KR101406314B1 - 췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟 - Google Patents

Abstract

본 발명은 췌장암 암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 암 줄기세포 및 암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 췌장암 또는 암 치료제 타겟은 췌장암 암 줄기세포 또는 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는 데 매우 유용하다. 또한, 본 발명을 이용하면 췌장암 또는 암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

Description

췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟{Novel Therapeutic Target for Pancreatic Cancer Based on Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics}

본 발명은 췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟 및 췌장암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커에 관한 것이다.

췌장암(Pancreatic cancer)은 세계적으로 14번째로 다발하는 암으로서, 미국 자체만 볼 때, 암 관련 사망자 중 4번째 사망요인에 해당한다. 이러한 췌장 종양의 약 90%는 PDAC(ductal adenocarcinomas, 관선암종)이라고 한다(Bardeesy et al, Nat . Rev . Cancer, 2(12):897(2002)). 이는 매우 낮은 평균 생존율을 가지는 매우 공격적인 악성암으로, 사망률이 높은 것은 낮은 조기진단율과 종래의 화학요법적 치료에 대한 높은 내성에 기인한다(Koliopanos, A. et al., Hepatobiliary Pancreat . Dis . Int., 7(4):345(2008)). 췌장암에 대해서 타겟 치료와 진단을 위하여 분자적 특징(molecular characteristics)을 규명하려는 노력이 시도되고 있으나 암세포는 이형성(heterogeneity)으로 자라는 만큼 분자적 특징을 명확하게 규명하기 어려운 것이 사실이다.

저분자(small molecule) 및 새로운 항원을 표적으로 한 신개념 표적 치료제들이 개발되어 췌장암 시장에도 도입되고 있으나, 이들 신약의 주된 일차목표는 항암효과의 판정에 있어서 반응율에 대부분 국한되고 있으며, 실제 환자의 생명 연장에 통계적으로 의미있는 항암제 또는 항암 병합요법제 개발은 아직도 요원한 실정이다. 더욱이 췌장암과 같이 항암제에 쉽게 내성을 보이는 암종에서는 더욱 새로운 차원의 항암치료제 개발이 절실히 요망되고 있다.

기존 약제가 반응율이 높더라도 궁극적으로 환자의 생명연장에 의미있는 기여를 하지 못하는 이유는, 항암제에 어느 정도 반응을 한다는 의미 자체가 종양을 구성하는 암세포의 대부분에는 항암효과를 나타내어 종양의 크기를 감소시키는 데에는 기여하나, 궁극적으로 이런 항암 치료에도 생존해 있는 암 줄기세포 및 암 줄기세포 유래 항암제 내성 암세포까지는 표적화 시키지 못함에 기인한 것으로 생각되고 있다.

최근 연구에서 자가재생(self renewal), 분화(differentiation) 및 증식(proliferation)의 줄기세포 특징을 가지는 암 줄기세포(cancer stem cell)는 유전자적 변이가 축적되어 종양이 발생한다는 기존의 암화 과정에서 탈피하여 줄기세포 또는 전구세포(progenitor cell)에서 변이가 축적되어 암 줄기세포가 발생하고 종양이 형성된다는 사실이 보고되었으며, 이것이 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고된 바 있다(BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery,8:806-823(2009)).

암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포가 존재하며, 이들 세포는 in vitro에서 부유 배양 시 스피어(sphere)를 형성하게 되고, 스피어 세포 배양으로 얻은 세포는 원 세포주에 비해 강력한 암 형성 능력을 가진다고 보고된 바 있다(A. Dubrovska et al. Proc Natl Acad Sci U S A.: 106, 268-273(2009)). 또한 암 줄기세포는 암의 발생은 물론 기존의 암 치료법이 적용된 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 시작, 재발이나 전이는 물론 항암제 내성에도 관여하여 암 치료에 핵심적인 역할을 한다는 것(BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery: 8, 806-823(2009))이 암 줄기세포 연구의 핵심이다. 따라서 암을 근본적으로 진단 및 치료하기 위해서는, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 하며, 암 줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 표지자 개발에도 도움이 될 것이다. 기존에 연구되어온 방식을 종양의 시작으로 여겨지는 암 줄기세포에 접목하여 암줄기세포가 가진 특징을 규명한다면 암 및 암줄기세포의 근원적 치료에 접근이 용이할 것이다.

현재, 선진국에서는 유방암(M. Al-Hajj et al., Proc Natl Acad Sci U S A.: 100(7), 3983-3988(2003)), 간암(ZF Yang et al., Cancer cell; 13, 153-166(2008)), 대장암(P. Dalerba et al., Proc Natl Acad Sci U S A.: 104(24), 10158-63(2007)), 췌장암(C. Li et al. Cancer Res: 67(3) 1030-1037(2007))등의 분야에서 이미 어느 정도의 암 줄기세포에 대한 정보들이 확보되어 있기 때문에, 이들 선진국의 방향과는 차별화 할 수 있는 장기 및 조직의 암 줄기세포에 대한 연구가 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟 및 췌장암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 단백질들이 췌장암 치료용 분자 타겟이 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 췌장암 암 줄기세포 생물학적 특성에 근거하여 췌장암을 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 암 줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟 및 췌장암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 췌장암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 단백질들이 췌장암 치료용 분자 타겟이 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 췌장암을 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.

본 발명은 췌장암 세포주로부터 분리된 췌장암 암 줄기세포로부터 특이적으로 발현하는 단백질을 동정하고 이들이 췌장암 치료 타겟이 될 수 있고, 췌장암을 조기에 매우 정확하게 진단 및 예후를 분석할 수 있는 특징을 가진다.

본 발명의 상기 2개 마커는 췌장암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현된다. 더욱이, 상기 2개 마커는 췌장암 세포와 췌장암 암 줄기세포를 구별할 수 있는 능력, 즉 췌장암 세포와 비교하여 췌장암 암 줄기세포에서 고발현되는 발현 패턴을 나타내는 마커이다.

본 발명에서 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 사용되는 표현“세포 또는 조직”은 암 줄기세포 또는 암 조직이며, 바람직하게는 췌장암 암 줄기세포 또는 췌장암 조직이다.

본 발명자들은 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 경우, 일반 췌장암세포와 달리 췌장암 암 줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 증가한다는 사실을 발견하였다. 일반 췌장암세포와는 달리 췌장암 암 줄기세포 내에서만 타겟 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 암 줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며, 이의 발현을 차단하는 물질은 암 줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 췌장암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질, 즉 췌장암 치료제로 판정된다.

상기 단계 (a)에서 사용되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew . Chem. Int . Ed . Engl . 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;

(b) 상기 단백질에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질과 시험 물질을 접촉시킨다.

본 발명에서 이용되는 단백질은 세포 표면에 전시(displaying)되어 있는 형태, 바이러스(예컨대, 박테리오파아지) 표면에 전시되어 있는 형태, 분리된(isolated) 형태 또는 정제된(purified) 형태일 수 있다.

세포 표면 또는 바이러스 표면에 전시되어 있는 단백질을 이용하는 경우, 스크리닝의 신속화 또는 자동화를 위하여 상기 세포 또는 바이러스는 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 또한, 분리된(isolated) 또는 정제된(purified) 형태의 단백질도 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 기질로서 이용가능 한 것은, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어, 폴리스틸렌과 폴리프로필렌과 같은 탄화수소 폴리머, 유리, 금속 및 젤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고상의 기질은 딥스틱, 마이크로타이터 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 면역블롯 막(예컨대, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막)의 형태로 제공될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,143,825호, 제5,374,530호, 제4,908,305호 및 제5,498,551호). 가장 바람직하게는, 상기 고상 기질은 마이크로타이터 플레이트이다.

본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 상기 단백질들은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.

검출가능한 표지가 레이블링된 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

택일적으로, 시험물질의 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 QP-C에 결합하는 지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 셀이 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 QP-C 사이의 결합에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다(McConnell et al., Science 257:19061912(1992)).

시험물질의 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다(Sjolander & Urbaniczky, Anal . Chem . 63:23382345(1991), and Szabo et al., Curr . Opin . Struct. Biol . 5:699705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore™). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법에 따라 실시할 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al., J. Biol . Chem . 268, 1204612054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 16931696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, 상기 단백질을 베이트(bait) 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, 상기 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드 시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL-4)의 DNA 결합 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질(“프레이” 또는 “시료”)을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 인 비보에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 분석 대상의 단백질이 상기 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 결론적으로 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.

본 발명에서 이용되는 시료는 상술한 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물 이외에, 펩타이드, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody, 미국 특허 제5,831,012호), 아비머(Avimer, Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23(12):1556(2005)) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain, Arnoux B et al., Acta Crystallogr . D Biol . Crystallogr . 58(Pt 7):12524(2002)), 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9(2):2618(2006))을 포함한다.

발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명에서 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 사용되는 표현세포 또는 조직은 암 줄기세포 또는 암 조직이며, 바람직하게는 췌장암 암 줄기세포 또는 췌장암 조직이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;

(b) 상기 단백질에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는 지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 또는 암 줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 암의 근본적인 치료를 가능하게 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

특히, 본 발명의 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트는 췌장암 암 줄기세포에 의해 유래되는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트이다.

본 명세서에서 표현 “췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 “췌장암(biliary duct cancer)”이란 췌장에 생긴 암세포로 이루어진 종괴를 의미한다. 췌장암은 다른 암에 비해 발생 빈도는 낮지만 조기 진단이 어렵고 주변 장기나 림프절로 전이가 잘 되어 예후가 평균적으로는 좋지 않다. 췌장암은 전체 소화기암의 3%를 차지하며 서구에서는 드물지만 우리나라를 비롯한 동아시아 지역은 췌장암의 호발 지역이다. 췌장암의 종류를 놓고 보면 간외췌장암은 전세계적으로 감소 추세이지만 간내췌장암은 증가하고 있다. 췌장암은 50-70세에서 호발하고 남자에서 더 잘 발생한다. 또한, 췌장에 발생하는 종양은 대부분 악성이며, 췌장 폐쇄로 인한 황달 때문에 진단되는 경우가 많다. 발병원인은 아직 불명확하며, 다만 담즙 속에 들어있는 발암성 물질이 췌장에 자극을 주어 발생한다는 보고가 있다.

본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 췌장암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 췌장암을 진단하는데 있어서 사용되는 표현 단백질 발현 분석은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 췌장암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 췌장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 췌장암 및/또는 췌장암 암 줄기세포를 진단하기 위하여 상기 단백질군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 각각 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)을 포함하며, 보다 바람직하게는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 (multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 췌장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 췌장암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립 (Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 췌장암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 20개의 마커로 구성된 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 췌장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 췌장암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 췌장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 췌장암 의심 환자의 실제 췌장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 췌장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 췌장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 췌장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 췌장조직 및 췌장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈청을 의미한다.

본 발명에서 췌장암을 진단하기 위하여 사용되는 표현폴리뉴클레오타이드 측정은 생물학적 시료에서 본원 발명의 단백질 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 마커로 사용되는 상기 단백질군으로부터 선택되는 각각의 단백질 마커를 코딩하는 염기서열은, 이들 서열과 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 mRNA의 단편을 의미한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

상기 암은 예를 들어, 췌장암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 표현 “췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 표현 “암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 췌장암 암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 암 줄기세포 및 암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 췌장암 또는 암 치료제 타겟은 췌장암 암 줄기세포 또는 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는데 매우 유용하다.

(ⅳ) 또한, 본 발명을 이용하면 췌장암 또는 암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

도 1은 인체 췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 세포를 배양하여 나타낸 그림이다.
도 2는 인체 췌장암 Hpac(human pancreatic adenocarcinoma) 스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Betaactin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 3은 인체 췌장암 Hpac 스피어 세포에서 암 줄기세포 표지자들의 발현을 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 인체 췌장암 세포에 줄기세포 신호차단 약물을 처리한 후 스피어 형성 확인 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 Hpac 스피어 세포를 누드마우스에 피하 주사하고 종양 크기 및 H&E 염색을 통한 병리조직학적 형태를 나타낸 그림이다.
도 6은 Hpac 부착 세포 및 스피어 세포에서 신규 표지자의 유전자들의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
Hpac 부착 세포 : HA, Hpac 스피어 : HS, Capan1 부착 세포 : CA, Capan1 스피어 : HS
도 7은 Hpac 부착 세포 및 스피어 세포에서 신규 표지자의 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 8은 Hpac 부착 세포 및 스피어 세포에서 세포막 단백질의 발현을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 인체 췌장암 조직에서 췌장암 암 줄기세포 관련 표지자의 발현을 면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
a) 췌장암 환자의 TMA(tissue microarray) 슬라이드에서 항-CDC42EP5 항체로 염색, b) 췌장암 환자의 조직 슬라이드(whole slide)에서 항-SLC6A20로 염색, c) 췌장암 환자의 TMA 슬라이드에서 항-SLC6A20로 염색

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

인체 췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 세포 분리 및 배양

인체 췌장암 세포주 8주(Hpac, Capan1, Capan2, Cfpac1, Aspc1, Bxpc3, Miapaca2, Panc1)는 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며, ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장 배지에서 배양하였다. AsPC-1 및 BxPC-3 세포는 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였고, Capan-1 및 CFPAC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 IMDM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Capan-2 세포는 10% FBS를 포함한 맥코이 5a(Invitrogen Gibco)에서, 그리고 MIA PaCa-2 세포는 10% FBS 및 2.5% 마혈청(Hyclone)을 포함하는 DMEM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Hpac 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM/햄 F12(D/F12; Invitrogen Gibco), PANC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 스피어 세포 배양을 위하여 췌장암 세포주들을 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 DMEM/F12 배지에 1000 세포/㎖의 비율로 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7-10일 동안 배양하였다. 같은 배양액으로 배양 접시(Nalgene Nunc Int., Rochester, NY)에 부착시켜 부착(adherent) 상태에서 키운 세포를 대조군으로 하였다.

스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 폴리뉴클레오타이드 측정

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 Hpac 부착 및 스피어 세포의 총 RNA를 추출하였다. Superscript II(Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석하였고, 베타 액틴(Beta actin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머 염기 서열, PCR 반응 온도 및 싸이클수는 하기 표 2에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	Tm/사이클
Jagged 1	CTCAATTACTGTGGGACTCATCA	GAACACTCACACTCAAAGCCC	52℃/30
Notch3	ATGGTGGGAACTAAACACAGCT	ATGACCCTGGAGGAAGCACA	55℃/35
Hes1	GTGCTGTCTGGATGCGGAGT	GAACACTCACACTCAAAGCCC	55℃/35
Ihh	CCTGAACTCGCTGGCTATCT	AATACACCCAGTCAAAGCCG	56℃/35
PTCH	GCAGTGGTGAGAGAAAAGGA	CTCGGATTGGTGACCATAAG	59℃/30
Gli1	AGAGTCCAGGGGGTTACATA	AGAGTCCAGGGGGTTACATA	57℃/35
Wnt4	CTCCTCGTCTTCGCCGTCTT	TACTGGCACTCCTCAATGGA	62℃/40
Dvl2	GGTTGGGGAGACGAAGGTGATT	ATCTGAGGACACCAGCCAGGATAC	58℃/30
Lef1	CGAAGAGGAAGGCGATTTAG	GGATGGGTGGAGAAAGAGAT	62℃/40
Oct4	GTGGAGGAAGCTGACAACAA	AGCAGCCTCAAAATCCTCTC	62℃/27
Nanog	ACTGTCTCTCCTCTTCCTTCCT	AGAGTAAAGGCTGGGGTAGGTA	61℃/30
Stat3	GTCTGGCTGGACAATATCAT	TTGGGAATGTCAGGATAGAG	56℃/30
ABCG2	TATGAGTGGCTTATCCTGCT	CACTGATCCTTCCATCTTGT	56℃/30
PTEN	GGACGAACTGGTGTAATGAT	CAGACCACAAACTGAGGATT	56℃/30
Beta-actin	GGCATCCTCACCCTGAAGTA	GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA	55℃/25

스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 표지자들의 발현 분석

Hpac 세포로부터 부착 및 스피어 세포 배양을 한 후, 아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 부착 및 스피어 세포를 암 줄기세포 표지자 항체로 염색하였으며, FITC-CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-PROM2(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-EphA2(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD130(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD271(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD133(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 PE-CD117(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)을 각각의 표지자 항체로 이용하였다. 유세포 분석은 BD LSR II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실시하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어를 통하여 분석하였다.

줄기세포 신호 차단 약물에 의한 스피어 세포 형성 억제

줄기세포 신호 차단 약물인 DAPT(Calbiochem, San Diego, CA, USA), Cyclopamine-KAAD(Calbiochem, San Diego, CA, USA), LiCl(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), ATRA(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), OV(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)를 배양액에 첨가하여 스피어 세포 배양을 하고, 7일 후 스피어 세포 형성 억제여부를 확인하였다.

Hpac 스피어 세포의 암화능력 확인

인체 췌장암 세포주 Hpac으로부터 배양된 부착 및 스피어 세포를 0.25 % 트립신 EDTA(Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 처리하여 동일한 수의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, NOD-SCID 면역제어 마우스(Charles River, Japan)의 췌장에 직접 in situ 이식하여 부착 세포와 스피어 세포간의 종양 형성 능력을 관찰하였다.

cDNA microarray 를 통한 췌장암 암줄기세포 신규 표지자 후보물질 확보

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 제조사 표준 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭 분광기(NanoDrop Technologies, Inc., DE)를 사용하여 정량 분석하고, Agilent 2100 생분석기(Agilent Technologies, Santa Clare, CA)에 의해 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. 마이크로어레이 실험 절차는 제조사 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 디지털 제노믹스(Seoul, Korea)에서 cDNA마이크로어레이 분석을 수행하였다. 간략히 정리하면, 각각의 총 RNA 6 ㎍ 분량을 사용하여 이중사 cDNA를 준비하고, 비오틴-표지(IVT 라벨링 키트; Affymetrix)를 하여 증폭하였다. 상기 표지된 cDNA를 조각내어 AffymetrixGeneChip 인간 지놈 U133 플러스 2.0 고농도 올리고뉴클레오타이드어레이(Affymatrix, Santa Clara, CA)에 혼성화시켰다. 그 다음 마이크로어레이를 Genechip Fluidics 스테이션 450(Affymetrix)으로 세척하고 Genechip어레이 스캐너 3000 7G(Affymetrix)를 사용하여 스캔하였다. Affymetrix 발현 Console 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 발현 데이터를 생성시키고, 이를 MAS5 알고리즘 표준화하였다. raw .cel 파일 내 발현 강도 데이터는 MAS5 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. 적어도 하나의 샘플 군 내 50%가 넘는 샘플에서, MAS5 탐지 콜에 의할 때 프레즌트 콜이 아닌 프로브 세트는 걸러내었다. 두 그룹 간에 다르게 발현하는 유전자를 결정하기 위하여 MASS 발현 값에 대하여 짝지은 t-테스트를 수행하였고, 1.5배가 넘는 차이를 보이는 유전자를 고려하였다. 모든 개별적인 칩 분석은 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 2회 반복 수행하였다.

스피어 세포에서의 신규 표지자 후보물질 폴리뉴클레오타이드 측정

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 Hpac 부착 및 스피어 세포의 총 RNA를 추출하였다. Superscript II(Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석하였고, 베타 액틴(Beta actin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머 염기 서열, PCR 반응 온도 및 싸이클수는 하기 표 3에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	Tm/사이클
CDC42EP5	GCTTTTCCACCACTGCTTTC	CTTCAGCACGGGCATCTC	55℃/30
Beta-actin	GGCATCCTCACCCTGAAGTA	GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA	55℃/25

스피어 세포에서 웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 췌장암 줄기세포 관련 단백질 발현 분석

췌장암 줄기세포 관련 단백질의 발현을 분석하기 위해 Hpac 및 Capan 1의 부착 및 스피어 세포를 배양한 후 세포만을 수집하였다. Lysis buffer를 이용하여 세포막을 제거하고 총 단백질을 모아서 단백질 정량에 의해 25 ㎍씩 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩(loading)한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인(Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에 1시간 동안 블록킹하였다. 그 다음, 각각의 멤브레인을 1차 항체와 4℃에서 12시간 반응시켰다. 1차 항체는 래빗 폴리클로날 CDC42EP5(abcam, Abcam Ltd, UK), 래빗 폴리클로날 SLC6A20(Sigma, St. Louis, MO)을 사용하였고 대조군으로 마우스 모노클로날 GAPDH(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 을 사용하였다. 1차 항체와 반응한 각각의 멤브레인을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)-콘쥬게이티드 2차 항체(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 단백질을 Enhanced chemiluminescence system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다.

스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 표지자들의 발현 분석

Hpac 세포로부터 부착 및 스피어 세포를 배양한 후, 아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 부착 및 스피어 세포를 암 줄기세포 표지자 항체 CDC42EP5(abcam, Abcam Ltd, UK)로 1차 염색하였으며, Rabbit-PE(santa cruz)을 이용하여 2차 염색하였다. 유세포 분석은 BD LSR II(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실시하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어를 통하여 분석하였다.

면역조직 화학염색을 통한 인체 췌장암 조직에서의 췌장암 암줄기세포 관련 단백질들의 발현 분석

췌장 조직 슬라이드를 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 4분 동안 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 1: 100으로 희석하여 반응시킨 1차 항체는 래빗 폴리클로날 CDC42EP5(abcam, Abcam Ltd, UK), 래빗 폴리클로날 SLC6A20(Sigma, St. Louis, MO)이다. 블록화된 섹션을 1차 항체와 4℃에서 12시간 배양시켰다. 그 이후의 반응은 Envision 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA)에 포함된 권장 과정을 이용하여 실시하였다. 마지막으로, 슬라이드를 3,3’-디아미노벤지딘(3,3’-diaminobenzidine; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다. 염색의 강도는 각각 음성, 약한, 중간 및 강한 갈색 염색의 존재에 해당하는 -, +, ++ 및 +++로 평가하였다.

췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 세포 분리 및 배양

췌장암 세포주 8주(Hpac, Capan1, Capan2, Cfpac1, Aspc1, Bxpc3, Miapaca2, Panc1) 모두 ATCC(USA)로부터 분양 받았으며, ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 배양하였다. 스피어 세포 배양을 위하여 췌장암 세포주들을 스피어 세포 배양액 (Serum free media, 0.5% BSA, 1X ITS, 10 ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF)에 1000 cells /ml의 농도로 6 well ultra low attachment plate(Corning)에 분주하여 7-10일간 배양하였으며, 같은 배양액으로 부착 상태에서 키운 세포를 대조군으로 하였다. 암 줄기세포의 특성을 나타내는 스피어 세포 형성 유무를 확인한 결과, 총 8종의 췌장암 세포주 중 Hpac, Capan1 및 Capan2 세포주에서 스피어 세포가 형성됨을 확인하였고, 그 중 Hpac 및 Capan1을 선택하여 후속 실험을 진행하였다.

스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 폴리뉴클레오타이드 분석

췌장암 세포주의 부착 세포에 비해 스피어 세포에서 Notch, Hedgehog 및 Wnt 등 줄기세포 관련 신호전달 체계가 활성화 되어 있는 것을 RT-PCR로 확인하였다. 발생초기에 증가하는 것으로 알려진 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 Oct4, Nanog 및 Stat3 등 유전자의 발현도 증가되어 있었으며, 이외에도 ABCG2 및 PTEN 등 암 줄기세포의 표지자의 발현도 증가함을 확인하였다.

스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 표지자들의 발현 분석

유세포 분석을 통하여 기존에 알려진 암 줄기세포 표지자들의 발현을 Hpac-스피어 세포에서 확인한 결과 CD44, PROM2, EphA2, CD130 및 CD271이 증가되어 있었다(도 3).

췌장암 줄기세포 관련 표지자 항체에 의한 암 줄기세포 형성능력 억제

췌장암 세포주의 스피어 세포에서 이미 줄기세포 관련 유전자로 잘 알려진 Notch, Hedgehog 및 Wnt의 신호전달 체계가 활성화 되어 있으며 발생초기에 증가하는 것으로 알려진 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 Oct4, Nanog 및 Stat3의 유전자 발현도 증가되어 있음이 확인되었다(도 2). 도 2의 결과를 토대로 Notch inhibitor-DAPT, Hedgehog inhibitor-KAAD, GSK3 beta inhibitor-LiCl, Oct4 inhibitor-ATRA 및 Nanog inhibitor-OV 등 줄기세포 신호 체계를 차단하는 억제제들을 스피어 세포에 처리한 결과 이들 약물에 의해 스피어의 형성 능력이 완전히 억제되거나 감소하는 것을 확인하였다(도 4).

Hpac 스피어 세포의 암화능력 확인

인체 췌장암 세포주 Hpac로부터 스피어 세포 배양을 통해 형성한 Hpac-스피어 세포를 NOD/SCID 마우스의 췌장에 in situ 이식(implant)하여 종양형성 능력을 비교하였을 때 Hpac 세포에 비해 암 줄기세포의 특성을 지니는 Hpac-스피어 세포를 이식한 그룹에서 암 형성능력이 높게 나타났고, 폐와 복막 등 기관 및 조직으로의 전이가 관찰 되었다 (도 5).

신규 암 줄기세포 표지자 규명을 위한 암 줄기세포 유전자 데이터베이스 구축

스피어 세포가 암 줄기세포와 관련된 유전자 및 표지자들을 발현하고 있으며, 암화능력이 증가되어 있는 결과(도 1-5)들을 토대로, 췌장암에서 신규 암 줄기세포 표지자를 규명하기 위하여 Affymetrix HG-U133 plus 2.0 Gene chip으로 microarray를 진행하였다. 췌장암 세포주로부터 분리 배양한 스피어 세포와 대조군인 부착 세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA 합성 후 microarray 실험을 수행하였고, 두 번의 반복실험에서 공통적인 변화를 보이는 유전자를 우선 선정하였다. 이 중 스피어 세포에서 1.5배 이상 증가한 유전자들을 선택하였다. 또한 본 연구의 목적이 치료용 신규 암 줄기세포 표지자의 발굴이기에 세포 표면 표지자 관련 유전자를 중점적으로 선별하였다. 1.5배 이상 증가한 후보물질 중에서 CDC42EP5 및 SLC6A20이 가능성이 있다고 판단하였다.

RT - PCR 을 통한 췌장암 암 줄기세포 신규 표지자의 폴리뉴클레오타이드 분석

췌장암 암줄기세포 표지자로서의 증명실험으로 먼저 RT-PCR에 의해 mRNA 발현을 확인하였다. 각각 유전자들의 발현은 췌장암 세포주 Hpac 및 CAPAN1의 스피어 세포에서 부착 세포를 대조군으로 확인하였을 때 CDC42EP5 유전자의 발현이 부착 세포 대비 스피어 세포에서 증가되어 있음을 확인하였다(도 6).

웨스턴블랏을 통한 췌장암 암 줄기세포 신규 표지자의 단백질 발현 분석

웨스턴 블랏을 이용하여 Hpac 및 Capan1으로부터 유도된 부착 및 스피어 세포를 모아서 전체 단백질을 추출하여 CDC42EP5 및 SLC6A20의 증가여부를 확인한 결과 부착 세포 대비 스피어 세포에서 증가한 것을 확인하였다(도 7).

Indirect 유세포분석을 통한 세포 표면 발현 분석

부착 세포 대비 스피어 세포에서 췌장암 암 줄기세포 신규 표지자의 발현 증가여부를 확인하기 위하여 indirect 유세포분석을 실시하였다. 유세포 분석용의 상용화된 항체가 존재하지 않으므로 1차 항체를 반응시킨 후, PE가 접합(conjugation)된 2차 항체를 결합시키는 방법을 통하여 세포 표면의 단백질 발현을 확인하였다. 췌장암 세포주 Hpac의 부착 세포를 대조군으로 하였을 때, 스피어 세포에서 CDC42EP5 단백질이 세포 표면 발현이 증가되어 있음을 확인하였다(부착 세포 4.6%, 스피어 세포 13.2%)(도 8).

인체 췌장암 조직에서 암 줄기세포 관련 표지자들의 발현 분석

인체 췌장암 조직에서 암 줄기세포 관련 단백질인 CDC42EP5에 대한 발현을 검증하기 위하여 총 33명의 췌장암(Pancreatic cancer) 환자 샘플이 있는 TMA (tissue microarray)를 제작 후 면역조직 화학 염색법(Immunohistochemistry)을 수행하였다(도 9). CDC42EP5의 경우 관찰 가능한 총 33명의 TMA 슬라이드에서 췌장암 환자 54.5%(18예)의 암조직에서 발현되었고(도 9a), SLC6A20 의 경우 관찰 가능한 총 33명의 TMA 슬라이드에서 췌장암 환자 51.5%(17예)의 암조직에서 발현되었다(도 9c). 췌장암 환자의 조직에서(whole slide) 관찰하였을 때 비교적 정상인 부분보다는 암세포에서 염색되는 것을 관찰 할 수 있다(도 9b). 췌장암 줄기세포 관련 세포 표면 단백질의 발현을 췌장암 환자 조직에서 검증한 결과, 정상 췌장 조직에서는 거의 발현을 하지 않는 반면 췌장염 조직, 췌장암 조직 및 전이가 일어난 림프조직에서 발현하는 것을 관찰할 수 있었고, 이는 이들 신규 세포 표면 단백질들이 췌장암 암화과정에 관여 가능성을 보여주는 것으로 사료된다. 도 6-9의 mRNA, 단백질, 스피어형성 억제 및 면역염색 등의 in vitro 실험 결과들은 본 발명에서 발굴한 CDC42EP5 및 SLC6A20이 췌장암 줄기세포 관련 타겟 항원의 가능성을 가지고 있음을 나타낸다고 할 수 있다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> PN110425 <130> PN110425 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 148 <212> PRT <213> CDC42EP5 human protein <400> 1 Met Pro Val Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Gln Pro Lys Lys Arg Pro 1 5 10 15 Asp Arg Gly Ala Leu Ser Ile Ser Ala Pro Leu Gly Asp Phe Arg His 20 25 30 Thr Leu His Val Gly Arg Gly Gly Asp Ala Phe Gly Asp Thr Ser Phe 35 40 45 Leu Ser Arg His Gly Gly Gly Pro Pro Pro Glu Pro Arg Ala Pro Pro 50 55 60 Ala Gly Ala Pro Arg Ser Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Ala 65 70 75 80 Ala Pro Ser Pro Ala Asp Pro Leu Leu Ser Phe His Leu Asp Leu Gly 85 90 95 Pro Ser Met Leu Asp Ala Val Leu Gly Val Met Asp Ala Ala Arg Pro 100 105 110 Glu Ala Ala Ala Ala Lys Pro Asp Ala Glu Pro Arg Pro Gly Thr Gln 115 120 125 Pro Pro Gln Ala Arg Cys Arg Pro Asn Ala Asp Leu Glu Leu Asn Asp 130 135 140 Val Ile Gly Leu 145 <210> 2 <211> 917 <212> DNA <213> CDC42EP5 human nucleotide <220> <221> gene <222> (1)..(917) <220> <221> CDS <222> (354)..(797) <400> 2 ccgcccccac actccgccca gaggggcctc agcttttcca ccactgcttt ctagtccttt 60 aactcctaga ggcaaacttt tgggggataa gaaagcctgg gaggggcctg tgccaaaacc 120 ctctctgcct ggggactggg cggtgattcc gcttctgcct gggctcctgc catggccccc 180 gagaggggct gacactttag ctcccggtgc aggtgagaac ccgcccggag gaagaaggaa 240 ggcgcgggcc ggggattagg agacggaggc ggactcggag ccagggaacc aggggtccgg 300 gctagagctg gagtcgtgag cgcgcgcccg ccccgctctg ggaggaccgc gag 353 atg ccc gtg ctg aag cag ctg ggc ccc gcg cag ccc aag aag cgg cct 401 Met Pro Val Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Gln Pro Lys Lys Arg Pro 1 5 10 15 gat cgc ggc gcc ctg tcc atc tcc gcg ccg ctc ggc gac ttc cgg cac 449 Asp Arg Gly Ala Leu Ser Ile Ser Ala Pro Leu Gly Asp Phe Arg His 20 25 30 acg ctg cac gtg ggg cgc ggc ggc gac gcc ttc ggg gac acc tcg ttc 497 Thr Leu His Val Gly Arg Gly Gly Asp Ala Phe Gly Asp Thr Ser Phe 35 40 45 ctg agc cgc cac ggc ggc ggg ccg ccc ccc gag ccc cgg gcg ccc ccc 545 Leu Ser Arg His Gly Gly Gly Pro Pro Pro Glu Pro Arg Ala Pro Pro 50 55 60 gcg ggg gcc ccg cgc tcc ccg ccg ccg ccc gcc gtc ccg cag tcc gca 593 Ala Gly Ala Pro Arg Ser Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Ala 65 70 75 80 gcg ccc tcg cct gcc gac ccg ctg ctg tcc ttc cac ctg gat ctg ggg 641 Ala Pro Ser Pro Ala Asp Pro Leu Leu Ser Phe His Leu Asp Leu Gly 85 90 95 ccc tcc atg ctg gac gcg gtg ctg ggc gtc atg gac gcg gcg cgc ccg 689 Pro Ser Met Leu Asp Ala Val Leu Gly Val Met Asp Ala Ala Arg Pro 100 105 110 gag gcg gct gcc gcc aag ccc gac gcg gaa ccc cgc ccc ggg acg cag 737 Glu Ala Ala Ala Ala Lys Pro Asp Ala Glu Pro Arg Pro Gly Thr Gln 115 120 125 ccc ccc cag gcc cgc tgc cgc ccc aac gcg gac ctc gag ctg aac gac 785 Pro Pro Gln Ala Arg Cys Arg Pro Asn Ala Asp Leu Glu Leu Asn Asp 130 135 140 gtc atc ggc ctc tag gttccctcat tccccgcgcc cttcccgccc ggcaccccac 840 Val Ile Gly Leu 145 ttctgtatac ataaacggcc aaggtgtgtg cccggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaa 917 <210> 3 <211> 547 <212> PRT <213> SLC6A20 human protein <400> 3 Met Glu Lys Ala Arg Pro Leu Trp Ala Asn Ser Leu Gln Phe Val Phe 1 5 10 15 Ala Cys Ile Ser Tyr Ala Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro 20 25 30 Tyr Leu Cys Gln Met Tyr Gly Gly Gly Ser Phe Leu Val Pro Tyr Ile 35 40 45 Ile Met Leu Ile Val Glu Gly Met Pro Leu Leu Tyr Leu Glu Leu Ala 50 55 60 Val Gly Gln Arg Met Arg Gln Gly Ser Ile Gly Ala Trp Arg Thr Ile 65 70 75 80 Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Val Gly Val Ala Ser Val Val Val Ser Phe 85 90 95 Phe Leu Ser Met Tyr Tyr Asn Val Ile Asn Ala Trp Ala Phe Trp Tyr 100 105 110 Leu Phe His Ser Phe Gln Asp Pro Leu Pro Trp Ser Val Cys Pro Leu 115 120 125 Asn Gly Asn His Thr Gly Tyr Asp Glu Glu Cys Glu Lys Ala Ser Ser 130 135 140 Thr Gln Tyr Phe Trp Tyr Arg Lys Thr Leu Asn Ile Ser Pro Ser Leu 145 150 155 160 Gln Glu Asn Gly Gly Val Gln Trp Glu Pro Ala Leu Cys Leu Leu Leu 165 170 175 Ala Trp Leu Val Val Tyr Leu Cys Ile Leu Arg Gly Thr Glu Ser Thr 180 185 190 Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Ser Leu Pro Tyr Cys Val Leu Ile 195 200 205 Ile Tyr Leu Ile Arg Gly Leu Thr Leu His Gly Ala Thr Asn Gly Leu 210 215 220 Met Tyr Met Phe Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ala Asn Pro Lys Ala 225 230 235 240 Trp Ile Asn Ala Ala Thr Gln Ile Phe Phe Ser Leu Gly Leu Gly Phe 245 250 255 Gly Ser Leu Ile Ala Phe Ala Ser Tyr Asn Glu Pro Ser Asn Asn Cys 260 265 270 Gln Lys His Ala Ile Ile Val Ser Leu Ile Asn Ser Phe Thr Ser Ile 275 280 285 Phe Ala Ser Ile Val Thr Phe Ser Ile Tyr Gly Phe Lys Ala Thr Phe 290 295 300 Asn Tyr Glu Asn Cys Leu Lys Lys Val Ser Leu Leu Leu Thr Asn Thr 305 310 315 320 Phe Asp Leu Glu Asp Gly Phe Leu Thr Ala Ser Asn Leu Glu Gln Val 325 330 335 Lys Gly Tyr Leu Ala Ser Ala Tyr Pro Ser Lys Tyr Ser Glu Met Phe 340 345 350 Pro Gln Ile Lys Asn Cys Ser Leu Glu Ser Glu Leu Asp Thr Ala Val 355 360 365 Gln Gly Thr Gly Leu Ala Phe Ile Val Tyr Thr Glu Ala Ile Lys Asn 370 375 380 Met Glu Val Ser Gln Leu Trp Ser Val Leu Tyr Phe Phe Met Leu Leu 385 390 395 400 Met Leu Gly Ile Gly Ser Met Leu Gly Asn Thr Ala Ala Ile Leu Thr 405 410 415 Pro Leu Thr Asp Ser Lys Ile Ile Ser Ser His Leu Pro Lys Glu Ala 420 425 430 Ile Ser Gly Leu Val Cys Leu Val Asn Cys Ala Ile Gly Met Val Phe 435 440 445 Thr Met Glu Ala Gly Asn Tyr Trp Phe Asp Ile Phe Asn Asp Tyr Ala 450 455 460 Ala Thr Leu Ser Leu Leu Leu Ile Val Leu Val Glu Thr Ile Ala Val 465 470 475 480 Cys Tyr Val Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Glu Ser Asp Leu Lys Ala Met 485 490 495 Thr Gly Arg Ala Val Ser Trp Tyr Trp Lys Val Met Trp Ala Gly Val 500 505 510 Ser Pro Leu Leu Ile Val Ser Leu Phe Val Phe Tyr Leu Ser Asp Tyr 515 520 525 Ile Leu Thr Gly Thr Leu Lys Tyr Gln Ala Trp Asp Ala Ser Gln Asp 530 535 540 Asp Lys Leu 545 <210> 4 <211> 2662 <212> DNA <213> SLC6A20 human nucleotide <220> <221> gene <222> (1)..(2662) <220> <221> CDS <222> (65)..(1705) <400> 4 accgcgcact gagactgccg tgccggaccc ccgagccgga gccgagcgcg ccgaggccgg 60 ggcc atg gag aaa gcg cgg ccg ctg tgg gcc aac tcg cta cag ttc 106 Met Glu Lys Ala Arg Pro Leu Trp Ala Asn Ser Leu Gln Phe 1 5 10 gtg ttc gcc tgc atc tcg tac gcc gtg ggc ctg ggc aac gtg tgg cga 154 Val Phe Ala Cys Ile Ser Tyr Ala Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg 15 20 25 30 ttc ccg tac ctg tgc cag atg tac ggc gga ggt agt ttc ctg gtc ccc 202 Phe Pro Tyr Leu Cys Gln Met Tyr Gly Gly Gly Ser Phe Leu Val Pro 35 40 45 tac atc atc atg ctt atc gtg gag gga atg ccg ctc ttg tac ctg gaa 250 Tyr Ile Ile Met Leu Ile Val Glu Gly Met Pro Leu Leu Tyr Leu Glu 50 55 60 ctg gct gtg ggg cag cgc atg cgg cag ggc agc atc ggc gcc tgg agg 298 Leu Ala Val Gly Gln Arg Met Arg Gln Gly Ser Ile Gly Ala Trp Arg 65 70 75 acc atc agc ccg tac ctc agt ggt gtc ggg gtc gcc agc gtg gtg gtc 346 Thr Ile Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Val Gly Val Ala Ser Val Val Val 80 85 90 tct ttc ttc ctc tcc atg tac tac aac gtc atc aac gcc tgg gcc ttc 394 Ser Phe Phe Leu Ser Met Tyr Tyr Asn Val Ile Asn Ala Trp Ala Phe 95 100 105 110 tgg tac ctc ttc cac tcc ttc cag gat ccc ctg ccg tgg tct gtc tgc 442 Trp Tyr Leu Phe His Ser Phe Gln Asp Pro Leu Pro Trp Ser Val Cys 115 120 125 cca ctg aat ggt aac cac acg ggc tac gat gag gag tgc gag aag gcg 490 Pro Leu Asn Gly Asn His Thr Gly Tyr Asp Glu Glu Cys Glu Lys Ala 130 135 140 tcc tcc aca cag tac ttc tgg tac agg aaa acc ctc aat atc tcg ccg 538 Ser Ser Thr Gln Tyr Phe Trp Tyr Arg Lys Thr Leu Asn Ile Ser Pro 145 150 155 tcc ctc cag gag aac ggg ggt gtg cag tgg gag ccg gcg ctg tgc ctc 586 Ser Leu Gln Glu Asn Gly Gly Val Gln Trp Glu Pro Ala Leu Cys Leu 160 165 170 ctc ctg gcc tgg ctg gtg gtg tac ctg tgc atc ctg cgt ggc acc gag 634 Leu Leu Ala Trp Leu Val Val Tyr Leu Cys Ile Leu Arg Gly Thr Glu 175 180 185 190 tcc act ggc aag gtg gtg tat ttc acg gcg tca ctg ccc tat tgc gtg 682 Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Ser Leu Pro Tyr Cys Val 195 200 205 ctc atc atc tac ctc atc agg ggc ctc acg ctc cac gga gcc acc aat 730 Leu Ile Ile Tyr Leu Ile Arg Gly Leu Thr Leu His Gly Ala Thr Asn 210 215 220 ggc ctc atg tac atg ttc act ccc aag ata gag cag ctg gcc aac ccc 778 Gly Leu Met Tyr Met Phe Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ala Asn Pro 225 230 235 aag gcc tgg atc aat gca gcc acc cag atc ttc ttc tca ctt ggc ctg 826 Lys Ala Trp Ile Asn Ala Ala Thr Gln Ile Phe Phe Ser Leu Gly Leu 240 245 250 ggc ttc ggc agc ctg atc gcc ttc gcc agc tac aat gag cca tcc aac 874 Gly Phe Gly Ser Leu Ile Ala Phe Ala Ser Tyr Asn Glu Pro Ser Asn 255 260 265 270 aac tgc cag aag cac gcc atc atc gtg tcc ctc atc aac agc ttc acc 922 Asn Cys Gln Lys His Ala Ile Ile Val Ser Leu Ile Asn Ser Phe Thr 275 280 285 tcc ata ttt gcc agc att gtc acc ttc tcc atc tat ggc ttc aag gcc 970 Ser Ile Phe Ala Ser Ile Val Thr Phe Ser Ile Tyr Gly Phe Lys Ala 290 295 300 acc ttc aat tat gaa aac tgc ttg aag aag gtg agt ctg ctg ctg acc 1018 Thr Phe Asn Tyr Glu Asn Cys Leu Lys Lys Val Ser Leu Leu Leu Thr 305 310 315 aac act ttt gac ctt gaa gat ggc ttt ttg aca gcc agc aac ctg gag 1066 Asn Thr Phe Asp Leu Glu Asp Gly Phe Leu Thr Ala Ser Asn Leu Glu 320 325 330 cag gtg aag ggc tac ctc gca tct gcc tac cca agc aaa tac agc gag 1114 Gln Val Lys Gly Tyr Leu Ala Ser Ala Tyr Pro Ser Lys Tyr Ser Glu 335 340 345 350 atg ttc ccg caa atc aaa aac tgc agc ttg gaa tcg gag cta gac 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gtg ctg gtg gag acg att 1498 Tyr Ala Ala Thr Leu Ser Leu Leu Leu Ile Val Leu Val Glu Thr Ile 465 470 475 gcc gtg tgc tac gtg tac ggg ctg agg aga ttt gaa agt gac ctt aag 1546 Ala Val Cys Tyr Val Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Glu Ser Asp Leu Lys 480 485 490 gcc atg acc ggc cga gct gtg agc tgg tac tgg aag gtg atg tgg gct 1594 Ala Met Thr Gly Arg Ala Val Ser Trp Tyr Trp Lys Val Met Trp Ala 495 500 505 510 ggc gta agc cca ctg ctg att gtc agc ctc ttt gtc ttc tac ctg agc 1642 Gly Val Ser Pro Leu Leu Ile Val Ser Leu Phe Val Phe Tyr Leu Ser 515 520 525 gac tac atc ctc acg ggg acc ctg aag tat caa gcc tgg gac gcc tcc 1690 Asp Tyr Ile Leu Thr Gly Thr Leu Lys Tyr Gln Ala Trp Asp Ala Ser 530 535 540 cag gat gac aag tta taaag aaagaagatc tttgtctggg acccccaaag 1740 Gln Asp Asp Lys Leu 545 ggatcctttc tctaaggtct ctgacagtgg gtccaggacc agacctctct acaaaaaatt 1800 gccccaacta cagtttgcaa ccccaaacca cattagaagt ctgtgcagac atccctccgt 1860 ggtgtgtgtc ttggtgcatt ggaaaaggag tcaggagcca ctgtgagtag gtcgttaccc 1920 ctaaagtgag cgagtccctt cctgctctaa cgtccagtgc ttccttgaga tcatggaatt 1980 ctggagagtt tctgtggata tatttgcaca gatatctttg aagacacaaa cactcacctg 2040 ggacgttggc cggagatgtc tttttatttt tgtgctgtaa aattctctta cagcaaaaat 2100 aggctttaga aaggtcttct actgtcttca gcaaccatct catcttccag cttcacctga 2160 ttgtccagtt atcatacatt tgactttcaa atgtatgaac cagcatgtac cccatggatt 2220 taatcttatc taccccgtgg attcaatctt cttatcagaa ggttctttta tgtcaaaaaa 2280 cctgctgtca aggcttgaag agccggcaca ctcaatggca aacacagcac cgagtctgct 2340 ctgaatcctg gaggatctgg ccctcctctc aacccccact cacagtcacc gtcttacaac 2400 tcagggccac ctgggatcag tcatcagtca gggtgcgtaa gccttgaata ccaggtagcc 2460 tcaggagtga aaagataaat gtcctagatc attaccttat tcagtgtccc caccttgcag 2520 cgcattccaa ccacctggga gcatttaaaa ctccagatgc ccacaccaca ccctggggcc 2580 acccatcaga ccttctggaa gcaagacctg ggcctccatg gccccaaaaa ctccctaggt 2640 gatccgatgt gcagccaaat ct 2662

Claims (11)

1. 다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
2. 다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;
   (b) 상기 단백질에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
3. 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
4. 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;
   (b) 상기 단백질에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
5. 제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 세포 표면 또는 바이러스 표면에 존재하거나, 또는 분리된 형태(isolated form)로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트.
   
7. 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 줄기세포 검출용 키트.
   
8. 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
9. 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
    
11. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 또는 마이크로어레이용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
    

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