시료의 결과는 모두 다 특별히 치료의 새로운 목표로 종양성 질병에서 콜린 키나아제 알파를 제시하고 있다.

Claims (18)

  1. 암 치료용 조성물의 유효성을 확인 및 평가하기 위한 시험방법으로서:
    a) 종양세포 배양체를 후보 조성물(candidate compound)과 접촉시켜 서로 반응이 이루어지도록 하는 단계와,
    b) 콜린 키나아제 알파 유전자나 콜린 키나아제 알파 프로틴의 형질발현 레벨을 검출하고 정량분석하는 단계와, 및
    c) 상기 형질발현 레벨을 후보 조성물로 처리되지 않은 종양세포의 대조군 배양체의 형질발현 레벨과 비교하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 암 치료용 조성물의 유효성 확인을 위한 체외 시험방법.
  2. 삭제
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  11. 삭제
  12. 유방암, 폐암 또는 방광암 환자의 생존기간 진단용 체외 시험방법으로서: 암환자로부터 추출된 암조직 샘플에서 콜린 키나아제 알파 프로틴의 메신저 RNA의 레벨, 상기 프로틴의 농도 또는 그것의 효소활성도로부터 선택되는 콜린 키나아제 알파 프로틴에 관한 최소한 하나의 파라미터의 결정에 의하여 상기 샘플에서의 콜린 키나아제 알파 프로틴 발현 레벨을 평가하는 단계, 및 상기 파라미터의 획득된 값을 하나 또는 그 이상의 정상적인 암발생이 없는 조직 샘플에 해당하는 값과 비교하는 단계를 포함하는 암환자의 생존기간 진단용 체외 시험방법.
  13. 항암제의 투여가 이루어지고 있는 환자로부터 추출된 조직샘플에서 콜린 키나아제 알파 프로틴의 메신저 RNA의 레벨, 상기 프로틴의 농도 또는 그것의 효소활성도로부터 선택되는 콜린 키나아제 알파 프로틴에 관한 최소한 하나의 파라미터의 결정에 의하여 수행되는 상기 샘플에서의 콜린 키나아제 알파 프로틴 발현 레벨의 평가 단계, 및 상기 파라미터의 획득된 값을 하나 또는 그 이상의 정상적인 암발생이 없는 조직 샘플에 해당하는 값과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암환자에게 투약하는 치료의 효과를 모니터링하는 체외 시험방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 1항에 있어서, 배양 종양세포는 폐, 유방, 대장, 직장 또는 방광 종양세포인 것을 특징으로 하는 암치료용 조성물의 유효성 확인을 위한 체외 시험방법.
  18. 삭제
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