KR20100128326A - 암 치료 및 진단을 위한 표적 유전자인 ｃ2ｏｒｆ18 - Google Patents

암 치료 및 진단을 위한 표적 유전자인 ｃ2ｏｒｆ18 Download PDF

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KR20100128326A
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유스케 나카무라
히데와키 나카가와
슈이치 나카츠루
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 암, 특히 췌장암이 발달하는 경향을 검출 또는 진단하는 방법에 관한 것이다. 한가지 실시예에서, 상기 진단 방법은 항-C2orf18 항체를 이용하여 C2orf18의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 암, 예를 들면 췌장암과 같은 C2orf18 관련 질환의 치료에 유용한 치료제를 스크리닝하는 방법, 세포 성장 및 이들의 증상을 치료 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 벡터와 같은 물질, 이중 가닥 분자, 항체 및 이들로 구성된 조성물을 특징으로 한다.

Description

암 치료 및 진단을 위한 표적 유전자인 Ｃ2ＯＲＦ18{C2ORF18 as target gene cancer therapy and diagnosis}
우선권
본 발명의 청구범위는 2008년 3월 12일에 제출된 미국의 가출원 제 61/036,035를 근거로 우선권을 주장하고, 상기 내용은 본 발명에 그 전체가 참조로서 통합된다.
기술분야
본 발명은 암, 특히 췌장암의 발명의 존재 또는 경향을 검출 및 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암, 특히 췌장암의 예방 및 치료의 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암에서 구체적으로 업-레귤레이터(상향조절)되는 유전자인 C2ORF18, 및 암을 위한 치료 표적 및 진단 마터로서 이의 용도에 관한 것이다.
암은 죽음의 주된 원인이고 세계에서 매년 수백만의 사람들이 암으로 죽는다. 특히, 췌장암은 악성종양 중에서 가장 높은 사망률을 나타내는 것 중에 하나이며, 환자의 5년 생존율은 4%이다. 대략 28,000 환자들이 매년 췌장암을 진단받고, 거의 모든 환자들은 상기 병으로 사망한다(Greenlee, R. T., et al., (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36). 이러한 악성종양은 낮은 예후로 인해 조기진단의 어려움 및 현재의 치료법에서 좋지 못한 치료에 결과를 가져온다.(Greenlee, R. T., et al. (2001) CA Cancer J Clin, Ji: 15-36, Klinkenbijl, J. H., et al. (1999) Ann Surg, 230: 776-82; discussion 782-4.).
췌장 관 선암종(PDAC)은 서구에서 암 사망의 4번째의 주된 원인이며 환자의 5년 생존율이 오직 5%인 흔한 악성 종양 중 가장 높은 사망률을 보이는 것 중에 하나이다(DiMagno EP, et al. Gastroenterology. 1999 Dec;117(6):1464-84.1, Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2). 대략 37,170명의 새로운 환자들이 2007년 췌장암을 진단받을 것이고, 미국에서 거의 33,370명이 상기 병으로 죽을 것이다(Jemal A, et al. CA Cancer J Clin. 2007 Jan-Feb;57(1):43-66.3). 현재 PDACs를 위한 치료법은 오직 외과적 절제술뿐이다. 그러나 PDAC 환자의 대다수는 매우 늦은 수준에서 진단받기 때문에 오직 환자의 15% - 20%만이 진단 당시에 외과적 수술을 받을 수 있는 가능성이 있다. 가능성 있는 치료적 수술을 겪은 대부분의 환자는 결국 재발하거나 상기 병으로 인해 죽는다(Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2). 몇몇 방법은 방사선치료와 함께 또는 없이 잼사이타빈(gemcitabine) 또는 5-FU를 포함하는 화학적 요법과 수술을 함께 행하여 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다(DiMagno EP, et al. Gastroenterology. 1999 Dec;117(6):1464-84.1, Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2). 그러나 상기 치료법은 PDAC의 극도로 공격적이고 항암화학적 요법에 저항적 성질 때문에 PDAC 환자의 오랜 기간의 생존에서 매우 제한적인 효과를 가진다.
이러한 어려운 상황을 극복하기 위해, 표적분자의 확인을 통한 PDAC의 새로운 분자치료법의 개발이 현재 시급한 사안이다. 이전에는, PDAC 세포의 정확한 발현분석실험을 위한 순수한 암세포 집단을 획득하기 위하여 레이저 미세 절제기(laser microdissection)와 전 영역 cDNA 마이크로어레이(genome-wide cDNA 마이크로어레이) 결합을 이용하여 획득하였다.
미토콘드리아는 세포의 생체에너지를 위해 필수적이고 세포사멸과정을 결정하는 중심적인 역할을 한다(Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.). 세포의 물질대사에서 암과 관련된 변화는 미토콘드리아의 기능에 영향을 미치고(Warburg effect, Galluzzi L, et al. Oncogene. 2006 Aug 7;25(34):4812-30.) 세포의 생존력 특히 하이포톡식(hypotoxic) 상태와 관련될 것이다. 게다가 세포사멸의 실효(invalidation)는 미토콘드리아 외막투과(mitochondrial outer membrane permeabilization; MOMP)와 연관되어 있다. 이론적인 부분에서는 미토콘드리아 단백질을 대상으로 삼은 구체적인 치료개입의 개발을 시도하고 있다. 각가지 실험적인 치료제는 직접적으로 미토콘드리아를 대상으로 삼고 있으며, 그렇기 때문에 세포사멸을 유도한다. 상기 치료제의 예로는 Bcl-2-유사 단백질(Bcl-2-like proteins)의 Bcl-2 상동성 도메인 3(Bcl-2 상동성 domain 3)(Walensky LD, et al. Science. 2004 Sep 3;305(5689):1466-70.), 말초형 벤조디아제핀 수용체 리간드(peripheral-type benzodiazepine receptor ligands)(DecaudinD, et al. Cancer Res. 2002 Mar 1;62(5):1388-93.) 및 양성 양이온(ampholytic cations)(Ellerby HM, et al. Nat Med. 1999 Sep;5(9):1032-8.)을 모방체를 위해 고안된 것을 포함한다. 상기 MOMP 유도물질 또는 촉진제는 스스로 세포사멸을 유도할 수 있고 또한 병용요법(combination therapies)으로 세포사멸 유도를 촉진할 수 있고, 그렇기 때문에 DNA-손상 인자에 대항하여 어떠한 내성도 효력이 없게 할 수 있다(Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.).
본 발명은 새로운 표적유전자, 췌장암 세포에서 구체적으로 상향조절(up-regulated) 되는 C2orf18(염색체 2 오픈리딩프레임 18)의 검출을 통해서 개선된 췌장암의 진단 및 치료를 위한 당업계의 요구를 기술한다.
발명의 공개( Disclosure of Invention )
발명의 개요
전술한 것에 비추어, 본 발명의 목적은 암, 특히 췌장암을 검출, 진단, 예측, 모니터링 및/또는 치료를 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서, 하나의 새로운 유전자 C2orf18는 췌장암 세포(구체적으로, PAAC 세포)에서 구체적으로 과발현됨으로써 마이크로어레이 분석을 통하여 확인되었고, 상기 암세포의 과발현은 RT-PCR 및 면역조직화학적 검색을 통하여 확인되었다. C2orf18는 성인 정상조직에서 제한적으로 발현되기 때문에 최소한의 부작용을 가지는 새로운 치료적 접근을 위한 적절하고 전도유망한 표적분자일 것이다. 기능적으로는, 췌장의 암 세포주에서 siRNA에 의한 내인성(endogenous) C2orf18의 녹다운(knockdown)은 췌장암 세포 성장에 급격한 억제의 결과를 야기하며, 이는 생존력을 유지하는데 그것의 필수적인 역할을 제시한다. 면역세포화학분석(immunocytochemical analysis) 및 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)에 따르는 세포 분획법의 결과 C2orf18는 미토콘드리아에 위치되어있으며, 이는 C2orf18이 암세포의 세포사멸 또는 에너지 항상성에 관련되어 있는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 목적은 개체에서 파생된 생물학적 시료, 생검(biopsy)과 같은 것에서 C2orf18의 발현 수준(level)을 결정함으로써 개체 내에서 암, 특히 췌장암을 진단 또는 검출하는 방법, 암 발병의 소인을 결정하는 방법 및/또는 암의 치료과정을 모니터링하는 방법을 제공한다. 정상적인 대조군 수준과 비교하여 C2orf18의 발현 수준의 증가는 개체가 암, 특히 PDAC 발병의 위험이 있거나 고통받는 것을 나타낸다. 본 발명의 방법에서, C2orf18 유전자는 적절한 프로브(probes)에 의해 검출될 수 있거나 C2orf18 단백질은 항-C2orf18(anti-C2orf18) 항체(antibody)에 의해 검출될 수 있다.
본 발명은 또한, C2orf18 유전자의 발현 또는 C2orf18 유전자 산물의 활성을 억제하는 물질을 확인하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서보다 상세히 논의한 바와 같이 본 발명은 C2orf18 및 ANT2 사이의 상호작용의 발견, 및 세포사멸뿐만 아니라 미토콘드리아 막전위와의 관련성에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 C2orf18 및 ANT2 사이의 상호작용을 억제하는 물질을 확인하는 방법을 제공한다. 더 나아가 본 발명의 목적은 C2orf18와 관련된 질병, 암, 예를 들면 췌장암, 보다 구체적으로 PDAC등을 치료 또는 예방하기 위한 후보물질 또는 이런 질병 상태에서 세포 성장을 억제하는 후보물질을 확인하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 실험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 중 어느 하나에서 수행될 수 있다. 피검 물질이 존재하지 않는 조건과 비교하여 피검 물질이 존재하는 조건에서 C2orf18 유전자의 발현 수준 및/또는 상기 유전자 산물의 생물학적 활성의 감소는 피검 물질이 C2orf18의 억제자이고 암 세포, 예를 들면 췌장 암세포, 보다 구체적으로 PDAC와 같은 C2orf18 과발현 세포의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 상기 후보 물질은 췌장암, 특히 PDAC의 성장을 억제함으로써 상기 암의 증상을 줄일 수 있다.
더 나아가 본 발명의 목적은 C2orf18 유전자의 발현 및 C2orf18 유전자 산물인 C2orf18 단백질의 기능을 억제하는 물질을 투여함으로써, C2orf18를 과발현하는 암세포의 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 물질을 억제하는 핵산(예를 들면 안티센스(antisense), 리보자임(ribozyme), 이중 가닥 분자(이중 가닥 분자)이다. 상기 물질은 이중-가닥 분자를 제공하기 위한 핵산 분자 또는 벡터일 수 있다. 유전자의 발현은 C2orf18 유전자의 발현을 억제하기 위한 충분한 양의 이중-가닥 분자를 표적유전자로 도입함으로써 억제될 수 있다. 본 발명은 또한 개체 내에서 C2orf18 과발현 암세포의 성장을 억제할 뿐 아니라 개체의 암, 특히 췌장암으로부터의 고통받는 개체를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 유효성분으로 이중 가닥 분자 또는 이를 암호화하는 벡터를 적절한 약학적으로 허용가능한 담체를 조합으로 포함하는 암, 특히 췌장암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물과 관련된다. 본 발명의 이중-가닥 분자는 C2orf18안으로 도입될 때, C2orf18 유전자의 발현을 억제하고 C2orf18 과발현 암세포의 성장을 억제한다. 예를 들면, 상기 분자는 핵산 잔기 196 및 214 사이 또는 핵산잔기 574 및 592 사이의 확장된(extending) 서열번호: 11의 일부에 상응하는 서열을 표적화하기 위하여 고안될 수 있다. 본 발명의 이중-가닥 분자는 센스(sense) 가닥 및 안티센스(antisense) 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 표적서열을 포함하는 서열을 포함하며, 상기 안타센스 가닥은 센스가닥에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 분자의 센스 및 안티센스 가닥은 본 발명의 이중-가닥 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화(hybridize)한다.
본 발명은 또한 C2orf18에 대항하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 CRAAGQSDSSVDPQQPF (서열번호: 5) 및/또는 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (서열번호: 6)의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 항원을 이용하여 형성되어진다. 이런 항체들은 암 특히 췌장암의 진단을 위한 면역학적 염색 분석(immunological stain assays)의 환경에서 유용하다. 다른 측면에서 본 발명은 항-C2orf18 항체를 포함하는 암, 특히 췌장암의 검출, 진단 및 예측할 수 있는 검출시약 또는 킷트를 제공한다. 본 발명에서, CRAAGQSDSSVDPQQPF (서열번호: 5) 및/또는 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (서열번호: 6)의 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 항-C2orf18 항체를 조제하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 목적은 상기 펩티드뿐만 아니라 항-C2orf18 항체를 조제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면이 다른 목표를 충족한다고 하더라도 당업자라면, 본 발명의 하나 이상의 측면이 동시에 하나 이상의 측면을 충족시키는 것을 이해할 것이다. 각 목표는 본 발명의 모든 측면에서 동등하게 적용되지 않을 수 있다. 따라서, 상기 목표는 본 발명의 모든 측면에 관하여 대안적인 시각을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목표 및 특성은 하기 도면 및 실시예와 함께 읽는 상세한 설명에 의해 더욱 명백해질 것이다. 그러나 본 발명의 전술한 요약 및 하기 바람직한 실시예의 상세한 설명은 본 발명을 이해하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 대안적 실시예를 제한하는 것은 아니다. 구체적으로 본 발명은 상당한 구체적 실시예에서 참조와 함께 본 문서에서 설명되어지지만, 상기 설명은 본 발명의 한 예 일뿐 본 발명을 제한하는 개념이 아니다. 첨부된 청구항에 의해 기술된 본 발명의 범위 및 목적을 벗어나지 않는 범위에서 숙련된 당업자에 의해 다양한 변경 및 응용을 가할 수 있다. 게다가 본 발명의 다른 목적, 특징, 혜택 및 이득은 본 발명의 요약 및 하기에서 설명한 특정 실시예에 의해 알 수 있으며, 숙련된 당업자에 의해 쉽게 알 수 있다. 이러한 목적, 특징, 혜택 및 이득은 수반되는 예, 데이터, 도면 및 이러한 것들로부터 유추할 수 있는 모든 상당한 추론의 단독 또는 이 문서에 포함된 참조의 고려를 통하여 분명히 알 수 있다.
도 1. "PDAC 세포에서 C2orf18 과-발현"에서 (A) 부분은 현미해부된 PDAC 세포(1-9)에서 현미해부 되거나 필수 성인 기관의 정상 췌장 관의 상피세포와 비교하여 C2orf18 및 TUBA의 mRNA 발현의 RT-PCR 결과를 나타낸다. Panc: 정상 췌장, BM: 골수. (B) 부분은 C2orf18이 췌장암 세포주에서 많은 보이고, 그러나 필수적인 조직에서는 제한된 발현을 보이며, 전립선, 갑상선, 부신 조직에서는 희미하게 발현되는 것으로 나타나는 노던 블랏 분석의 결과를 나타낸다. (C) 부분은 PDAC 세포주에서 내인성의 C2orf18이 검출된 두 마리의 토끼의 혈청으로부터 정제된 항-C2orf18 항체(lot#192 및 lot#193)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석의 결과를 나타낸다. PDAC 세포주에서 PAPM 발현은 정상 세포주(NIH3T3, HEK-293, 및 COS7)보다 높다. 베타-엑틴은 로딩 대조군(loading control)으로서 제공된다. (D) 부분은 항-C2orf18 항체를 이용한 면역조직화학 분석의 결과를 나타내고, PDAC 세포에서 강한 염색이 보였다(C1 x200, C2 x400, C3 x400). C2orf18의 강한 염색은 PDAC 세포의 세포질에서 보인다. 정상 췌장 조직, 선포 세포 및 정상 선관 상피 세포에서는 염색이 보이지 않는다(N, x400).
도. 2 “PDAC 세포의 성장에서 C2orf18-siRNAs의 효과” (A) 부분은 PDAC 세포주, MIA-PaCa2(왼쪽) 및 Panc-1(오른쪽)의 C2orf18에서 siRNA의 녹다운 효과(knockdown effect)를 나타낸다. 반-정량적 RT-PCR은 음성 대조군 벡터(siEGFP)뿐만 아니라 C2orf18 (#196, #574, 및 #3254)에서 siRNA-발현하는 벡터의 각각에 형전 감염된 세포를 이용하여 수행하였고, 이는 siEGFP 및 #3254에 의한 것이 아닌, #196 및 #574에 의한 녹다운 효과를 확인하였다. (B) 부분은 C2orf18(#196, #574, 및 #3254) 및 음성 대조군 벡터(siEGFP)에 siRNA-발현하는 벡터가 존재하는 각각의 형질전환 된 MIA-PaCa2(왼쪽) 및 Panc-1(오른쪽)세 포의 콜로니 형성 분석의 결과를 나타낸다. 세포는 게네티신과 함께 배양 14-일 후, 0.1% 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 가시화하였다. (C) 부분은 C2orf18(#196, #574, 및 #3254) 및 음성 대조군 벡터(siEGFP)에서 siRNA-발현하는 벡터의 존재하에서 형질감염 된 MIA-PaCa2(왼쪽) 및 Panc-1(오른쪽) 세포의 각각을 이용한 MTT 분석의 결과를 나타낸다. 각각의 평균은 게네티신과 함께 배양 14-일 후 에러 바(error bar)로 나타나는 SD(표준 편차)로 나타내었다. Y축의 ABS는 마이크로플레이트 리더로 측정된 490 nm, 및 630 nm의 흡광도를 의미한다. 상기 실험은 3번 실행하였다. ** 평균 P < 0.01 (Students't-test).
도 3. “PDAC 세포에서 C2orf18의 로컬리제이션” (A) 부분은 항-C2orf18 항체를 이용한 면역세포화학분석의 결과를 나타내고, 상기 양성 신호(녹색)는 PDAC 세포의 세포질에서 소포성 양식으로 보인다(왼쪽 위쪽 페널). 항-C2orf18 항체(녹색)의 신호는 MitoTracker 신호와 부분적으로 병합한다(빨강: 오른쪽 위쪽 페널). 항-C2orf18 항체에 상기 신호는 siRNA에 의해 C2orf18 녹다운함에 따라 사라지고(오른쪽 아래 패널), 반면에, 대조군 siRNA(siEGFP)의 처리에 따라 세포질에서 소포성 양식으로 유지된다(왼쪽 아래쪽 페널). (B) 부분은 항-C2orf18 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석의 결과랄 나타내고, C2orf18이 세포질 및 오직 미토콘드리아 부분에 존재하는 것을 나타낸다. 항-미토필린(mitofilin) 항체는 미토콘드리아 부분을 검출하기 위해 사용된다. (C) 부분은 질량분석법에 의한 면역 침강법 분석의 결과를 나타내고, ANT2는 C2orf18-상호작용 단백질의 후보로 확인하였다. C2orf18-HA 발현 벡터 및/또는 ANT2-Flag 발현 벡터는 COS7 세포 안으로 공동 형질전환 한다. C2orf18-HA 또는 ANT2-Flag을 포함하는 단백질 복합체는 각각 항-HA 항체(왼쪽 페널) 또는 항-Flag 항체(오르쪽 페널)에 의해 세포 추출물로부터 면역 침강한다. 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블랏은 두 개의 발현 벡터가 공동 형질 될 때(왼쪽 페널에 화살표시된) C2orf18-HA와 ANT2-Flag는 공동 면역침강하는 것을 나타낸다. 항-HA를 이용한 웨스턴 블랏은 두 발현 벡터가 공동 발현할 때(오른쪽 페널에 화살표시된), C2orf18-HA와 ANT2-Flag는 공동 면역침강하는 것을 나타낸다.
도 4. “C2orf18/ANT2BP는 미토콘드리아 막전위(delta psi m) 및 세포사멸과 관련 있다” (A) 부분은 형질감연 연구의 결과를 나타내고, ANT2 siRNA, C2orf18/ANT2BP siRNA, 또는 siEGFP(대조군)을 KLM-1에 형질감염한 후, 형질감염 48시간 후, 수집하였다. 항-C2orf18/ANT2BP 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 통해 KLM-1 세포에서 C2orf18/ANT2BP siRNA의 녹다운 효과를 확인하였다. (B) 부분은 형광 분석의 결과를 나타내고, 세포를 Rhodamine123 및 PI에 배양하고, 형광을 FACS분석을 통해 측정하였다. X축의 Rhodamine123(Rh123) 강도는 delta psi m를 반영하고 X축의 PI (요오드화 프로파티엄) 투과성은 죽은 세포에서 세포 막 파괴를 반영한다. Rh123 강도의 낮은 수준 및 PI의 음성-투과성은 미토콘드리아 delta psi가 감소하지만 세포사멸은 완전히 끝나지 않은 빠른 사멸 세포를 나타내고, 반면에 Rh123 강도의 낮은 수준 및 양성-투과성 사멸 세포를 나타낸다. 낮은 delta psi 및 PI의 음성-투과성을 보이는 세포는 대조군(siEGFP, 19%)과 비교하여, ANTBP2(25%) 또는 ANT2(26%)가 녹다운될 때 감소한다.
(C) 부분은 siEGFP-형질감연된 세포와 비교하여, Panc-1 세포에서 C2orf18의 녹다운이 세포 사멸 세포의 수가 감소를 TUNEL 분석의 결과를 보여준다. DNase I를 처리한 막 투과성 세포는 TUNEL 분석을 위한 양성 대조군으로 제조하였다. (D) 부분은 유세포 분석기를 이용하여 TUNEL-양성 세포의 수를 나타낸다. 히스토그램 플렛에서, X축은 TUNEL-양성 세포의 녹색 신호의 강도를 반영한다. 히스트그램의 오른쪽으로 이동은 siEGFP-형질전환된 세포와 비교하여 TUNEL-양성 세포의 수가 감소한 C2orf18의 녹다운을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실 또는 검사를 위해, 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 하기에 기술된다. 그러나 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이며, 본 발명에서의 방법론 또는 프로토콜에 한정되는 것이 아니며, 통상적 실험 및 최적화와 같이 다양하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 설명에 사용한 용어는 특별한 버전(version)의 설명의 목적으로 사용되었을 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그러나 충돌하는 경우 정의를 포함하여 본 명세서를 따른다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 하기 정의를 적용한다. 추가적인 정의는 해당되는 본문에 배치하였다.
정의:
본 명세서에서 사용되는 용어 “1개(a, an)" 및 “그(the)"는, 특별히 나타내지 않는 한, “적어도 1개”를 의미한다.
본 발명에서 언급한 상기 용어 “유기체(organism)"는 적어도 하나의 세포로 구성된 어떤 살아있는 독립체를 나타낸다.
상기 살아있는 유기체의 예를 들면 단일 진핵세포처럼 단순하거나 인간을 포함하는 포유류처럼 복잡할 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어“생물학적 시료(biological sample)”는 전체 생물체 또는 그것의 조직, 세포 또는 구성요소의 일부분(예를 들면, 혈액에 한정되지 않고, 점액, 림프액, 윤활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 양막 제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하는, 체액)을 나타낸다. 또한, 상기 용어“ 생물학적 시료”는 전체 생물체 또는 그것의 세포, 조직 또는 구성요소, 또는 이들의 분획물 또는 부분의 일부분으로부터 제조된 균질현탁액, 용해물, 추출물, 세포 배양물 또는 조직 배양물을 나타낸다. 마지막으로 “생물학적 시료”는 예를 들어, 생물체가 번식하는 영양 배지 또는 겔과 같은 배지를 나타내고, 예를 들어, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 세포구성성분을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 상기 개체에서 파생된 샘플은 테스트 객체, 예를 들면 이미 알려진 또는 암 구체적으로 췌장암이 의심되는 테스트 객체로부터 획득할 수 있다. 예를 들면, 상기 조직은 상피세포를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 조직은 췌장암 또는 PDAC의 상피세포일 수 있다.
물질(예를 들면, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드 등)과 관련되어 사용되는 용어 "분리된" 및 "정제된"은 천연물에 포함될 수 있는 적어도 하나의 물질로부터 상기 물질이 실질적으로 제거되는 것을 나타낸다. 따라서, “분리된” 또는 “추출된” 항체는 세포로부터의 탄수화물, 지질, 또는 다른 오염된 단백질과 같은 세포 물질 또는 상기 단백질(항체)이 유래된 조직원을 실질적으로 포함하지 않거나 또는 화학적으로 합성될 경우 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는다. 상기 용어 "세포 물질을 실질적으로 포함하지 않는다."라는 폴리펩티드의 조제물질을 포함하고 상기 폴리펩티드는 분리되거나 또는 재조합적으로 생산된 것에서의 세포의 세포 구성성분으로부터 분리된다.
따라서, 실질적으로 세포 물질이 없는 폴리펩티드는 약 30%, 20%, 10%, ,5%, 2% 또는 1%(건조중량에 의해)보다 적은 이종 단백질(또한 본 명세서에서 "오염된 단백질"로서 기재)을 가지는 폴리펩티드의 조제물질을 포함한다. 상기 폴리펩티드가 재조합적으로 생산되는 경우, 바람직하게 실질적으로 배양 배지를 포함하지 않고, 이는 상기 단백질 조제물질 부피의 약 20%, 10%, 또는 5%보다 적은 배양 배지와 폴리펩티드의 조제물질을 포함한다. 상기 폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 바람직하게 실질적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 포함하지 않고, 상기 단백질의 합성에 연관된 상기 단백질 조제물질 부피의 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 또는 1%(건조중량에 의해)보다 적은 화학적 전구체 또는 다른 화학물질과 폴리펩티드의 조제물질을 포함한다. 특정 단백질 조제물질은 예를 들어, 상기 단백질 조제물질의 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 또는 상기 겔과 같은 것에 따른 단일 밴드의 모습으로 나타낼 수 있는, 분리되거나 또는 정제된 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 실시태양에 있어서, 본 발명의 항체는 분리되거나 또는 정제된다.
"분리된" 또는" 정제된" 핵산 분자, 예를 들면 cDNA 분자는, 재조합 기술에 의해 제조되는 경우 다른 세포 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 포함하지 않을 수 있거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자는 분리되거나 또는 정제된다.
상기 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내기 위하여 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머 뿐만 아니라, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형된 잔기, 또는 예를 들면, 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인위적인 화학적 모방체와 같이, 비자연적으로 발생하는 잔기가 있는 아미노산 폴리머에 적용된다.
상기 용어 "아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라, 자연적으로 발생 및 합성한 아미노산을 나타낸다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 세포 내 번역 후 변형된 것뿐만 아니라, 유전암호에 의해 암호화된 것이다(예를 들면, 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린). 상기 어구 "아미노산 유사체"는 자연적으로 발생하는 아미노산과 같은 동일한 기본화학구조(수소에 결합된 알파 탄소, 카르복시기, 아미노기, 및 R기)를 가지지만 변형된 R기 또는 변형된 백본(backbone)(예를 들면, 호모세린, 노르루신, 메티오닌, 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄)을 가지는 화합물을 나타낸다. 상기 어구 "아미노산 모방체"는 일반적인 아미노산과 상이한 구조를 가지지만 유사한 기능을 가지는 화학적 화합물을 나타낸다.
아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권고 되는 그들의 흔히 잘 알려진 세 문자 기호 또는 한-문자 기호에 의해 본 명세서에 기재될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 아마노산의 추가, 삭제 및/또는 치환에서 적용되는 용어“ 몇몇”은 3-7, 바람직하게 3-5, 보다 바람직하게 3-4 가장 바람직하게는 3 아미노산 잔기를 의미한다.
상기 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "핵산", 및 "핵산 분자"는 특별히 나타내지 않는 한 호환적으로 사용되고, 그들의 흔히 받아들여지는 단일-문자 암호에 의해 기재되는 상기 아미노산과 유사하다. 아미노산과 유사하게, 그들은 자연적으로 발생하는 및 비자연적으로 발생하는 핵산 폴리머를 모두 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 핵산, 또는 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, “대조군 수준” 구문은 대조군 샘플에서 검출되는 유전자 또는 단백질 발현 수준을 나타내고, (a) 정상 대조군 수준 또는 (b) 암의 특정 대조군 수준, 구체적으로 췌장암 특정 대조군 수준을 포함한다. 대조군 수준은 단일 참고 집단 또는 대수의 발현 패턴으로 구성된 것으로부터 유래된 단일 발현 패턴이다. “정상 대조군 수준” 구문은 정상 및 건강한 개체 또는 암, 특히 췌장암 예를 들면 PDAC로부터 고통받지 않고 있는 개체의 집단으로부터 별견된 유전자 발현 수준을 나타낸다. 정상 개체는 암, 췌장암 같은 예를 들면 PDAC의 임상증상이 없는 것이다. 이와 반대로, “췌장암(PC) 대조군 수준” 또는 “PDAC 대조군 수준”은 각각 췌장암(PC) 및 췌장 관 선암종 (PDAC)로부터 고통받고 있는 개체에서 검출된 유전자 발현 수준을 나타낸다.
테스트 샘플 및, PC 또는 PDAC 대조군 사이의 C2orf18 발현 수준의 유사성은 각각 PC 또는 PDAC의 발병위험이 있거나 고통을 받고 있는 대상(테스트 샘물로부터 획득)을 나타낸다. 본 발명에서, 특정 유전자의 발현 수준은 유전자 발현이 대조군 수준과 비교하여 적어도 1.1 바람직하게 1.5 이상, 바람직하게 2.0 이상, 바람직하게 5.0 이상, 바람직하게 10.0 또는 배 이상 증가하였을 때 증가하였다고 간주한다. 또한, 특정 유전자의 발현 수준은 유전자 발현이 대조군 수준과 비교하여 적어도 1.1 바람직하게 1.5 이상, 바람직하게 2.0 이상, 바람직하게 5.0 이상, 바람직하게 10.0 또는 배 이상 감소하였을 때, 감소하였다고 간주한다. C2orf18 유전자 발현은 RT-PCR 또는 놀던 블랏 분석(Northern blot analysis)을 통해 대상의 조직 샘플로부터 C2orf18의 mRNA을 검출하는 것 또는 대상의 조직 샘플의 면역조직화학적 분석을 통해 C2orf18에 의해 암호화된 단백질을 검출하는 것으로 알아낼 수 있다.
The C2orf18 유전자 및 C2orf18 단백질:
본 발명은 C2orf18을 암호화한 유전자가 비(non)-암 조직과 비교하였을 때 PDAC에서 과발현되어 지는 것을 검출하고 이를 부분적으로 본 발명의 근거로 한다. 또한, C2orf18는 본 명세서에서 PAMP(췌장암 미토콘드리아 단백질)로 나타내어진다. 본 발명은 C2orf18 유전자 및 C2orf18 유전자를 암호화한 C2orf18 단백질 및 췌장암 진단 및 치료의 맥락에서의 이의 용도에 관한 것이다. C2orf18의 확인된 cDNA 길이는 3912 뉴클레오티드이다. C2orf18의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 각각 서열번호: 11 및 12에 나타내었다. 상기 서열 데이터는 하기 등록번호를 통해서 이용 가능하다. C2ORF18/C2orf18/ANT2BP: NM_017877.
본 발명의 문맥에서, 기능적 등가물 또한 “C2orf18 폴리펩티드”인 것으로 여겨진다. 본 명세서에서 단백질의“기능적 등가물” 상기 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 즉, C2orf18 단백질의 생물학적 능력을 가지는 임의의 폴리펩티드는 본 발명에서 기능적 등가물로서 이용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 바람직하게 C2orf18 기능적 등가물에 의해 유지되는 생물학적 능력은 생(native) C2orf18 단백질과 관련된 활성을 증진시키는 세포 증식이다. 생물학적 샘플의 세포증식능은 증식 속도의 검출 또는 세포 주기 또는 콜로니 형성능력(colony forming ability)을 측정함으로써 알아낼 수 있다. 이러한 활성(activity)은 ATCC(Manassas, VA)를 통해 할 수 있는 MTT 세포 증식 분석 또는 Lonza(Basel Switzerland)의 ViaLightTMAssay과 같은 기존기술 및 표준 분석을 이용하여 기계적으로 분석되었다. 또한, 본 발명은 생(native) C2orf18 단백질이 ANT2에 바인드(bind)하는 능력에 관한 것이다.
기능적 등가물은 상기 C2orf18 단백질에서 자연 발생된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결핍, 첨가 및 삽입된 것을 포함한다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드는 상기 각 단백질의 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 상동성(또한, 서열 동일성으로 지칭됨), 더욱 바람직하게는 적어도 90% 내지 95% 이상의 상동성의 상동성을 가지는 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 상기 C2orf18 유전자의 자연 발생한 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 이를 생성하는 세포 또는 숙주 또는 사용된 분리 방법에 따라 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 당쇄의 존재 또는 부재, 또는 형태에서 변종을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 인간 C2orf18 단백질의 기능적 등가물로서 기능 하는 한, 본 발명의 범위 내에 속한다.
상기 어구 “엄격한(혼성화) 조건”일반적으로 핵산의 복합 혼합물에서 핵산 분자가 그의 표적 서열에 혼성화 되고, 다른 서열에는 검출되지 않는 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 환경에서는 달라질 것이다. 긴 서열은 높은 온도에서 구체적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 포괄적 안내는 “혼성화 원칙 및 핵산 분석 방법의 전략에 대한 개관”(Tijssen, techniques in Biochemistry and Molecular Biology 혼성화 with Nucleic probes, "Overview of principles of 혼성화 and the strategy of nucleic acid assays" (1993))에서 확인된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 일정한 pH의 이온 세기에서 구체적 서열에 대한 융점(Tm)보다 낮은 약 5-100℃에서 선택된다. 상기 융점(일정한 pH의 이온 세기, 및 핵산 농도)은 표적에 상보적인 탐침의 50%가 표적 서열과 혼성화되어 평형(과량의 표적 서열이 존재할 때, Tm에서 50%의 탐침이 평형 상태이다)을 이루는 온도이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 시약을 첨가하여 도달할 수 있다. 선택적인 또는 구체적인 혼성화를 위하여, 적어도 양성 신호가 바탕 값의 두 배이고, 바람직하게는 바탕 값 혼성화의 10배이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 42℃에서 5×SSC 및 1% SDS로 세척하면서 50% 포름아마이드, 5×SSC, 및 1% SDS, 65℃에서 반응; 또는 0.2× SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 반응.
본 발명의 문맥에서, 상술한 인간 C2orf18 단백질에 대한 기능적 등가물인 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 선별하기 위한 혼성화 조건은 당업자라면 일상적으로 선별할 수 있다. 예를 들면, 혼성화는 “Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)를 이용하여 68℃에서 30분 또는 그 이상 전-혼성화를 수행하는 것, 표지 된 탐침을 첨가하는 것 및 65℃에서 1시간 또는 그 이상 보온하는 것을 통해 수행될 수 있다. 이후 세척 수준은 예를 들면, 낮은 엄격한 조건에서 수행될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건은 42℃, 2x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 50℃, 2x SSC, 0.1% SDS를 포함한다. 높은 엄격한 조건을 사용하는 것이 종종 바람직하다. 예시적인 높은 엄격한 조건은 2x SSC, 0.01% SDS로 상온에서 20분간 3번 세척, 1x SSC, 0.1% SDS로 37℃에서 20분간 3번 세척, 1x SSC, 0.1% SDS로 50℃에서 20분간 2번 세척을 포함한다. 그러나 온도, 염 농도와 같은 몇몇의 인자는 혼성화의 엄격함에 영향을 줄 수 있고, 당업자는 요구되는 엄격함을 달성하기 위하여 상기 인자를 용이하게 선별할 수 있다.
일반적으로 단백질에서 하나 이상의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 주지 않는 것으로 알려졌다. 사실, 돌연변이 되거나 변형된 단백질, 특정 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되어 변형된 단백질은 본래의 생물학적 활성이 남아있는 것으로 알려져 있다(Mark et al ., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6(1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500(1982); Dalbadie-McFarland et al ., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982)). 따라서, 당업자는 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산 또는 “보존된 변환(conservative modifications)”으로 고려되는 아미노산 서열의 개별적 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 인식할 것이고, 본 발명에서 상기 단백질의 변화 결과, 유사한 기능의 단백질이라면, 본 발명의 내용에 수용가능하다.
상기 단백질의 활성이 남아있는 한, 아미노산의 돌연변이의 숫자는 특별히 제한되지 않는다. 그러나 일반적으로 상기 아미노산 서열의 5% 이하를 변화시키는 것이 바람직하다. 따라서, 나아간 실시예에서 돌연변이에서 돌연변이될 아미노산의 숫자는 일반적으로 30개 아미노산 이하, 바람직하게는 20개 아미노산 이하, 더욱 바람직하게는 10개 이마노산 이하, 더더욱 바람직하게는 6개 아미노산 이하, 가장 바람직하게는 3개 아미노산 이하이다.
아미노산 잔기는 돌연변이될 수 있으며, 바람직하게는 아미노산 잔기는 상기 아미노산 측쇄의 특성을 가지는 다른 보존된 아미노산으로 돌연변이될 수 있다(보존적 아미노산 치환으로 알려진 과정). 아미노산 측쇄의 특성의 예로는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공동으로 특징을 가지는 측쇄: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 하이드록시기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드가 포함된 측쇄(D, N, E, Q); 염기가 포함된 측쇄(R, K, H); 및 방향족이 포함된 측쇄(H, F, Y, W)가 있다. 또한, 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 아미노산을 포함하는 각각의 하기 8개의 군은 서로에 대한 보존적 치환이다:
(1) 알라닌(Alanine, A), 글리신(Glycine, G);
(2) 아스파트산(Aspartic acid, D), 글루타민산(Glutamic acid, E);
(3) 아스파라긴(Aspargine, N), 글루타민(Glutamine, Q);
(4) 아르기닌(Arginine, R), 라이신(Lysine, K);
(5) 이소류신(Isoleucine, I), 류신(Leucine, L), 메티오닌(Methionine, M), 발린(Valine, V);
(6) 페닐알라닌(Phenylalanine, F), 티로신(Tyrosine, Y), 트립토판(Tryptophan, W);
(7) 세린(Serine, S), 트레오닌(Threonine, T); 및
(8) 시스테인(Cystein, C), 메티오닌(Methionine, M) (예를 들어, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 폴리펩티드는 본 발명의 문맥에 포함되고, 보존적으로 변형된 폴리펩티드는 생 C2orf18 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 조건에서, “C2orf18 폴리펩티드”로 간주된다. 그러나 본 발명은 이에 한정되지 않고 상기 C2orf18은 상기 C2orf18 단백질(세포증식의 자극과 같은)의 생물학적 활성 중 적어도 하나에 의해 유지되는 조건에서는 비보존적 변형을 포함한다. 또한, 이러한 변형된 단백질은 다형성 변종, 종간 상동체 및 상기 단백질의 대립 유전자에 의해 암호화되는 것들에 대해서 배타적이지 않다.
또한, 본 발명의 C2orf18 유전자는 상기 C2orf18 단백질의 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 혼성화에 추가로, 예를 들면, 상기 단백질을 암호화화는 DNA(서열번호: 11)서열 정보에 기초하여 합성된 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 방법인 유전자 증폭 방법이 상기 C2orf18 단백질의 기능적 등가물 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 선별하는데 사용될 수 있다. 상기 각각의 인간 C2orf18 유전자 및 단백질에서 기능적인 등가물인 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 본래의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 일반적으로 높은 상동성을 가진다. “높은 상동성”은 통상적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 내지 95% 이상의 상동성을 지칭한다. 상기 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성은 “Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30(1983)”의 알고리즘을 통해 결정될 수 있다.
항체:
본 발명은 또한 C2orf18에 대항하는 항체 또는, 상기 항체의 면역학적 활성 단편을 제공한다. 상기 항체는 C2orf18의 구체적인 발현의 검출에서 유용성을 발견한다. 본 발명의 문맥에서, C2orf18에서 구체적인 다클론성(polyclonal) 항체를 이용한 면역조직화학적 분석은 췌장암세포에서 C2orf18의 과발현 및 정상 성인 필수 조직(심장, 폐, 신장 간 및 뇌)에서 없거나 극히 제한적인 발현을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항체는 개체 유래의 생검에서 C2orf18 단백질을 검출하고, 예를 들면 PDAC 등의, 췌장암과 같은 C2orf18 관련 질환을 진단하고 이런 질환을 치료하는데 유용하다. 게다가, 본 발명의 항체는 C2orf18의 기능적 분석을 위한 유용한 도구 될 것이다. 본 발명의 항체는 CRAAGQSDSSVDPQQPF (서열번호: 5) 및/또는 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (서열번호: 6)으로 나타낸 아미노산을 갖는 C2orf18 단편을 이용함으로써 제조될 수 있다. 따라서 아미노산 서열 CRAAGQSDSSVDPQQPF (서열번호: 5) 및/또는 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (서열번호: 6)으로 구성된 에피토프(epitope)를 인지하는 항체는 본 발명에 포함된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호: 5 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 인식하거나 또는 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 용어“항체”는 단일 가단 항체, 키메릭, 두 기능을 가진 및 사람화 항체뿐만 아니라 항원-결합 단편(항원-binding fragments)(e.g., Fab', F(ab')2, Fab, Fv and rIgG)을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 항체뿐만 아니라 자연적으로 일어나는 항체를 포함한다. Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)에서 확인할 수 있다. 예를 들어 Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998)에서 확인할 수 있다. 상기 비-자연적으로 일어나는 항체는 고체성 펩티드 합성기술이 이용하여 만들 수 있고, 예를 들어 본 명세서의 참조로 통합된 Huse et al., Science 246:1275-81 (1989)에서 서술한 가변부위 중세(variable heavy chains) 및 가변부위 경쇄(variable light chains)로 구성된 조합 라이브러리 스크리닝을 통하여 재조합하여 생산할 수 있으며 또는 획득할 수 있다. 예를 들어 키메릭 항체, 인간화 항체, CDR-이식 항체, 한 가닥의 항체 및 두 가지의 기능을 가진 항체를 만드는 상기 및 다른 방법은 당업계에서 당업자에게는 자명한 사실이다(Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-6 (1993); Ward et al., Nature 341:544-6 (1989); Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995); 각각은 본 명세서에서 참조에 의해 통합되어졌다).
상기 용어 “항체”는 다클론 및 단일클론을 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메릭 항체(예를 들어, 사람화 뮤린(murine) 항체) 및 헤테로컨쥬게이트(heteroconjugate)항체(예를 들어, 이특이성(bispecific) 항체)와 같은 유전자변형 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 단일 사슬 Fv 단편(재조합 single chain Fv fragments; scFv)을 나타낸다. 또한 상기 용어 항체는 이가의(bivalent) 또는 이특이성 분자, 디아바디(diabodies), 트리이바디(triabodies) 및 테트라비디(tetrabodies)를 포함한다. 이가 및 이특이성 분자는 Kostelny et al. (1992) J Immunol 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90:6444, Gruber et al. (1994) J Immunol :5368, Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781, Hu et al. (1997) Cancer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026, and McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301에 기술되어 있다.
일반적으로, 항체는 경쇄 및 중쇄를 가지고 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변부위(constant region) 및 가변부위부(variable region)(상기 지역은“도메인(domains)"으로 또한 알려져 있다)를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 가변부위영역은“상보성-결정 영역”또는 “CDRs" 라고 불리는 3가지의 초-가변부위영역의 방해에 의한 4개의“프레임워크" 영역을 포함하고 있다. 상기 프레임워크 및 CDRs의 정도는 밝혀져 있다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 구조형성 영역의 서열들은 종 내에서 상대적으로 보호되어진다. 상기 항체의 구조형성 영역 즉, 중쇄 및 경쇄의 구성요소가 결합된 프레임 워커는 3차원 공간에서 CDRs을 나란히 하고 위치하게 하는 역할을 한다.
상기 CDRs는 주로 항원에 에피토프를 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDRs은 N-말단으로부터 번호가 정해져 순차적으로 시작하는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 나타나고 또한 특정 CDR이 위치한 사슬에 의해 확인되어진다. 따라서, 검출된 VH CDR3는 항체의 중쇄 가변부위 도매인에 위치하고 있고, 반면에 검출된 VH CDR1는 항체의 경쇄 가변부위 도매인의 CDR1에 위치한다.
참조로서“VH" 는 Fv, scFv, 또는 Fab의 중쇄를 포함하는 항체의 면역글로블린(immunoglobulin)의 가변부위부를 나타난다. 참조로서 ”VL"는 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 경쇄를 포함하는 면역글로블린 경쇄의 가변부위부를 나타낸다.
상기 문구 “ 단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 는 전통적으로 2개의 사슬 항체인 경쇄 및 중쇄의 가변부위 도메인이 하나의 사슬을 형성하기 위해 결합된 항체를 나타낸다. 일반적으로, 링커(linker) 펩티드는 활성 결합자리의 생성 및 적절한 폴딩(folding)을 가능하게 하기 위해 두 개의 사슬 사이에 삽입되었다.
키메릭 항체는 (a) 불변부위, 또는 이의 일부에, 항원 결합자리(가변 부위)가 다른 또는 변화된 부류, 효과기 및/또는 종의 불변부위에 연결되어 지도록 하기 위해, 또는 항체의 새로운 특성을 부여하기 위한 완전히 다른 분자(예를 들어 효소, 독소(toxin), 호르몬, 성장인자, 약물 등) 또는 (b) 가변부위, 또는 이의 일부는, 다른 또는 변화된 항원 특이성을 가지는 가변부위의 변경, 교체 또는 교환하는 면역글로블린 분자이다.
인간화 항체는 비-인간 면역글로블린으로부터 유래된 최소한의 서열을 포함하는 면역글로블린 분자이다. 인간화 항체는 요구되는 특이성, 친화성 및 수용력을 가지는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR의 잔기에 의해 교체된 수용자(recipient)의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기의 인간 면역글로블린(수용자 항체)를 포함한다. 일부 실시예에서, 인간 면역글로블린의 Fv 구조형성 잔기는 비-인간 잔기에 상응하는 것에 의해 교체되었다. 인간화 항체는 수용자 항체 및 임포티드(imported) CDR 또는 구조형성 서열 내에서 검출되지 않은 잔기를 또한 포함한다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로블린의 모두 또는 실질적으로 모두의 CDR 영역에 상응하는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 둘, 가변영역 및 인간 면역글로블린 공통서열의 구조형성(FR) 영역의 모두 또는 실질적으로 모두를 포함한다. 상기 인간화 항체는 이상적으로 면역글로블린 불변부위(Fc), 일반적으로는 사람 면역글로블린(Jones et al., Nature 321:522-5 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-7 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-6 (1992))의 적어도 일부를 또한 포함한다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 설치류 CDRs 또는 CDR 영역 서열을 치환함으로써, Winter와 그의 연구진의 방법에 따라 기본적으로 수행될 수 있고(Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6). 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메릭 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이고, 온전한 인간 가변 도메인보다 상당히 적은 것은 비인간 종에서의 상응하는 서열에 의해 치환된다.
상기 “에피토프(epitope)", "항원의" 및 "결정요인"은 항체 결합에서 항원에 위치하는 것을 의미한다. 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 인접한 아미노산 또는 비인접한 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로 형성된 에피토프는 변성 용액에서 노출로 인해 일반적으로 유지되는데 반해 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 변성용액에서 처치시에 일반적으로 손실된다. 에피토프는 일반적으로 특별한 단백질 분자구조에서 적어도 3개, 보다 보편적으로는 적어도 5 또는 8 - 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 단백질분자 구조를 검출하는 방법은 예를 들어, X선 결정 해석 및 2-차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, Epitope Mapping 프로토콜s in Methods in 분자 Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)에서 확인할 수 있다.
상기 용어 "비-항체 결합 단백질" 또는 "비-항체 리간드" 또는 "항원 결합 단백질"은 더욱 상세히 하기에 나타낸 것과 같이, 아드넥틴(adnectin), 아비머(avimer), 단일 사슬 폴리펩티드 결합 분자, 및 항체 유사 결합 펩티도미메틱(peptidomimetic)를 포함하는, 비면역글로불린 단백질 지지체를 사용하는 항체 모방체를 호환적으로 나타낸다.
항체와 유사한 방법으로 표적을 표적하고 결합하는 다른 화합물들이 개발되어 왔다. 이러한 "항체 모방체" 중 어느 것은 항체의 가변 부위에 대한 대안적인 단백질 구조형성으로서 비면역글로불린 단백질 지지체를 사용한다.
예를 들면, Ladner 등(미국 특허 번호 5,260,203)은 응집되었으나, 분자적으로 분리된, 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 것과 유사한 결합 특이성을 갖는 단일 뉴클레오티드 사슬 결합 분자를 제시하였다. 상기 단일 사슬 결합 분자는 펩티드 링커에 의해 연결된 항체의 무겁고 가벼운 모든 가변 영역의 항원 결합 부위를 포함하고 두 펩티드 항체의 것과 유사한 구조로 접힐 것이다. 상기 단일 사슬 결합 분자는 더욱 작은 크기, 더욱 큰 안정성을 포함하여, 종래의 항체를 뛰어넘는 몇몇의 이점을 나타내고 더욱 손쉽게 변형된다.
Ku(Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995)) 등은 시토크롬 b562(cytochrome b562)에 기초한 대안적인 항체를 제시하였다. Ku(1995) 등은 소 혈청 알부민에 대한 결합을 위해 랜덤화 및 선택되는 시토크롬 b562의 두 개의 루프가 있는 라이브러리를 생성하였다. 개별적인 돌연변이들은 BSA와 선택적으로 항-BSA 항체와 유사하게 결합하는 것으로 확인되었다.
Lipovsek(미국 특허 번호 6,818,418 및 7,115,396) 등은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유사 단백질 지지체 및 적어도 하나의 가변 루프를 특징으로 하는 항체 모방체를 제시한다. 아드넥틴으로서 나타낸, 이러한 피브로넥틴 기반의 항체 모방체는, 임의의 표적화 리간드에 대한 높은 친화도 및 특이성을 포함하는, 자연적인 또는 공학적인 항체의 많은 동일한 특징을 나타낸다. 발전하는 신규한 것 또는 향상된 결합 단백질에 대한 임의의 기술이 이러한 항체 모방체와 사용될 수 있다.
이러한 피브로넥틴 기반의 항체 모방체의 구조는 상기 IgG 중쇄의 가변 영역의 구조와 유사하다. 따라서, 이러한 모방체는 천연에 있어서 유사한 항원 결합 특성 및 본래의 항체와의 친화도를 나타낸다. 또한, 이러한 피브로넥틴 기반의 항체 모방체는 항체 및 항체 단편을 뛰어넘는 어떠한 이점을 나타낸다. 예를 들면, 이러한 항체 모방체는 본래의 접힘 안정성을 위해 이황화 결합에 의존하지 않고, 따라서, 정상적으로 항체를 분해하는 조건하에서 안정적이다. 또한, 이러한 피브로넥틴 기반의 항체 모방체의 구조가 IgG 중쇄의 것과 유사하기 때문에, 루프 무작위화 및 셔플링에 대한 과정은 생체 내에서 항체의 친화도 성숙의 과정과 유사한 시험관 내에서 이용될 수 있다.
Beste(Proc Natl Acad Sci USA 96(5):1898-1903 (1999)) 등은 리포칼린 지지체{안티칼린TM　(AnticalinTM　)}에 기초한 항체 모방체를 제시한다. 리포칼린은 상기 단백질의 말단에 4개의 초가변 루프를 가지는 베타-배럴(beta-barrel)로 구성된다. Beste(1999)는 상기 루프를 무작위로 돌연변이화 시켰고 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein)과 결합하기 위해 선택하였다. 이러한 변이체들은 항-플루오레세인 항체의 것과 유사한 결합을 보이는 하나의 변이체와 함께, 플루오레세인과 구체적 결합을 나타냈다. 추가적인 분석에서는 모든 무작위화된 위치는 가변적이고, 안티칼린TM은 항체에 대안으로서 사용되기에 적절한 것으로 나타났다.
안티칼린TM은 작고, 단일 사슬 펩티드이고, 전형적으로 160과 180개 사이의 잔기이며, 생산 비용의 감소, 저장에 있어서 증가된 안정성 및 면역학적 반응의 감소를 포함하여, 항체를 뛰어넘는 몇몇의 이점을 제공한다.
Hamilton(미국 특허 번호 5,770,380) 등은 엄격한, 칼릭세린(calixarene)의 비펩티드 유시 지지체, 결합 부위로서 사용되는 다중 가변 펩티드 루프로 부착된 것을 사용하여 합성 항체 모방체를 제시한다. The peptide 루프(loop)s all project from the same side geometrically from the calixarene, with respect to each other. 이러한 기하학적 형태 때문에, 상기 모든 루프는 리간드에 대한 결합, 결합 친화도의 증가를 위해 이용가능하다. 그러나, 다른 항체 모방체에 비해, 상기 칼릭세린 기반의 항체 모방체는 펩티드의 독점적인 구성이 아니며, 따라서 프로테아제 효소에 의한 공격에 덜 취약하다. 상기 지지체는 펩티드, DNA 또는 RNA만으로 순수하게 구성되지 않고, 이러한 항체 모방체는 상대적으로 극한 환경 조건에서 안정적이고 긴 수명을 가지는 것을 의미한다. 또한, 상기 칼릭세린 기반의 항체 모방체가 상대적으로 작기 때문에, 면역성 반응을 더 적게 생성할 수 있다.
Murali(Cell Mol Biol. 49(2):209-216 (2003)) 등은 더욱 작은 펩티도미메틱에서 항체의 감소를 위한 방법론을 논의하였고, 그들은 항체에 대한 대안으로서 또한 유용할 수 있는 "항체 유사 결합 펩티도미메틱(antibody like binding peptidomemetics)"(ABiP)라고 지칭하였고 이는 또한 항체에 대안으로서 유용할 수 있다.
Silverman(Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561) 등은 "아비머(avimer)"로 지칭한 다중 도메인을 포함하는 단일 사슬 폴리펩티드인 융합 단백질을 발표하였다. 시험관 내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인으로부터 개발된 상기 아비머는 다양한 표적 분자에 대한 그들의 친화도 및 특이성이 항체와 다소 유사한 결합 단백질 중 하나의 분류이다. 결과적인 멀티도메인 단백질은 단일 에피토프 결합 단백질에 비해 향상된 친화도(경우에 따라서는 서브-나노몰) 및 특이성을 나타낼 수 있는 다중 독립적 결합 도메인을 포함할 수 있다. 아비머의 컨스트럭션 및 용도의 방법에 대한 추가적인 세부사항은 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 및 20050221384에 공개되었다.
비면역글로불린 단백질 구조형성과 더불어, 또한 항체 특성은 RNA 분자 및 비천연적인 올리고머(예를 들어, 프로테아제 억제자, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 퓨린 유도체 및 베타-턴 모방체)를 포함하는 화합물에서 모방되었고 이들 모두는 본 발명으로의 용도로 적절하다.
이중 가닥 분자:
본 발명은 또한 C2orf18의 발현을 억제하는 것이 특히 췌장암과 관련하여 암세포의 세포성장을 억제하는데 효과적인 것에 대한 놀라운 발견에 관한 것이다. 본 명세서에서 설명된 본 발명은 상기 검출에 일부를 기초로 한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "이중 가닥 분자"는 예를 들면, 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA)(siRNA; 예를 들면, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)) 및 짧은 간섭 DNA/RNA[siD/R-NA; 예를 들면, DNA 및 RNA의 이중 가닥 키메라(dsD/R-NA) 또는 DNA 및 RNA의 작은 헤어핀 키메라(shD/R-NA)]를 포함하는, 표적 분자의 발현을 저해하는 핵산 분자를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는, 상기 용어 "dsRNA"는 서로 상보적인 서열을 포함하고, 상기 상보적 서열을 통해 서로 어닐링(anealing)하여 이중 가닥 RNA분자를 형성하는 2개의 RNA 분자의 구조물(construct)을 나타낸다. 두 가닥의 핵산 서열은 표적 유전자 서열의 단백질을 암호화하는 서열로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" RNA뿐만 아니라, 상기 표적 유전자의 비암호화 영역으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 상기 용어 "shRNA"는, 서로 상보적인 제1 및 제2 영역, 즉, 센스 가닥 및 안티센스 가닥)을 포함하는, 스템(stem)-루프 구조를 갖는 siRNA를 나타낸다. 상기 제 1 및 제 2 영역의 상보성과 방향성(orientation)의 정도는 영역들 사이에서 염기쌍(base pairing)을 형성하는데 충분하고, 상기 제1 및 제2 영역은 루프 영역에 의해 연결되고, 상기 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이의 염기쌍의 결여에 기인한다. 상기 shRNA의 루프 영역은 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재 단일 가닥 영역이며, "개재 단일 가닥(intervening single-strand)"이라고도 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "siD/R-NA"는 RNA 및 DNA 모두로 구성되고, RNA 및 DNA의 하이브리드 및 키메라를 포함하며, 표적 mRNA의 번역을 억제하는 이중 가닥 분자를 나타낸다. 본 발명에 있어서, 하이브리드는 DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 RNA로 구성된 올리고뉴클레오티드가 서로 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성하는 분자를 가리키고; 한편 키메라는 이중 가닥 분자를 구성하는 상기 가닥의 한쪽 또는 양쪽이 RNA 및 DNA를 포함할 수 있는 것을 나타낸다. siD/R-NA를 세포 내로 도입하는 표준적인 기술이 이용된다. 상기 siD/R-NA는 센스 핵산 서열("센스 가닥"이라고도 나타냄), 및 안티센스 핵산 서열("안티센스 가닥"이라고도 나타냄), 또는 이들 모두를 포함한다. 상기 siD/R-NA는, 단일 전사체, 예를 들면, 헤어핀과 같은, 표적 유전자로부터의 센스 및 상보적인 안티센스 핵산 서열 모두를 갖도록 구성될 수 있다. 상기 siD/R-NA는 dsD/R-NA 또는 shD/R-NA일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "dsD/R-NA"는 서로 상보적인 서열을 포함하고, 상기 상보적 서열을 통해 서로 어닐링(anealing)하여 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 형성하고 있는 2개의 분자로 이루어진 구조물을 나타낸다. 상기 두 가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질을 암호화하는 서열로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 표적 유전자의 비암호화 영역으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 dsD/R-NA를 구성하는 2개의 분자의 하나 또는 두 개 모두는 RNA 및 DNA로 구성되거나(키메릭 분자), 또는, 상기 분자의 하나는 RNA로 구성되고, 다른 하나는 DNA로 구성된다(하이브리드 이중 가닥).
본 명세서에서 사용된, 용어 "shD/R-NA"는, 서로 상보적인 제1 및 2 영역, 즉, 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, 스템-루프 구조를 갖는 siD/R-NA를 나타낸다. 상기 제1 및 2 영역의 상보성과 방향성의 정도는, 영역들 사이에 염기쌍을 형성하는데 충분하고, 제1 및 제2영역은 루프 영역에 의해 연결되며, 상기 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이에 염기쌍의 결여로부터 기인한다. shD/R-NA의 상기 루프 영역은, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재 단일 가닥 영역이며, 상기 "개재 단일 가닥"이라고도 나타낼 수 있다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비인산디에스터(non-phosphodiester) 결합을 포함할 수 있다. 당업계에서 잘 알려진 화학적 변형은 상기 이중 가닥 분자의 안정성, 유효성, 및/또는 세포 흡수(cell uptake)를 향상시킬 수 있다. 당업자는 본 발명의 분자에 결합될 수 있는 다른 형태의 화학적 변형을 알 수 있을 것이다(WO03/070744; WO2005/045037). 하나의 실시예에 있어서, 변형은 분해에 대한 내성을 향상시키거나 또는 흡수를 향상시키는데도 이용될 수 있다. 이러한 변형의 예시로는 포스포로티오에이트(인산화rothioate) 결합, 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(methyl ribonucleotides) (특히 이중 가닥 분자의 센스 가닥에 상에서), 2'-디옥시(deoxy)-플루오로리보뉴클레오티드(fluoro ribonucleotides), 2'-디옥시리보뉴클레오티드(deoxy ribonucleotides), "유니버설 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5'-C-메틸뉴클레오티드(methylnucleotides), 및 반전 디옥시탈염기 잔기의 흡수(inverted deoxyabasic residue incorporation)를 포함한다(US 특허 출원 번호 20060122137).
본 발명의 다른 실시예에서, 변형은 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키거나 또는 표적하는(targeting) 효율을 향상시키기 위해서 이용될 수 있다. 변형은 이중 가닥 분자의 두 개의 상보적인 가닥 사이의 화학적 가교 결합, 이중 가닥 분자의 하나의 가닥의 3' 또는 5' 말단의 화학적 변형, 당 변형, 핵산염기 변형 및/또는 골격 변형, 2-플루오로 변형된 리보뉴클레오티드(fluoro modified ribonucleotides) 및 2'-데옥시리보뉴클레오티드(deoxy ribonucleotides)를 포함한다(WO2004/029212). 본 발명의 다른 실시예에서, 변형은 표적 mRNA 및/또는 상보적인 이중 가닥 분자 가닥에 있어서 상보적인 뉴클레오티드에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는데 이용될 수 있다(WO2005/044976). 예를 들면, 비변형된 피리미딘 뉴클레오티드(unmodified pyrimidine nucleotide)는, 2-티오(thio), 5-알키닐(alkynyl), 5-메틸 또는 5-프로피닐 피리미딘(propynyl pyrimidine)으로 치환될 수 있다. 추가적으로, 비변형된 퓨린은, 7-데자(deza), 7-알키(alkyi), 또는 7-알케니(alkenyi) 퓨린(purine)으로 치환될 수 있다. 또 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 이중 가닥 분자가 3' 오버행(오버행)을 갖는 이중 가닥 분자일 경우, 3' 말단 뉴클레오티드 오버행 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)에 의해 치환될 수 있다(Elbashir SM et al ., Genes Dev 2001 Jan 15,15(2):188-200). 더욱 상세하게는, 발표된 문서, 예를 들면, US 미국 특허 출원 번호 20060234970이 이용가능하다. 본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않고, 결과적인 분자가 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 능력을 보유하는 한 본 발명의 상기 이중 가닥 분자에 대하여 임의의 공지된 화학적 변형도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및 RNA 모두, 예를 들면, dsD/R-NA 또는 shD/R-NA를 포함할 수 있다. 구체적으로, DNA 가닥과 RNA 가닥의 혼성체(hybrid) 폴리뉴클레오티드 또는 DNA-RNA 키메라 폴리뉴클레오티드(chimera polynucleotides)는 증가된 안정성을 나타낸다. DNA와 RNA의 혼합, 즉, DNA 가닥(폴리뉴클레오티드)과 RNA가닥(폴리뉴클레오티드)으로 이루어진 혼성체 형태의 이중 가닥 분자와, 어느 한쪽 또는 양쪽의 단일 가닥(폴리뉴클레오티드)에 대한 DNA 및 RNA 모두를 포함하는 키메라 형태의 이중 가닥 분자, 또는 그것의 유사체가 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키기 위해서 형성될 수 있다.
DNA 가닥과 RNA 가닥 혼성체는 상기 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되었을 경우에 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는 한, 상기 센스 가닥이 DNA이고 상기 안티센스 가닥이 RNA인 혼성체일 수 있고 또는 그 반대의 혼성체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 센스 가닥 폴리 뉴클레오티드는 DNA이고, 상기 안티센스 가닥 폴리뉴클레티드는 RNA이다. 또한, 상기 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되었을 경우에 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는 한, 상기 키메라 형태의 이중 가닥 분자는 상기 센스 및 안티센스 가닥의 모두는 DNA 및 RNA로부터 구성될 수 있고, 또는 상기 센스 및 안티센스 가닥 중 어느 하나가 DNA 및 RNA로 구성될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키기 위하여, 바람직하게는, 상기 분자는 가능한 한 많은 DNA를 포함하고, 한편, 상기 표적 유전자 발현의 억제를 유도하기 위해서, 상기 분자는 충분한 발현 억제를 유도하는 범위 내의 RNA인 것이 요구된다.
키메라 형태의 이중 가닥 분자의 하나의 실시예에 있어서, 상기 이중 가닥 분자의 업스트림(upstream) 부분 영역(예를 들어, 상기 센스 또는 안티센스 가닥 내의 상기표적 서열 또는 이의 상보적 서열에 인접하는 영역)은 RNA이다. 바람직하게는, 업스트림 부분 영역은, 상기 센스 가닥의 5' 측(5' 말단) 및 상기 안티센스 가닥의 3'측(3' 말단)을 가리킨다. 즉, 바람직한 실시예에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 인접 영역, 또는 센스 가닥의 5' 말단 인접 영역 및 안티센스 가닥의 3' 말단 인접 영역 모두가 RNA로 구성된다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 또는 혼성체 형태의 이중 가닥 분자는 하기의 조합을 포함한다.
센스 가닥: 5'-[---DNA---]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5' :안티센스 가닥,
센스 가닥: 5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5' :안티센스 가닥, 및
센스 가닥: 5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-5' :안티센스 가닥.
상기 업스트림 부분 영역(upstream partial 부위)은, 상기 이중 가닥 분자의 센스 또는 안티센스 가닥 내의 표적 서열 또는 이의 상보적 서열의 말단에서부터 계수되는 약 9～13개의 뉴클레오티드의 도메인일 수 있다. 또한, 이러한 키메라 형태의 이중 가닥 분자의 예시로는 상기 폴리뉴클레오티드의 적어도 업스트림 절반 영역(상기 센스 가닥의 5'측 영역 및 상기 안티센스 가닥의 3'측 영역)이 RNA이고, 다른 절반이 DNA인 19～21 뉴클레오티드 길이의 가닥을 갖는 것을 포함한다. 이러한 키메라 형태의 이중 가닥 분자에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현 억제 효과는 안티센스 가닥 전체가 RNA인 경우보다 훨씬 높다(미국 특허 출원 번호 20050004064).
본 발명에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 헤어핀 구조, 예를 들면, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 DNA와 RNA로 구성된 짧은 헤어핀(short hairpin made of DNA and RNA, shD/R-NA)을 형성할 수 있다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 타이트한 헤어핀 턴(hairpin turn)을 형성하는 RNA 또는 RNA와 DNA의 혼합 서열이며 그것은 RNA 간섭을 통해서 유전자 발현을 중지시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 단일 가닥 상에 상기 센스 표적 서열과 상기 안티센스 표적 서열을 포함하고, 상기 서열은 루프 서열에 의해 분리된다. 일반적으로, 상기 헤어핀 구조는 dsRNA 또는 dsD/R-NA 내에서 세포 기구에 의해 절단되고, 그런 다음 RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 결합된다. 이러한 복합체는 상기 dsRNA 또는 dsD/R-NA의 표적 서열에 매치하는 mRNA와 결합하여 절단한다.
C2orf18 유전자에 대항하는(예를 들면 “C2orf18 siRNA")이중-가닥 분자는 유전자의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 상기 용어 "siRNA"는 표적 mRNA의 번역을 억제하는 이중 가닥 RNA 분자를 나타낸다. 본 발명의 문맥에서, 이중-가닥 분자는 C2orf18 유전자에 대항하는 센스 핵산 서열 및 안티-센스 핵산서열로 구성된다. 상기 이중-가닥 분자는 센스 및 표적 서열의 상보적인 안티센스 서열을 포함하기 위해 만들어졌다. 상기 siRNA는 dsRNA, shRNA, ds D/RNA 또는 shD/RNA일 수 있다.
C2orf18 유전자에 대항하는 이중 가닥 분자는 mRNA 표적영역에서 혼성화된다, 즉 표적 서열에 상응하는 영역에서 단일-가닥 mRNA 전사와 대게 연관되며 그 때문에 유전자에 의해 암화화된 폴피펩티드의 생산(발현)을 억제 및 감소하는 mRNA의 번역을 방해한다. 따라서, 본 발명의 이중-가닥 분자는 엄격한 조건하에서 C2orf18 유전자의 mRNA에서 구체적으로 혼성화하는 능력을 규정하고 있다.
본 발명에 문맥에 있어서, 이중-가닥 분자는 길이에 있어서 바람직하게 500, 200, 100, 50, 또는 25 미만의 뉴클레오티드이다. 보다 바람직하게는 이중-가닥 분자는 길이에 있어서 19 - 25 뉴클레오티드이다. C2orf18 이중-가닥 분자의 바람직한 표적 핵산 서열은 C2orf18의 표적 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드 서열 예를 들어 5'-GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3'(서열번호: 7) 또는 5'-GCACGACAGTCAGCACAAG-3'(서열번호: 8)을 포함한다. 따라서, 본 발명은 서열번호: 7 또는 8로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 이중-가닥 분자를 제공한다. 이중 가닥 분자의 RNA 영역에서 표적 유전자의 뉴클레오티드“t"는 "u"로 교체된다. 이중-가닥 분자의 억제능을 높이기 위하여 안티센스 가닥의 3 ’말단에 뉴클레오티디 "u" 를 첨가할 수 있다. 첨가된 "u"의 수는 적어도 2개 일반적으로는 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개이다. 첨가된 "u"는 상기 이중 가닥 분자의 상기 안티센스 가닥의 3' 말단에서 단일 가닥을 형성한다.
헤어핀 루프(loop) 구조를 형성하기 위하여, 임의의 뉴클레오티드 서열로 구성된 루프 서열은 상기 센스 및 안티센스 서열의 사이에 위치될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명은 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는 이중 가닥 분자를 제공하고, 상기 [A]는 mRNA 또는 상기 C2orf18 유전자의 cDNA의 표적 서열에서 구체적으로 혼성화 된 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드 서열이고, [A]는 C2orf18 유전자의 표적 서열에서 상응하는 올리고뉴클레오티드 서열이다; [B]는 3개에서 23개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열이고; 및 [A']는 [A]의 상보적인 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열이다. 상기 [A] 영역은 [A']에서 혼성화되고, 그리고 나서 [B] 영역으로 구성된 루프가 형성된다. 상기 루프 서열은 길이에 있어서 바람직하게 3개에서 23개의 뉴클레오티드이다. 상기 루프 서열은, 예를 들어 다음 서열로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html): CCC, CCACC, 또는 CCACACC: Jacque JM et al., Nature 2002, 418: 435-8.UUCG: Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5; Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4):1639-44. 'UUCAAGAGA ("ttcaagaga" in DNA)' 는 특히 적합한 루프 서열이다.
게다가, 23개의 뉴클레오티드로 구성된 루프 서열은 또한 활성 siRNA(Jacque J-M et al., Nature 2002, 418:435-8)을 제공한다. 본 발명의 문맥에서 적합한 이용을 위하여 바람직한 헤라핀 이중-가닥 서열 다음을 포함한다;
5'- GGAGCACAGCUUCCAGCAU-[B]-AUGCUGGAAGCUGUGCUCC -3' (서열번호: 7의 표적 서열을 위해); 및
5'-GCACGACAGUCAGCACAAG-[B]-CUUGUGCUGACUGUCGUGC-3' (서열번호: 8의 표적 서열을 위해).
구체적으로, 하기 이중-가닥 분자 [1]에서 [13]은 본 발명에 포함된다;
[1] 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 이중-가닥 분자에서, 상기 센스 가닥은 서열번호: 7 또는 8을 포함하는 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상기 이중-가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화되고, 상기 이중-가닥 분자는, 발현하는 C2orf18 유전자가 발현하는 세포로 도입될 때, 상기 유전자의 발현을 억제한다.
[2] 상기[1]의 이중-가닥 분자에서, 상기 표적 서열은 서열번호: 11을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 대략 19개에서 25개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다.
[3] 상기 [2]의 이중-가닥 분자에서, 상기 이중-가닥 분자는 단일 가닥 뉴클레오티드 가닥에 연결된 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 뉴클레오티드 전사체이다.
[4] 상기 [3]의 이중-가닥 분자는 일반적인 화학식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 가지며, 상기 [A]는 서열번호 7 또는 8의 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥이다; [B]는 대략 3개에서 23개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다; 그리고 [A']는 [A]의 서열에 상보적인 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥이다.
[5] 상기 [3]의 이중-가닥 분자는 일반적인 화학식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 가지고, 상기 [A]는 표적 서열로서 서열번호 7 또는 8을 포함하는 서열에 상응하는 리보뉴클레오티드 서열이다; [B]는 대략 3개에서 23개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다; 및 [A']는 [A]의 상보적인 서열을 포함하는 리보뉴클레오티드 서열이다.
[6] 상기 [1] - [5]의 이중-가닥 분자는 RNA를 포함한다.
[7] 상기 [1] - [5]의 이중-가닥 분자는 DNA 및 RNA를 포함한다.
[8] 상기 [7]의 이중-가닥 분자는 DNA 폴리뉴클레오티드 및 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드(hybrid)이다.
[9] 상기 [8]의 이중-가닥 분자에서 센스 및 안티센스 가닥은 각각 DNA 및 RNA로 만들어진다.
[10] 상기 [7]의 이중-가닥 분자는 DNA 및 RNA의 키메라이다.
[11] 상기 [10]의 이중-가닥 분자에서 센스가닥의 표적 서열의 5'-말단 영역 및/또는 안티센스 가닥에서 표적서열의 상보적 서열의 3'-말단 서열은 RNA를 포함한다.
[12] 상기 [11]의 이중-가닥 분자에서 상기 RNA 지역은 9에서 13의 뉴클레오티드를 포함한다.
[13] 상기 [1]-[5]의 이중-가닥 분자는 3' 오버행(overhang)를 포함한다.
본 발명의 상기 이중-가닥 분자는 하기에서 좀더 자세히 설명한다.
적합한 이중-가닥 분자의 올리고뉴클레오티드 서열은 Ambion 웹사이트(http://www.ambion.com/techlib/ misc/siRNA_finder.html)로부터 구할 수 있는 디자인 컴퓨터 프로그램을 이용하여 고안될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 하기의 프로토콜(protocol)을 기초로 이중-가닥 분자 합성을 위해 뉴클레오티드 서열을 선택한다.
표적 부위의 설계:
1. 상기 대상의 전사체의 AUG 시작 코돈(codon)으로부터 시작하여, AA 다이-뉴클레오티드(di-nucleotide) 서열을 구하기 위하여 다운스트림(downstream)을 스캔한다. 잠재적인 표적 부위로서 각각의 AA 및 3'에 인접하는 19개의 뉴클레오티드의 출현을 기록한다. Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7 등은 5' 및 3' 비번역 영역(untranslated 부위, UTR) 및 시작 코돈(코돈) 근방(75 염기 이내)의 영역에 대한 고안된 표적사열에 대응을 제안하지 않으며, 이는 이 영역은 조절 단백질 결합 부위에서 더욱 풍부할 수 있으며, UTR 결합 단백질 및/또는 번역 시작 복합체는 엔도뉴클레아제(endonuclease)복합체의 결합을 방해할 수 있기 때문이다.
2. 잠재적인 표적 부위를 적절한 인간 게놈 데이터베이스와 비교하여 다른 암호화 서열에 대하여 유의적인 상동성을 가지는 임의의 표적 부위의 검토 대상에서 제외한다. 상기 상동성 조사는 NCBI 서버: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 에서 찾을 수 있는 (블라스트(BLAST)(Altschul SF et al., Nucleic A챵s Res 1997, 25:3389-402; J Mol Biol 1990, 215:403-10.)를 이용하여 실행될 수 있다.
3. 합성을 위해 적합한 표적서열을 선택한다. Ambion에서 바람직하게 평가하는 유전자의 길이에 따라 몇몇 표적서열이 선택될 수 있다.
이중-가닥 분자를 세포 안으로 도입하기 위해 표준 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, C2orf18의 이중-가닥 분자는 mRNA 전사체를 바인딩(binding) 할 수 있는 폼(form)에서 세포 안으로 직접 도입될 수 있다. 이러한 실시예에서, 본 발명의 상기 이중-가닥 분자는 안티센스 분자를 위한 설명에서 일반적으로 수정될 수 있다. 다른 변경 또한 가능하고, 예를 들어 콜레스테롤-컨쥬게이트(cholesterol-conjugated) 이중-가닥 분자는 약리학적 특성을 개선시키는 것을 보여준다(Song et al., Nature Med 2003, 9:347-51).
대안으로, 이중-가닥 분자를 암호화한 DNA는 벡터(하기에서, 또한 ‘siRNA 벡터’로 나타낸다)내로 운반된다. 상기 벡터는 두 가닥(Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20: 500-5)의 발현을 허락하는 방법으로(DNA 분자의 전사에 의해) 서열 측면에 기능적으로 연결된 조절 서열을 가지는 발현 벡터(예를 들어, 소형 핵 RNA(snRNA) U6 또는 인간 H1 RNA 프로모터(promoter)로부터의 RNA 중합효소(polymerase) III 전사 유닛(unit))안으로 표적 C2orf18 유전자 서열을 클로닝(cloning) 함으로써, 생산되어 진다. 예를 들어, RNA 분자는 C2orf18 유전자의 mRNA가 첫 번째 프로모터에 의해 번역되어지기 위한 안타센스이다(예를 들어, 복제된 DNA의 프로모터 서열 3’). 예를 들면, C2orf18 유전자의 mRNA에 대한 안티센스인 RNA 분자는 제1 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 3' 프로모터 서열)에 의해 전사되고 상기 C2orf18 유전자의 mRNA에 대한 센스 가닥인 RNA 분자는 제2 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 5' 프로모터 서열)에 의해 전사된다. 상기 센스 및 안티센스 가닥은 상기 C2orf18 유전자의 발현을 제거(silencing)하는 이중 가닥 분자 구조물을 생성하기 위해 생체 내에서 혼성화한다. 또한, 상기 두 개의 구조물은 단일-가닥 구조물의 센스 및 안티센스 가닥을 만들기 위해 이용될 수 있다. 이 경우에 있어서, 이차 구조(예를 들어, 헤어핀)를 가지는 구조물은 표적유전자의 센스 및 안티센스 서열을 가지는 단일 전사체로서 생산될 수 있다.
구체적으로 본 발명은 센스 가닥 핵산 및 안티센스 핵산을 가지는 폴리뉴클레오티드의 단독 또는 제형을 가지는 벡터를 제공하고, 상기 센스 가닥 핵산은 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥의 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 전사체는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화하며, 상기 벡터는 C2orf18 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되는 경우 상기 유전자의 발현을 억제하다.
또한, 본 발명은 센스 가닥 핵산 및 안티센스 핵산을 가지는 폴리뉴클레오티드 조합 각각을 포함하는 벡터를 제공하고, 상기 센스 가닥 핵산은 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 안티센스 가닥 핵산은 센스 가닥의 상보적인 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 및 안티 센스가닥의 전사체는 이중-가닥 분자을 형성하기 위해 서로 혼성화 하며, 상기 벡터는 C2orf18 유전자 발현하는 세포 내로 도입될 때, 상기 유전자의 발현을 억제한다. 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이에 있어서 대략 19개 및 25개 뉴클레오티드 사이의 올리고뉴클레오티드이다(예를 들어, 서열번호: 11의 뉴클레오티드 서열로부터 인접한 뉴클레오티드). 보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드의 조합은 단일-가닥 뉴클레오티드 서열에 연결된 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지는 단일 뉴클레오티드 전사체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 조합은 일반적인 5'-[A]-[B]-[A']-3 화학식을 가지며, 상기 [A]는 서열 번호: 7 또는 8을 가지는 뉴클레오티드 서열이고; 상기 [B]는 대략 3개에서 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열이며; 상기 [A']는 [A]에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이중-가닥 분자의 벡터를 세포 안으로 도입하기 위해, 트렌스펙션을 높일 수 있는 물질을 사용할 수 있다. FuGENE6(Roche diagnostics), 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen), 올리고펙타민(Oligofectamine)(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)을 트렌스펙션을 높일수 있는 물질로 이용할 수 있다.
췌장암의 검출 또는 진단 방법:
췌장암 세포에서 많은 전사 촉진된(trans-activated) 유전자 사이에서, 본 발명은 많은 막관통 단백질(trans-membrane protein)을 암호화하는 하나의 새로운 유전자 C2orf18(GenBankTM Accession No. NM_017877)에 초점을 맞추고 있다. 본 명세서에서 "ANT2BP"(ANT2-binding protein) 및 "PAMP"(췌장암 미토콘드리아 단백질)을 병용하여 사용한다. C2orf18에서 구체적으로 다클론성 항체를 이용하여 RT-PCR, 노던 블랏(northern-blot), 및 면역조직화학적 검색으로 췌장암 세포의 과별현 및 정상적인 성인 필수 조직(심장, 폐, 신장, 간, 및 뇌)에서 발현이 되지 않거나, 매우 한정된 발현을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 암 발병(예를 들어, 조직 샘플과 같은, 개체에서 유래된 생물학적 시료에서 C2orf18 발현 수준의 결정에 의해 개체에서의 췌장암)의 성향의 존재를 결정하고, 검출하고 및/또는 진단하는 방법을 특징으로 한다. 변성(alteration)(예를 들어, 정상 대조군 수준과 비교하여 C2orf18 발현 수준의 증가)은 암(예를 들어, 췌장암)으로 고통받거나 암 발생의 위험이 있는 것을 의미한다.
그래서, 본 발명은 C2orf18 유전자의 발현 수준을 결정하는 것(예를 들어, 측정하는 것)을 수반한다. 알려진 서열은 GenBankTM 데이터베이스 엔터리에서 제공되는 서열 정보를 이용하여, 상기 C2orf18 유전자는 당업계의 잘 알려진 보통의 기술을 이용하여 결정 및 측정될 수 있다. 예를 들어, C2orf18 유전자의 상응하는 서열 데이터베이스 엔터리 내의 서열은 C2orf18 유전자에 상응하는 RNA 서열을 검출하기 위한 프로브(probe)를 만들기 위해 사용될 수 있다(예를 들어 노던 블럿 혼성화 분석). 프로브는 C2orf18 서열의 일반적으로 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예로서, 상기 서열은 C2orf18 핵산을 구체적으로 증폭시키기 위해, 예를 들어, 역잔사 기반의 중합효소 연쇄반응인 증폭-기반 검출 방법을 이용하여 프라이머를 만들기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 예로는, C2orf18에 대항하는 항체, 예를 들어 항-C2orf18 타클론성 항체 또는 항-C2orf18 단일클론성 항체는 면역분석법, 예를 들어 면역조직화학적 검색, 웨스턴 블랏 분석 또는 ELISA 그 밖의 방법을 위해 이용될 수 있다.
또한, C2orf18 유전자의 번역 산물은 증폭 기반의 검출 방법(예를 들면, RT-PCR)에 의한 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다. 또한 이러한 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 바탕으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 프라이머(서열번호: 3 및 4 )가 RT-PCR 또는 노던 블랏에 의한 검출에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
대안적으로, 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 검출될 수 있다. 예를 들면, C2orf18 단백질의 양이 측정될 수 있다. 번역 산물로서 상기 단백질의 양의 측정 방법은 상기 단백질을 구체적으로 인식하는 항체 또는 항체 모방체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일클론성 또는 다클론성일 수 있다. 또한, 상기 항체의 임의의 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)은, 상기 단편이 C2orf18 단백질에 대한 결합 능력을 보유하는 한, 검출에 사용될 수 있다. 단백질들의 검출을 위한 이러한 종류의 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 임의의 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
C2orf18 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 방법은 C2orf18 유전자의 번역 산물을 기초로 하고, 상기 염색 강도는 C2orf18 단백질에 대항하는 항체 또는 항체 모방체를 이용하여 면역조직화학적 검색을 통하여 관찰될 수 있다. 즉, 강한 염색의 관찰은 단백질의 존재의 증가 및 같은 시간에 C2orf18 유전자의 높은 발현 수준을 나타낸다.
게다가, 상기 번역 산물은 번역산물의 생물학적 활성을 기초로 검출될 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에서, C2orf18 단백질은 암 세포의 증식과 관련되어 있는 것을 보여준다. 따라서, C2orf18 단백질의 세포 증식 활성은 C2orf18 단백질이 생물학적 시료에 존재하고 있다는 지표로서 사용된다.
세포군, 예를 들어 개체의 조직 샘플에서 C2orf18 유전자의 발현 수준은 참조 세포군에서 유전자의 발현과 비교하였다. 상기 참조 세포군은 알려진 비교 파라미터인 예를 들어 췌장암 세포, 정상 췌장 세포 또는 췌장관 상피세포를 하나 이상 포함한다.
참조 세포군과 비교하여 테스트 세포군의 유전자의 발현 수준이 암 즉, 췌장암 또는 췌장암의 소인을 나타내는지 아닌지는 참조 세포군의 조성물에 달려있다. 예를 들어, 참조 세포군이 정상 세포(암이 아닌)로 구성되어 진다면, 테스트 세포군 및 참조 세포군의 유전자 발현 수준의 유사성은 암이 아니거나, 암의 위험이 없는 것을 나타낸다. 반대로 참조 세포군이 암세포로 구성되어 있다면, 테스트 세포군 및 참조 세포군의 유사성은 테스트 세포군이 암 세포를 포함하고 있다는 것을 나타낸다.
테스트 세포군에서 C2orf18 유전자의 발현 수준은 참조 세포군에서 C2orf18 유전자의 발현 수준과 1.1 이상, 1.5 이상, 2.0 이상, 5.0 이상, 10.0 이상 또는 2배 이상 일 때, “변화다”또는“ 다르다”라고 간주된다.
테스트 세포군에서 및 참조 세포군에서 차별적 유전자 발현은 대조군 핵산, 예를 들어 항존 유전자(housekeeping gene)에서 정상화될 수 있다. 예를 들어, 대조군 핵산은 세포에서 암 또는 암이 아닌 상태에서 차이가 없는 것으로 알려진 것이다. 대조군 핵산의 발현 수준은 테스트 또는 참조 세포군에서 신호 수준을 정상화하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 제어 유전자는, 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(Glyceraldehyde-3-인산염 dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 테스트 세포군은 많은 참조 세포군에 비교될 수 있다. 많은 참조 세포군의 각각은 알려진 파라미터가 다를 수 있다. 따라서, 테스트 세포군은 알려진 암세포를 포함하는 첫 번째 참조 세포군뿐만 아니라 췌장암 세포를 포함하지 않는 정상 세포를 가지는 두 번체 참조 세포와 비교될 수 있다. 상기 테스트 세포군은 암세포를 포함하거나 또는 포함되는 것을 의심할 수 있는 개체의 조직 또는 세포 샘플을 포함할 수 있다.
상기 세포군은 생검, 예를 들어 신체 조직 또는 체액, 즉 생물학적 유체(예를 들어 피, 객담, 타액)에서 획득할 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 세포군은 암, 예를 들어 췌장암으로부터 고생하고 있는 것으로 의심되는 개체의 췌장 조직으로부터 정제될 수 있다. 바람직하게, 상기 테스트 세포군은 상피세포를 포함한다. 상기 세피세포는 바람직하게 암, 예를 들어 췌장암이거나, 의심되는 조직이다.
참조 세포군의 세포는 테스트 세포군의 조직 형태와 유사한 것이 바람직하다. 선택적으로, 상기 참조 세포군은 예를 들어, 췌장암 세포주 또는 PDAC 세포주(즉, 양성 대조군) 또는 정상 비-암 세포주(즉, 음성 대조군)이다. 또한, 상기 대조 세포군은 분석된 파라미터 또는 조건이 알려진 세포의 분자 정보의 데이터베이스로부터 유래될 수 있다.
진단받는 개체는 바람직하게는 포유동물이다. 바람직한 포유동물은 인가, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
대안적으로, 본 발명에 따르면 개체의 조건을 조사하기 위하여 중간 결과가 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 암, 예를 들어 췌장암으로부터 고통받는 개체를 알아낼 수 있도록 의사, 간호사, 또는 다른 종사자 보조하기 위해 추가적인 정보를 결합할 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 개체-유래 조직에서 암세포를 검출하는데 사용될 수 있으며, 의사에게 암, 예를 들어 췌장암으로부터 고통받는 개체를 알아내기 위한 유용한 정보를 제공한다. 그래서, 본 발명은 개체에서 유래된 샘플, 예를 들어 췌장 조직 샘플에서 C2orf18의 수준을 결정하는 것과(예를 들어, 측정하는 것)과 관련 있다. 본 발명은, 암, 예를 들어 췌장암을 진단하기 위한 방법은 암, 예를 들어 췌장암을 검출하고 테스트하기 위한 방법을 또한 포함한다. 대안적으로, 또한 본 발명은 암을 진단하는 것은 개체에서 암의 의심, 위험 또는 가능성을 보여주는 것을 나타낸다.
암치료의 모니터링 및 효율 평가:
C2orf18 유전자는 정상 및 암 세포에서 차별적으로 발현되어 지고, 따라서 암 치료의 과정이 모니터되어지는 것이 가능하며, 상기 설명된 암을 진단 방법은 암, 특히 췌장암의 치료를 모니터링 및 효율을 평가를 위해 적용 및 채택될 수 있다. 구체적으로 암의 치료의 효울은 처치중에 개체로부터 유래된 세포에서 C2orf18 유전자의 발현 수준을 결정함으로써 평가될 수 있다. 요구되는 테스트 세포군은 치료 전, 치료하는 동안 및/또는 치료 후에 다양한 시간 점에서 개체로부터 획득될 수 있다. C2orf18 유전자의 발현 수준은 예를 들어 상기 설명한 방법에 따라 알아낼 수 있다. 본 발명의 문맥에서 당해 치료에 노출되지 않은 세포의 C2orf18 유전자 발현을, 검출된 발현 수준의 비교대상이 되는 대조군 수준으로 이용하는 것이 바람직하다.
C2orf18 유전자의 발현 수준을 정상세포 또는 비-암세포를, 예를 들어 비-췌장암세포를 포함하는 세포군의 대조군과 비교하여, 발현 수준의 유사성은 상기 치료가 효과가 있는 것을 나타내고 발현수준의 차이는 상기 치료의 덜 유리한 임상 결과 또는 예후를 나타낸다. 이와 반대로, 암세포 또는 암세포, 예를 들어 췌장암을 포함하는 세포군의 대조군에 대항하여 비교를 실시한 결과, 발현 수준의 차이는 효과적인 치료를 나타내는 반면, 발현 수준의 유사성은 더 유리한 임상 결과 또는 예후를 나타낸다.
게다가, 치료 전 및 후의 C2orf18 유전자 발현 수준은 치료의 효과를 평가하기 위해 본 발명의 방법에서 비교될 수 있다. 구체적으로 치료 후, 개체에서 유래된 생물학적 샘플에서 검출된 발현 수준(즉., 후-처리 수준)은 상기 개체로부터 치료시작 전 획득된 생물학적 시료(즉, 전-처리 수준)에서 검출된 발현 수준과 비교될 수 있다. 후-처리 수준을 전-처리수준과 비교하여 감소는 상기 치료가 효율적인 것을 나타내고 반면에 후-처리 수준과 전-처리 수준의 유사 또는 증가는 더 유리한 임상 결과 및 예후를 나타낸다.
본 명세서에서, 상기 용어“효능이 있는”은 병리학적 상향-조절 유전자의 발현의 감소, 병리학적 하향-조절 유전자의 발현 증가 또는 개체에서 암의 전이가능성, 유병율 또는 사이즈의 감소를 이끈다. 상기 치료를 예방적으로 적용할 때, “효능이 있는”은 상기 치료가 적어도 병의 하나의 임상 증상을 경감, 또는 예방 및 지체 또는 종양 형성을 막거나 늦추는 것을 의미한다. 개체에서 암의 상태의 평가는 표준 임상 프로토콜을 이용할 수 있다.
게다가, 치료의 효과는 암 진단과 관련된 어떠한 알려진 방법으로 알아낼 수 있다. 암은 예를 들어 증상이 보이는 이상 예로서 체중 감소, 복통, 요통, 감욕감퇴, 구역, 구토 및 일반적인 불안, 심약 및 황달을 확인함으로써, 진단될 수 있다.
췌장암을 검출, 진단 및 결정하기 위해 킷트 및 시약:
본 발명은 암을 검출, 진단 및 결정하기 위한 킷트를 제공한다. 바람직하게, 상기 암은 췌장암이고, 보다 바람직하게는 PDAC이다. 구체적으로, 상기 킷트는 개체에서 유래된 생물학적 시료에서 C2orf18의 발현 수준을 검출하기 위해 적어도 하나의 시료를 포함하고, 상기 시료는 하기의 그룹으로부터 선택되어 진다;
(a) C2orf18의 mRNA의 검출하기 위한 시료
(b) C2orf18 단백질을 검출하기 위한 시료; 및
(c) a 시약 for 검출하다 the 생리 활성 of the C2orf18 생리 활성을 검출하기 위한 시료.
C2orf18의 mRNA의 검출하기 위한 적합한 시료는 구체적으로 C2orf18 mRNA에 바인드(bind) 또는 확인하는 핵산, 예를 들어 C2orf18 mRNA의 부분에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 올리고펩타이드들은 C2orf18 mRNA에 구체적인 프라이머 및 프로브에 의해 예시되어진다. 상기 올리고펩타이드들은 당업자에 의해 잘 알려진 방법에 의해 준비되어진다. 필요한 경우, 상기 C2orf18 mRNA을 검출하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정될 수 있다.
이와 반대로, 상기 C2orf18 단백질은 검출하기 위한 적합한 시약은 C2orf18 단백질에 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일 클론성 또는 다 클론성일 것이다. 게다가 상기 단편은 C2orf18 단백질에서 바인딩(binding) 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변경(예를 들어, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등.)은 시약으로 사용될 수 있다. 상기 단백질의 검출를 위한 상기 항체들을 준비하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 그래서 상기 항체 및 그 등가물을 마련하기 위해 본 발명에서는 어떠한 방법도 채용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 직접 결합 또는 간접 표지 기술을 통해 신호 생성 분자로 표지 될 수 있다. 표지 및 항체 표지 방법 및 그들의 표적에 대한 항체의 결합 검출은 당업계에 잘 알려져 있고 임의의 표지 및 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다.
또한, 상기 생물학적 활성은 생물학적 시료에서 상기 발현되는 C2orf18 단백질로 인해 예를 들면, 세포 증식 활성의 측정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 개체 유래의 생물학적 시료의 존재하에서 배양되고, 그런 다음 증식 속도의 검출에 의해, 또는 세포주기 또는 콜로니 형성 능력에 의해 상기 생물학적 시료의 세포 증식 활성을 측정할 수 있다.
상기 키트는 고체 매트릭스 및 상기 C2orf18 유전자 또는 상기 C2orf18 단백질에 대한 항체, 세포 배양용 배지 및 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 상기 C2orf18 단백질에 대한 항체 검출용 2차 항체로 구성될 수 있다. 예를 들면, 좋은 예후 또는 나쁜 예후를 가지는 환자로부터 수득 된 조직 시료는 유용한 대조군 시약으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 킷트는 완충용액, 희석제, 여과장치, 바늘, 주사, 및 포장 부속물(예를 들면, 문서, 테이프, CD-ROM, 등)을 사용을 위한 지시 사항과 함께 포함되는, 상업적이고 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질들을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 시약 등은 라벨이 있는 용기 안에 유지될 수 있다. 적절한 용기는 병, 유리병, 및 검사 튜브를 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예에 따라, 상기 시약이 상기 C2orf18 mRNA에 대한 탐침인 경우, 상기 시약은 적어도 하나의 검출 부위를 형성하기 위해, 고체 매트릭스, 예를 들면, 다공성 스트립 상에 고정화될 수 있다. 상기 다공성 스트립의 측정 또는 검출 영역은 각각 핵산(탐침)을 포함하는, 다수의 부위를 포함할 수 있다. 또한 검사 스트립은 음성 및/또는 양성 대조군을 위한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 상기 검사 스트립으로부터 분리된 스트립 상에 위치될 수 있다. 선택적으로, 상이한 검출 부위는 고정화된 핵산의 상이한 양, 즉, 최초 검출 부위에서 더욱 높은 양 및 다음 부위에서 더 낮은 양을 포함할 수 있다. 피검 물질의 첨가에 있어서, 검출되는 신호를 나타내는 지점의 개수는 상기 시료에 존재하는 C2orf18 mRNA의 양의 정량적 표시를 제공한다. 상기 검출 부위는 임의의 적절하게 검출되는 모양에서 설정될 수 있고 전형적으로 검사 스트립의 너비에 걸친 막대 또는 점의 모양으로 있다.
대안적으로, 본 발명은 췌장암 발명의 소인 또는 존재를 결정, 진단 또는 검출하기 위한 시약을 제공한다.
스크리닝 방법:
과발현 C2orf18 세포에서 siRNA에 의해 내인성의 C2orf18의 녹다운은 세포 생장의 급격한 억제하는 결과를 가져오며, 세포의 생존력을 유지하는 필수적인 룰을 제안한다. 게다가, 하기의 웨스턴 분석에 의한 면역세포화학분석 및 세포 분획법은 C2orf18이 미토콘드리아에 위치하고, C2orf18은 세포에서 세포사멸 또는 에너지 항상성과 관련 있다는 것을 나타낸다. C2orf18의 기능 및 세포 이하의 위치의 상기 검출들은 췌장암 치료를 위한 가능성 있는 표적 분자임을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 과발현 C2orf18 세포의 증식 억제를 위한 후보물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 암세포이고, 구체적으로 췌장암 세포이며, 보다 구체적으로 PDAC 세포이다. C2orf18 유전자, 상기 유전자 또는 단편에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 유전자의 전자 조절 영역을 이용하여 유전자 발현 또는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 물질 또는 화합물을 스크리닝을 하는 것이 가능하다. 본 발명의 문맥에서, 생물학적 활성은 세포 증식 활성이다. 상기 물질 또는 화합물은 암, 예를 들어 췌장암과 같은 C2orf18-관련된 질환을 예방하고 치료하기 위한 약학적 후보물질 또는 화합물이다. 그러므로, 본 발명은 C2orf18 유전자, 상기 유전자 또는 단편에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 유전자의 전자 조절 영역을 이용하여 암, 구체적으로 췌장암, 보다 구체적으로 PDAC와 같은 C2orf18-관련된 질환을 예방하고 치료하기 위한 약학적 후보물질 또는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝하는 방법에 의해 확인된 물질 또는 화합물은 C2orf18 유전자의 발현 또는 상기 유전자 또는 물질의 전사 산물의 활성을 억제하는 화합물 또는 물질이고 또한, 암, 구체적으로 췌장암, 보다 구체적으로 PDAC와 같은 C2orf18-관련 질환의 치료에 효과적인 화합물이다. 즉, 본 발명을 통해 확인된 상기 물질 또는 화합물 임상적 이익을 가지는 것이 기대되고, 또한 동물 모델 또는 개체 실험에서 과발현 C2orf18 세포의 성장을 억제하는 능력을 테스트할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 본 발명의 내용에 있어서, 본 스크리닝 방법을 통해 확인된 물질 또는 화합물은 몇몇의 화합물을 포함하는 임의의 생물제제 화합물 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 세포 또는 단백질에 노출된 피검 물질 또는 화합물은 단일 화합물 또는 화합물들의 조합일 수 있다. 화합물들의 조합이 상기 방법들에 사용되는 경우, 상기 화합물들은 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다.
임의의 검사 시약 또는 화합물, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양 상등액, 발효시킨 미생물의 산물, 해양생물로부터의 추출물, 식물 추출물, 정제된 또는 천연 그대로의 단백질, 펩티드, 비펩티드, 화합물, 합성 미세분자 화합물(핵산 구조, 예를 들면, 안티센스 RNA, 이중 가닥 분자, siRNA, 리보자임, 등) 및 천연 화합물이 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 상기 검사 시약 또는 화합물은 당업계에 알려진 조합의 라이브러리 방법에 있어서 다수의 접근법 중 임의의 것을 사용하여 획득될 수 있으나, 이에 한정되지 않고,
(1) 생물학적 라이브러리,
(2) 공간적으로 주소화할 수 있는 평행의 고체상 또는 용액상 라이브러리,
(3) 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법,
(4) "하나의 비드 하나의 화합물" 라이브러리 방법 및
(5) 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 합성 라이브러리 방법을 포함한다.
상기 생물학적 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리로 제한되는 반면에, 다른 네 개의 접근법은 화합물의 펩티드, 비펩티드, 올리고머 또는 소분자 라이브러리로 이용가능하다(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67). 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법들의 예들은 당업계에서 확인될 수 있다(DeWitt et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13; Erb et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6; Zuckermann et al ., J Med Chem 37: 2678-85, 1994; Cho et al ., Science 1993, 261: 1303-5; Carell et al ., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell et al ., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061; Gallop et al ., J Med Chem 1994, 37: 1233-51). 화합물들의 라이브러리는 용액(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21 참조)에 또는 비드(Lam, Nature 1991, 354: 82-4), 칩(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6), 박테리아(미국 특허 번호 5,223,409), 포자(미국 특허 번호 5,571,698; 5,403,484 및 5,223,409), 플라스미드(Cull et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9) 또는 파지(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90; Devlin, Science 1990, 249: 404-6; Cwirla et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10; 미국 특허. 출원 2002-103360)에 존재할 수 있다.
임의의 본 스크리닝 방법에 의해 확인된 화합물의 구조의 한 부분이 있는 화합물은 첨가, 결실 및/또는 치환에 의해 전환되고, 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 의해 수득 된 상기 약제 또는 화합물을 포함된다.
또한, 상기 탐색 된 검사 시약 또는 화합물이 단백질인 경우, 또는 단백질을 암호화하는 DNA인 경우, 상기 단백질의 전체 아미노산 서열은 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추론하기 위해 확인될 수 있고, 또는 상기 수득 된 단백질의 부분적 아미노산 서열은 상기 서열에 기초한 탐침으로서 올리고 DNA를 제조하기 위해 분석될 수 있고, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위해 상기 탐침으로 cDNA 라이브러리를 탐색할 수 있다. 상기 수득 된 DNA는 암 치료 또는 예방용 후보인 상기 검사 시약 또는 화합물을 제조하는 데에 사용할 수 있다.
I. 인실리코 ( in silico ) 스크리닝 방법:
검사 화합물 라이브러리의 구성은 탐색 된 특성들을 가지는 것으로 알려진 화합물의 분자 구조, 및/또는 억제되는 표적 분자, 즉, C2orf18의 분자 구조의 지식에 의해 촉진된다. 추가적인 평가를 위한 검사 화합물의 예비 스크리닝에 대한 하나의 접근법은 상기 검사 화합물과 그것의 표적 사이에 상호작용의 컴퓨터 모델링이다. 본 발명에서 검사 화합물과 C2orf18 사이에 상호작용 모델링은 상호작용의 상세한 이해를 제공하고, 상호작용을 방해하기 위한 가능한 전략을 제공하며, 상호작용의 가능성 있는 분자 억제자를 포함한다.
컴퓨터 모델링 기술은 선택된 분자의 3차원 원자 구조의 가시화 및 상기 분자와 상호작용할 신규한 화합물의 순이론적 설계를 가능하게 한다. 상기 3차원의 구조는 상기 선택된 분자의 X선 결정학적 분석 또는 NMR 이미징에서의 데이터에 전형적으로 좌우된다. 상기 분자 역학은 역장(force field) 데이터를 요구한다. 컴퓨터 그래픽 시스템은 어떻게 신규한 화합물이 상기 표적 분자에 연결될지 예측을 가능하게 하고 뛰어난 결합 특이성을 위해 상기 화합물 및 표적 분자의 구조의 실험적 조작을 가능하게 한다. 상기 분자와 화합물의 상호작용의 예측은 작은 변화들이 하나 또는 두 개의 요구하는 분자 역학 소프트웨어 및 계산적으로 집약적인 컴퓨터에서 만들어지는 경우에, 일반적으로 사용자 친화적으로, 분자 설계 프로그램과 사용자 사이에 메뉴에 따라 조작하는 구조의 인터페이스와 연결될 것이다.
일반적으로 상기에 기재된 상기 분자 모델링 시스템의 예로는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램, Polygen Corporation, Waltham, Mass를 포함한다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 역학 기능을 수행한다. QUANTA는 구성, 그래픽 모델링 및 분자 구조의 분석을 수행한다. QUANTA는 상호적인 구성, 변형, 가시화, 및 서로의 분자의 행동 분석을 가능하게 한다.
많은 문헌들에서는 특정 단백질들과 상호적인 약제의 컴퓨터 모델링을 검토하였고, 예를 들면, Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166 (1988); Ripka, New Scientist 54-57 (Jun. 16, 1988); McKinlay and Rossmann, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122 (1989); Perry and Davies, Prog Clin Biol Res.291:189-93(1989); Lewis and Dean, Proc. R. Soc. Lond B Biol Sci. 236, 125-40 and 141-62 (1989); 및, with respect to a model receptor for nucleic acid compositions, Askew et al ., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90.등이 있다.
화학물질을 탐색하고 그래프로 묘사하는 다른 컴퓨터 프로그램은 업체들, 예를 들면, BioDesign, Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, and Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario에서 이용가능하다. 예를 들면, DesJarlais et al. (1988) J. Med. Chem. 31:722-9; Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505-24; Meng et al. (1993) Proteins 17:266-78; Shoichet et al. (1993) Science 259:1445-50을 참조한다.
추정되는 C2orf18 억제자가 일단 확인되면, 상기 확인된 억제자의 화학적 구조에 기초한 많은 변종들을 구성하기 위하여 조합의 화학 기술들이 사용될 수 있다. 후보 억제자의 상기 결과의 라이브러리, 또는 "검사 시약" 또는 “검사 화합물”는 추정의 억제자의 라이브러리의 표적 약제를 확인하기 위하여 본 발명의 C2orf18의 생물학적 활성을 억제하는 검사 시약 또는 화합물을 선별하는 방법을 사용하여 탐색될 수 있다.
II . 단백질의 기초한 스크리닝 방법
본 발명에 따르면, C2orf18 유전자의 발현은 암 세포, 구체적으로 췌장암 세포, 보다 구체적으로 PDAC 세포와 같은 유전자 과발현 세포의 생존 및/또는 성장에 아주 중대한 것을 제안한다. 따라서, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 기능 및 발현을 억제하는 시약 또는 화합물은 세포의 생장 및/또는 생존을 억제하고, 세포 생장 및 암의 예방 및 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 C2orf18 폴리펩티드을 이용하여 세포 생장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 화합물 또는 C2orf18 관련된 질환의 예방 및 치료를 위한 후보 물질 또는 화합물을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에서 성장인 억제되어진 세포는 암, 예를 들어 췌장암 세포, 구체적으로 췌장 관 선암종 세포와 같은 C2orf18의 과발현을 특징으로 한다. 상기 C2orf18 관련 질병은 암, 예를 들어 췌장암, 구체적으로 PDAC와 같은 C2orf18의 과발현을 특징으로 한다.
게다가, C2orf18 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편은 자연적으로 일어나는 C2orf18 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성이 유지되는 한, 본 발명의 스크리닝 방법에 이용될 수 있다.
상기 폴리펩티트 또는 단편은 펩티드의 유래 되는 적어도 하나의 생리적 활성이 유지되는 결과가 있다면 다른 물질에 연결될 수 있다. 사용 가능한 물질은 다음을 포함한다: 펩티드, 지질(lipids), 당 및 당 체인, 아세틸 그룹, 천연 및 합성 폴리머 등. 상기의 변경들은 추가적인 기능을 수여하기 위해 또는 폴리펩티드 및 단편을 안정화하기 위해 실행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되어지는 상기 폴리펩티드 또는 단편은 전통적인 정재 방법을 통한 자연적으로 발생하는 단백질로서 천연으로부터 또는 선택된 핵산 서열을 기초로 한 화학적 합성을 통해서 획득할 수 있다. 예를 들어, 전통적인 펩티드 합성 방법은 합성을 위해 하기를 포함한다:
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
2) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
3) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;
5) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
6) WO99/67288; 및
7) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
대안적으로, 상기 단백질은 폴리펩트드를 제조하기 위해 임의의 알려진 유전공학 방법적 방법을 사용하여 획득할수 있다(예를 들어., Morrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들어, 첫째, 발현되어지는 형태(프로모터를 포함하는 조절 서열의 다운스트림(downstream))에서 목적 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터는 준비되고, 적합한 숙주세포로 변화되어지고, 그리고 나서, 상기 숙주세포는 단백질을 생산하기 위해 배양되어 진다. 보다 구체적으로 C2orf18 폴리펩티드를 암호화한 유전자는 외래 유전자들, 예를 들면.pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS, 또는 pCD8을 발현하기 위해 상기 유전자를 벡터내로 삽입함으로서, 숙주(예를 들면, 동물)세포에서 발현된다. 프로모터는 발현을 위해 사용될 수 있다. 임의의 통상적으로 사용되는 프로모터는 예를 들어 SV40 초기 프로모터(SV40 early promoter)(Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141), EF-알파 프로모터(EF-alpha promoter)(Kim et al., Gene 1990, 91:217-23), CAG 프로모터(CAG promoter)(Niwa et al., Gene 1991, 108:193), RSV LTR 프로모터(RSV LTR promoter)(Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704), SR 알파 프로모터(SR alpha promoter)(Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466), CMV 즉시 초기 프로모터(CMV immediate early promoter)(Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9), SV40 후기 프로모터(SV40 late promoter)(Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94), 아데노바이러스 후기 프로모터(Adenovirus late promoter)(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946), HSV TK 프로모터(HSV TK promoter) 등을 포함한다. 외래 유전자를 발현하기 위해 숙주 세포 내로 상기 유전자의 도입은 임의의 방법들, 예를 들면, 전기천공법(Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15: 1311-26), 인산칼슘 방법(Chen et al., Mol Cell Biol 1987,7: 2745-52), DEAE 덱스트란 방법(Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12: 5707-17 ; Sussman et al., Mol Cell Biol 1984, 4: 1641-3), 리포펙틴 방법(Derijard B., Cell 1994, 7: 1025-37; Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5: 22-30; Rabindran et al., Science 1993, 259: 230-4) 등에 따라 수행될 수 있다. 상기 C2orf18 단백질은 실험관내(in vitro) 변환 시스템을 이용하여 실험관내에서 생산될 수 있다.
검사 시약 또는 화합물과 접촉되는 상기 C2orf18 폴리펩티드는, 예를 들면, 정제된 폴리펩티드, 용해성 단백질, 또는 다른 폴리펩티드들과 융합된 융합 단백질일 수 있다.
II -1. C2orf18 폴리펩티드에 연결된 물질 또는 화합물의 확인
단백질에 연결된 물질 또는 화합물은 단백질 또는 단백질의 생물학적 활성을 위해 암호화된 유전자의 발현이 변화될 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명은 세포 생장을 억제하고 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 물질 또는 화합물을 위한 다음 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 상기 C2orf18 폴리펩티드 또는 기능적 단편을 검사 시약 또는 화합물에 접촉하는 단계;
b) 상기 폴리펩티드(또는 단편) 및 검사 시약 또는 화합물 사이에 겹합을 밝히는 단계; 및
c) 상기 폴리펩티드(또는 단편)에 연결된 검사 시약 또는 화합물을 연관짓는 단계.
본 발명에 따라면, 세포 성장의 억제 및 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료함에 있어서 상기 검사 시약 또는 화합물의 치료적 효과는 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 세포 생장을 억제하고 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 물질 또는 화합물을 위한 다음 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 상기 C2orf18 폴리펩티드 또는 기능적 단편을 검사 시약 또는 화합물에 접촉하는 단계;
b) 상기 폴리펩티드(또는 단편) 및 검사 시약 또는 화합물 사이에 겹합을 밝히는 단계; 및
c) 상기 b)의 결합과 검사 시약 또는 화합물의 치료적 효과를 연관짓는 단계.
본 발명에서 상기 치료적 효과는 검사 시약 또는 화합물의 결합특성과 관련되어 있다. 예를 들어, 상기 검사 시약 또는 화합물인 폴리펩티드(또는 단편)에 연결될 때, 상기 검사 시약 또는 화합물은 후보물질 또는 치료적 효과를 가지는 화합물로서 확인 또는 선별될 수 있다. 대안적으로, 검사 시약 또는 화합물이 폴리펩티드(또는 단편)에 연결되지 않았다면, 상기 시약 또는 화합물은 충분한 치료적 효과를 가지지 않는 물질 또는 화합물로 밝혀질 것이다. 검사 시약 또는 화합물이 C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 것은 폴리펩티드에 대항하는 항체를 이용한 면역침강법을 통해 밝혀졌다. 따라서, 상기 탐색의 목적은, 상기 C2orf18 폴리펩티드 또는 상기 기능적 단편은 항체 인식 부위를 스크리닝하기 위해 사용되는 것이 선호된다. 스크리닝을 위해 사용되는 상기 항체는 본 당업자에게 잘 알려진 임의의 조제 방법에 의한 본 발명의 C2orf18 폴리펩티드의 항원(예를 들어, 에피토프)을 인식하는 것이고, 상기 항체 및 동등물을 준비하기 위해 본 발명에서 임의의 방법을 채택할 수 있다.
대안적으로, C2orf18 폴리펩티드 또는 상기 기능적 단편은 상기 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 대해, 특이성은 밝혀진, 단일클론 항체의 N 말단 또는 C 말단 인식부위(에피토프)를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 에피토프-항체 시스템이 사용될 수 있다(Experimental Medicine 1995, 13: 85-90). 예를 들면, 베타-갈락토시다제(β-갈락토시다아제), 말토스(maltose) 결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase), 녹색 형광 단백질(green florescence protein, GFP) 등을 가진 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터들은 그것의 다중 클로닝 부위의 사용에 의해 상업적으로 이용가능하고 본 발명에사 사용될 수 있다. 게다가, 에피토프에 대항하는 항체와 면역침강법에 의해 탐색되어지는 보다 작은 에피토프를 포함하는 융합 단백질은 당업게에 자명하다(Experimental Medicine 1995, 13:85-90). 10여 개의 아미노산으로 구성된 상기 에피토프는 C2orf18 폴리펩티드 또는 상기 기능적 단편의 특성이 변하지 않는 한 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리히스티딘(polyhistidine)(His-tag), 인플루엔자 집합체 인플루엔자 응집 HA, 인간 c-myc, FLAG, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7 gene 10 protein, T7-tag), 인간 단순 헤르페스 바이러스 당단백질(human simple herpes virus glycoprotein, HSV-tag), E-tag(단일클론 파지 상의 에피토프) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)은 면역침강법에 의해 탐색 되어진 융합단백질의 대응물로 잘 알려져 있다. GTS는 융합단백질을 형성하기 위해 C2orf18 폴리펩티드 또는 상기 단편을 융합되기 위한 단백질로서 사용되는 경우, 상기 융합단백질은 GTS에 대항하는 항체 또는 GTS에 구체적으로 결합된 물질 즉, 글루타티온(예를 들어 글루타티온-세파로우스 4B)을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
면역침강법에서, 면역 복합체는 C2orf18 폴리펩티드 및 검사 시약의 반응 혼합물에 항체(C2orf18 폴리펩티드 또는 상기 기능적 단편, 또는 폴리펩티드 또는 단편에 테그된 에피토프)를 추가함으로써, 형성될 수 있다. 상기 검사 시약 또는 화합물은 폴리펩티드에 결합되는 능력을 가지면, 형성된 면역 복합체는 C2orf18 폴리펩티드, 상기 검사 시약 또는 화합물 및 항체로 구성될 것이다. 이와 반대로, 상기 능력인 없는 검사 시약 또는 화합물은, 형성된 면역 복합체에서 오직 C2orf18 폴리펩티드 및 항체를 포함한다. 따라서, C2orf18 폴리펩티드에 검사 시약 또는 화합물을 결합하는 능력은 예를 들어, 형성된 면역 복합체의 크기를 측정하여 조사될 수 있다. 물질의 크기를 검출하는 임의의 방법은, 크로마토크래피, 전기영동법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스 IgG 항체를 검출을 위해 사용될 때, 단백질 A 또는 단백질 G 세파로오스는 형성된 면역 복합체의 양을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 보다 구체적은 면역침강법은, 예를 들어 Harlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52를 참조한다.
게다가, 상기 C2orf18 폴리펩티드 또는 기능적 단편은 운반체에 연결되는 물질 또는 화합물을 스크리닝하기 위해 사용된다. 폴리펩티드에 결합하기 위해 사용되는 운반체의 예에는 아가로스, 셀룰로스 및 덱스트란과 같은 불용성 다당류; 및 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 및 실리콘과 같은 합성 레진을 포함하고; 바람직하게는 상기 물질들로부터 제조된 상업적으로 이용가능한 비드 및 플레이트(예를 들어, 멀티-웰 플레이트, 바이오센서 칩, 등.)가 사용될 수 있다. 비드를 사용할 경우, 그것들은 컬럼에 충전될 수 있다. 대안적으로, 전자기 비드의 사용도 당업계에 알려져 있고, 자성을 통해 상기 비드에 결합된 폴리펩티드 및 검사 시약 또는 화합물을 즉시 분리할 수 있다.
운반체에 대한 상기 폴리펩티드의 결합은 화학적 결합 및 물리적 흡착과 같은, 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 상기 단백질을 구체적으로 인식하는 항체를 통해 운반체에 결합될 수 있다. 또한, 운반체에 대한 폴리펩티드의 결합은 또한 아비딘 및 비오틴의 조합과 같은 분자 상화작용에 의한 방법으로 수행될 수 있다.
운반체에 결합된 C2orf18 폴리펩티드 또는 상기 기능적 단편을 이용한 스크리닝 방법은 예를 들어, 검사 시약 또는 화합물을 운반체 결합된 폴피펩티드에 접촉하는 단계, 혼합물을 배양하는 단계, 운반체를 세척하는 단계 및 운반체에 결합된 물질 또는 화합물을 측정 및/또는 검출하는 간계를 포함한다. 상기 결합은 버퍼, 예를 들어, 상기 버퍼가 결합을 억제하지 않는 한, 포스페이트 버퍼 및 트리스(tris) 버퍼에 실행되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편을 이용한 바람직한 스크리닝 방법은 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, C2orf18 폴리펩티드는 친화 컬럼의 운반체에 고정되고, 적어도 하나의 검사 시약 또는 화합물을 포함하는 용액은 컬럼에 쓰인다. 검사 시약 또는 화합물을 로딩(loading) 한 후, 컬럼을 세척하고 난 후, 폴리펩티드에 결합된 검사 시약 또는 화합물을 적절한 버퍼에서 분리하였다.
본 발명에서, 상기 표면 플라스몬 공명 현상을 사용한 바이오센서는 상기 결합 물질 또는 화합물을 검출 또는 정량하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 이러한 바이오센서가 사용되는 경우, 상기 C2orf18 폴리펩티드 및 검사 시약 또는 화합물의 상기 상호작용은 표지 없는 오직 미량의 폴리펩티드를 사용한, 표면 공명 신호로서 실시간으로 관찰될 수 있다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia). 그러므로 BIAcore와 같은 바이오센서를 사용하여 폴리펩티드 및 검사 시약 또는 화합물 사이의 결합을 평가하는 것이 가능하다.
분자에서 운반체의 고정된 구체적 단백질의 노출에 의해 합성 화학적 화합물들 중 구체적 단백질 또는 천연 물질 뱅크 또는 랜덤 파지 펩티드 디스필레이 라이브러리의 분자에 결합하는 분자의 스크리닝 방법, 및 조합의 화학적 기술(Wrighton et al., Science 1996, 273:458-64; Verdine, Nature 1996, 384:11-3)을 기초한 당업자에게 잘 알려진 단백질뿐만 아니라 화학적 화합물을 분리하기 위한 초고속 스크리닝 방법. 상기 방법은 C2orf18 단백질 또는 이의 단편에 결합한 물질 또는 화합물(작용제(agonist) 및 길항제(antagonist))을 스크리닝하기 위해 사용된다.
검사 시약 또는 화합물이 단백질이면, 웨스트 웨스턴 블랏팅 분석(Skolnik et al ., Cell 65: 83-90 (1991))이 사용될 수 있다. 구체적으로, C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 단백질은 파지 벡터(예를 들면, ZAP)를 사용하여 상기 C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 세포, 조직, 기관 또는 배양된 세포들(예를 들어, 췌장암 세포)로부터 유래된 cDNA 라이브러리를 제조, 상기 cDNA 라이브러리의 벡터에 의해 암호화된 LB 아가로스 상에서 상기 단백질을 발현, 필터 상에 발현된 상기 단백질을 고정, 상기 필터로 상기 정제되고 표지 된 C2orf18 폴리펩티드를 반응, 및 상기 C2orf18 폴리펩티드 표지에 따라 상기 C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 단백질들을 발현하는 프라그를 검출함으로써 수득 될 수 있다.
방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I), 효소(예를 들어, 알칼라인 포스파타아제, 고추냉이 페록시다아제, 베타-갈락토시다아제, 알파-글루코시다아제), 형광물질(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시네이트(FITC), 로다민) 및 비오틴/아비딘과 같은 표지 물질들이 본 발명의 방법에서 C2orf18 폴리펩티드의 상기 표지를 위해 사용될 수 있다. 상기 단백질이 방사성 동위원소로 표지된 경우, 상기 검출 또는 측정은 액체 신틸레이션(scintillation)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 단백질이 효소로 표지 되면, 색깔의 생성과 같은, 상기 기질의 효소적 변화를 검출하기 위해 상기 효소의 기질을 첨가함으로써 검출 또는 측정할 수 있다. 또한, 형광물질이 상기 표지로서 사용된 경우, 상기 결합된 단백질은 형광광도계를 사용하여 검출 또는 측정될 수 있다.
게다가, 단백질에 연결된 상기 C2orf18 폴리펩티드는 C2orf18 폴리펩티드에 융합된 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, GST), 또는 C2orf18 폴리펩티드에 구체적으로 연결된 항체의 이용에 의해 측정하거나 검출할 수 있다. 본 스크리닝에서 항체가 사용된 경우, 상기 항체는 상기 언급된 표지 물질 중 하나로 바람직하게 표지되고, 상기 표지 물질을 바탕으로 검출 또는 측정된다. 대안적으로, C2orf18 폴리펩티드에 대한 상기 항체는 표지 물질로 표지된 2차 항체로 검출되는 1차 항체로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 스크리닝에서 상기 C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 상기 항체는 단백질 G 또는 단백질 A 컬럼을 사용하여 검출 또는 측정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 상기 스크리닝 방법의 다른 실시예에서, 세포를 이용한 이중 하이브리드 시스템이 사용될 수 있다(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”, “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid 분석 Kit”, “MATCHMAKER one-Hybrid system”(Clontech); “HybriZAP Two-Hybrid VECTOR System”(Stratagene); 참조 “Dalton et al., 세포 1992, 68: 597-612”, “Fields et al., Trends genet 1994, 10: 286-92).
상기 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에 있어서, 본 발명의 상기 C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편은 SRF-결합 영역 또는 GAL4 결합 영역에 융합되고 효모 세포에서 발현된다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 상기 C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 세포들로부터 제조되고, 이러한 라이브러리가, 발현되는 경우, VP16 또는 GAL4 전사 활성 영역에 융합된다. 그런 다음 상기 cDNA 라이브러리는 상기 효모 세포 내로 도입되고 상기 라이브러리로부터 유래된 상기 cDNA는 검출된 양성 클론으로부터 분리된다(본 발명의 상기 C2orf18 폴리펩티드에 결합하는 단백질이 효모 세포에서 발현되는 경우, 상기 두 개의 결합은 양성 클론을 검출이 가능하게 하는, 리포터 유전자를 활성화함). 상기 cDNA에 의해 암호화되는 단백질은 상기 분리된 cDNA를 E. Coli에 도입하여 단백질을 발현함으로써 제조될 수 있다.
리포터 유전자로서, 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자 등이 HIS3 유전자와 더불어 사용될 수 있다. 상기 스크리닝에의해 확인된 상기 물질 또는 화합물은 C2orf18 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제를 위한 호보이다. 상기 용어“작용제”폴리펩티드에 결합함으로써, 폴리펩티드의 기능을 활성화 하는 분자이다. 이와 반대로, 상기 용어“길항제”는 폴리펩티드에 결합함으로써 폴리펩티드의 기능을 억제하는 분자이다. 게다가, 길항제로서, 이러한 스크리닝에 의해 분리된 물질 또는 화합물은 분자들(핵산(RNAs 및 DNAs) 및 단백질 포함)과 상기 C2orf18 폴리펩티드의 생체 내 상호작용을 억제시키는 화합물에 대한 후보이다.
II -2. C2orf18 폴리펩티드의 생리 활성의 검출에 의해 물질 또는 화합물의 확인
본 발명에 따르면, C2orf18 유전자의 발현은 과발현 C2orf18 유전자, 예를 들면, 암세포, 구체적으로 췌장암 세포, 보다 구체적으로 PDAC 세포의 성장 및/또는 생존에 중요함을 보여준다. 따라서, C2orf18 유전자의 번역 산물을 생물학적 기능의 삭제 또는 억제하는 물질 또는 화합물은 세포 성장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 화합물, 또는 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료할수 있는 후보 물질 또는 화합물로 쓰일 수 있다. 그러므로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편이 이용하여 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질 또는 화합물 또는 세포 성장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 또한 제공한다:
II -2. C2orf18 폴리펩티드의 생리 활성의 검출에 의해 물질 또는 화합물의 확인
본 발명에 따르면, C2orf18 유전자의 발현은 과발현 C2orf18 유전자, 예를 들면, 암세포, 구체적으로 췌장암 세포, 보다 구체적으로 PDAC 세포의 성장 및/또는 생존에 중요함을 보여준다. 따라서, C2orf18 유전자의 번역 산물을 생물학적 기능의 삭제 또는 억제하는 물질 또는 화합물은 세포 성장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 화합물, 또는 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료할수 있는 후보 물질 또는 화합물로 쓰일 수 있다. 그러므로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편이 이용하여 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질 또는 화합물 또는 세포 성장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 또한 제공한다:
a) C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편과 검사 시약 또는 화합물을 접촉하는 단계; 및
b) a) 단계의 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편의 생리 활성을 검출하는 단계.
본 발명에 따르면, C2orf18 관련 질환 예방 또는 치료를 위한 후보 물질 또는 화합물, 또는 세포 성장을 억제하는 후보 물질 또는 화합물의 치료적 효과를 평가한다. 따라서, 본 발명은 다음을 단계를 포함하는 C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편이 이용하여 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질 또는 화합물 또는 세포 성장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
a) C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 단편과 검사 시약 또는 화합물을 접촉하는 단계;
b) a) 단계의 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편의 생리 활성을 검출하는 단계; 및
c) 상기 b)의 생리 활성과 상기 시험 물질 또는 화합물과 연관시키는 단계.
본 발명에서, 상기 치료적 효과는 C2orf18 폴리펩티드의 생리 활성 또는 상기 기능적 단편과 연관된다. 예를 들어, 상기 검사 시약 또는 화합물이 존재하지 않는 수준과 비교하여 C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생리적 활성을 삭제하거나 억제한다면, 상기 물질 또는 화합물은 치료적 효과를 가지는 후보 물질 또는 화합물로 선택 또는 확인된다. 대안적으로, 상기 검사 시약 또는 화합물이 존재하지 않는 수준과 비교하여 C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생리적 활성을 삭제 또는 억제하지 않으면, 상기 물질 또는 화합물은 충분한 치료적 효과를 가지는 않는 후보 물질 또는 화합물로 확인된다.
임의의 폴리펩티드는 본 발명의 색인으로서 사용될 수 있는 C2orf18 폴리펩티드의 생물학적 활성을 한 가지를 가지고 있는 한 스크리닝을 위해 사용할 수 있다. C2orf18 폴리펩티드는 암 세포의 세포 증식을 촉진하는 활성을 가지고 있기 때문에, C2orf18 폴리펩티드의 생물학적 확성은 인간 C2orf18 폴리펩티드의 세포-증식 활성을 포함하는 스크리닝을 위한 색인으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 C2orf18 폴리펩티드를 사용할수 있고, 폴리펩티드의 기능적 동등물 또는 이의 기능적 단편 또한 이용할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 적합한 세포에서 내인성 또는 외인성으로 발현한다.
본 발명에서 검출된 생물학적 활성이 세포 증식 활성 또는 항-아포토시스 활성이면, 예를 들어, C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편이 발현하는 세포의 제조, 피검 물질 또는 화합물에 존재하는 세포의 배양 및 세포 증식 속도의 결정, 세포 주기의 측정을 통해 검출 할 수 있으며, 뿐 만 아니라 창상 치유 활성(wound-healing activity)의 검출, Matrigel invasion 분석 실행 및 콜로니 형성 활성을 측정하여 검출할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 스크리닝 (b) 단계 이후에 다음에 단계를 더 포함한다:
c) 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 생물학적 활성과 비교하여 폴리펩티드의 생물학적 활성이 억제된 피검 물질 또는 화합물을 선택하는 단계.
게다가, 상기 후보 물질 또는 화합물은 비(non)-C2orf18 발현 세포의 효과와 비교하여 C2orf18의 특이성을 확인할 수 있다. 상기 후보 물질 또는 화합물이 C2orf18 발현 세포에서 효과를 가지거나 C2orf18 비-발현 세포에서 효과를 가지를 않는다면, 상기 후보 물질 또는 화합물은 C2orf18에 특이성을 가진다. 본 발명의 스크리닝에 의해 분리된 상기 물질 또는 화합물은 C2orf18 폴리펩티드의 길항제의 후보 물질 또는 화합물이고, 상기 후보 물질 또는 화합물은 분자(핵산(RNA 및 DNA) 및 단백질을 포함)와 폴리펩티드의 생체내 상호작용을 억제한다.
세포 증식 활성 또는 항-아포토시스 활성뿐만 아니라, C2orf18 단백질은 ANT2 단백질에 결합 활성을 가진다. 따라서, 본 발명은 C2orf18 및 ANT2 사이의 결합을 억제하는 물질 또는 화합물을 위한 스크리닝 방법을 또한 제공한다. C2orf18 및 ANT2 사이의 결합을 억제하는 물질 또는 화합물은 암 세포 증식을 억제하고, 암을 치료 또는 예방하는데 유용하게 쓰일 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 세포의 증식을 억제하는 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 암을 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 또한 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 피검 물질 또는 화합물의 존재하에서 C2orf18 단백질 및 ANT2 단백질을 접촉하는 단계;
(b) C2orf18 및 ANT2 단백질 사이의 결합 수준을 검출하는 단계;
(c) 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 C2orf18 및 ANT2 단백질의 결합 수준 비교하는 단계; 및
(d) C2orf18 및 ANT2 단백질 사이의 결합을 억제하는 물질 또는 화합물로서, C2orf18 및 ANT2 단백질의 결합 수준을 감소시키는 피검 물질 또는 화합물을 선별하는 단계, 즉 상기 후보 몰질 또는 화합물은 암 세포 증식을 억제하고 암의 예방 및 치료를 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따라서, 세포 성장을 억제하는 물질 또는 화합물, 또는 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 물질 또는 화합물의 치료적 효과를 평가한다. 따라서, 본 발명은 암 세포 증식을 억제하는 후보 물질 또는 화합물의 스크리닝을 위한 방법, 및 암을 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 또한 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 피검 물질 또는 화합물의 존재하에서 C2orf18 단백질과 ANT2 단백질을 접촉하는 단계;
(b) C2orf18 및 ANT2 단백질 사이에 결합 수준을 검출하는 단계;
(c) 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 C2orf18 및 ANT2 단백질을 결합 수준을 비교하는 단계; 및
(d) 상기 c)의 결합 수준과 피검 물질 또는 화합물의 치료적 효과를 연관짓는 단계.
본 발명에서, 상기 치료적 효과는 C2orf18 및 ANT2 단백질의 결합 수준과 연관된다. 예를 들어, 상기 피검 물질 또는 화합물이 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 C2orf18 및 ANT2 단백질의 결합 수준이 감소한다면, 상기 피검 물질 또는 화합물은 치료적 효과를 가지는 후보 물질 또는 화합물로서 선택 또는 확인 될 것이다. 대안적으로, 상기 피검 물질 또는 화합물이 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 C2orf18 및 ANT2 단백질의 결합 수준이 감소하지 않는다면, 상기 피검 물질 또는 화합물은 충분한 치료적 효과를 가지지 않는 물질 또는 화합물이다.
본 발명의 문맥에서, 두 단백질 사이의“결합의 억제”는 두 단백질 사이의 결합을 최소한 줄이는 것을 나타낸다. 따라서, 샘플에서 결합 쌍의 퍼센트는 적절한 대조군 샘플(예를 들어, 피검 물질을 처리하지 않은)과 비교하여 감소 할 것이다. 대조군 샘플에서 단백질은 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 25%, 10%, 5%, 1% 보다 적게 또는 그 이하(예를 들어., 0%)로 결합한다. 본 명세서에서, C2orf18 단백질 및 ANT2 단백질은 하기에서 나타낸 상기 단백질들의 기능적 동등물을 포함한다. 스크리닝에 사용된 C2orf18 또는 ANT2 단백질 또는 이의 기능적 동등물은 당업자에게 잘알려진 방법에 의해 천연 단백질 또는 재조합 단백질을 사용 할 수 있다. 상기 단백질은 폴리펩티드를 생산하기 위해 임의의 알려진 유전자 공학 방법을 통해 획득할 수 있다(예를 들어,Morrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들어, 재조합 단백질은 단백질(예를 들어, 서열번호: 11(C2orf18을 위한) or 25(ANT2을 위한)의 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA)을 암호화한 DNA를 적절한 발현 벡터내로 삽입하고, 상기 벡터는 적절한 숙주 세포내로 도입하고, 적절한 배지에서 상기 숙주를 배양하고, 상기 숙주 세포의 추출물을 획득하여, 크로마토그래피, 예를 들어, 이온교환크로마토그래피, 역상크로마토그래피, 겔여과 또는 단백질이 고정된 것에 대응하는 항체의 컬럼을 이용한 친화성 크로마트그래피에서 추출물하는 것을 거쳐, 또는 전술한 컬럼의 하나이상의 조합을 통해 단백질을 정제하여 준비할 수 있다.
또한, 본 발명의 문맥에서 이용되는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 단백질과 융합 단백질 또는 여러 히스타딘이 첨가된 재조합 단백질같이 단백질이 숙주세포(예를 들어, 동물 세포 및 E. coli)내에서 발현 할 때, 상기 발현된 재조합 단백질은 글루타티온 컬럼 또는 니켈 컬럼을 이용하여 정제 할 수 있다.
융합 단백질을 정제한 후, 요구되는 트롬빈(thrombin) 또는 인자-Xa(factor-Xa)로 절단을 함으로써, 목적 단백질 이외의 지역을 또한 배제할 수 있다.
천연 단백질은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어 C2orf18 또는 ANT2 단백질이 결합된 것에 결합하는 항체가 있는 친화 칼럼을 조직 추출물 또는 단백질이 발현하는 세포를 접촉함으로써 분리할 수 있다. 상기 항체는 C2orf18 또는 ANT2 단백질에서 결합되는 한, 단일 클론성 항체, 다클로성 항체 또는 변경된 항체일수 있다. 상기 C2orf18 또는 ANT2 단백질 또는 이의 기능적 동등물은 실험관내(in vitro) 변환 시스템을 이용하여 실험관내에서 생산될 수 있다.
게다가, C2orf18 및 ANT2 단백질의 결합 활성이 유지되는 한 C2orf18 및 ANT2 proteins의 부분적 펩티드 역시 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 부분적 펩티드는 유전자 공학,펩티드 합성의 알려진 방법 또는 천연 C2orf18 또는 ANT2 단백질을 적절한 펩타이드와 다이제스팅(digesting)에의 생산 할 수 있다. 상기 펩티드 합성은, 예를 들어 고체상 합성 또는 액체상 합성을 이용할 수 있다. 전통적인 펩티드 합성 방법은 다음의 합성을 채택할 수 있다:
1) Peptide Synthesis, Interscience, 뉴욕, 1966;
2) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, 뉴욕, 1976;
3) Peptide Synthesis (일본어), Maruzen Co., 1975;
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (일본어), Maruzen Co., 1985;
5) Development of Pharmaceuticals (second volume) (일본어), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
6) WO99/67288; and
7) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
상기 폴리펩티드 및 이의 단편이 서로 연결되어 그들의 고유의 능력을 유지되는 한 폴리펩티드 또는 이의 단편은 다른 물질에 더 연결될 수 있다. 사용할 수 있는 물질은 다음을 포함한다: 펩티드, 지질(lipids), 당 및 당 체인, 아세틸 그룹, 천연 및 합성 폴리머 등. 상기의 변경들은 추가적인 기능을 수여하기 위해 또는 폴리펩티드 및 단편을 안정화하기 위해 실행될 수 있다.
피검 물질 또는 화합물의 존재하에서 접촉된 상기 C2orf18 및 ANT2 폴리펩티드 또는 기능적 등가물은, 예를 들어, 정제된 폴리펩티드, 가용성 단백질 또는 융합 단백질은 다른 폴리펩티드와 융합될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 C2orf18 와 C2orf18 와 결합하는 파트너 ANT2의 연관을 방해하는 높은 개연성을 가진 피검 물질 또는 화합물의 효과적이고 빠른 감식을 제공한다. 일반적으로, 상기 연관을 방해하는 피검 물질 또는 화합물의 능력을 알아내는 임의의 방법은 본 발명에서 사용하기 적합하다. 예를 들어, ELISA 포맷(format)에서 경쟁적 또는 비-경쟁적 억제 분석을 이용할 수 있다. 대조군 실험은 시스템의 최대의 결합 능력(예를 들어, C2orf18 와 ANT2을 접촉하고, C2orf18에 연결된 ANT2의 양을 결정하는것)을 알아내기 위해 실행된다.
단백질 사이에 결합을 억제하는 물질 또는 화합물을 확인하는 방법으로는 당업자에게 잘 알려진 많은 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 확인은 시험관 내 분석 시스템,예를 들어 세포의 시스템으로서 실시될 수 있다. 보다 구체적으로, 첫째, C2orf18 또는 이의 파트너 ANT2가 지지체에 결합하고, 다른 단백질은 피검 물질 또는 상기 화합물과 함께 접촉한다. 그 다음, 상기 혼합물을 배양하여, 세척하고, 상기 지지체에 결합된 다른 단백질을 검출 및/또는 측정된다.
단백질에 결합하기 위해 사용되는 지지체의 예에는 아가로스, 셀룰로스 및 덱스트란과 같은 불용성 다당류; 및 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 및 실리콘과 같은 합성 레진을 포함하고; 바람직하게는 상기 물질들로부터 제조된 상업적으로 이용가능한 비드 및 플레이트(예를 들어, 멀티-웰 플레이트, 바이오센서 칩, 등.)가 사용될 수 있다. 비드를 사용할 경우, 그것들은 컬럼에 충전될 수 있다. 대안적으로, 전자기 비드의 사용도 당업계에 알려져있고, 자성을 통해 상기 비드에 결합된 단백질을 즉시 분리할 수 있다.
지지체에 대한 상기 단백질의 결합은 화학적 결합 및 물리적 흡착과 같은, 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 상기 단백질을 구체적으로 인식하는 항체를 통해 지지체에 결합될 수 있다. 또한, 지지체에 대한 단백질의 결합은 또한 아비딘 및 비오틴조합과 같은 분자의 상호작용의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 단백질들 사이의 결합은 버퍼, 예를 들면, 상기 버퍼가 상기 단백질 사이의 결합을 억제하지 않는 한, 이에 한정되지 않고, 인산염 버퍼 및 Tris 버퍼에서 수행된다. 본 발명에서, 상기 표면 플라스몬 공명 현상을 사용한 바이오센서는 상기 결합 단백질을 검출 또는 정량하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 이러한 바이오센서가 사용되는 경우, 상기 단백질 사이의 상기 상호작용은 표지 없는 오직 미량의 폴리펩티드를 사용한, 표면 공명 신호로서 실시간으로 관찰될 수 있다(예를들면, BIAcore, Pharmacia). 그러므로 BIAcore와 같은 바이오센서를 사용하여 C2orf18 및 ANT2사이의 결합을 평가하는 것이 가능하다.
대안적으로, C2orf18 또는 ANT2은 표지될 수 있고, 상기 단백질에 연결된 표지는 단백질의 연결을 검출 또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 하나의 상기 폴리펩티드를 미리 표지한 후, 상기 표지된 폴리펩티드는 피검 화합물의 존재하에서 상기 다른 폴리펩티드로 접촉시키고, 그런 다음 결합된 폴리펩티드는 세척한 후 상기 표지에 따라 검출 또는 측정되었다.
방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I), 효소(예를 들어, 알칼라인 포스파타아제, 고추냉이 페록시다아제, b-갈락토시다아제, b-글루코시다아제), 형광물질(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시네이트(FITC), 텍사스 레드, 녹색 형광 단백질 및 로다민), 자성 비드(예를 들면, DYNABEADSTM), 열량측정 표지(예를 들면,콜로이드 금(colloidal gold) 또는 유색 유리 또는 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)비드) 및 비오틴/아비딘과 같은 표지 물질들이 본 발명의 방법에서 단백질의 상기 표지를 위해 사용될 수 있다. 이러한 표지들의 사용을 나타낸 특허들에는 미국 특허 번호 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,275,149; 및 4,366,241이 포함된다. 그러나, 본 발명은 상기의 사항으로 제한되지 않고, 분광기, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 임의의 검출 가능한 표지를 사용할 수 있다.
상기 단백질이 방사성 동위원소로 표지된 경우, 상기 검출 또는 측정은 액체 신틸레이션(scintillation)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 효소로 표지된 단백질은 흡수계로, 색깔의 생성과 같은, 상기 기질의 효소적 변화를 검출하기 위해 상기 효소의 기질을 첨가함으로써 검출 또는 측정될 수 있다. 또한, 형광물질이 상기 표지로서 사용된 경우, 상기 결합된 단백질은 형광광도계를 사용하여 검출 또는 측정될 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에서 결합은 C2orf18 또는 ANT2에 대항하는 항체를 이용하여 검출 또는 측정될 수 있다. 예를 들면, 지지체에 고정화된 C2orf18를 피검 물질 또는 화합물 및 ANT2 접촉시킨 후, 상기 혼합물을 배양하여 세척하고, 검출 또는 측정은 ANT2 대한 항체를 사용하여 실시할 수 있다. 대안적으로, ANT2는 지지체에 고정화되고, C2orf18에 대한 항체는 항체로서 사용될 수 있다.
본 스크리닝에서 항체가 사용된 경우, 상기 항체는 상기 언급된 표지 물질 중 하나로 바람직하게 표지되고, 상기 표지 물질을 바탕으로 검출 또는 측정된다. 대안적으로, C2orf18 또는 ANT2에 대한 상기 항체는 표지 물질로 표지된 2차 항체로 검출되는 1차 항체로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 스크리닝에서 상기 단백질에 결합하는 상기 항체는 단백질 G 또는 단백질 A 컬럼을 사용하여 검출 또는 측정될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 상기 확인 방법의 다른 실시예에서, 세포를 이용한 이중 하이브리드 시스템이 사용될 수 있다(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”, “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid 분석 Kit”, “MATCHMAKER one-Hybrid system”(Clontech); “HybriZAP Two-Hybrid VECTOR System”(Stratagene); 참조 “Dalton 및 Treisman, 세포 1992,68: 597-612)”, “Fields 및 Sternglanz, Trends genet 1994, 10: 286-92”).
상기 이중 하이브리드 시스템에서, 예를 들면, C2orf18는 상기 RF-결합 부위 또는 GAL4-결합 부위에 융합되고 효모세포에서 발현된다. ANT2는 상기 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 부위에 융합되고 피검 물질 또는 화합물의 존재하에서 상기 효모 세포에서 또한 발현된다. 대안적으로, ANT2는 상기 SRF-결합 부위 또는 GAL4-결합 부위에 융합되고, C2orf18는 상기 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 부위에 융합된다. 피검 물질 또는 화합물이 C2orf18 및 ANT2 사이의 결합을 억제하지 않으면, 상기 두 결합은 리포터 유전자를 활성화하고, 양성 클론을 검출할 수 있게 한다. 리포터 유전자로서, 예를들면, HIS3 유전자외에 Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라아제 유전자 등이 사용될 수 있다.
본 명세서에서, C2orf18 및 ANT2 사이의 결합 수준은 C2orf18 및 ANT2의 결합 후, 일어나는 임의의 변화로서 측정한다. 구체적으로, 상기 스크리닝은 피검 물질 또는 화합물을 J82 또는 UMUC 세포와 같은, C2orf18 및 ANT2가 발현하는 세포와 접촉함하여 수행 할 수 있다. 세포 증식의 억제는 C2orf18 및 ANT2의 결합에서 피검 물질 또는 화합물의 영향을 밝힘으로서 검출할 수 있다.
1. 경쟁적인 분석 포맷( format )
경쟁적인 분석은 본 발명의 피검 물질 또는 화합물을 스크리닝하기 위해 사용된다. 추가적인 예로서, 경쟁적인 ELISA 포맷은 고형 지지체에 결합하는 C2orf18 (또는 ANT2)를 포함한다. 상기 결합된 C2orf18 (또는 ANT2)는 ANT2 (또는 C2orf18)와 피검 물질 또는 화합물과 함께 배양된다. 충분한 시간이 지난후, 피검 물질 또는 화합물 및/또는 ANT2 (또는 C2orf18)를 C2orf18 (또는 ANT2)에 결합시키기 위해, 상기 기질은 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척하였다. C2orf18에 결합된 ANT2의 양은 그때 파악된다. 상기 방법은 당업자에겨 잘 알려진 임의의 다양한 방법, 예를 들어 팀지 가능한 표지를 붙인 ANT2 (또는 C2orf18)를 이용, 또는 세척된 기질과 ANT2 (또는 C2orf18)에 대한 표지된 항체와의 접촉에 의해 완수할 수 있다. C2orf18 (또는 ANT2)에 결합된 ANT2 (또는 C2orf18)의 양은 C2orf18 또는 ANT2의 연대를 방해하기 위해 피검 물질 또는 화합물의 능력에 거꾸로 반비례한다. 항체 및 표지를 포함하는 일반적인 방법은 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)에 기술된다.
변형된 실시예에 따르면, C2orf18 (또는 ANT2)는 친화성 태그와 표지한다. 그런 다음 표지된 C2orf18 (또는 ANT2)는 피검 물질 또는 화합물 및 ANT2 (또는 C2orf18)와 배양한 다음, 면역침강법을 실시한다. 상기 면역침강법은 ANT2 (또는 C2orf18)에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 처리된다. 이전 경쟁적인 분석 포맷에서는, C2orf18 (또는 ANT2)와 연관된 것으로 파악되는 ANT2 (또는 C2orf18)의 양은 C2orf18 및 ANT2의 연관을 방해하기 위한 피검 물질 또는 화합물의 능력에 거꾸로 역 비례한다.
2. 비-경쟁적은 분석 포멧
비-경쟁적 결합 분석은 본 명세서에서 설명한 것 같은, 경쟁적 분석을 이용한 스크리닝에서 쉽게 처리할수 없는 포맷에서 구성된 피검 물질 또는 화합물 라이브러리를 위한 최초의 스크린으로서 유용성을 찾을 수 있다. 상기 라이브러리의 예는 파지 디스플레이 라이브러리다(예를 들어, Barrett et al., Anal Biochem 1992, 204: 357-64 참조).
파지 라이브러리는 다양한 재조합 펩티드의 많은 양을 빠르게 생산할 수 있는 유용성을 찾는다. 파지 라이브러리는 본 발명에서 단독으로 경쟁적 분석으로 사용될수 없지만, C2orf18 또는 ANT2에 결합한 피검 물질 또는 화합물로서 재조합 펩티드을 알아내기 위한 비-경쟁적 포맷에서 효과적으로 스크린 할 수 있다. 비-경쟁적 포맷을 통해 확인된 피검 물질 또는 화합물은 당업자에게 잘 알려진 임의의 방법으로 생산 할 수 있고, 경쟁적 분석 포맷의 이용하여 스크린 될 수 있다. 파지 및 세포 디스플레이 라이브러리의 생산 및 스크리닝은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, Ladner et al., WO 88/06630; Fuchs et al., Biotechnology 1991, 9: 1369-72; Goward et al., TIBS 1993, 18: 136-40; Charbit et al., EMBO J 1986, 5: 3029-37; Cull et al., PNAS USA 1992, 89: 1865-9; Cwirla et al., PNAS USA 1990, 87: 6378-82에서 설명된다.
바람직한 비-경쟁적 분석은 구성요소(C2orf18 또는 ANT2)의 추가 없이, 경쟁적 분석에서 설명한 것과 유사한 절차를 따른다. 그러나, 비-경쟁적 포맷은 C2orf18 또는 ANT2에 결합하는 피검 물질 또는 화합물을 알아내기 위해서는, C2orf18 및 ANT2 상호 결합하는 피검 물질 또는 화합물질의 능력은 각각의 후보를 위해 발혀지는 것이 필요하다. 따라서, 실시예에 따르면, C2orf18에 고정된 피검 물질 또는 화합물의 결합은 결합되지 않은 상기 피검 물질 또는 화합물의 유실; 지지체로부터 검할된 피검 물질 또는 화합물의 용출을 통해 알아 낼 수 있고, 용출의 방법은; 예를 들어 질량분석법, 단백질 정량법(radford or Lowry assay, or Abs. at 280nm determination.)을 따른다. 대안적으로 상기 용출 단계가 제거되고, 피검 물질 또는 화합물의 결합은 지지체 표면의 유기막의 분광 특성의 변화를 모니터함으로서 알아낼 수 있다. 표면의 분광 특성을 모니터링 하기 위한 하기의 모든 방법은 당업자에게 잘 알려진 흡광도(absorbance), 반사율(reflectance), 투과율(transmittance), 복굴절(birefringence), 굴절율(refractive index), 회절(diffraction), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 타원해석기(ellipsometry), 공명 거울 기술(resonant mirror techniques), 격자 결합 웨이브가이드 기술(grating coupled waveguide techniques) 및 다극성 분광법(multipolar resonance spectroscopy)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 표지된 피검 물질 또는 화합물은 용출 단계의 요구 없이 분석에서 사용될 수 있다. 이 경우, 결합되지 않은 물질을 세척한 후 지지체에 연관된 표지의 양은 피검 물질 또는 화합물 결합에 직접 반비례한다.
잘 알려진 로봇 시스템은 용액 상 화학적 성질을 위해 개발 되었다. 상기 시스템은 화학자에 의해 수행되는 매뉴얼 합성 작업에 모방체인 Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, 일본)에 의해 개발된 자동화된 합성 장치 및 로봇 팔을 이용하는 다양한 로봇 시스템(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.)과 같은 자동화된 단말기를 포함한다. 본 발명에서 사용을 위해 임의의 장치를 사용할 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 방식으로 작동하도록 하기 위해 상기 장치에 가해지는 병경의 성질 및 실시형태는 당업자에게 자명한 사실이다. 게다가, 다양한 조합 라이브러리는 통상적으로 사용가능하다(예를 들어, e.g., ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.참조).
본 발명의 한 측면에 따르면, 상기 본 발명의 스크리닝 방법을 위해 필수적인 구성요소는 C2orf18 및 ANT2 사이의 결함을 억제하기 위한 스크리닝 물질 또는 화합물, 췌장암 세포의 증식을 억제하는 물질 또는 화합물 또는 췌장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 또는 화합물을 위한 킷트로서 제공한다. 상기 킷트는 예를 들어 C2orf18 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물, 및/또는 ANT2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 포함한다. 더 나아가, 상기 킷트는 대조군 시약(양성 및/또는 음성), 검출 할수 있는 표지, 반응 버퍼, 세포 배양 배지, 스크리닝을 위해 필요한 컨테이너 또는 방법을 실행하기 위한 지시(예를 들어, 문서, 테이프, VCR, CD-ROM 등)등을 포함한다. 상기 구성요소 및 시약은 분리된 컨테이너에 포장된다.
III . 뉴클레오티드 기반된 스크리닝 방법
III-1. C2orf18 유전자를 이용한 스크리닝 방법
보다 상세히 설명하자면, C2orf18 유전자의 발현 수준을 컨트롤함으로써, C2orf18 관련 질환을 시작 또는 진행, 또는 세포 성장을 컨트롤 할 수 있다. 따라서, 세포 성장 억제 또는 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료하는데 사용되는 후보 물질 또는 화합물은 색인으로서, C2orf18 유전자의 발현 수준을 이용하여 스크리닝을 통해 확인하였다. 본 발명의 문맥에서, 상기 스크리닝은 예를 들어, 다음의 단계를 포함한다:
a) 피검 물질 또는 화합물을 C2orf18 유전자가 발현하는 세포와 접촉하는 단계;
b) C2orf18 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
c) 피검 물질 또는 화합물이 부재하에서 검출되는 수준과 비교하여 C2orf18 유전자의 발현 수준을 줄이는 피검 물질 또는 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 따르면, C2orf18 관련 질환을 예방 하고 치료하기 위한 후보 물질 또는 화합물, 세포 성장을 억제하는 피검 물질 또는 화합물의 치료적 효과를 측정 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 세포의 증식을 억제하는 후보물질 또는 화합물을 스크리닝하기 위한 방법 및, C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝 하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 문맥에서, 상기 스크리닝은, 예를 들어, 다음의 단계를 포함한다:
a) 피검 물질 또는 화합물을 C2orf18 유전자가 발현하는 세포에 접촉하는 단계;
b) C2orf18 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
c) b)의 발현 수준과 피검 물질 또는 화합물의 치료적 효과를 연관짓는 단계.
본 발명에서, 상기 치료적 효과는 C2orf18 유전자의 발현수준과 연관 된다. 예를 들어, 상기 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 탐진된 수준과 비교하여 상기 피검 물질 또는 화합물이 C2orf18 유전자의 발현 수준을 감소시킨다면, 상기 피검 물질 또는 화합물은 치료적 효과를 가지는 후보 물질 또는 화합물로서 선별 또는 확인된다. 대안적으로, 상기 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 피검 물질 또는 화합물이 C2orf18 유전자의 발현 수준을 감소시키지 않는다면, 상기 피검 물질 또는 화합물은 충분한 치료적 효과를 가지지 않는 물질 또는 화합물로 확인된다.
보다 구체적으로, 상기 언급한 발현 수준은 다음의 단계로 구성된 군으로부터 선택하는 방법에 의해 검출할 수 있다:
(a) 상기 C2orf18 폴리펩티드, 또는 기능적 등가물을 암호화한 mRNA의 양을 검출하는 단계;
(b) 상기 C2orf18 폴리펩티드, 또는 기능적 등가물의 양을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 C2orf18 폴리펩티드, 또는 기능적 등가물의 생물학적 활성을 검출하는 단계.
바람직하게, C2orf18 폴리펩티드가 발현하는 세포의 세포 증식활성은 상기 언급한 생물학적 활성으로서 검출할 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포는 암 세포 예를 들어, 췌장암 세포, 췌장관 선암종(PDAC) 세포와 같은 C2orf18의 과발현을 특징으로 한다. 상기 C2orf18 관련 질환은 암, 예를 들어, 췌장암, 구체적으로, 췌장관 선암종(PDAC)과 같은 C2orf18의 과발현을 특징으로 한다. 상기 C2orf18 유전자의 발현을 억제하는 물질 또는 화합물은 상기 C2orf18 유전자가 발현 하는 세포와 피검 물질 또는 화합물의 접촉하고 나서 상기 C2orf18 유전자의 발현 수준을 검출함으로서 확인할 수 있다. 당연히 상기 확인은 단일 세포를 대신해 유전자가 발현하는 세포군을 이용하여 또한 수행할 수 있다. 상기 피검 물질 또는 화합물의 부재 하에서의 발현 수준과 비교하여 피검 물질 또는 화합물의 존재 하에서 검출된 감소된 발현 수준은 상기 피검 물질 또는 화합물이 C2orf18 유전자의 억제자인 것을 나타내고, 상기 피검 물질 또는 화합물이 암을 억제하는데 유용한 가능성을 제안하며, 따라서, 후보 물질 또는 화합물은 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
상기 유전자의 발현수준은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 추정 될 수 있다. 상기 C2orf18의 발현 수준은, 예를 들어, ‘실시예’에서 설명한 방법을 통해 검출할 수 있다.
상기 확인을 위해 사용된 상기 세포 또는 상기 세포군은 C2orf18 유전자가 발현하는 한 임의의 세포 또는 임의의 세포군을 일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 또는 상기 세포군은 조직에서 유래된 상피세포이거나, 이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 세포 또는 상세 세포군은 불멸화된 세포(immortalized cell)이거나 췌장암으로부터 유래된 것을 포함하는, 예를 들어, PDAC, 암 세포로부터 유래된 불멸화된 세포를 포함할 수 있다. C2orf18 유전자가 발현하는 세포는, 예를 들어, 암세포로부터 확립되는 세포주(예를 들어, MIA-PaCA2)를 포함한다. 게다가, 상기 세포 또는 상기 세포군은 C2orf18 유전자와 형질감염된 세포이거나, 이를 포함하는 세포일 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 물질 또는 화합물의 스크리닝을 할 수 있고, 특히 안티센스 RNA, siRNA을 포함하는 기능적 핵산 분자를 확인하기 위해 적합하다.
III-2. C2orf18 유전자의 전사 조절영역을 이용한 스크리닝 방법
본 발명의 다른 측면을 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 피검 물질 또는 화합물을 C2orf18의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절 하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 삽입된 세포를 접촉시키는 단계;
b) 상기 언급한 리포터 유전자의 활성 또는 발현을 검출하는 단계; 및
c) 피검 물질 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 언급한 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소 시키는 피검 물질 또는 화합물을 선별하는 단계.
본 발명의 따르면, 세포의 성장을 억제하는 상기 피검 물질 또는 화합물 또는 C2orf18 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보 물질 또는 화합물의 상기 치료적 효과는 측정 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 세포의 증식을 억제하는 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하기 위한 방법 및 C2orf18 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 후보 물질 또는 화합물을 스크리닝하기 위한 방법을 또한 제공한다.
본 발명의 문맥에서, 상기 스크리닝은, 예를 들어 다음의 단계를 포함한다:
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 피검 물질 또는 화합물을 C2orf18의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절 하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 삽입된 세포를 접촉시키는 단계;
b) 상기 언급한 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 검출하는 단계; 및
c) b)의 발현수준과 상기 피검 물질 또는 화합물읠 치료적 효과를 연관짓는 단계.
본 발명에서, 상기 치료적 효과는 상기 언급한 리포터 유전자의 활성 또는 발현과 연관 있다. 예를 들어, 피검 물질 또는 화합물의 부재 하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 피검 물질 또는 화합물이 상기 언급한 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킨다면, 상기 피검 물질 또는 화합물은 치료적 효과를 가지는 후보 물질 또는 화합물로서 선별 또는 확인된다. 대안적으로, 피검 물질 또는 화합물의 부재 하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 피검 물질 또는 화합물이 상기 언급한 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키지 않는다면, 상기 피검 물질 또는 화합물은 충분한 치료적 효과가 없는 물질 또는 화합물로 확인된다.
적합한 리포터 유전자 및 숙주세포는 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 스크리닝을 위해 필요한 리포터 구조체는 유전자의 뉴클레오티드 서열 정보를 기초로 한 유전자 라이브러리로부터 전사 조절영역을 포함하는 뉴클레오티드 마디에서 획득할 수 있는, C2orf18 유전자의 전사 조절영역을 이용하여 준비할 수 있다.
상기 전자 조절 영역은, 예를 들어 C2orf18 유전자의 프로모터 서열이다.
상기 스크리닝에 요구되는 상기 리포터 구조체는 리포터 유전자 서열과 C2orf18의 전사 조절 영역을 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서 C2orf18의 상기 전사 조절 영역은 개시코돈으로부터 적어도 500bp 상부, 바람직하게, 1000bp, 보다 바람직하게, 5000 또는 10000bp 상부까지의 영역이다. 상기 전사 조절 영역을 포함하는 뉴클레오티드 마디는 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있고 또는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 전사 조절 영역을 확인하기 위한 방법, 및 분석 프로토콜도 또한 잘 알려져 있다(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press).
상기 언급한 리포터 구조체를 포함하는 상기 벡터는 숙주 세포에 감염되고 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 검출된다(예를 들면, 발광측정장치(luminometer), 흡광광도계(absorption spectrometer), 유세포분석기(flow cytometer) 등을 이용). 본 명세서에서 정의된 것으로서 "발현 수준 또는 활성의 감소"는 상기 화합물의 부재하에서 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성의 적어도 10% 감소, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 75% 감소, 가장 바람직하게는 적어도 95% 감소를 나타낸다.
C2orf18 유전자의 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자와 형질 감염된 세포가 사용될 때, 상기 물질 또는 화합물은 리포터 유전자 산물의 발현 수준의 검출를 통하여 C2orf18 유전자의 발현을 높이거나 또는 억제함을 확인할 수 있다. 리포터 유전자로서, 예를들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라아제 유전자, HIS3 유전자 및 당업자에게 잘 알려진 유전자가 사용될 수 있다. 상기 유전자의 발현의 검출를 위한 방법은 당업자에게 자명한 사실이다.
III-3. 특정 개인에게 적합한 치료제 또는 조성물의 선택
개인들의 유전자 조성의 차이는 다양한 약물에 대하여 대사 작용을 하는 상대적인 능력에 차이가 초래할 수 있다. 개체 내에서 항암제 또는 항암 조성물로 작용할 수 있는 약제 또는 조성물은 그 자체로 암 상태의 특성에서 비암성 상태의 유전자 발현 패턴 특성으로 개체의 세포의 유전자 발현 패턴에 변화를 유도함으로써 명확해진다. 따라서, 본 발명에 기재되어 있는 암과 비암세포에서 차별적으로 발현되는 C2orf18 유전자는 상기 약제 또는 조성물이 개체의 적합한 억제제인지를 판단하기 위하여 선택되는 개체의 피검 세포 집단에서 테스트됨으로써, 잠정적인 암의 치료 또는 예방 억제제일 수 있다.
특정 개체에 대하여 적합한 암 억제제를 규명하기 위하여, 상기 개체로부터 피검 세포 집단을 치료제 또는 조성물 후보에 노출시키고, C2orf18 유전자의 발현을 측정한다. 본 발명의 방법의 문맥에서 피검 세포 집단은 상기 C2orf18 유전자를 발현하는 암세포를 포함한다. 상기 피검세포는 상피세포인 것이 바람직하다.
구체적으로, 피검 세포 집단은 치료제 또는 조성물 후보가 있는 상태에서 배양될 수 있으며, 상기 피검 세포 집단에서 C2orf18 유전자의 발현 수준은 측정되고, 하나 또는 다수의 참고 프로파일에 비교될 수 있다, 예, 암 참고 프로파일 또는 상기 치료제 또는 조성물이 부재할 때의 발편 참고 프로파일.
암 세포를 포함하는 세포 참조 또는 치료제 또는 조성물이 부재할때의 세포 참조에 대하여, 치료제 또는 조성물과 접촉한 피검 세포 집단의 상대적인 C2orf18 유전자 발현 수준의 감소는 상기 치료제 또는 조성물이 상기 피검 세포 집단이 유래된 개체에서 치료적으로 유효하다는 것을 의미한다.
세포 성장 또는 암의 치료 또는 예방을 억제하기 위한 조성물:
본 발명의 어느 하나의 스크리닝 방법에 의해서 규명된 치료제인 C2orf18 유전자에 대한 이중-나선 분자, 및 C2orf18 폴리펩타이드에 대한 항체는 C2orf18 유전자의 발현 또는 C2orf18 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시킴으로써, 세포의 증식을 억제한다. 따라서, 본 발명은 세포의 성장을 억제하는 조성물 또는 본 발명의 스크리닝 방법 중 어느 하나에 의해서 규명된 조성물을 포함하는, C2orf18이 관련된 질병의 치료 또는 예방하는 조성물을 제공한다, 예. C2orf18 유전자에 대한 이중-나선 분자, 또는 C2orf18 폴리펩타이드에 대한 항체, 펩타이드 미메틱스, 조성물 또는 이의 조합. 본 발명에서, 상기 세포는 C2orf18의 과발현으로 특징되는 췌장암, 구체적으로 췌관 선암종 (PDAC) 세포이다. 상기 C2orf18 연관 질병은 C2orf18의 과발현에 의해서 특징되는 췌장암, 예를 들어, 췌관 선암종 (PDAC)이다. 본 발명의 조성물은 암, 구체적으로 췌장암, 예를 들어 췌관 선암종 (PDAC)과 같은 C2orf18 연관 질병의 치료에 사용될 수 있다.
상기 조성물은 인간 및 다른 포유류, 예를 들어 마우스, 랫트, 기니아 피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 개코원숭이, 침팬지의 치료제로써 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 하기에 상세히 기재되어 있는 본 발명의 활성성분을 위한 적합한 치료학적 제형은 (스크리닝된 체료제, 안티센스 핵산, 이중-나선 분자, 항체 등을 포함함) 구강, 직장, 비강, 국부(구강 및 혀밑), 질내 또는 비경구(근육내, 피하 및 정맥을 포함함) 투여, 또는 흡입 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 투여는 정맥으로 되는 것이 바람직하다. 상기 제형은 선택적으로 개별의 투여 단위로 포장될 수 있다.
구강 투여에 적합한 약학적 제형은 미리 정해진 활성성분을 각각 포함하고 있는 캡슐, 마이크로 캡슐, 카쉐 및 알약을 포함한다. 또한, 적합한 체형은 파우더, 엘릭시르제, 과립제, 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 상기 활성성분은 선택적으로 1회분의 연약 또는 페이스트로 투입될 수 있다. 선택적으로 필요에 따라서 상기 약학적 조성물은 비구강으로 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체와 함께 살균된 액체 또는 현탁액의 주입 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 활성성분은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 배양액, 구체적으로 멸균된 물, 생리학적 식염수, 식물-기름, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 스태빌라이저(stabilizer), 향미제, 첨가제, 담체, 보존제, 바인더 등과 일반적으로 허용가능한 약물 주입에 요구되는 단위 복용량으로 혼합될 수 있다. 이러한 제조에 포함된 활성성분의 양은 요구되는 지시 범위 한에서 적합한 용량을 함유한다.
알약 및 캡슐에 혼합될 수 있는 첨가제의 예로는 젤라틴, 옥수수 전분, 트래거캔스 고무(tragacanth gum)와 같은 바인더, 결정 셀룰로오스(crystalline cellulose)와 같은 아라비아 고무(arabic gum) 첨가제; 옥수수 전분, 젤라틴 및 아르긴산(alginic acid)과 같은 팽윤제; 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate)과 같은 윤활제; 슈크로즈, 락토오스(lactose) 또는 사카린(saccharin)과 같은 감미제; 페퍼민트, 가울테리아 아데노트릭스(Gaultheria adenothrix) 오일 및 체리와 같은 향미제가 있으나, 이에 한정되지 않는다. 알약은 하나 또는 다수의 제형 성분과 함께 압축 또는 몰딩(molding)되어 제조될 수 있다. 압축된 알약은 파우더 또는 과립과 같은 프리 플로윙 폼(free-flowing form)내의 활성성분을 적합한 기계에서, 선택적으로 바인더, 윤활제, 비활성 희석제, 윤활제, 표면 활성 또는 분산제와 혼합되어 제조될 수 있다. 몰딩된 알약은 적합한 기계에서 비활성 액체 윤활제에 의해서 수분을 함유한 파우더 조성물의 혼합물을 몰딩하여 만들어 질 수 있다. 상기 알약은 당업계에 잘 알려제 방법에 의해서 코팅될 수 있다. 상기 알약은 생체 내에서 상기 활성성분이 서서히 또는 조절되며 방출할 수 있도록 선택적으로 제조될 수 있다. 알약들의 패키지에는 각 달에 하나씩 섭취되는 하나의 알약이 포함될 수 있다. 더욱이, 상기 단위-투여 형태가 캡슐일 때, 오일과 같은 액체 담체가 상기 성분에 추가적으로 더 포함될 수 있다.
구강 용액 제조는 예를 들어 수용액 또는 오일 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르 의 형태로 제조되거나, 또는 이용하기 전에 물 또는 다른 적합한 담체에 의해서 복원되는 드라이 산물로 제공될 수 있다. 이러한 용액 제조는 현탁제, 유화제, 비 수용성 담체(식용성 오일을 포함할 수 있음) 또는 보존제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 항산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제를 포함하는 수용성 또는 비수용성의 멸균된 투여 용액, 계획된 수용체의 혈액에 제형의
등장성을 주는 용질 제형, 및 현탁제 및 농유제를 포함하는 수용성 및 비수용성 멸균된 투여용액을 포함한다. 상기 제형은 예를 들어 봉입된 앰플, 바이얼과 같은 단위 용량 또는 멀티-용량 컨테이너로 제공되고, 식염숙, 주입을 위한 물과 같은 멸균된 용액 담체만을 사용하기 바로 직전에 첨가하는 것이 필요한 동결 건조된 조건에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 상기 제형은 연속 투입에 제공될 수 있다. 임기 용액 및 현탁액의 주입은 멸균된 파우더, 과립 및 상기 기재된 종류의 알약으로부터 제조될 수 있다.
더욱이, 주입을 위한 멸균된 화합물은 주입에 적합한 증류수와 같은 담체를 이용한 일반적인 약물 투여에 맞게 제조될 수 있다. 생리 식염수, 글루코오스, 및 D-소르비톨, D-마노스, D-마니톨 및 염화나트륨을 포함하는 다른 등장액은 주입을 위한 수용액으로 이용될 수 있다. 이들은 예를 들어 에탄올과 같은 알콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리 알콜, 폴리소르베이트 80 (TM)(Polysorbate 80 (TM)) 및 HCO-50과 같은 비이온성 계면활성제와 같은 적합한 가용화제와 함께 사용될 수 있다.
참깨 오일 또는 대두 오일은 벤질벤조산 또는 벤질 알콜을 가용화제로 함께 이용하여, 기름이 많이 든 용액으로 사용될 수 있으며, 인산완충용액 및 아세트산 나트륨 버퍼와 같은 버퍼, 염산프로카인(procaine hydrochloride)과 같은 진통제, 벤질 알콜 및 알콜과 같은 스태빌라이저, 및/또는 항산화제와 함께 제조될 수 있다. 제조된 주입은 적합한 앰플에 채워질 수 있다.
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직장 투여를 위한 제형은 코코아 버터 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 표준 담체와 함께 좌약이 포함된다. 구강 또는 혀밑과 같은 입을 통한 구부투여를 위한 제형은 슈크로즈 아카시아 또는 트래거캔스 고무와 같은 향미 베이스에 활성성분으로 포함하고 있는 로진제스(logenzes)와, 젤라틴, 글리세린, 슈크로즈 또는 아카시아와 같은 베이스에 있는 활성성분을 포함하는 패스틸(pastilles)을 포함한다. 활성성분의 비강내 투여를 위해서, 액체 스프레이 또는 분산성 파우더 또는 드롭스(drops) 형태가 이용될 수 있다. 드롭스는 수성 또는 비수성 베이스와 하나 또는 다수의 분산제, 용해보조제 또는 현탁제를 포함하여 제조될 수 있다.
흡입에 의한 상기 조성물의 투여를 위하여, 상기 조성물은 일반적으로 취입기, 분무기, 가압된 팩 또는 에어로졸 스프레이를 전달하는 일반적인 도구에 의해서 전달된다. 가압된 팩은 디클로로디플루오로메탄(Dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로메탄(dichiorotetrafluoroethane), 이산화탄소 또는 그외의 적합한 가스와 같은 적합한 추진제를 포함할 수 있다. 가압된 에어로졸에 있어서, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정할 수 있다.
선택적으로, 흡입 또는 주입에 의한 투여를 위해서, 상기 조성물은 예를 들어 활성성분의 파우더 혼합 및 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 파우더 베이스와 같은 드라이 파우더 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 상기 파우더 조성물은 예를 들어 캡슐, 카트리지, 젤라텐 또는 블리스터 팩과 같은 형태의 단위 투여량의 형태로 제공될 수 있으며, 이러한 형태에서 상기 파우더는 흡입기 또는 주입기의 도움으로 주입될 수 있다.
그 외의 제형은 치료제를 방출하는 착상할 수 있는 도구 및 접합 패치를 포함한다. 필요에 따라서는 상기 기재한 제형은 활성성분의 지속적인 방출에 적합하게 변형되어 이용할 수 있다. 상기 치료학적 조성물은 또한 항균제, 면역억제제 또는 보전제와 같은 다른 활성성분을 포함할 수 있다.
상기에서 특히 언급된 성분에 추가적으로, 당해 제형의 타입에 대해, 종래에 알려진 기타 다른 제제를 포함할 수 있다. 즉, 예를 들면, 경구투여에 접한한 제형들은 맛 첨가 제제를 포함할 수 있다.
바람직한 단독 투여 제형들은 “C2orf18-관련 질환을 치료하는 방법”의 항목하에서의 언급된 바와 같이, 본 발명의 활성 성분의 단독 또는 상기의 적절한 부분의 유효량을 포함한다.
I. 이중-가닥 분자를 포함하는 조성물
본 발명은 상기에서 설명한 임의의 이중-가닥 분자 또는 상기에서 설명한 본 발명의 스크리닝 방법을 포함하는 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방 및/또는 세포 성장을 예방하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 이중-가닥 분자는 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 억제 및 세포 성장을 억제하기 위해 채택될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 이중-가닥 분자로 구성된 조성물은 피험체에 투여하기 위하여 예를 들어 리포좀과 같은 전달용 비히클(vehicle)에 캡슐화될수 있고, 담체 및 희석액 및 그들의 염 및/또는 약학적으로 혀용 가능한 제형에서 존재할 수 있다. 핵산 분자의 전달을 위한 방법은 Akhtar S & Juliano RL. Trends Cell Biol. 1992 May;2(5):139-44.; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeuticss, ed. Akhtar, 1995; Maurer N, et al., Mol Membr Biol. 1999 Jan-Mar;16(1):129-40.; Hofland & Huang. Handb Exp Pharmacol. 1999 137:165-192에 기술되어 있다. 상기 사항은 핵산 분자의 전달을 위한 일반적인 방법을 설명한다(US 6,395,713 and WO 199402595). 이러한 프로토콜은 임의의 이중-가닥 분자를 실질적으로 운반하기 위하여 사용될 수 있다. 이중 가닥 분자는 리포좀에 의한 캡슐화, 이온토포레시스에 의한 방법 또는 생물 분해성 중합체, 히드로겔, 사이클로덱스트린(예를 들어 Gonzalez H, et al., Bioconjug Chem. 1999 Nov-Dec;10(6):1068-74.; WO 03/47518 and WO 03/46185 참조), 폴리(lactic-co-glycolic) 에시드(acid)(PLGA) 및 PLCA 마이크로스피어(예를 들어, US 6,447,796 및 US 2002130430 참조), 생물분해성 나노캡슐 및 생체접합성 마이크로스피어 같은 다른 비히클안에서 융합 또는 단백질 벡터(WO 200053722)를 포함하는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 세포에 주입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시예에서, 본 발명의 이중-가닥 분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)-엔(N)-아세틸갈락토사민(acetylgalactosamine)(PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-아세틸갈락토사민-트리(tri)-엔-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-triGAL)파생물과 같은 폴리에틸렌이민 및 이의 파생물을 만들거나 구성할수 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 상기 이중-가닥 분자는 본 명세서의 전체로서 통합되는 US 20030077829에 설명한데로 만들어진다(즉, 지질-기반 제형).
본 발명의 상기 이중-가닥 분자는 전체적으로 치료적 효과를 향상시키기 우해 다른 치료적 화합물과 혼합하여 개체에 또한 투여할 수 있다. 징후를 치료하기 위한 다중 혼합물의 사용은 부작용의 존재를 줄이는 유익한 효과를 증가시킨다.
다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자가 발현하는 암의 예방 또는 치료의 사용을 위하여 약학적 조성물을 제조하기 위해 본 발명의 이중-가닥 분자의 이용을 또한 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 C2orf18 유전자가 발현하는 암 치유에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위해 세포에서 C2orf18 유전자의 발현을 억제하는 이중-가닥 분자의 이용과 관련 있고, 상기 분자는 센스 가닥 및 이의 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 이중-가닥 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화하고, 서열 번호 7 또는 8의 서열에 표적한다.
본 발명에 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자가 발현하는 암의 예방 또는 치료에 사용을 위한 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자를 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 C2orf18 유전자가 발현하는 암세포의 치료를 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 절차 및 방법을 또한 제공한다, 상기 방법 또는 절차는 세포에서 C2orf18 유전자의 발현을 억제하는 이중-가닥 분자를 가지는 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 분자는 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가득을 포함하고, 이중-가닥 핵산 분자를 형성화하기 위해 서로 혼성화되며 유효성분으로 서열 번호: 7 또는 8을 표적한다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자가 발현하는 암의 치료를 하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 절차 또는 방법을 또한 제공하고, 상기 방법 또는 절차는 약학적 또는 생리적 허용가능한 담체 와 유효성분을 혼합하는 단계를 포함하며, 상기 유효성분은 세포에서 C2orf18 유전자의 발현을 억제하는 이중-가닥 핵산 분자이며, 상기 분자는 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 이중-가닥 핵산 분자를 형성화하기 위해 서로 혼성화되고 서열번호 7 또는 8을 표적한다.
II. 안티센스 핵산을 포함하는 조성물
C2orf18 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 안티센스 핵산은 암 세포의 상향 조절로 유전자의 발현 수준을 감소하기 위해 사용할수 있고, 암 치료 및 세포 성장을 억제하기 위해 유용하며, 따라서 C2orf18 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 안티센스 핵산은 또한 본 발명에 포함된다. 안티센스 핵산은 C2orf18 유전자의 뉴클레오티드 또는 이에 상응하는 mRNAs에 결합함으로써 행동하고, 그렇기 때문에 유전자의 전사 또는 번역을 억제하고, mRNAs의 감성(degradation)을 증진시키고, 및/또는 유전자에 의해 암호화된 단백질읠 발현을 억제한다. 따라서, 그결과, 안티센스 핵산은 암 세포에서 C2orf18 단백질의 작동을 억제한다. 본 명세서에서 “안티센스 핵산” 구분은 구체적으로 표적 서열에 혼성화하고 표적 서열에 완전히 상보적인 뉴클레오티드를 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 미스메치를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 안티센스 적어도 15개의 연속적인 C2orf18 유전자 또는 이의 상보적인 서열에서 핵산은 적어도 70% 또는 이보다 높은, 바람직하게는 적어도 80% 또는 이보다 높은, 보다 바람직하게는 적어도 90% 또는 이보다 높은, 가장 바람직하게는 95% 또는 이보다 높은 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업자에게 알려진 알고리즘은 상기 상동성을 알아내기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산은 상기 DNA 또는 mRNA의 결합을 통해 C2orf18 유전자에 의해 암호화된 단백질을 생산하는 세포에서 행동하며, 그렇기 때문에 전사 또는 번역을 억제하고, mRNA의 감성을 증진하며, 단백질의 발현을 억제하며, 따라서 단백질의 작동을 억제한다. 본 발명의 안티센스 핵산은 핵산에 대해 효력인 나타나지 않는 적합한 원료를 혼합함으로써, 도찰제(liniment) 또는 찜질제와 같은 외용제로 만들 수 있다.
또한, 필요에 따라서, 본 발명의 안티센스 핵산은 첨가제, 등장화제, 솔루빌라이져, 안정화제, 방부제, 진통제 등과 같은 것을 첨가하여 정제, 파우더, 과립제, 캡슐제, 리포좀 캡슐, 주사제, 용액, 점비약 및 동결 보호제같이 제형화할수 있다. 안티센스 봉입제(antisense-mounting medium)는 또한 내구성 및 막-투과성을 높이기 위해 사용될 수 있다. 리포솜, 폴리-L-라신, 지질, 콜레스테롤, 리포펙틴 또는 이의 파생물이 포함될수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 것들은 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산은 C2orf18 단백질의 발현을 억제하고 상기 단백질의 생물학적 활성을 억제하는데 유용하다. 게다가, 본 발명의 안티센스 핵산을 포함하는 발현-억제제들은 그들이 C2orf18 단백질의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 점에서 유용하다. 본 발명의 안티센스 핵산은 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, 티오산화 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 대해 뉴클레아제 내성을 제공하는데 사용될 수 있다. 또다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물을 제조하는데 본 발명의 안티센스 핵산의 용도를 제공한다.
또다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 안티센스 핵산을 제공한다. 대안으로, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 유효한 성분으로 본 발명의 안티센스 핵산과 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함한다.
또다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 유효성분과 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유효성분은 본 발명의 안티센스 핵산이다.
III. 항체를 포함하는 조성물
암에서 과발현되는 C2orf18 유전자의 유전자 산물의 기능은 상기 유전자 산물의 기능을 억제하기 위해 결합하는 화합물 또는 그 외 억제하는 물질들을 투여함으로써 억제될 수 있다. C2orf18 폴리펩티드에 대항하는 항체는 이런 화합물과 같이 언급될 수 있으며, 세포 성장 억제제 또는 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 본 발명은 C2orf18 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대항하는 항체, 또는 상기 항체의 단편의 사용과 관련된다. 본 명세서에 사용된, 용어 "항체"는 상기 언급된 의미를 나타낸다.
항체는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은, 다양한 분자와 접합함으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 이런 변형된 항체를 포함한다. 상기 변형된 항체는 항체를 화학적으로 변형함으로써 획득될 수 있다. 이런 변형된 방법은 당업계에서 보편적인 것이다. 대안으로, 본 발명을 위해 사용된 항체는 C2orf18 폴리펩티드에 대항하는 비-인간 항체으로 파생된 가변부위 및 인간 항체로부터 파생된 불변 부위를 가지는 키메라 항체, 또는 비-인간 항체으로 파생된 상보성결정부위(CDR), 프레임워크부위(FR) 및 인간항체로부터 파생된 불변부위로 구성된 인간화된 항체일 수 있다. 이런 항체들은 알려진 기술을 이용함으로써 제조될 수 있다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류의 CDRs 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다(예를 들면, Verhoeyen et al., Science 1988, 239:1534-6 참조). 따라서, 이런 인간화 항체는 온전한 인간 가변 도메인 보다 낮은 실질적으로 비-인간 종 유래 상응하는 서열에 의해 치환되는, 키메라 항체이다.
인간 프레임워크 및 불변 부위에 추가적으로 인간 가변 부위를 포함하는 완벽한 인간 항체를 또한 사용될 수 있다. 이런 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들면, 시험관내(in vitro) 방법은 박테리아파지에 나열된 인간 항체 단편의 재조합 라이브러리의 사용과 관련된다(예를 들면, Hoogenboom et al., J Mol Biol 1992, 227:381-8). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 예를 들면, 마우스와 같은, 형질전환 동물 내로 도입함으로써 제조될 수 있으며, 여기서 상기 내생 면역글로불린 유전자는 부분적으로 또는 완전히 비활성된 것이다. 이런 접근은 예를 들면 미국 특허번호 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다. 상기 획득된 항체는 인간 항체에 투여되는 경우(항체 처리), 인간 항체 또는 인간화 항체는 면역원성을 감소시키기 위한 것이 바람직하다.
획득된 항체는 동종성으로 정제될 수 있다. 예를 들면, 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질을 위해 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체는 예를 들면, 친화성 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 및 기타 중 적절하게 선택되거나 조합하여 사용함으로써 분리 및 격리될 수 있으며(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질 A 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로 사용될 수 있다. 예시적인 단백질 A 컬럼은 예를 들면, Hyper D, POROS, 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)를 포함하는 것으로 사용될 수 있는 것이다.
친화성을 제외한 예시적인 크로마토그래피로는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡수 크로마토그래피(adsorption chromatography) 등을 포함한다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 크로마토그래피 공정은 HPLC 및 FPLC과 같은 액상 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 또다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물으리 제조에 본 발명의 항체의 용도를 제공한다.
또다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공하는 것이다. 대안으로, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 유효성분으로 본 발명의 항체와 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하기 위한 단계를 포함한다.
또다른 실시예에서, 본 발명은 C2orf18 유전자를 발현하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 유효성분과 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 혼합하기 위한 단계를 포함하며, 여기서 상기 유효성분은 본 발명의 항체이다.
세포 성장 억제의 방법:
췌장암 세포주에서 siRNA에 의한 내생 C2orf18의 녹다운은 C2orf18을 과발현하는 세포 성장의 급격한 억제를 야기하며, 이는 이런 세포들의 생존을 유지하는데 중요한 역할을 제시한다. 그러므로, 본 발명은 C2orf18의 발현 및/또는 C2orf18 단백질의 활성을 억제함으로써 세포 성장을 억제하는 것과 관련된다. C2orf18의 발현은, 예를 들면 C2orf18 유전자를 구체적으로 표적화하는 이중 가닥 분자에 의해 억제된다. C2orf18 표적 서열은, 예를 들면 서열번호 7 또는 8의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서, 세포는 예를 들면 췌장암 세포, 특히 PDAC 세포와 같은 C2orf18의 과발현에 의해 특정된다.
이런 조절 방법은 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서(예를 들면, 세포를 액제와 함께 배양함으로써), 또는 대안으로 생체내에서(in vivo)(예를 들면, 약제를 개체에 투여함으로써) 수행될 수 있다. 상기 방법은 C2orf18 유전자의 비정상적인 발현 또는 이들 유전자 산물의 비정상적인 활성을 대응하기 위해 치료로서, 단백질 또는 단백질의 조합, 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 조합을 투여하는 것에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 약제는, 예를 들면
(i) C2orf18 유전자 또는 이의 유사체에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 이의 유도체, 단편 또는 상동체;
(ii) C2orf18 유전자 또는 유전자 산물에 대한 항체, 이의 단편;
(iii) "기능을 하지 않는" 안티센스 핵산 또는 핵산(즉, C2orf18 유전자의 핵산내에 이종의 삽입에 기인함);
(iv) 예를 들면, 작은 간섭 RNA(small interfering RNAs, siRNAs) 등의 이중 가닥 분자; 또는
(v) 조절자(즉, 억제제, C2orf18 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너 사이 상호작용을 변화하는 길항제)를 포함한다.
기능을 하지 않는 안티센스 분자는 상동 재조합에 의해 폴리펩티드의 내생 기능을 "녹아웃"하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Capecchi, Science 1989, 244: 1288 92 참조).
증가된 수준은 세포에서 펩티드 및/또는 RNA를 정량화하고, 시험관 내에서 (발현이 변화된 유전자의 mRNAs) RNA 또는 펩티드 수준, 발현된 펩티드(또는 발현이 변화된 유전자의 mRNAs)의 구조 및/또는 활성을 분석함으로써 용이하게 검출될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법은 면역분석[예를 들면, 웨스턴 블랏 분석, 도데실황산나트륨(SDS) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 따르는 면역침강법, 면역세포화학 등), RT-PCR 및/또는 mRNA의 발현을 검출하기 위한 혼성화 분석(예를 들면, 노던블랏 분석(Northern assays), 도트 블랏(dot blots), 인 시투 혼성화(in situ hybridization) 등}]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 측면에 따르면, 본 발명의 방법을 통해 스크리닝된 약제가 사용될 수 있다. 당업자에 잘 알려진 방법은 상기 약제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 만약, 약제가 DNA에 의해 암호화될 수 있다면, 상기 DNA는 DNA를 발현하는 벡터 내로 삽입될 수 있고 상기 벡터는 세포로 투여될 수 있다. 세포 내로 이중 가닥 분자의 벡터를 삽입하기 위해, 트랜스펙션 증진제가 사용될 수 있다. FuGENE6(Roche diagnostics), 리포펙타민 2000(Invitrogen), 올리고펙타민(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)가 트랜스펙션 증진제로 사용될 수 있다.
C2orf18 -관련 질환을 치료하는 방법:
C2orf18 관련 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 것은 C2orf18 과발현 새포를 외과적으로 제거, 암 세포의 성장의 억제, 종양의 퇴축 또는 퇴화, 암 발생의 완화 및 억제의 유도와 같은 단계들 중 어느 것을 포함한다. C2orf18 관련 질환의 효과적인 치료는 C2orf18 관련 질환을 가지는 개체의 사망률을 감소시키고 예후를 개선시키고 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, C2orf18 관련 질환을 동반한 검출가능한 증상을 완화시킨다.
C2orf18 유전자를 과발현하는 세포주에서 siRNA에 의한 내생 C2orf18의 녹다운은 세포 성장의 급격한 억제를 야기하고, 이는 이런 세포들의 생존성을 유지하는데 필수적인 역할을 제시한다. 그러므로, 본 발명은 C2orf18의 발현 및/또는 C2orf18 단백질의 활성을 억제함으로써 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 예방하는 것과 관련된다. C2orf18의 발현은, 예를 들면 C2orf18 유전자를 구체적으로 표적화하는 이중 가닥 분자에 의해 억제된다. C2orf18 표적 서열은, 예를 들면 서열번호 7 또는 8의 뉴클레오티드를 포함한다. 게다가, C2orf18의 활성은 항-C2orf18 항체 또는 펩티드 미메틱스에 의해 억제된다. 본 발명에서, C2orf18 관련 질환은 예를 들면, 췌장암, 특히 PDAC 등의 암과 같은 C2orf18의 과발현에 의해 특정된다.
본 발명에서, 억제하는 핵산은 전달 시약과 조합으로 네이키드 핵산으로, 또는 억제하는 핵산을 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 개체에 투여될 수 있다. 본 발명의 억제하는 핵산과 조합으로 투여하기 위한 적절한 전달 시약은 Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴(lipofectin); 리포펙타민(lipofectamine); 셀펙틴(cellfectin); 또는 다양이온(polycations)(예를 들면, 폴리신), 또는 리포좀(liposomes)을 포함한다. 바람직한 전달 시약은 리포좀이다.
리포좀은 망막 또는 종양 조직과 같은, 특정 조직에 억제하는 핵산의 전달에 도움을 줄 수 있고, 억제하는 핵산의 혈액 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 qkfauddptj 사용하기 위한 적절한 리포좀은, 일반적으로 중상 또는 음 전하의 인지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 원하는 리포좀 크기 및 혈류에서 리포좀의 반감기와 같은 요소를 고려함으로써 일반적으로 가이드된다. 다양한 방법은 예를 들면, 그 전문이 참고로서 본 명세서에 통합되는 Szoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467; 및 미국 특허번호 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 및 5,019,369에 기재된 바와 같이, 리포좀을 제조하는 것에 관해 알려 있다.
바람직하게, 본 발명의 억제하는 핵산을 캡슐화하는 리포좀은 암 부위에 리포좀을 전달할 수 있는 리간드 분자를 포함한다. 종양 항원에 결합하는 단클론 항체와 같은, 종양 세포에서 우세한 수용체에 결합하는 리간드가 바람직하다.
특히 바람직하게, 본 발명의 억제하는 핵산을 캡슐화하는 리포좀은, 예를 들면 구조 표면에 결합된 옵소닌화-억제 모이어티(opsonization-inhibition moieties)를 가짐으로써 단핵 대식세포(mononuclear macrophage) 및 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의한 제거를 피할 수 있도록 변형된 것이다. 한가지 실시예에서, 본 발명의 리포좀은 옵소닌화-억제 모이어티 및 리간드를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀을 제조하는데 사용하기 위한 옵소닌화-억제 모이어티는 전형적으로 리포좀 막에 결합되는 큰 친수성 고분자이다. 본 명세서에 사용된, 옵소닌화-억제 모이어티는 예를 들면, 막 자체 내로 지질 가용성 앵커(anchor)의 상호작용에 의하거나, 또는 막 지질의 활성기에 직접적으로 결합함에 의해, 막에 화학적 또는 물리적으로 접합될 때 리포좀 막에 "결합"된 것이다. 이런 옵소닌화-억제 친수성 고분자는, 예를 들면 그 전문이 참고로서 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 4,920,016에 기재된 바와 같이, 대식세포-단핵구 시스템("MMS") 및 세망내피계("RES")에 의해 리포좀의 흡수를 유의적으로 감소시키는 보호적인 표면층을 형성한다. 따라서 옵소닌화-억제 모이어티로 변형된 리포좀은 변형되지 않은 리포좀 보다 훨씬 오래 순환을 유지한다. 이런 이유로, 이런 리포좀은 때때로 "잠행(stealth)" 리포좀으로 불린다.
잠행 리포좀은 다공성 또는 "구멍이 난(leaky)" 미세혈관계(microvasculature)에 의해 영양분을 받는 조직에서 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 예를 들면 고형암 등의 이런 미세혈관계 결점에 의해 특정되는 표적 조직은, 이런 리포좀을 효율적으로 축적할 것이다(Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53 참조). 게다가, RES에 의해 감소된 흡수는 간 및 비장에서 유의적인 축적을 방지함으로써 잠행 리포좀의 독성을 낮춘다. 따라서, 옵소닌화-억제 모이어티로 변형된 본 발명의 리포좀은 종양 세포에 대해 본 발명의 억제하는 핵산을 전달할 수 있다.
리포좀을 변형하는데 적절한 옵소닌화-억제 모이어티는 바람직하게 약 500 내지 약 40,000 달톤, 보다 바람직하데 약 2,000 내지 약 20,000의 분자량을 가지는 수용성 고분자이다. 이런 고분자는 강글리오사이드(ganglioside) GM. sub.1. 등의 강글리오사이드 뿐만 아니라, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 유도체; 예를 들면, 메톡시 PEG 또는 PPG, 및 PEG 또는 PPG 스테아르산염; 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 또는 폴리-N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone)과 같은 합성 고분자; 선형, 측쇄형 또는 덴드리머형 폴리아미도아민(polyamidoamine); 폴리아크릴산(polyacrylic acid); 카르복실 또는 아미노기가 화학적으로 연결된 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol) 및 폴리자일리톨(polyxylitol) 등의 폴리알콜을 포함한다. PEG의 혼성중합체(copolymer), 메톡시 methoxy PEG, 또는 메톡시 PPG, 또는 이들의 유도체들 또한 적절하다. 게다가, 옵소닌화-억제 고분자는 PEG 및 폴리아미노산, 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 혼성중합체가 차단될 수 있다. 또한, 옵소닌화-억제 고분자는 예를 들면, 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 마누론산(mannuronic acid), 히알루론산(hyaluronic acid), 펙트산(pectic acid), 뉴라민산(neuraminic acid), 알긴산(alginic acid), 카라기난(carrageenan)과 같은 아미노산 또는 카르복실산을 포함하는 천연 폴리사카라이드; 아미네이트 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드(선형 또는 측쇄형); 또는 예를 들면, 결과적으로 카르복실기의 연결을 갖는 탄산의 유도체와 반응하는 카르복실화 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드일 수 있다.
바람직하게, 옵소닌화-억제 모이어티는 PEG, PPG, 또는 이들의 유도체이다. PEG 또는 PEG 유도체로 변형된 리포좀은 때때로 "페길화된(PEGylated) 리포좀"으로 불린다. 옵소닌화-억제 모이어티는 많이 잘 알려진 기술 중 하나에 의해 리포좀에 결합될 수 있다. 예를 들면, PEG의 N-하이드록시숙시니마이드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester)는 포스파티딜-에탄올아민 지질 가용성 알콜(phosphatidyl-ethanolamine lipid-soluble anchor)에 결합되고, 그런 다음 막에 결합될 수 있다. 유사하게, 덱스트란 고분자는 Na(CN)BH. sub. 3를 이용하여 환원적인 아미노화를 통해 스테아릴아민 지질-가용성 알콜(stearylamine lipid-soluble anchor) 및 60℃에서 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran) 및 물을 30:12 비율과 같이 혼합한 용액으로 유도체가 합성될 수 있다.
본 발명의 억제하는 핵산을 발현하는 벡터는 상기 기재된 것이다. 이런 본 발명의 억제하는 핵산을 적어도 하나 발현하는 벡터는 직접, 또는 Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴(lipofectin); 리포펙타민(lipofectamine); 셀펙틴(cellfectin); 또는 다양이온(polycations)(예를 들면, 폴리신), 또는 리포좀(liposomes)을 포함하는 적절한 전달 시약과 조합으로 투여될 수 있다. 개체 내 암 부위에 본 발명의 억제하는 핵산을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 전달하는 방법은 당업계에 있는 기술이다. 본 발명의 억제하는 핵산은 암 부위 내로 억제하는 핵산을 전달하기 위한 적절한 수단에 의해 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 억제하는 핵산은 유전자 총(gene gun), 전기천공법(electroporation), 또는 다른 적절한 비경구 또는 장내 투여 루트에 의해 투여될 수 있다. 적절한 장내 투여 루트는 경구, 직장 또는 비강내 전달을 포함한다.
적절한 비경구 투여 루트는 혈관내 투여[예를 들면, 정맥주사(intravenous bolus injection), 정맥 투입(intravenous infusion), 동맥주사(intra-arterial bolus injection), 동맥 투입(intra-arterial infusion) 및 맥관구조 내 카테터 점적 주사(catheter instillation into the vasculature)]; 내(peri)- 및 위(intra)-조직 주사[예를 들면, 종양 내 및 종양 위 주사(peri-tumoral and intra-tumoral injection), 망막 내 주사(intra-retinal injection), 또는 망막하 주사(subretinal injection)]; 피하 주사 또는 피하 주입을 포함하는 증착(deposition)(삼투압 펌프에 의한 것 등); 예를 들면, 카테터 또는 다른 배치 장치에 의해 암 부위 또는 근처에 직접 투여[예를 들면, 망막 펠렛(retinal pellet) 또는 좌약(suppository) 또는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질을 갖는 임플란트]; 및 흡입법을 포함한다. 억제하는 핵산 또는 벡터를 암 부위 또는 근처 부위에 제공하는 것은 주사 또는 투입이 바람직하다.
본 발명의 억제하는 핵산은 단 회 투여 또는 다수 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 억제하는 핵산의 투여가 투입될 때, 투입은 단 회 지속적 투여가 되거나 다수 투입으로 전달될 수 있다. 조직 내로 직접적으로 약제의 주사는 암의 부위 또는 근처에 하는 것이 바람직하다. 암 부위 또는 근처에서 조직 내로 약제를 다수 투여하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 당업자는 제공되는 개체에 본 발명의 억제하는 핵산을 투여하기 위한 적절한 투여량 요법을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 억제하는 핵산은 예를 들면 암 부위 또는 근처에 단 회 투여 또는 증착으로 한번에 개체에 투여될 수 있다. 대안으로, 억제하는 핵산은 약 3 내지 약 28일, 더 바람직하게 약 7 내지 약 10일의 기간 동안 개체에 하루에 한번 또는 두번씩 투여될 수 있다. 바람직한 투여량 요법에서, 억제하는 핵산은 7일 동안 하루에 한 번 암 부위 또는 근처에 주사한다. 투여량 요법이 다수 투여과 관련될 때, 개체에 투여되는 유효한 양의 억제하는 핵산은 전체 투여량 요법에 걸쳐서 투여된 억제하는 핵산의 총 량을 포함할 수 있다.
유전자 및 유전자 산물 각각의 발현 수준 떠는 생물학적 활성이 증가됨으로써 특정되는 질환 및 장애(상기 질환 및 장애로부터 고통받지 않은 개체에 상대적인)는 과발현되는 유전자의 활성을 길항작용하는(즉, 감소 또는 억제하는) 치료법으로 치료될 수 있다. 활성을 길항작용화하는 치료법은 치료학적으로 또는 예방학적으로 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 치료법은, 예를 들면,
(i) C2orf18 유전자 또는 이의 유사체에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 이의 유도체, 단편 또는 상동체;
(ii) C2orf18 유전자 또는 유전자 산물에 대한 항체, 이의 단편;
(iii) "기능을 하지 않는" 안티센스 핵산 또는 핵산(즉, C2orf18 유전자의 핵산내에 이종의 삽입에 기인함);
(iv) 예를 들면, 작은 간섭 RNA(small interfering RNAs, siRNAs) 등의 이중 가닥 분자; 또는
(v) 조절자(즉, 억제제, C2orf18 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너 사이 상호작용을 변화하는 길항제)를 포함한다.
기능을 하지 않는 안티센스 분자는 상동 재조합에 의해 폴리펩티드의 내생 기능을 "녹아웃"하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Capecchi, Science 1989, 244: 1288 92 참조).
증가된 수준은 개체 조직 샘플(예를 들면, 생체 검사로부터)을 획득하고, 시험관 내에서 (발현이 변화된 유전자의 mRNAs) RNA 또는 펩티드 수준을 정량화하고, 발현된 펩티드(또는 발현이 변화된 유전자의 mRNAs)의 구조 및/또는 활성을 분석함으로써 용이하게 검출될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법은 면역분석[예를 들면, 웨스턴 블랏 분석, 도데실황산나트륨(SDS) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 따르는 면역침강법, 면역세포화학 등), RT-PCR 및/또는 mRNA의 발현을 검출하기 위한 혼성화 분석(예를 들면, 노던블랏 분석(Northern assays), 도트 블랏(dot blots), 인 시투 혼성화(in situ hybridization) 등}]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예방을 위한 투여는 질환 또는 장애가 예방되거나, 대안으로 이의 진행을 지연시키도록 질환의 명백한 임상적 증상의 징후 이전에 수행한다. 본 발명의 문맥에서, 예방은 질환으로부터 사망률 또는 질병률의 부담을 감소시키는 활성이다. 예방은 1차, 2차 및 3차 예방에서 수행할 수 있다. 1차 예방은 질환의 발생을 피하는 반면에, 예방의 2차 및 3차 수준은 기능을 회복시키고 질환 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 음성적 영향 뿐만 아니라 질환의 진전 및 증상의 발생을 예방하는데 목적을 둔다. 따라서, 본 발명은 예를 들면, 췌장암 특히 PDAC 등의 암과 같은 격렬한 C2orf18 관련 질환을 완화하는데 목적을 둔 넓은 범위의 예방 요법을 포함한다.
본 발명의 치료 방법은 세포를 C2orf18 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 활성을 조절하는 약제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 단백질 활성을 조절하는 약제의 예시로는 핵산, 단백질, 이런 단백질의 자연 발생하는 리간드, 펩티드, 펩티도미메틱스, 및 다른 작은 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 C2orf18 유전자의 발현 또는 상기 유전자 산물의 활성을 감소시킴으로써 개체에 암의 증상을 치료 또는 완화하거나, 또는 암을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 예를 들면, 췌장암 특히 PDAC 등의 암과 같은 C2orf18 관련 질환을 치료 또는 완화하는데 특히 적절하다.
적절한 치료법은 C2orf18 관련 질환으로부터 고통받거나 발생의 위험이 있는(발생할 수 있는) 개체에 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 이런 개체는 표준 임상적 방법을 이용하거나, C2orf18 유전자의 비정상적인 발현 수준("과발현" 또는 "저발현") 또는 상기 유전자 산물의 비정상적인 활성을 검출함으로써 확인될 수 있다. 본 발명의 측면에 따라, 본 발명의 방법을 통해 스크리닝된 약제는 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 당업자에 잘 알려진 방법은 예를 들면, 동맥 내, 정맥 내, 피부를 통한 주사 또는 비강내, 경기관지(transbronchial) 근육 내 또는 경구 투여와 같은 개체에 약제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 만약, 상기 약제가 DNA에 의해 암호화할 수 있다면, 상기 DNA는 유전자 치료법을 위해 벡터 내로 삽입될 수 잇으며, 상기 벡터는 치료법을 수행하기 위해 개체 내 투여될 수 있다. 이중 가닥 분자의 벡터를 세포 내로 도입하기 위해, 트렌스펙션 증진제가 사용될 수 있다. FuGENE6(Roche diagnostics), 리포펙타민 2000(Invitrogen), 올리고펙타민(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)가 트랜스펙션 증진제로 사용될 수 있다.
치료되는 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 상태 및 투여 방법에 따라 투여량 및 방법은 다양하다; 그러나 당업자는 일상적으로 적절한 투여량 및 투여 방법을 선택할 수 있다. 예를 들면, C2orf18 폴리펩티드에 결합하고 상기 폴리펩티드의 활성을 조절하는 약제의 투여량이 상기 언급된 다양한 요소에 의해 의존적임에도 불구하고, 상기 투여량은 정상 성인(60 kg 체중)에게 경구 투여할 때, 일반적으로 일일 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 바람직하게 일일 당 약 1.0 mg 내지 약 50 mg, 더욱 바람직하게 일일 당 1.0 mg 내지 약 20 mg이다.
약제를 정상 성인(60 kg 체중)에게 주사의 제형으로 비경구적으로 투여할 때, 환자, 표적 기관 및 투여 방법에 따라 일부 차이가 있음에도 불구하고, 일일 당 약 0.01 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게 일일 당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg, 더욱 바람직하게 일일 당 0.1 mg 내지 약 10 mg의 투여량으로 정맥 주사하는 것이 편리하다. 다른 동물의 경우에서, 적절한 투여량은 일반적으로 60 kg의 체중에 대해 전환함으로써 계산될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 약학적 조성물은 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법은 예를 들면, 동맥 내, 정맥 내 또는 피부를 통한 주사 또는 비강내, 경기관지(transbronchial) 근육 내 또는 경구 투여와 같은 환자에 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다.
상기 언급된 각각의 조건에 대해, 폴리펩티드 및 유기 화합물 등의 조성물은 일일 약 0.1 내지 약 250 mg/kg의 투여량 범위로 경구적으로 또는 주사를 통해 투여될 수 있다. 성인의 투여량 범위는 일반적으로 약 5 mg 내지 약 17.5 g/day, 바람직하게 약 5 mg 내지 약 10 g/day, 더욱 바람직하게 약 100 mg 내지 약 3 g/day이다. 별개의 유닛으로 제공되는 본 발명의 정제 또는 그 외 유닛 투여량 제형은 예를 들면, 약 5 mg 내지 약 500 mg, 보통 약 100 mg 내지 약 500 mg을 포함하는 유닛을 그 투여량이 유효한 하나의 양 또는 동일한 양의 다수로서 편리하게 포함할 수 있다.
작용되는 투여량은 개체의 연령, 체중 및 성별, 치료되는 정확한 질환을 포함하는 다양한 요소에 의존적일 것이다. 또한, 투여 루트는 상태 및 그의 격렬함에 의존적으로 다양할 수 있다. 어떤 사례에서, 적절하고 최적의 투여량이 상기 언급된 요소를 고려함으로써 당업자에 의해 일반적으로 계산될 수 있다. 구체적으로, C2orf18 유전자에 대한 안티센스 핵산은 악화된 부위에 직접 투여하거나 또는 질병의 부위에 도달할 수 있도록 혈관 내로 주사함으로써 제공될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 유도체의 투여량은 환자의 상태에 따라 적절하게 조절되고 원하는 양으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 0.1 내지 100 mg/kg, 바람직하게 0.1 내지 50 mg/kg의 투여량이 투여될 수 있다.
본 발명의 유형 1
이하, 본 발명은 실시예와 관련하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 물질, 방법 및 예시들은 단지 본 발명의 측면을 설명하는 것일 뿐, 결코 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질은 본 발명의 수행 또는 시험하는데 사용될 수 있다.
일반적인 방법
1. 세포주 및 임상적 시료
PDAC 세포주 MIA-PaCa2 및 Panc-1, 및 NIH3T3, HEK-293T 및 COS7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다. PDAC 세포주 KLM-1, PK-59, PK-45P, SUIT-2, 및 PK-1는 도호쿠 대학교(Sendai, Japan), 생물의학 연구 세포 자원 센터(Cell Resource Center for Biomedical Research)에 의해 제공받았다. 모든 세포주는, Panc-1, KLM-1, PK-59, PK-45P, SUIT-2, 및 PK-1를 위해서 RPMI-1640(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서, COS-7, NIH3T3, HEK-293, 및 MIA-PaCa2를 위해서 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Invitrogen)에서 배양하였다. 모든 세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 항생/항진균 용액이 첨가된 적절한 배지에서 단층으로, 5% CO2를 포함하는 대기에서 37℃를 유지하면서 배양하였다. 냉동 및 파라핀으로 고정된 PDAC 조직은 적절한 사전동의 하에서 오사카 암 및 심혈관 질환 의료 센터(Osaka Medical Center for Cancer and Cardiovascular Diseases)에서 절제된 외과적 시료로부터 획득하였고, 이런 임상적 시료를 이용하는 연구는 도쿄 대학교 의학협회, 및 오사카 암 및 심혈관 질환 의료 센터에서 IRB에 의해 승인받았다.
2. 반-정량적 RT - PCR
췌장암으로부터 PDAC 세포 및 정상 관 상피세포의 정제는 선행문헌(Nakamura T, et al. Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400.)에 기재되어 있다. 정제된 PDAC 세포 및 정상 관 상피세포 유래 RNA는 T7 근거 시험관내(in vitro) 전사(Epicentre Technologies, Madison, WI)를 이용하여 두 번 연속의 RNA 증폭시키고 단일 가닥 cDNA로 합성시킨다. 인간 췌장암 세포주 유래 총 RNA는 제조사의 권고된 절차에 따라 트리졸 시약(Invitrogen)을 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 DNase I(Roche Diagnostic, Basel, Switzerland)으로 처리한 후, oligo (dT) 프라이머 및 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 단일 가작 cDNA로 역으로 전사시켰다. 각 단일 가닥 cDNA의 적절한 희석물은 정량적 대조군으로서 알파-튜블린(alpha-tubulin, TUBA)을 모니터링함으로써 연속적인 PCR 증폭을 위해 제조되었다. 다음의 프라이머 서열을 사용하였다:
TUBA를 위한 5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3'(서열번호: 1) 및
5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3'(서열번호: 2),
C2orf18(NM_017877)를 위한 5'-GGTAGCTCAGTCATAAAACACCG-3'(서열번호: 3) 및
5'- GTCTCTCCATCATCCTCACTGTC-3'(서열번호: 4).
모든 반응은 GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems, Foster, CA)에서 94℃에서 2분 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 동안 23 사이클(TUBA의 경우) 또는 28 사이클(C2orf18의 경우)을 수반하였다.
3. 노던 블랏 분석
총 RNA를 14개의 췌장암 세포주로부터 트리졸 시약(Invitrogen)을 이용하여 추출한 후, 노던 블랏 분석을 수행하였다. DNase I(Nippon Gene)으로 처리한 후, mRNA Purification Kit(GE Healthcare, Piscataway, NJ)로 제조사의 프로토콜에 따라 mRNA를 정제하였다. 인간 성인 심장, 폐, 간, 신장, 골수 및 췌장으로부터 분리된 것들 뿐만 아니라, 췌장암 세포주로부터 유래된 1 마이크로 g의 각 mRNA를 1% 변성 아가로즈 젤에서 분리한 후, 나일론 막으로 이동시켰다. 이런 암 막(cancer membrane) 및 인간 다중 조직 블랏(Human Multiple Tissue blots)(Clontech, Palo Alto, CA)을 Mega Label kit(GE Healthcare)를 이용하여 표지된 32P-labeled C2orf18 cDNA로 16시간 동안 혼성화시켰다. C2orf18 cDNA의 232-bp PCR 산물은 프라이머 5'-GGTAGCTCAGTCATAAAACACCG-3'(서열번호: 3) 및 5'-GTCTCTCCATCATCCTCACTGTC-3'(서열번호: 4)를 이용하여 프로브로서 제조하였다. 전-혼성, 혼성 및 세척은 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 블랏은 -80℃에서 10일 동안 방사선자동사진(autoradiograph)화 하였다.
4. C2orf18 단백질에 구체적인 항체 및 면역조직화학염색의 일반
C2orf18 단백질(Genbank accession no: NP_060347, 서열번호: 12)의 코돈 70-86 및 코돈 351-371를 연결하는 부위에 각각 상응하는 두 개의 펩티드(CRAAGQSDSSVDPQQPF(서열번호: 5) 및 AEESEQERLLGGTRTPINDAS(서열번호: 6))는 Sigma-Aldrich Japan(Ishikari, Japan)에 의해 만들어 내었으며, 이들의 혼합물을 두 마리의 래빗(rabbit)에 면역시켰다. 상기 면역 혈청은 기본적인 방법론에 따라 각 펩티드 항원을 활용하는 Affi-Gel 10 활성화된 친화성 배지(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 패킹된 친화성 컬럼으로 정제하였다. PDAC로부터 보편적인 조직 절편은 적절한 사전동의 하에서 오사카 암 및 심혈관 질환 의료 센터에서 절제된 외과적 시료로부터 획득하였다. 상기 절편은 탈파라핀화한 후, pH 6.0의 구연산염 완충용액에서 108℃에서 15분 동안 고압멸균시켰다. 내생의 퍼옥시다제 활성은 퍼옥시다제 차단 시약(Peroxidase Blocking Reagent)(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 차단시켰다. 상기 절편을 차단용 소태아혈청과 인큐베이션한 후, 래빗 항-C2orf18 다클론 항체와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다(희석 1:1500). PBS로 세척한 후, 면역검출은 퍼옥시다제로 표지된 항-래빗 면역글로불린(Envision kit, Dako Cytomation)으로 수행하였다. 마지막으로, 상기 반응물을 3, 3'-디아미노벤지딘(3, 3'-diaminobenzidine)(Dako Cytomation)로 발생시켰다. 대비 염색은 헤마톡실린(hematoxylin)을 이용하여 수행하였다.
5. C2orf18 에 구체적인 작은 간섭 RNA ( siRNA )-발현 컨스트럭트
PDAC 세포에서 내생의 C2orf18 발현을 하향 조절시키기 위해, 선행문헌(Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.)에 기재된 바와 같이 표적 유전자에 대항하는 짧은 헤어핀 RNA의 발현을 위한 psiU6BX3.0 벡터를 준비하였다. U6 프로모터는 게네티신(Geneticin)(Invitrogen)에 의해 선택되기 위한 종결 신호로서 5개의 티미딘(thymidine) 및 네오 카세트(neo cassette)를 갖는, 유전자 구체적인 서열(짧은 스페이서인 TTCAAGAGA에 의해 동일한 서열의 역상보로부터 분리된, 표적 전사물로부터 19-nt 서열)의 상향으로 클론시켰다. C2orf18를 위한 표적 서열은
5'-GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3'(서열번호: 7)(#196),
5'-GCACGACAGTCAGCACAAG-3'(서열번호: 8)(#574) 및
5'-GTGACTTCCTCTTTATGGA-3'(서열번호: 9)(#3254)였으며, 음성 대조군에 대한 표적 서열은 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(서열번호: 10)(siEGFP)였다. 인간 PDAC 세포주인 MIA-PaCa2 및 Panc-1 세포를 10-cm 디쉬에 플레이트한 후, FuGENE6(Roche)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 #196, #574, #3254 각각으로, 또는 siEGFP siRNA 발현 벡터로 형질전환시켰다. 세포를 0.8 mg/ml(MIA-Paca2의 경우), 또는 1.0 mg/ml(Panc-1의 경우) 게네티신(Invitrogen)으로 선별하였다. 상기 기재된 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 C2orf18에 대한 녹다운 효과를 분석하기 위해 형질전환 7일 후에 세포를 채취하였다. 상기 세포를 9일 동안 게네티신을 포함하는 적절한 배지에서 배양한 후, 100 % 메탄올로 고정시킨 다음, 콜로니 형성 분석을 위해 0.1%의 크리스탈 바이올렛-H20으로 염색하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석에서, 세포 생존도는 형질전환 11일 후에 Cell-counting kit-8(DOJINDO, Kumamoto, Japan)를 이용하여 측정하였다. 흡광도는 Microplate Reader 550 (Bio-Rad)로 참고문헌에 따라 490 nm 및 630 nm에서 측정하였다. siRNA 에 대한 서열들
Figure pct00001
6. 면역조직화학 분석
Panc-1 세포는 제조사의 권고 절차에 따라 리포펙타민 2000 또는 RNAiMAX(Invitrogen)을 이용함으로써 상기 기재된 siC2orf18 (#196, #574) 또는 siEGFP에 대응하는 RNA 듀플렉스(duplex)로 처리한 후, siRNA 처리 72시간 후에, 200 nM MitoTracker Red(Invitrogen)를 30분 동안 배양 배지에 첨가한 다음, 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 후, 실온에서 1분 동안 0.1% Triton X-100를 포함하는 PBS로 투과시켰다. 비-구체적 결합은 실온에서 30분 동안 3% BSA를 포함하는 PBS로 처리함으로써 차단시켰다. 상기 세포는 1% BSA(1:1000)를 포함하는 PBS로 희석된 래빗 항-C2orf18 항체로 실온에서 60분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 상기 세포를 실온에서 60분 동안 FITC-결합된 2차 항체(Santa Cruz)로 염색하였다. PBS로 세척한 후, 샘플을 4', 6'-디아미딘-2'-페닐인돌렌디하이드로클로라이드[4', 6'-diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide(DAPI)]를 포함하는 VECTASHIELD(VECTOR Laboratories, Inc, Burlingame, CA)로 고정시킨 다음, Spectral Confocal Scanning Systems(Leica, Bensheim, Germany)으로 시각화하였다.
7. C2orf18 단백질의 세포분획법 및 위치화
암 세포에서 내생 C2orf18의 세포내 위치화를 더 조사하기 위해, 우선 Panc-1 세포의 세포 용해물을 핵 및 세포질 추출 시약(Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents)(Pierce, Rockford, IL)을 이용함으로써 핵 분획으로부터 세포질 분획을 분리하기 위해 분획하였다. 두 번째로, Panc-1 세포를 균질 현탁액 완충용액(homogenate buffer)[0.25M 수크로스(sucrose), 10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA]에서 균질화한 후, 핵 및 잔해를 제거하기 위해 4℃에서 10분 동안 5000 rpm으로 세포 용해물을 초원심분리시켰다. 상청액을 미토콘드리아의 분획을 수집하기 위해 4℃에서 20분 동안 15000 rpm으로 초원심분리시켰다. 상청액을 다른 세포질 성분(펠렛)으로부터 마이크로솜 분획(상청액)을 분리하기 위해 4℃에서 30분 동안 17000 rpm으로 초원심분리시켰다. 각각의 세포 분획은 SDS-PAGE에서 분리하였으며, 상기 기재된 항-C2orf18 다클론 항체에 의해 내생 C2orf18를 검출하였고, 미토콘드리아 분획은 항-미토필린(Mitofilin) 항체(Abcam, Cambridge, UK)에 의해 구체적으로 검출하였다.
8. C2orf18 및 ANT2 를 위한 발현 컨스트럭트
인간 C2orf18(NM_017877)를 암호화하는 전장 cDNA는 하기 프라이머 세트의 이용에 의해 PCR 증폭을 수행하였다: 정방향 프라이머, 5'-ATTTGAGGAAGATCATGGCCTGGACCAAGTACCA-3'(서열번호: 27) 및 역방향 프라이머, 5'-CCGCTCGAGGCTGGCATCATTGATGGGA-3'(서열번호: 28). 이어서, cDNA를 pCAGGS 벡터(pCAGGS-C2orf18-HA)의 Not1 및 Xho1 부위내로 클론화시켰다. 유사하게, 인간 ANT2(SLC25A5로도 나타냄, 서열번호: 25, GenBankTMAccession No. NM_001152)를 암호화하는 전장 cDNA 단편은 하기 프라이머 세트의 이용에 의해 PCR 증폭을 수행하였으며: 정방향 프라이머, 5'-ATTCGCGGCCGCTCATGACAGATGCCGCTGTGTC-3'(서열번호: 29) 및 역방향 프라이머, 5'-CCGCTCGAGTGTGTACTTCTTGATTTCA -3' (SEQID NO: 30), 이어서 pCAGGS 벡터(pCAGGS-ANT2-Flag)의 Not1 및 Xho1 부위내로 클론화시켰다. 이런 플라스미드들의 DNA 서열들은 DNA 서열화(sequencing)로 확인하였다.
9. C2orf18 에 상호작용하는 단백질을 위한 면역침강법 및 질량-분광 분석법
C2orf18에 상호작용할 수 있는 단백질을 확인하기 위해, 면역침강 실험을 수행하였다. pCAGGS-C2orf18-HA 또는 empty pCAGGS-HA mock을 FuGENE6(Roche)을 이용하여 췌장암 세포주 PK-1 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 상기 세포를 용해 완충용액[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 0.4% NP-40, 150 mmol/L NaCl, 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(Protease Inhibitor Cocktail Set III)(Calbiochem, San Diego, CA)]에서 용해시켰다. 총 단백질을 17.5 micro의 랫트 단클론항체 항-HA 항체(Roche, clone3F10)와 함께 15분 동안 4℃에서 배양하였다. 면역복합체를 15분 동안 300 micro l의 단백질 G 세파로즈(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)와 함께 배양한 후, 용해 완충용액으로 세척하였다. 공-침지 단백질들을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하였고 은 염색 키트(silver-staining kit)(Invitrogen)로 염색하였다. 침전물에서 구체적으로 나타난 밴드는, mock 클론으로 트랜스펙션된 세포를 제외한 C2orf18-HA로 트랜스펙션된 PK-1 세포에서 항-HA 항체로 잘려졌으며, 그런 다음 트립신을 포함하는 겔에서 용해되었고, AXIMA-CFRMALDI-TOF 질량 분광기(Shimadzu Corp., Tsukuba, Japan)를 이용하여 펩티드-질량 지문(peptide-mass fingerprint)을 분석하였다. 펩티드 질량은 10-ppm 질량 정확도(mass accuracy)로 검색하였고, 단백질 데이타베이스 검색은 데이타베이스-피팅 프로그램(database-fitting program) IntelliMarque(Shimadzu)를 이용하여 수행하였다. C2orf18 및 ANT2 단백질 사이 상호작용을 확인하기 위해, C2orf18-HA 발현 벡터 및/또는 ANT2-Flag 발현 벡터는 COS-7 세포 내로 공-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포들을 상기 기재된 바와 같이 용해시킨 후, 랫트 항-HA 항체(Roche, clone3F10) 또는 랫트 다클론항체 항-Flag 항체(Roche, F-7425)로 면역침전시켰다. C2orf18 및 ANT2 단백질의 상호작용을 검사하기 위해, 이런 면역 복합체들은 항-FLAG 또는 항-HA 항체로 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.
10. 미토콘드리아 막 전위의 검출
KLM-1 세포를 ANT2를 표적화하는 siRNA duplex, 5'-GCAGATCACTGCAGATAA-3'(서열번호: 31), C2orf18 siRNA duplex 5'-GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3'(#196/서열번호: 7) 또는 siEGFP duplex 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(대조군으로서/서열번호: 10)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 채취한 후, C2orf18를 표적화하는 siRNA duplex의 녹다운 효과를 상기 기재된 바와 같이 항-C2orf18 다클론항체로 웨스턴 블랏에 의해 확인하였다. 채취된 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 암 조건에서 37℃에서 15분 동안 10 micro M 로다민123(Rhodamine123)(Wako, Osaka, Japan)을 포함하는 PBS로 배양한 다음, FACS 완충용액으로 세척한 후, 10 micro g/ml의 요오드화 프로피디엄(Propidium iodide)(PI, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 0.5 ml의 FACS 완충용액에서 재현탁시켰다. 로다민123(Rh123)은 전기화학적 기울기가 따르는 미토콘드리아 내로 축적되는 것으로 알려져 있다. 포함되지 않은 Rh123가 제거된 경우, 포함된 Rh123는 미토콘드리아 막 전위에 비례하는 양으로 미토콘드리아에서 우선적으로 유지된다(Darzynkiewicz Z et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 2383-7). 투과성 전이세공 채널(permeability transition pore channel)의 오프닝의 미토콘드리아 온전함의 손실은 상기 미토콘드리아로부터 이런 프로브의 누출 및 그 결과인 형광 감소의 결과를 야기한다(Darzynkiewicz Z et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 2383-7, Johnson LV et al., Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 990-994.). Rh123(530 nm) 및 PI(600 nm)로부터 형광 강도는 유세포분석기(FACSCalibur, BD)로 측정하였다.
11. TUNEL 분석법.
Panc-1 세포를 siRNA#196 duplex 5'-GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3'(서열번호: 7) 및 음성대조군으로서 siEGFP duplex 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(서열번호: 10)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 72시간 후, 세포를 채취하고, PBS로 재현탁시킨 후, 15분 동안 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS(pH7.4)에 의해 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 세포를 면역 세포 화학 분석을 위해 -20℃에서 5분 동안 전냉각된 에탄올+아세트산(2:1)으로, 또는 유세포 분석을 위해 전냉각된 70% 에탄올로 투과시켰다. TUNEL 분석에 의해 세포사멸을 검출하기 위해, ApopTag Fluorescein Direct In situApoptosis Detection Kit(Millipore, Bedford, MA)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였으며, Spectral Confocal Scanning Systems(Leica)으로 시각화하거나 유세포 분석기(Cell Lab Quanta SC MPL, Beckman Coulter, Fullerton, CA)에 의해 형광을 측정하였다. DNase I로 처리된 투과된 세포를 TUNEL 분석용 양성 대조군으로서 제조하였다.
본 발명의 유형 2
PDAC 세포에서 C2orf18 의 과발현
우리의 게놈 범위 cDNA 마이크로어레이 분석(Nakamura T, et al. Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400.4)을 통해 PDAC 세포내 전사 활성되는 것으로 확인된 유전자 세트 중, 하나의 신규하고 비특정된 유전자인 C2orf18를 추가적인 연구 동안 선별하였다. 이 유전자를 본 명세서에 나타내고 그 외 ANT2BP(ANT2-결합 단백질) 또는 PAMP(췌장암 미토콘드리아 단백질)로서 교환적으로 나타낸다. RT-PCR 분석은 9개의 PDAC 세포들 중 8개에서 C2orf18이 과발현되는 것을 확인하였다(도 1A). 프로브로서 C2orf18 cDNA 단편을 이용한 노던블랏 분석은 전립선 및 갑상선에서 발현되는 약 4.4-kb 전사물을 확인하였으며, C2orf18 발현은 폐, 심장, 간 및 신장을 포함하는 필수 기관에서 단지 희미하게 검출되었다(도 1B 상부). C2orf18의 높은 수준의 발현은 조사된 대부분의 PDAC 세포주에서 관찰되었다(도 1B 하부). C2orf18 단백질에 구체적인 다클론항체를 이용하여, 웨스턴 블랏 분석은 여러 PDAC 세포 및 정상 세포주(NIH3T3, HEK-293, 및 COS7)에서 내생 C2orf18을 검출하였으며, 이는 정상 세포주 보다 PDAC 세포주에서 C2orf18의 더 높은 발현을 보였다(도 1C). 또한, 임상적 PDAC 조직 절편에서 면역조직화학적 분석을 수행하였으며, 이는 정상 췌장 조직에서 염색이 안되는 반면에 PDAC 세포에서 강한 염색이 검출되었다(도 1D의 N). 전체적으로, 22개의 PDAC 조직 중 10개(45%)가 C2orf18에 대해 양성 염색을 보였다.
본 발명의 유형 3
PDAC 세포 성장에 대한 C2orf18 - siRNAs 의 효과
PDAC세포에서 C2orf18의 생물학적 기능 및 그의 PDAC 처리를 위한 분자표적으로서 잠재성을 조사하기 위해, C2orf18에 구체적인 여러 siRNA-발현 벡터를 제조하였고, 내생으로 높은 수준의 C2orf18을 발현하는 PDAC 세포주인 MIA-PaCA2 내로 트랜스펙션시켰다. RT-PCR은 #196 및 #574 siRNA-발현 컨스트럭트가 트랜스펙션될 때, 내생의 C2orf18의 유의적인 녹다운 효과를 나타내었다(도 2A). #196 및 #574을 이용한 콜로니 형성 분석(도 2B) 및 MTT 분석(도 2C)은 #3254 및 녹다운 효과가 관찰되지 않는 음성 대조군 siEGFP에 비해 생존 세포의 수가 극적으로 감소하는 것으로 나타났다. 또다른 C2orf18-양성 PDAC 세포주인 Panc-1에서, 동일한 효과를 관찰하였다(도 2A, B 및 C).
본 발명의 유형 4
미토콘드리아에서 C2orf18 와 ANT2 의 상호작용
가상실험 분석(In-silico analysis)은 C2orf18 단백질의 371 아미노산 서열에서 다양한 막통과 도메인을 예측하였다. 항-C2orf18 항체를 이용한 면역조직화학 분석은 PDAC 세포의 세포질에서 양성 신호의 소포 유형으로 나타났으며, 이런 형광 신호의 소멸은 siRNA duplex를 이용한 내생 C2orf18의 녹다운에 의해 관찰하였다(도 3A). 이런 신호는 미토콘드리아에서 그의 위치를 나타내는, 미토콘드리아 구체적 프로브인 MitoTracker의 신호로 부분적으로 합쳐졌다(도 3A). C2orf18 단백질의 세포내 위치를 정확하게 정의하기 위해, Panc-1 세포의 용해물을 미토콘드리아, 소포체(ER) 및 다른 세포질 분획으로 분획하였다. 도 3B에서 보여주는 바와 같이, 웨스턴 블랏 분석은 미토콘드리아 구체적 단백질인 미토플린(mitofilin)과 유사하게 미토콘드리아 분획에서만 C2orf18 단백질을 검출하였다. C2orf18 단백질에 대한 가상실험 분석(In-silico analysis)은 뉴클레오티드-당 운반체(nucleotide-sugar transporters)와 관련된 투과효소(permease)로서 그의 가능한 기능을 예측하였다. 암세포에서 C2orf18 기능을 조사하기 위해, C2orf18와 상호작용하는 단백질(들)을 확인하였다. 구체적으로, C2orf18를 포함하는 단백질 복합체는 내생의 C2orf18-HA을 과발현하는 세포의 용해물로부터 면역침전되었다. C2orf18와 상호작용할 가능성이 있는 단백질을 질량 분광기로 특정하였으며, ANT2 단백질을 C2orf18 단백질과 상호작용하는 후보물질로서 확인하였다. C2orf18 및 ANT2 사이 상호작용을 입증하기 위해, C2orf18-HA 또는 ANT2-Flag 중 어느 하나를 발현하는 벡터, 또는 두 벡터들 모두를 발현하는 벡터를 COS-7 세포 내로 트랜스펙션한 후, C2orf18-HA 및/또는 ANT2-Flag를 포함하는 단백질 복합체를 항-HA 항체(도 3C 왼쪽) 또는 항-Flag 항체(도 3C 오른쪽)에 의해 세포 추출물로부터 면역침전시켰다. 도 3C(왼쪽)에서, 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블랏은 모든 발현 벡터가 공-트랜스펙션될 때, 항-Flag가 C2orf18-HA와 공-면역침전되는 것을 나타내었다. 추가적으로, 도 3C(오른쪽)에서, 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블랏은 모든 발현 벡터가 공-발현될 때, ANT2-Flag와 공-면역침전되는 것을 나타내었다. 이런 이유로, 이런 비특정 단백질은 ANT2-결합 단백질(ANT2-binding protein, ANT2BP)로 용어화하였고, 그것의 ANT2 뿐만 아니라 뉴클레오티드-당 운반체로서 가능한 역할을 제시하였다.
본 발명의 유형 5
C2orf18 / ANT2BP 는 미토콘드리아의 막 전위( delta psi m) 및 세포사멸과 관련되었다.
암 세포주 또는 미토콘드리아 결함을 가진 세포에서, 미토콘드리아 막 전위(delta psi m)의 생성은 ANT2에 의해 ATP4 -/ADP3 -교환에 대해 주로 의존적인 것으로 의심된다(Chevrollier A, et al. J Bioenerg Biomembr 2005; 37: 307-16., Bonod-Bidaud C, et al. Mitochondria 2001; 1: 217-224., Loiseau D, et al. Exp Cell Res 2002; 278: 12-18, Chevrollier A, et al. Mol Carcinog 2005; 42: 1-8.). 이런 이유로, ANT2 침묵은 미토콘드리아 막 전위를 조절함으로써 촉진된 세포사멸을 촉진시켰다(Jang JY, et al. Breast Cancer Res 2008; 10: R11., Le Bras M, et al. Cancer Res 2006; 66: 9143-52.). ANT2BP가 미토콘드리아 막 전위 delta psi m를 조절할 수 있고, 미토콘드리아 세포사멸과 관련되는지 조사하기 위해, PDAC 세포에서 ANT2BP 발현을 녹다운시킨 후, 로다민123으로 염색 및 TUNEL 분석에 의해 각각 elta psi m 및 세포사멸을 조사하였다. 항-C2orf18/ANT2BP 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석은 KLM-1 세포에서 C2orf18/ANT2BP siRNA의 녹다운 효과를 확인하였다(도 4A). 도 4B에서, X-축에서 로다민123(Rh123) 강도는 delta psi m를 반영하고 Y-축에서 PI(propidium iodide) 투과성은 죽은 세포에서 세포 막 파괴를 반영한다. Rh123 강도의 낮은 수준 및 PI의 음성적 투과성은 delta psi m이 감소하나 세포사멸이 완전히 끝나지 않은 초기 세포사멸 세포를 나타내는 반면, Rh123 강도의 낮은 수준 및 PI의 양성 투과성은 죽은 세포를 나타낸다(Shimizu S, et al. Oncogene 1996; 13: 21-9.). 낮은 delta psi m 및 PI의 음성 투과성을 보이는 세포 수는 ANTBP2(25%) 또는 ANT2(26%)가 대조군과 비교하여(siEGFP, 19%) 녹다운되는 경우, 증가하였다. 이런 FACS 분석은 ANT2BP 녹다운이 ANT2 녹다운 뿐만 아니라, 미토콘드리아 막 전위 delta psi m의 감소를 유도하는 것을 나타내었다. 추가적으로, TUNEL 염색(도 4C) 및 FACS 분석(도 4D)은 ANT2BP가 녹다운되는 경우 세포사멸 세포의 수에서 유의적인 증가를 보였다. 이런 데이타는 ANT2BP가 아마도 ANT2와 상호작용을 통해, ANT2와 유사하게, 미토콘드리아 막 전위를 유지하는데 중요한 역할을 할 수 있고 미토콘드리아의 세포사멸 경로와 관련될 수 있음을 나타내었다.
토의:
본 명세서에 증거는 PDAC 세포의 게놈 범위 유전자 발현 프로파일을 통해 췌장의 발암과 관련된 중요 분자 중 하나가 되는 신규 유전자 C2orf18/ANT2BP를 증명한다. PDAC 세포주에서 siRNA를 이용한 C2orf18/ANT2BP의 녹다운은 PDAC 세포의 생존도를 유지하는 필수적인 역할을 암시하는, 암 세포 생존도의 극적인 억제를 가져오고, 미토콘드리아의 막 전위의 실패가 따르는 세포사멸을 유도하였다. 또한, 상기 증거는 C2orf18와, 미토콘드리아의 투과성 전이 세공 복합체(permeability transition pore complex, PTPC)의 성분 중 하나로서 미토콘드리아의 ADP를 세포질 ATP로의 교환을 촉진시키는 기능을 가진 것으로 보여지는, ANT2 사이에 상호작용을 나타낸다. PTPC는 세포사멸, 괴사 및 자가포식 동안 미토콘드리아 막 투과성의 조절에 중요한 역할을 하고, ANT 계열 멤버들은 호흡과 관련된 ATP 교환 또는 대사 뿐만 아니라 미토콘드리아 막 전위의 유지에 중요한 역할을 한다(Crompton M. J Physiol 2000; 529: 11-21., Verrier F, et al. Oncogene 2004; 23: 8049-64.). 암 세포주에서, 에너지 대사 또는 ATP 생산은 Warburg 효과로 인지되고 있는 해당과정(glycolysis)에 주로 의존한다(Wallace DE. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2005; 70:363-74.). ANT 계열 멤버들 중, 단지 ANT2만은 해당과정 의존적인 ATP 생산 및 그의 이동과 관련될 것이고, 이는 미토콘드리아의 결함을 가지는 세포 뿐만 아니라 암 세포에서 상향 조절되고 저산소 하에서 세포를 증식시키는 것을 보여주었다(Chevrollier A, et al. J Bioenerg Biomembr 2005; 37: 307-16., Bonod-Bidaud C, et al. Mitochondria 2001; 1: 217-224., Loiseau D, etal. Exp Cell Res 2002; 278: 12-18, Chevrollier A, et al. Mol Carcinog 2005; 42: 1-8.). C2orf18/ANT2BP는 ANT2와 상호작용하기 때문에, C2orf18/ANT2BP는 미토콘드리아에서 C2orf18/ANT2BP의 기능 및 암 세포의 에너지 대사의 분석이 추가적으로 요구됨에도 불구하고, ANT2 복합체의 멤버로서 해당과정 의존적인 ATP 생산 및 이동과 관련되고, 췌장암 세포가 저산소증 또는 화학요법에 저항하게 하는 것으로 의심된다. 일부 작은 화학물은 이미 항암제로서 ANT 운반체를 억제하는 것이 확립되어 있다(Galluzzi L, et al. Oncogene 2006; 25: 4812-30., Don AS, et al. Cancer Cell 2003; 3: 497-509., Machida K, et al. J Bio Chem 2002; 277: 31243-31248.). 가상분석(in-silico analysis)에 의해 예측되고 본 명세서의 데이타에 의해 지지되는, C2orf18/ANT2BP의 가능한 운반체 기능은, 신규 항암제로서 C2orf18/ANT2BP에 대한 억제제의 개발을 유도할 수 있는 것으로 고려된다. 요약하면, 본 명세서에서 발현적이고 기능적인 검출은 C2orf18/ANT2BP가 PDAC 치료 및 다른 암에 대한 유망한 분자 표적인 것을 제시한다.
산업상 이용가능성
본 명세서에 기재된 췌장암, 특히 췌장 관선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)의 유전자 발현 분석은 레이저 갭쳐 해부(laser-capture dissection) 및 게놈 범위 cDNA 마이크로어레이를 통해 획득하였고, 암 검출, 진단 및 치료를 위한 신규 표적으로서 C2orf18 유전자를 확인하였다. C2orf18의 발현을 근거로, 본 발명은 췌장암, 특히 췌장 관선암종(PDAC)을 확인 및 검출하기 위한 분자적 진단 마커를 제공한다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법은 PDAC와 같은 췌장암의 검출, 진단, 치료 및 예방을 위한 추가적인 분자 표적의 확인에 유용하다. 본 명세서에 보고된 데이타는 췌장암의 포괄적인 이해를 증가시키고, 그러므로 신규 진단 전략의 개발을 촉진하며, 치료 약제 및 예방 약제를 위한 분자 표적의 확인을 위한 실마리를 제공한다. 이런 정보는 췌장의 종양형성의 보다 심오한 이해에 기여하고, 췌장암의 검출, 진단, 치료 및 근본적으로 예방을 위한 신규 전략을 개발하는데 지표를 제공한다.
게다가, 본 명세서에 기재된 방법은 PDAC와 같은 췌장암을 가진 환자의 진전 및 예후를 모니터링하는 것 뿐만 아니라, PDAC와 같은 췌장암의 진단에도 유용하다. 아울러, 본 명세서에 보고된 데이타는 PDAC와 같은 췌장암에 대한 치료적 접근의 개발을 위한 가능성 있는 후보물질을 제공한다.
본 명세서에 언급된, 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 이들 전부가 참고문헌으로서 통합된다. 그러나, 본 명세서에 없는 것은 본 발명이 선행 발명의 장점에 의한 개시가 선행하는 권리를 부여받지 않는 허용으로 이해될 수 있다.
본 발명은 상세하게 설명하고 이의 구체적인 실시예와 관련된 한편, 앞서 언급한 설명은 특성을 예시하고 설명하는 것이고, 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 분명히 보여주는 의도로 이해되는 것이다. 관례적인 실험을 통해, 당업자가 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 사상 및 범위로부터 떨어지는 것 없이 그 안에 있을 수 있는 것으로 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 게다가 이점 및 특징은 하기 기재된 청구항으로부터 나타낼 것이며, 이는 당업자에 의해 이해될 수 있는 것으로서, 본 발명의 합리적인 등가물로 결정될 수 있는 청구항의 범위를 갖는다. 따라서, 본 발명이 상기 상세한 설명에 의해 한정되는 것을 의도하지 않는다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> C2ORF18 AS TARGET GENE FOR CANCER THERAPY AND DIAGNOSIS <130> 10fpi-09-03 <150> US 61/036,035 <151> 2008-03-12 <160> 31 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 1 aaggattatg aggaggttgg tgt 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 2 cttgggtctg taacaaagca ttc 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 3 ggtagctcag tcataaaaca ccg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 4 gtctctccat catcctcact gtc 23 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized antigen polypeptide <400> 5 Cys Arg Ala Ala Gly Gln Ser Asp Ser Ser Val Asp Pro Gln Gln Pro 1 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Ala 1 5 10 ggg ctc atg ctt gtt acc ggc tcc atc aac acg ctc tcg gca aaa tgg 157 Gly Leu Met Leu Val Thr Gly Ser Ile Asn Thr Leu Ser Ala Lys Trp 15 20 25 gcg gac aat ttc atg gcc gag ggc tgt gga ggg agc aag gag cac agc 205 Ala Asp Asn Phe Met Ala Glu Gly Cys Gly Gly Ser Lys Glu His Ser 30 35 40 ttc cag cat ccc ttc ctc cag gca gtg ggc atg ttc ctg gga gaa ttc 253 Phe Gln His Pro Phe Leu Gln Ala Val Gly Met Phe Leu Gly Glu Phe 45 50 55 tcc tgc ctg gct gcc ttc tac ctc ctc cga tgc aga gct gca ggg caa 301 Ser Cys Leu Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Arg Cys Arg Ala Ala Gly Gln 60 65 70 75 tca gac tcc agc gta gac ccc cag cag ccc ttc aac cct ctt ctt ttc 349 Ser Asp Ser Ser Val Asp Pro Gln Gln Pro Phe Asn Pro Leu Leu Phe 80 85 90 ctg ccc cca gcg ctc tgt gac atg aca ggg acc agc ctc atg tat gtg 397 Leu Pro Pro Ala Leu Cys Asp Met Thr Gly Thr Ser Leu Met Tyr Val 95 100 105 gct ctg aac atg acc agt gcc tcc agc ttc cag atg ctg cgg ggt gca 445 Ala Leu Asn Met Thr Ser Ala Ser Ser Phe Gln Met Leu Arg Gly Ala 110 115 120 gtg atc ata ttc act ggc ctg ttc tcg gtg gcc ttc ctg ggc cgg agg 493 Val Ile Ile Phe Thr Gly Leu Phe Ser Val Ala Phe Leu Gly Arg Arg 125 130 135 ctg gtg ctg agc cag tgg ctg ggc atc cta gcc acc atc gcg ggg ctg 541 Leu Val Leu Ser Gln Trp Leu Gly Ile Leu Ala Thr Ile Ala Gly Leu 140 145 150 155 gtg gtc gtg ggc ctg gct gac ctc ctg agc aag cac gac agt cag cac 589 Val Val Val Gly Leu Ala Asp Leu Leu Ser Lys His Asp Ser Gln His 160 165 170 aag ctc agc gaa gtg atc aca ggg gac ctg ttg atc atc atg gcc cag 637 Lys Leu Ser Glu Val Ile Thr Gly Asp Leu Leu Ile Ile Met Ala Gln 175 180 185 atc atc gtt gcc atc cag atg gtg cta gag gag aag ttc gtc tac aaa 685 Ile Ile Val Ala Ile Gln Met Val Leu Glu Glu Lys Phe Val Tyr Lys 190 195 200 cac aat gtg cac cca ctg cgg gca gtt ggc act gag ggc ctc ttt ggc 733 His Asn Val His Pro Leu Arg Ala Val Gly Thr Glu Gly Leu Phe Gly 205 210 215 ttt gtg atc ctc tcc ctg ctg ctg gtg ccc atg tac tac atc ccc gcc 781 Phe Val Ile Leu Ser Leu Leu Leu Val Pro Met Tyr Tyr Ile Pro Ala 220 225 230 235 ggc tcc ttc agc gga aac cct cgt ggg aca ctg gag gat gca ttg gac 829 Gly Ser Phe Ser Gly Asn Pro Arg Gly Thr Leu Glu Asp Ala Leu Asp 240 245 250 gcc ttc tgc cag gtg ggc cag cag ccg ctc att gcc gtg gca ctg ctg 877 Ala Phe Cys Gln Val Gly Gln Gln Pro Leu Ile Ala Val Ala Leu Leu 255 260 265 ggc aac atc agc agc att gcc ttc ttc aac ttc gca ggc atc agc gtc 925 Gly Asn Ile Ser Ser Ile Ala Phe Phe Asn Phe Ala Gly Ile Ser Val 270 275 280 acc aag gaa ctg agc gcc acc acc cgc atg gtg ttg gac agc ttg cgc 973 Thr Lys Glu Leu Ser Ala Thr Thr Arg Met Val Leu Asp Ser Leu Arg 285 290 295 acc gtt gtc atc tgg gca ctg agc ctg gca ctg ggc tgg gag gcc ttc 1021 Thr Val Val Ile Trp Ala Leu Ser Leu Ala Leu Gly Trp Glu Ala Phe 300 305 310 315 cat gca ctg cag atc ctt ggc ttc ctc ata ctc ctt ata ggc act gcc 1069 His Ala Leu Gln Ile Leu Gly Phe Leu Ile Leu Leu Ile Gly Thr Ala 320 325 330 ctc tac aat ggg cta cac cgt ccg ctg ctg ggc cgc ctg tcc agg ggc 1117 Leu Tyr Asn Gly Leu His Arg Pro Leu Leu Gly Arg Leu Ser Arg Gly 335 340 345 cgg ccc ctg gca gag gag agc gag cag gag aga ctg ctg ggt ggc acc 1165 Arg Pro Leu Ala Glu Glu Ser Glu Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Thr 350 355 360 cgc act ccc atc aat gat gcc agc t gaggttccct ggaggcttct 1210 Arg Thr Pro Ile Asn Asp Ala Ser 365 370 actgccaccc gggtgctcct tctccctgag actgaggcca cacaggctgg tgggccccga 1270 atgccctatc cccaaggcct caccctgtcc cctccctgca gaacccccag ggcagctgct 1330 gccacagaag ataacaacac ccaagtcctc tttttctcac taccacctgc agggtggtgt 1390 tacccagccc ccacaagcct gagtgcagtg gcagacctca gctctctgga cccctcctac 1450 agcactagag ctaaatcatg aagttgaatt gtaggaattt accaccgtag tgtatctgaa 1510 tcataaacta gattatcata gttatctagt ttatgagtca taagctagat ttgattcttc 1570 aaagaagaaa agtcagtgag caaatttaaa ccagaactaa gcattatatt ttcttttttt 1630 ttttttgaga cagagtctcg ctctgtcgcc caggctggag tgcagtggca cgatctcggc 1690 ggctcactac aacctctgcc tcccaggttc aaatgattct cctgcctcag cctcccgagt 1750 agctgggatt acaggtgcat aacacacctg ggtaactttt atagagatgg ggtttcacca 1810 tgttggccag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat ctgcctgcct cggcctccca 1870 aagtgctggg attacaggcg tgagacacca cacccagcca taactaagca ttatgttttc 1930 taaaacttct aagatcctcc ctaaacccgt ctggagacat gggttttagc ccagactctg 1990 cctcaaactc attgtagctc ccagcacatt acccagttgc tctgggcctt ggtgttatgc 2050 tctgggaagt agatgttgat gctgtggcct tagtgccttc tggccccagc attccatggg 2110 cctgtgatct tgaccaacct gagaaaacag taacagccca tccactggaa atacccctct 2170 gcccacagca ccacccttct gtgctgtttt ttttgttgtt tgtttgtttc ttctttttga 2230 gacagagtct tgctctgttg ccacgctgga gtgcagtggt gtgatctcgg ctcactgcaa 2290 cctcccgctc ccaggttcaa gcaagtcccc tgagtagctg ggactacagg cgtgtgccac 2350 cacatccggc taattttttg cattctttaa tagagacggg gttttgccat gttggccagg 2410 atggtctcaa tctcctgacc tcatgatcca cctgcctcag cctcccaaag tgctggggtt 2470 acaggcatga gccaccacgc ccagcctttt tttttttttt ttttttttct tgagagacag 2530 ggtcttgctc tgtcacccag gcacagctta ctgcagcctt gaactcctgg gatcaatcag 2590 tcctcctgcc tcagcctccc gagtagctaa gactaacagg tatgtaccac catgcctggt 2650 ttattgtttt atttttttgg cagagatggg tctcactgtg ttgcccaggc tgatctcaaa 2710 ctcctggcct caagcgatcc tcccatctca gcctcccaaa gtgctgggat tacagacctg 2770 agccaccaca cctgggcaac agagtgaaac ctgtccctgt tttcctgctc ttactctcac 2830 ctctgaggcc tcctctgcct ggaagagatt acagggaaat tccaggcagc ccttgtcaat 2890 tgtttttatg aattctttac ctgttccttt taaagacaag gaaactgagg cccaaagttc 2950 taagttgttt ggcaaatgga gtctcctacc ctcagctcct gcaaggacct gggggacccc 3010 caggtccagc agccacatga ttctgcagca gacagggacc tagagcacat ctggatctca 3070 gccccacccc tggcaacctg cctgcctaga gaactcccaa gatgacagac taagtaggat 3130 tctgccattt agaataattc tggtatcctg ggcgttgcgt taagttgctt aactttcatt 3190 ctgtcttacg atagtcttca gaggtgggaa cagatgaaga aaccatgccc cagagaaggt 3250 taagtgactt cctctttatg gagccagtgt tccaacctag gtttgcctga taccagacct 3310 gtggccccac ctcccatgca ggtctctgtg gggtctttgg gatggatctc ctagggctgg 3370 gctggaagcc tcatgtactg ttgtcttcta ggtaaccacc ctgaagagaa ggggtggcat 3430 caggaaccgc agggaaccaa gcagcctttg gtccagtgct gctccttgga acagttgagt 3490 gtggcctcaa accattctcc tgggtagctc agtcataaaa caccgaatgc ctgcctcaaa 3550 atagcctctg agggaaggga gctgttgaca agtgaagccc tcaggttgtg tgggattcca 3610 gcaggttatt acagcttgtg gggggaggga gggtccattc caccagcttt gaatcccagg 3670 gtcccctcag cttcactggg ccacagtgtc tgtcccagga agaagcaaat ggacagtgag 3730 gatgatggag agactacagc tgccttgtct aaaacctggg atcttaaaag tgttattttg 3790 gcttttattt tttaaaaaaa gaaaaggaaa attggcaatt gtattaatcc attctcgaat 3850 tgctgtaaag aaatacctga gactgggtaa tttaatttat aaagaaaaga ggtttaattg 3910 gc 3912 <210> 12 <211> 371 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Trp Thr Lys Tyr Gln Leu Phe Leu Ala Gly Leu Met Leu Val 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ile Asn Thr Leu Ser Ala Lys Trp Ala Asp Asn Phe Met 20 25 30 Ala Glu Gly Cys Gly Gly Ser Lys Glu His Ser Phe Gln His Pro Phe 35 40 45 Leu Gln Ala Val Gly Met Phe Leu Gly Glu Phe Ser Cys Leu Ala Ala 50 55 60 Phe Tyr Leu Leu Arg Cys Arg Ala Ala Gly Gln Ser Asp Ser Ser Val 65 70 75 80 Asp Pro Gln Gln Pro Phe Asn Pro Leu Leu Phe Leu Pro Pro Ala Leu 85 90 95 Cys Asp Met Thr Gly Thr Ser Leu Met Tyr Val Ala Leu Asn Met Thr 100 105 110 Ser Ala Ser Ser Phe Gln Met Leu Arg Gly Ala Val Ile Ile Phe Thr 115 120 125 Gly Leu Phe Ser Val Ala Phe Leu Gly Arg Arg Leu Val Leu Ser Gln 130 135 140 Trp Leu Gly Ile Leu Ala Thr Ile Ala Gly Leu Val Val Val Gly Leu 145 150 155 160 Ala Asp Leu Leu Ser Lys His Asp Ser Gln His Lys Leu Ser Glu Val 165 170 175 Ile Thr Gly Asp Leu Leu Ile Ile Met Ala Gln Ile Ile Val Ala Ile 180 185 190 Gln Met Val Leu Glu Glu Lys Phe Val Tyr Lys His Asn Val His Pro 195 200 205 Leu Arg Ala Val Gly Thr Glu Gly Leu Phe Gly Phe Val Ile Leu Ser 210 215 220 Leu Leu Leu Val Pro Met Tyr Tyr Ile Pro Ala Gly Ser Phe Ser Gly 225 230 235 240 Asn Pro Arg Gly Thr Leu Glu Asp Ala Leu Asp Ala Phe Cys Gln Val 245 250 255 Gly Gln Gln Pro Leu Ile Ala Val Ala Leu Leu Gly Asn Ile Ser Ser 260 265 270 Ile Ala Phe Phe Asn Phe Ala Gly Ile Ser Val Thr Lys Glu Leu Ser 275 280 285 Ala Thr Thr Arg Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Thr Val Val Ile Trp 290 295 300 Ala Leu Ser Leu Ala Leu Gly Trp Glu Ala Phe His Ala Leu Gln Ile 305 310 315 320 Leu Gly Phe Leu Ile Leu Leu Ile Gly Thr Ala Leu Tyr Asn Gly Leu 325 330 335 His Arg Pro Leu Leu Gly Arg Leu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ala Glu 340 345 350 Glu Ser Glu Gln Glu Arg Leu Leu Gly Gly Thr Arg Thr Pro Ile Asn 355 360 365 Asp Ala Ser 370 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 13 caccggagca cagcttccag catttcaaga gaatgctgga agctgtgctc c 51 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 14 aaaaggagca cagcttccag cattctcttg aaatgctgga agctgtgctc c 51 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA hairpin design <400> 15 ggagcacagc ttccagcatt tcaagagaat gctggaagct gtgctcc 47 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 16 caccgcacga cagtcagcac aagttcaaga gacttgtgct gactgtcgtg c 51 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 17 aaaagcacga cagtcagcac aagtctcttg aacttgtgct gactgtcgtg c 51 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA hairpin design <400> 18 gcacgacagt cagcacaagt tcaagagact tgtgctgact gtcgtgc 47 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 19 caccgtgact tcctctttat ggattcaaga gatccataaa gaggaagtca c 51 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 20 aaaagtgact tcctctttat ggatctcttg aatccataaa gaggaagtca c 51 <210> 21 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA hairpin design <400> 21 gtgacttcct ctttatggat tcaagagatc cataaagagg aagtcac 47 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 22 caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 23 aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA hairpin design <400> 24 gaagcagcac gacttcttct tcaagagaga agaagtcgtg ctgcttc 47 <210> 25 <211> 1284 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 agctccggct ccccctatat aaatcggcca tttgcttcgc tccgccccgc agcgccggag 60 tcaaagccgg ttcccggccc agtcccgtcc tgcagcagtc tgcctcctct ttcaacatga 120 cagatgccgc tgtgtccttc gccaaggact tcctggcagg tggagtggcc gcagccatct 180 ccaagacggc ggtagcgccc atcgagcggg tcaagctgct gctgcaggtg cagcatgcca 240 gcaagcagat cactgcagat aagcaataca aaggcattat agactgcgtg gtccgtattc 300 ccaaggagca gggagttctg tccttctggc gcggtaacct ggccaatgtc atcagatact 360 tccccaccca ggctcttaac ttcgccttca aagataaata caagcagatc ttcctgggtg 420 gtgtggacaa gagaacccag ttttggctct actttgcagg gaatctggca tcgggtggtg 480 ccgcaggggc cacatccctg tgttttgtgt accctcttga ttttgcccgt acccgtctag 540 cagctgatgt gggtaaagct ggagctgaaa gggaattccg aggcctcggt gactgcctgg 600 ttaagatcta caaatctgat gggattaagg gcctgtacca aggctttaac gtgtctgtgc 660 agggtattat catctaccga gccgcctact tcggtatcta tgacactgca aagggaatgc 720 ttccggatcc caagaacact cacatcgtca tcagctggat gatcgcacag actgtcactg 780 ctgttgccgg gttgacttcc tatccatttg acactgttcg ccgccgcatg atgatgcagt 840 cagggcgcaa aggaactgac atcatgtaca caggcacgct tgactgctgg cggaagattg 900 ctcgtgatga aggaggcaaa gcttttttca agggtgcatg gtccaatgtt ctcagaggca 960 tgggtggtgc ttttgtgctt gtcttgtatg atgaaatcaa gaagtacaca taagttattt 1020 cctaggattt ttccccctgt gaacaggcat gttgtattat ataacatatc ttgagcattc 1080 ttgacagact cctggctgtc agtttctcag tggcaactat ttactggttg aaaatgggaa 1140 gcaataatat tcatctgacc agttttctct taaagccatt tccatgatga tgatgatggg 1200 actcaattgt attttttatt tcagtcactc ctgataaata acaaatttgg agaaataaaa 1260 atatctaaaa taaattttgt ctgc 1284 <210> 26 <211> 298 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Thr Asp Ala Ala Val Ser Phe Ala Lys Asp Phe Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Ala Pro Ile Glu Arg Val 20 25 30 Lys Leu Leu Leu Gln Val Gln His Ala Ser Lys Gln Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Lys Gln Tyr Lys Gly Ile Ile Asp Cys Val Val Arg Ile Pro Lys Glu 50 55 60 Gln Gly Val Leu Ser Phe Trp Arg Gly Asn Leu Ala Asn Val Ile Arg 65 70 75 80 Tyr Phe Pro Thr Gln Ala Leu Asn Phe Ala Phe Lys Asp Lys Tyr Lys 85 90 95 Gln Ile Phe Leu Gly Gly Val Asp Lys Arg Thr Gln Phe Trp Leu Tyr 100 105 110 Phe Ala Gly Asn Leu Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ser Leu 115 120 125 Cys Phe Val Tyr Pro Leu Asp Phe Ala Arg Thr Arg Leu Ala Ala Asp 130 135 140 Val Gly Lys Ala Gly Ala Glu Arg Glu Phe Arg Gly Leu Gly Asp Cys 145 150 155 160 Leu Val Lys Ile Tyr Lys Ser Asp Gly Ile Lys Gly Leu Tyr Gln Gly 165 170 175 Phe Asn Val Ser Val Gln Gly Ile Ile Ile Tyr Arg Ala Ala Tyr Phe 180 185 190 Gly Ile Tyr Asp Thr Ala Lys Gly Met Leu Pro Asp Pro Lys Asn Thr 195 200 205 His Ile Val Ile Ser Trp Met Ile Ala Gln Thr Val Thr Ala Val Ala 210 215 220 Gly Leu Thr Ser Tyr Pro Phe Asp Thr Val Arg Arg Arg Met Met Met 225 230 235 240 Gln Ser Gly Arg Lys Gly Thr Asp Ile Met Tyr Thr Gly Thr Leu Asp 245 250 255 Cys Trp Arg Lys Ile Ala Arg Asp Glu Gly Gly Lys Ala Phe Phe Lys 260 265 270 Gly Ala Trp Ser Asn Val Leu Arg Gly Met Gly Gly Ala Phe Val Leu 275 280 285 Val Leu Tyr Asp Glu Ile Lys Lys Tyr Thr 290 295 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for PCR <400> 27 atttgaggaa gatcatggcc tggaccaagt acca 34 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for PCR <400> 28 ccgctcgagg ctggcatcat tgatggga 28 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for PCR <400> 29 attcgcggcc gctcatgaca gatgccgctg tgtc 34 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for PCR <400> 30 ccgctcgagt gtgtacttct tgatttca 28 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A target sequence for siRNA <400> 31 gcagatcact gcagataa 18

Claims (37)

  1. 개체 유래 생물학적 시료 내에서 C2orf18의 시험 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
    여기서, C2orf18의 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 상기 수준이 증가한 것은 상기 개체가 암으로부터 고통받거나 암 발생의 위험이 있는 것을 나타내는 것이며,
    여기서, 상기 C2orf18의 시험 발현 수준은 (a) C2orf18의 mRNA를 검출하는 방법,(b) C2orf18에 의해 암호화되는 단백질을 검출하는 방법, 및 (c) C2orf18에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는,
    개체 내 암을 검출 또는 진단하는 방법,
  2. 제 1항에 있어서, 상기 C2orf18의 시험 발현 수준에 상응하는 증가는 정상 대조군 수준 보다 약 10% 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 C2orf18 발현 수준은 상기 개체 유래 생물학적 시료의 유전자 전사물에 대한 C2orf18 프로브의 혼성화를 검출함에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 C2orf18 발현 수준은 C2orf18 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체의 결합을 검출함에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 CRAAGQSDSSVDPQQPF(서열번호: 5) 및/또는 AEESEQERLLGGTRTPINDAS(서열번호: 6)으로 구성된 C2orf18 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 개체 유래 생물학적 시료는 생체검사(biopsy)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. a) 피검 물질과 C2orf18에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 접촉시키는 단계;
    b) 상기 폴리펩티드와 피검 물질 사이 결합 활성을 검출하는 단계; 및
    c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 후보 물질 또는 암 세포 성장을 억제할 수 있는 C2orf18 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제용 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  9. a) 피검 물질과 C2orf18를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계;
    b) 단계 a)의 세포에서 C2orf18의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
    c) 단계 a)의 세포에서 C2orf18의 발현 수준이 피검 물질 부재하에서 검출된 C2orf18의 발현 수준과 비교하여 감소된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하거나 암 세포 성장을 억제하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 세포는 췌장암 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. a) 피검 물질과 C2orf18에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 접촉시키는 단계;
    b) 단계 a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및
    c) 단계 a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성이 피검 물질 부재하에서 검출된 생물학적 활성과 비교하여 억제된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하거나 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 세포 증식 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. a) 피검 물질과, C2orf18의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절 하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 삽입된 세포를 접촉시키는 단계;
    b) 단계 a)의 세포에서 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    c) 단계 a)의 세포에서 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성 수준이 피검 물질 부재하에서의 수준과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하거나 암 세포 성장을 억제하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
  14. 제 8, 9, 10 또는 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. a) 피검 물질의 존재 하에서, 하기 1) 내지 4)로 구성된 군으로부터 선택되는 첫 번째 폴리펩티드와 하기 5) 내지 8)로 구성된 군으로부터 선택되는 두 번째 폴리펩티드를 접촉시키는 단계:
    1) 서열번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    2) 서열번호: 12의 아미노산 서열에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 첨가, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 ANT2에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드;
    3) 서열번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 적어도 약 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 ANT2에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    4) 서열번호: 11의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되고, 서열번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 ANT2에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드,
    5) 서열번호: 26의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    6) 서열번호: 26의 아미노산 서열에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 첨가, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 26의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 C2orf18에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드;
    7) 서열번호: 26의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 적어도 약 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 26의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 C2orf18에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    8) 서열번호: 25의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되고, 서열번호: 26의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 C2orf18에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드,
    b) 상기 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사이 결합 수준을 측정하는 단계;
    c) 상기 물질의 부재하에서 검출된 상기 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사이 결합 수준을 비교하는 단계; 및
    d) 상기 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사이 결합을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, C2orf18 및 ANT2 사이 결합을 억제하는 물질을 확인하는 방법.
  16. C2orf18의 발현 수준을 감소시키는 이중 가닥 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 세포 성장을 억제하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 C2orf18의 센스 핵산 및 안티센스 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 표적 서열로서 서열번호: 7 또는 8로 구성되는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3' {여기서, [A]는 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드로 구성되는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, [B]는 약 3 내지 약 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열, 및 [A']는 [A]의 상보적인 서열로 구성되는 뉴클레오티드 서열}를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 개체에 형질전환 증진제와 함께 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 약학적으로 유효한 양의 C2orf18에 대항하는 이중 가닥 분자를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 표적 서열로서 서열번호: 7 또는 8로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3' {여기서, [A]는 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드로 구성되는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, [B]는 약 3 내지 약 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열, 및 [A']는 [A]의 상보적인 서열로 구성되는 뉴클레오티드 서열}를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 약학적으로 유효한 양의 C2orf18에 대항하는 이중 가닥 분자를 암호화하는 벡터를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
  26. 제 22 또는 25항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 서열번호: 7 또는 8로 구성되는 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥 및 상기 센스 가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화하며, C2orf18 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되는 경우 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 이중 가닥 분자.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 센스 가닥은 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 통해 연결된 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 뉴클레오티드 전사물인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3' {여기서, [A]는 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드로 구성되는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, [B]는 약 3 내지 약 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열, 및 [A']는 [A]의 상보적인 서열로 구성되는 뉴클레오티드 서열}를 가지는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  31. 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥 핵산 및 상기 센스 가닥에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 조합의 각각 또는 모두를 포함하고, 여기서 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화하며, C2orf18 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되는 경우 상기 세포 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  32. 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥 핵산 및 상기 센스 가닥에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 조합 각각을 포함하고, 여기서 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화하며, C2orf18 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되는 경우 상기 세포 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 전사물은 추가적으로 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥을 연결하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3' {여기서, [A]는 서열번호: 7 또는 8의 뉴클레오티드로 구성되는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, [B]는 약 3 내지 약 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열, 및 [A']는 [A]의 상보적인 서열로 구성되는 뉴클레오티드 서열}를 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.
  35. C2orf18 단백질에 결합하는 항체.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 CRAAGQSDSSVDPQQPF(서열번호: 5) 및/또는 AEESEQERLLGGTRTPINDAS(서열번호: 6)으로 구성되는 C2orf18 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
  37. 제 35항의 항체를 포함하는 개체 내 암 검출용 물질.
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