JP2013502201A - 肺癌の治療および診断の標的遺伝子としてのcstf2 - Google Patents
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Abstract
本発明は、がんの発がんにおいてCSTF2遺伝子が果たす役割に関し、CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子、またはそのような二本鎖分子を含む組成物、ベクター、もしくは細胞を投与することにより、がんを治療または予防するための方法を特徴とする。本発明はまた、CSTF2遺伝子の過剰発現を用いて、がんを診断するため、または肺癌を有する対象の予後を評価/判定するための方法を特徴とする。そのために、CSTF2はがん、特に肺癌の新規予後バイオマーカーとして役立ち得る。また、CSTF2の発現または生物学的活性に対するその効果を指標として用いて、がんを治療および予防するための候補物質をスクリーニングする方法も開示される。
Description
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん研究、がん診断、およびがん治療法の分野に関する。特に本発明は、肺癌を検出および診断するための方法、ならびに肺癌を有する対象を治療および予防するため、または該対象の予後を評価/判定するための方法に関する。さらに本発明は、肺癌を治療および/または予防するための候補物質をスクリーニングする方法に関する。
優先権
本出願は2009年8月21日に出願された米国仮特許出願第61/274,800号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は2009年8月21日に出願された米国仮特許出願第61/274,800号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
原発性肺癌は大多数の国におけるがん死の原因の第1位であり、非小細胞肺癌(NSCLC)はそのような症例の約80%を占める(非特許文献1)。肺発癌の詳細な分子機構は依然として不明なままであるが、肺癌における様々な遺伝子変化が報告された(非特許文献2)。進行性肺癌患者は、手術技術および化学放射線療法の改善にもかかわらず、致死的な疾患経過を受ける場合が多い(非特許文献1)。したがって、患者の生存を向上させるためには、肺癌の生物学を理解すること、およびより効果的な治療を導入することが極めて重要であると考えられる(非特許文献3)。過去20年の間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンなどの新たに開発されたいくつかの細胞傷害性剤が出現し、進行性NSCLC患者の治療に複数の選択肢を提供したが、これらのレジメンが示す生存上の恩恵は、シスプラチンに基づく従来の治療法と比較してわずかである(非特許文献4、5)。
現在では、特異的分子標的の概念が革新的ながん治療戦略の開発に適用されており、治療用モノクローナル抗体および小分子剤という主に2つのアプローチが治療に用いられている(非特許文献6)。これまでに、ゲフィチニブおよびエルロチニブなどの上皮増殖因子のチロシンキナーゼインヒビター、バンデタニブ、ソラフェニブ、スニチニブなどの血管内皮増殖因子のチロシンキナーゼインヒビター、ならびにベバシズマブおよびセツキシマブなどの上皮増殖因子または血管内皮増殖因子のモノクローナル抗体を含む多くの分子標的治療法が、進行性肺癌の化学療法の第II相および第III相試験において調べられてきた(非特許文献6〜10)。しかしながら、毒性の問題のために、限られた数の患者しかこれらの治療レジメンを選択することができず、たとえすべての種類の治療が適用されたとしても、良好な反応を示す患者の割合は限られている(非特許文献6〜10)。
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cDNAマイクロアレイ技術を用いる何千もの遺伝子の発現レベルの体系的な解析は、新規な治療法および診断法の開発のための候補となり得る、発がん経路と関連する標的分子を同定するための有効なアプローチである。肺癌の診断および/または治療用の潜在的分子標的を単離するため、本発明者らは以前に、レーザーマイクロダイセクションによって精製された腫瘍細胞集団を用いて、27,648個の遺伝子または発現配列タグ(EST)からなるcDNAマイクロアレイにより、101例の肺癌組織試料のゲノム全域にわたる遺伝子発現プロファイルを解析した(Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75)。各遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、本発明者らは、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析とRNA干渉技術との併用によるスクリーニング系を確立した(Suzuki C, Daigo Y, Kikuchi T, Katagiri T, Nakamura Y. Cancer Res 2003;63:7038-41, Ishikawa N, Daigo Y, Yasui W, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70, Kato T, Daigo Y, Hayama S, et al. Cancer Res 2005;65:5638-46, Furukawa C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:7102-10, Ishikawa N, Daigo Y, Takano A, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84, Suzuki C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25, Ishikawa N, Daigo Y, Takano A, et al. Cancer Sci 2006;97:737-45, Takahashi K, Furukawa C, Takano A, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19, Hayama S, Daigo Y, Kato T, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48, Kato T, Hayama S, Yamabuki Y, et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42, Suzuki C, Takahashi K, Hayama S, et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51, Yamabuki T, Takano A, Hayama S, et al. Cancer Res 2007;67:2517-25, Hayama S, Daigo Y, Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22, Taniwaki M, Takano A, Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31, Ishikawa N, Takano A, Yasui W, et al. Cancer Res 2007;67:11601-11, Mano Y, Takahashi, K, Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13, Kato T, Sato N, Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:8544-53, Kato T, Sato N, Takano A, et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70, Dunleavy EM, Roche D, Tagami H, et al. Cell 2009;137:485-97, Hirata D, Yamabuki T, Ito T, et al. Clin Cancer Res 2009,15:256-66, Suda T, Tsunoda T, Daigo Y, Nakamura Y, Tahara H. Cancer Sci 2007;98:1803-8, Mizukami Y, Kono K, Daigo Y, et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54, Harao M, Hirata S, Irie A, et al. Int J Cancer 2008;123:2616-25)。
この体系的なアプローチにより、cleavage stimulation factor, 3'pre−RNA, subunit 2, 64kDa(CSTF2)が、原発性肺癌の大多数において高頻度に過剰発現することが明らかになった。CSTF2は、N末端領域にリボ核タンパク質(RNP)型RNA結合ドメインを含む核タンパク質をコードする。このタンパク質は切断刺激因子複合体(CSTF)のメンバーであり、切断刺激因子の他の2つのメンバーと共に、mRNAのポリアデニル化において役割を果たす(Takagaki Y, MacDonald CC, Shenk T, Manley JL. Proc. Nat. Acad. Sci 1992; 89: 1403-1407)。CSTF2は、mRNAの3'非翻訳領域内のGUリッチエレメントに結合する(Colgan DF, Manley JL. Genes Dev 1997;11:2755-2766、MacDonald CC, Wilusz J, Shenk T. Mol Cell Biol 1994;14:6647-6654、Takagaki Y, Manley JL. Mol Cell Biol 1997;17:3907-3914、Deka P, Rajan PK, Perez-Canadillas JM, J Mol Biol 2005;347:719-33)。CSTF2の量は、マウス3T6線維芽細胞において、G0期からS期への移行中に増加する(Martincic K, Campbell R, Edwalds-Gilbert G, Souan L, Lotze MT, Milcarek C. 1998; 95:11095-100)。強力なCSTF2発現が、マウスおよびラットの雄性生殖細胞ならびにヒトがん細胞において報告され、またはCSTF2はマウス組織において遍在的に発現した(Dass B, Tardif S, Park JY, Tian B, Weitlauf HM, Hess RA, Carnes K, Griswold MD, Small CL, Macdonald CC. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:20374-9, Huber Z, Monarez RR, Dass B, MacDonald CC. Ann N Y Acad Sci. 2005;1061:163-72, Wallace AM, Denison TL, Attaya EN, MacDonald CC. Biol Reprod 2004;70:1080-7, Dass B, Attaya EN, Michelle Wallace A, MacDonald CC. Biol Reprod 2001;64:1722-9, Chennathukuzhi VM, Lefrancois S, Morales CR, Syed V, Hecht NB. Mol Reprod Dev 2001;58:460-9, Dass B, McMahon KW, Jenkins NA, Gilbert DJ, Copeland NG, MacDonald CC. J Biol Chem 2001;276:8044-50, Wallace AM, Dass B, Ravnik SE, Tonk V, Jenkins NA, Gilbert DJ, Copeland NG, MacDonald CC. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:6763-8, Shankarling GS, Coates PW, Dass B, Macdonald CC. BMC Mol Biol 2009 Mar;10:22)。インビトロにおけるCSTFのメンバーとしてのCSTF2機能の証拠にもかかわらず、ヒトがんの進行におけるCSTF2の活性化の意義、および治療標的としてのその臨床的可能性は説明されていなかった。
上記したように、本発明は、CSTF2、および肺癌の発癌においてそれが果たす役割に関する。したがって本発明は、肺癌を検出、診断、治療、および/または予防するための新規な組成物および方法、ならびに有用な物質をスクリーニングするための方法に関する。
特に、本発明は、CSTF2遺伝子ががんでは過剰発現するが正常組織では過剰発現せず、かつ、CSTF2遺伝子を標的とする特異的配列(特に、SEQ ID NO:9および10)で構成される二本鎖分子が肺癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見から生じている。具体的には、CSTF2遺伝子を標的とする低分子干渉RNA(siRNA)が本発明によって提供される。これらの二本鎖分子は単離された状態で利用することもでき、またはベクター中でコードさせて該ベクターから発現させることもできる。したがって、そのような二本鎖分子、ならびにそれらを発現するベクターおよび宿主細胞を提供することは、本発明の1つの目的である。
特に、本発明は、CSTF2遺伝子ががんでは過剰発現するが正常組織では過剰発現せず、かつ、CSTF2遺伝子を標的とする特異的配列(特に、SEQ ID NO:9および10)で構成される二本鎖分子が肺癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見から生じている。具体的には、CSTF2遺伝子を標的とする低分子干渉RNA(siRNA)が本発明によって提供される。これらの二本鎖分子は単離された状態で利用することもでき、またはベクター中でコードさせて該ベクターから発現させることもできる。したがって、そのような二本鎖分子、ならびにそれらを発現するベクターおよび宿主細胞を提供することは、本発明の1つの目的である。
1つの局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターをそれを必要とする対象に投与することにより、がん細胞の増殖を阻害するため、または肺癌を含むがんを治療するための方法を提供する。そのような方法は、二本鎖分子またはベクターの1つまたは複数を含む組成物を対象に投与する段階を含む。
別の局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも1つを含む、肺癌を治療するための組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも1つを含む、肺癌を治療するための組成物を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定することにより、対象におけるがんの素因を診断または判定する方法を提供する。該遺伝子の正常対照レベルと比較して、該遺伝子の発現レベルが上昇していることにより、対象が、肺癌を含むがんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。好ましい態様において、適切なプローブもしくはプライマーによってCSTF2遺伝子のmRNAを検出することにより、または抗CSTF2抗体によってCSTF2タンパク質を検出することにより、CSTF2遺伝子の発現レベルを測定することができる。
さらに本発明は、CSTF2の高発現レベルが生存率不良と相関するという発見に関する。したがって本発明は、CSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階、それを所定の参照発現レベルと比較する段階、およびその間の差から患者の予後を判定する段階を含む、肺癌患者の予後を評価または判定する方法を提供する。
さらなる局面において、本発明は、がんを治療および/または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。そのような物質は、CSTF2タンパク質と結合し得るか、CSTF2タンパク質の生物学的活性を低下させ得るか、CSTF2遺伝子の発現を低下させ得るか、またはCSTF2遺伝子の代用となるレポーター遺伝子の発現もしくは活性を低下させ得る。
本発明の1つまたは複数の局面は特定の目的を満たすことができる一方、1つまたは複数の他の局面は特定の他の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されよう。各目的は、本発明のすべての局面に、あらゆる点で等しく当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の1つの局面に関して択一的に考慮することができる。本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読んだ場合に、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明および本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明、ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
図1は、肺腫瘍におけるCSTF2の発現を示す:A、半定量的RT−PCRによって調べた、15例の臨床肺癌[肺腺癌(ADC)、肺扁平上皮癌(SCLC)、および小細胞肺癌(SCC)]および15例の肺癌細胞株におけるCSTF2の発現。β−アクチン(ACTB)遺伝子の発現を量の対照とした。B、ウェスタンブロット解析による、肺癌細胞株におけるCSTF2タンパク質の発現。ACTBタンパク質の発現を量の対照とした。IB、免疫ブロッティング。
図1は、肺腫瘍におけるCSTF2の発現を示す:C、共焦点顕微鏡検査によって調べたCSTF2タンパク質の細胞内局在性。
図2は、正常組織におけるCSTF2の発現、およびCSTF2過剰発現とNSCLC患者の予後不良との関連性を示す:A、ノーザンブロット解析により検出した、正常ヒト組織におけるCSTF2の発現。B、ウサギ抗CSTF2ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的染色により検出した、5例の正常ヒト組織および肺線癌細胞におけるCSTF2の発現;ヘマトキシリンを用いた対比染色(×200)。
図2は、正常組織におけるCSTF2の発現、およびCSTF2過剰発現とNSCLC患者の予後不良との関連性を示す:C、肺ADC組織および正常肺組織におけるCSTF2の強発現、弱発現、および発現なしの典型例(元の拡大率、×100)。D、NSCLC患者の生存についてのカプラン・マイヤー解析(P=0.0079、ログランク検定)。
図3は、CSTF2に対するsiRNAによる、NSCLC細胞の増殖の阻害を示す:A、半定量的RT−PCRにより解析した、A549細胞およびLC319細胞における、CSTF2に対するsiRNA処理(si−CSTF2−#1またはsi−CSTF2−#2)または対照siRNA[si−高感度緑色蛍光タンパク質(si−EGFP)またはsi−ルシフェラーゼ(si−LUC)]に応答した、CSTF2の発現(上部)。B、C、si−CSTF2または対照siRNAをトランスフェクトした腫瘍細胞のMTTアッセイおよびコロニー形成アッセイ。
図4は、哺乳動物細胞へのCSTF2導入による細胞増殖の増強を示す:A、ウェスタンブロット解析により検出した、COS−7細胞におけるCSTF2の一過性発現。細胞に、pcDNA3.1−myc−His−CSTF2またはモックベクターを導入した。BおよびC、MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイにより、細胞生存率およびコロニー数を評価した。アッセイは、3連のウェルで3度実施した。
態様の説明
本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載される特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載される特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
定義
本明細書で用いられる「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、特記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。
本明細書で用いられる「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、特記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾された天然アミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびO−ホスホセリン)である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造(水素、カルボキシ基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素)を有するが、修飾R基または修飾骨格を有する、化合物(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、類似した機能を有する、化学物質を指す。
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC−IUB生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)の推奨する、公知の3文字表記または1文字表記により言及されてもよい。
本明細書で用いられる「生物学的試料」という用語は、生物全体、または、その組織、細胞、もしくは構成部分(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液)のサブセットを指す。「生物学的試料」はさらに、生物全体からまたはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、あるいはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」は、細胞成分、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドを含む、生物が増殖した培地、例えば栄養ブロスまたはゲルを指す。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられ、特記されない限り、広く認められたその1文字コードにより言及される。当該用語は、1つまたは複数の核酸がエステル結合によって結合している核酸(ヌクレオチド)ポリマーに適用される。核酸ポリマーはDNA、RNA、またはそれらの組み合わせからなってよく、天然核酸ポリマーおよび非天然核酸ポリマーの両方を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーに加えて、1つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
「細胞増殖性活性(cell proliferative activity)」、「細胞増殖増強活性(cell proliferation enhancing activity)」、「細胞増殖活性(cell−prolierationg activity)」、および「細胞増殖促進活性(cell proliferation promoting activity)」は本明細書において互換的に用いられ、ポリペプチドが細胞に接触しているかまたは該ポリペプチドをコードする遺伝子が該細胞に導入される場合に細胞増殖を促進または増強する、該ポリペプチドの活性を指す。
物質(例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等)に関連して用いられる「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源中に含まれ得る少なくとも1つの物質を実質的に含まないということを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、そのタンパク質(抗体)が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞材料、例えば糖質、脂質、および他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まない、抗体を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドが単離されるかまたは組換えによって産生される細胞の細胞成分から、該ポリペプチドが分離された、該ポリペプチドの調製物を含む。
したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、(乾燥重量あたり)約30%未満、20%未満、10%未満、または5%未満の異種タンパク質(本明細書では「混入タンパク質」とも称される)を有する、ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが組換えによって作製される場合、いくつかの態様においてこれはまた培養培地を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約20%未満、10%未満、または5%未満の培養培地を有する、該ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、いくつかの態様においてこれは化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に伴う化学的前駆体または他の化学物質が該タンパク質調製物の体積の(乾燥重量あたり)約30%未満、20%未満、10%未満、5%未満である該ポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、該タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および該ゲルのクマシーブリリアントブルー染色等の後に単一のバンドが出現することによって示され得る。1つの態様において、本発明の抗体を含むタンパク質は単離されているかまたは精製されている。
「単離された」または「精製された」核酸分子、例えばcDNA分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞材料および培養培地を実質的に含まなくてよく、または化学合成された場合には、化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まなくてよい。1つの態様において、本発明のタンパク質をコードする核酸分子は単離されているかまたは精製されている。
特記しない限り、「がん」という用語は、腺癌(ADC)、扁平上皮癌(SCC)、大細胞癌(LCC)、および小細胞肺癌(SCLC)を含む肺癌などの、CSTF2遺伝子を過剰発現するがんを指す。
CSTF2遺伝子またはCSTF2タンパク質
ヒトCSTF2遺伝子の核酸およびポリペプチドの配列は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示されるが、これらに限定されるわけではない。さらに、上記の配列データは、GenBankアクセッション番号NM_001325を介して入手することも可能である。
ヒトCSTF2遺伝子の核酸およびポリペプチドの配列は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示されるが、これらに限定されるわけではない。さらに、上記の配列データは、GenBankアクセッション番号NM_001325を介して入手することも可能である。
本発明の1つの局面によれば、機能的同等物もまた上記の「ポリペプチド」であると見なされる。本明細書において、タンパク質の「機能的同等物」とは、該タンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。例えば、CSTF2ポリペプチドは、細胞増殖増強活性、RNA結合活性、RNA切断活性、RNAポリアデニル化活性等を有することが知られている。これらの活性の少なくとも1つを保持するポリペプチドは、本発明においてCSTF2ポリペプチドの機能的同等物と見なされる。そのような機能的同等物には、該タンパク質の天然アミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。あるいは、ポリペプチドは、各タンパク質の配列に対して少なくとも約80%の相同性(配列同一性とも称される)、より好ましくは少なくとも約90%〜95%の相同性、さらにより好ましくは96%、97%、98%、または99%の相同性を有するアミノ酸配列で構成され得る。他の態様において、ポリペプチドは、該遺伝子の天然ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
本発明のポリペプチドには、その産生に用いた細胞もしくは宿主または利用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、ヒトタンパク質と同等の機能を有する限り、これは、本発明の範囲内である。
「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別々の状況では異なり得る。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmとは、標的に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である(標的配列が過剰に存在するので、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成させてもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、以下が挙げられる:50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDS、42℃でインキュベーション、あるいは5×SSC、1%SDS、65℃でインキュベーション、加えて0.2×SSCおよび0.1%SDSにおいて50℃で洗浄。
本発明の文脈において、上記のヒトタンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。例えば「Rapid−hyb緩衝液」(Amersham LIFE SCIENCE)を用いてプレハイブリダイゼーションを68℃で30分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加して、68℃で1時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行うことができる。例示的な低ストリンジェント条件としては、42℃、2×SSC、0.1%SDS、好ましくは50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。しばしば高ストリンジェント条件が好ましく用いられる。例示的な高ストリンジェント条件としては、室温で2×SSC、0.01%SDSにおける20分間の洗浄を3回行った後に、37℃で1×SSC、0.1%SDSにおける20分間の洗浄を3回行い、50℃で1×SSC、0.1%SDSにおける20分間の洗浄を2回行うことが挙げられる。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
一般的に、タンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている。実際に、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち、特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物学的活性を保持することが知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更するか、または1つのタンパク質の変更により類似機能をもつタンパク質が生じる「保存的改変」とみなされる、アミノ酸配列に対する個別の付加、欠失、挿入、もしくは置換が、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されるわけではない。しかしながら、アミノ酸配列の5%またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、そのような変異体において変異させるアミノ酸の数は、一般的には30アミノ酸またはそれ未満、好ましくは20アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは10アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、さらにより好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させることが好ましい(保存的アミノ酸置換として知られるプロセス)。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が挙げられる:脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P);ヒドロキシル基含有側鎖(S、T、Y);硫黄原子含有側鎖(C、M);カルボン酸およびアミド含有側鎖(D、N、E、Q);塩基含有側鎖(R、K、H);ならびに芳香族含有側鎖(H、F、Y、W)。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。例えば、以下の8群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
そのような保存的改変ポリペプチドは、本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら本発明はこれらに限定されず、該タンパク質は、該タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性が保持されている限り、非保存的改変物を含む。さらに、改変タンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
さらに、CSTF2遺伝子は、該タンパク質のそのような機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。該タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加えて、上記の配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いる、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用することができる。それぞれヒト遺伝子およびタンパク質と機能的に同等であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、40%またはそれ以上、好ましくは60%またはそれ以上、より好ましくは80%またはそれ以上、さらにより好ましくは90%〜95%またはそれ以上、さらにより好ましくは96%、97%、98%、99%またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」におけるアルゴリズムに従うことによって決定することができる。
抗体
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書における抗体は広義で使用され、具体的には、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および、所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を、包含する。「抗体」とは、すべてのクラス(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM)を示す。
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書における抗体は広義で使用され、具体的には、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および、所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を、包含する。「抗体」とは、すべてのクラス(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM)を示す。
本発明は、CSTF2に対する抗体を使用する。これらの抗体は、公知の方法によって提供される。
本発明に従って用いられる抗体を作製するための例示的な技術について説明する。
(i)ポリクローナル抗体:
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射によって動物中で産生される。二官能性剤または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介した結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOC12、またはR'N=C=NR(式中、RおよびRは異なるアルキル基である)を用いて、免疫される種において免疫原性であるタンパク質に、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、関連抗原を結合させることが有用であり得る。
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射によって動物中で産生される。二官能性剤または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介した結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOC12、またはR'N=C=NR(式中、RおよびRは異なるアルキル基である)を用いて、免疫される種において免疫原性であるタンパク質に、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、関連抗原を結合させることが有用であり得る。
例えばタンパク質または結合体100μgまたは5μg(それぞれ、ウサギまたはマウスの場合)を3倍容量のフロイント完全アジュバントと混合し、この溶液を複数の部位に皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫する。1ヶ月後、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたは結合体の初回量の1/5〜1/10を複数の部位に皮下注射することにより、動物を追加免疫する。7〜14日後に、動物から採血し、血清を抗体価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで、動物を追加免疫する。好ましくは、同一抗原の結合体であるが、別のタンパク質に結合させかつ/または別の架橋物質によって結合させた結合体で、動物を追加免疫する。
結合体は、タンパク質融合物として組換え細胞培養の際に作製することもできる。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンなどの凝集剤も適切に用いられる。
(ii)モノクローナル抗体:
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る潜在的な自然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る潜在的な自然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler G & Milstein C. Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製してもよく、組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製してもよい。
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターのような他の適切な宿主動物を本明細書において上記したように免疫して、免疫に使用したタンパク質に特異的に結合し得る抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
このように調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つまたは複数の物質を好ましくは含む、適切な培養培地に播種して増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合には、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質はHGPRT欠損細胞の増殖を妨げる。
好ましい骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持し、かつHAT培地などの培地に対して感受性のある細胞である。中でも好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center、San Diego,California USAから入手可能なMOPC−21およびMPC−11マウス腫瘍に由来するもの、ならびにAmerican Type Culture Collection、Manassas,Virginia,USAから入手可能なSP−2細胞またはX63−Ag8−653細胞である。ヒトモノクローナル抗体の作製に関して、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた記載されている(Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5;Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、または放射性免疫測定法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)などのインビトロ結合アッセイ法により測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39の30スキャッチャード解析により測定することができる。
所望の特異性、親和性、および/または活性をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、限界希釈手法によりクローンをサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に適した培養培地には、例えばD−MEM培地またはRPML−1640培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手法により、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されれば、該DNAを発現ベクター中に配置することができ、次にこれを、宿主細胞、例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する総説には、Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):256-62、およびPluckthun A. Immunol Rev. 1992 Dec;130:151-88が含まれる。
CSTF2に対して反応性を有する特異的抗体または抗体断片を作製する別の方法とは、細菌中で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリを、CSTF2を用いてスクリーニングすることである。例えば、ファージ発現ライブラリを用いて、完全なFab断片、VH領域、およびFv領域を細菌中で発現させることができる。例えば、Ward ES, et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6;Huse WD, et al., Science. 1989 Dec 8;246(4935):1275-81;およびMcCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4を参照されたい。CSTF2ペプチドを用いてそのようなライブラリをスクリーニングすることにより、CSTF2に対して反応性を有する免疫グロブリン断片を同定することができる。あるいは、抗体またはその断片を産生させるために、SCID−huマウス(Genpharmから入手可能)を使用することもできる。
さらなる態様では、抗体または抗体断片を、McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4に記載されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリから単離することができ;Clarkson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8;およびMarks JD, et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97はそれぞれ、ファージライブラリを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離について記載している。その後の刊行物には、鎖シャッフリングによる高親和性(nM範囲)ヒト抗体の産生(Marks JD, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Jul;10(7):779-83)、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボ組換え(Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 11;21(9):2265-6)について記載されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実行可能な代替案である。
例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同的なマウス配列と置き換えることにより(米国特許第4,816,567号;Morrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5)、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部を共有結合させることにより、DNAを改変することもできる。
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインの代わりに用いるか、またはそれらを抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、ある抗原に対して特異性を有する1つの抗原結合部位および別の抗原に対して特異性を有するもう1つの抗原結合部位を含む、キメラ二価抗体を作製する。
(iii)ヒト化抗体:
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、非ヒト供給源に由来する1つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と称されることが多く、これらは典型的に「移入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法(Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5;Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7;Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6)に従い、超可変領域配列を対応するヒト抗体配列の代わりに用いることによって行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、ここで、完全なヒト可変ドメインとは実質的に言えないものが非ヒト種由来の相当する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は典型的に、数個の超可変領域残基、および場合によっては数個のFR残基が、げっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、非ヒト供給源に由来する1つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と称されることが多く、これらは典型的に「移入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法(Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5;Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7;Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6)に従い、超可変領域配列を対応するヒト抗体配列の代わりに用いることによって行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、ここで、完全なヒト可変ドメインとは実質的に言えないものが非ヒト種由来の相当する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は典型的に、数個の超可変領域残基、および場合によっては数個のFR残基が、げっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製する際に用いるべき軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「最良適合(best−fit)」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(FR)として承認する(Sims MJ, et al., J Immunol. 1993 Aug 15;151(4):2296-308;Chothia C & Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを数個の異なるヒト化抗体に使用してもよい(Carter P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9;Presta LG, et al., J Immunol. 1993 Sep 1;151(5):2623-32)。
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するには、好ましい方法に従って、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列および種々の概念的ヒト化産物の解析の手法によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検証によって、候補免疫グロブリン配列の機能において残基が果たす可能性のある役割の解析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性増大などの所望の抗体の特徴が達成されるように、FR残基をレシピエント配列および移入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域の残基は、抗原結合への作用において直接的かつ最も実質的に関与する。
(iv)ヒト抗体:
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作製することができる。例えば現在、免疫に際して、内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入することで、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5;Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8;Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;ならびに米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号、および同第5,545,807号を参照されたい。
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作製することができる。例えば現在、免疫に際して、内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入することで、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5;Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8;Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;ならびに米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号、および同第5,545,807号を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4)を用いて、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロにおいてヒト抗体および抗体断片を生成することができる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13またはfdなどの糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面上に提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むため、抗体の機能的特性に基づく選択によって、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も行われる。したがって、ファージはB細胞の特性の一部を模倣している。ファージディスプレイは様々な形式で行うことができる;それらの総説については、例えば、Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。
Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8は、免疫したマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。Marks JD, et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97、またはGriffiths AD, et al., EMBO J. 1993 Feb;12(2):725-34により記載されている技術に本質的には従って、免疫していないヒトドナー由来のV遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原の多様なアレイ(自己抗原を含む)に対する抗体を単離することができる。同じく、米国特許第5,565,332号および同第5,573,905号を参照されたい。
インビトロ活性化B細胞によって、ヒト抗体を作製することもできる(米国特許第20 5,567,610号および同第5,229,275号を参照されたい)。SCIDマウスを用いてヒト抗体を作製する好ましい手段は、共同所有される同時係属中の出願に開示されている。
(v)抗体断片:
抗体断片の作製について、様々な技術が開発されている。従来は、これらの断片は、完全な抗体のタンパク質分解消化によって得られた(例えば、Morimoto K & Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar;24(1-2):107-17;Brennan M, et al., Science. 1985 Jul 5;229(4708):81-3を参照されたい)。しかしながら、現在これらの断片は、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Fab'−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてF(ab')2断片を形成させることもできる(Carter P, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):163-7)。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を作製するための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Fv断片(scFv)である。国際公開公報第93/16185号;米国特許第5,571,894号;および同第5,587,458号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であってよい。
抗体断片の作製について、様々な技術が開発されている。従来は、これらの断片は、完全な抗体のタンパク質分解消化によって得られた(例えば、Morimoto K & Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar;24(1-2):107-17;Brennan M, et al., Science. 1985 Jul 5;229(4708):81-3を参照されたい)。しかしながら、現在これらの断片は、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Fab'−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてF(ab')2断片を形成させることもできる(Carter P, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):163-7)。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を作製するための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Fv断片(scFv)である。国際公開公報第93/16185号;米国特許第5,571,894号;および同第5,587,458号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であってよい。
(vi)非抗体結合タンパク質:
「非抗体結合タンパク質」または「非抗体リガンド」または「抗原結合タンパク質」という用語は互換的に、下記でより詳細に論じられる、アドネクチン(adnectin)、アビマー(avimer)、一本鎖ポリペプチド結合分子、および抗体様結合ペプチド模倣体を含む、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を指す。
「非抗体結合タンパク質」または「非抗体リガンド」または「抗原結合タンパク質」という用語は互換的に、下記でより詳細に論じられる、アドネクチン(adnectin)、アビマー(avimer)、一本鎖ポリペプチド結合分子、および抗体様結合ペプチド模倣体を含む、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を指す。
抗体と同様の様式で抗原を標的として結合する他の物質が開発されている。これらの「抗体模倣体」の一部は、抗体の可変領域の代替タンパク質フレームワークとして、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する。
例えば、Ladnerら(米国特許第5,260,203号)は、抗体の、凝集しているが分子的には分離した軽鎖および重鎖可変領域と同様の結合特異性を有する、単一ポリペプチド鎖結合分子について記載している。一本鎖結合分子は、ペプチドリンカーによって結合している抗体の重鎖および軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含み、2つのペプチド抗体と同様の構造に折りたたまれる。一本鎖結合分子は、サイズがより小さい、安定性がより高い、およびより容易に改変される等、従来の抗体に優るいくつかの利点を示す。
Kuら(Proc Natl Acad Sci USA 92(14): 6552-6556 (1995))は、シトクロムb562に基づいた抗体の代替物について記載している。Kuら(1995)は、シトクロムb562のループのうちの2つを無作為化したライブラリを作製し、ウシ血清アルブミンに対する結合について選択した。個々の変異体は、抗BSA抗体と同様にBSAと選択的に結合することが見出された。
Lipovsekら(米国特許第6,818,418号および同第7,115,396号)は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質骨格と少なくとも1つの可変ループとを特徴とする抗体模倣体について記載している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的リガンドに対する高い親和性および特異性を含む、天然抗体または改変抗体と同一の特徴を多く示す。新たなまたは改善された結合タンパク質を発展させる任意の技術を、これらの抗体模倣体と共に使用することができる。
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の可変領域の構造と類似している。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と性質および親和性が類似した抗原結合特性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体および抗体断片を上回るある利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は、天然の折りたたみ安定性に関してジスルフィド結合に依存せず、従って、通常は抗体が分解し得る条件下で安定である。加えて、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造はIgG重鎖の構造と類似しているため、インビボにおける抗体の親和性成熟のプロセスに類似したループの無作為化およびシャッフリングのプロセスをインビトロで利用することができる。
Besteら(Proc Natl Acad Sci USA 96(5):1898-1903 (1999))は、リポカリン骨格に基づく抗体模倣体(Anticalin(登録商標))について記載している。リポカリンは、βバレルと該タンパク質の末端における4つの超可変ループとで構成される。Beste(1999)はループをランダム突然変異誘発に供し、例えばフルオレセインとの結合について選択した。3つのバリアントがフルオレセインとの特異的結合を示し、1つのバリアントは抗フルオレセイン抗体と類似した結合を示した。さらなる解析により、無作為化の位置はすべて変更可能であることが明らかになり、これによって、Anticalin(登録商標)は抗体の代替物として使用するのに適していることが示された。
Anticalin(登録商標)は、典型的に160〜180残基の小さな一本鎖ペプチドであり、作製コストの削減、貯蔵安定性の向上、および免疫学的反応の低下を含め、抗体を上回るいくつかの利点を提供する。
Hamiltonら(米国特許第5,770,380号)は、結合部位として用いられる複数の可変ペプチドループが付着した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用する合成抗体模倣体について記載している。ペプチドループはすべて、互いに対して、カリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出している。この幾何学的高次構造のために、すべてのループが結合に利用可能であり、これによって、リガンドに対する結合親和性が向上する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は独占的にペプチドのみからなるわけではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。この骨格はペプチド、DNA、またはRNAから純粋になるわけではなく、このことは、この抗体模倣体が極端な環境条件において比較的安定であり、かつ寿命が長いことを意味している。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応を生じる可能性が低い。
Muraliら(Cell Mol Biol. 49(2):209-216 (2003))は、抗体を縮小して、同じく抗体の代替物として有用であり得る「抗体様結合ペプチド模倣体」(ABiP)と称するより小さなペプチド模倣体にするための方法論を記載している。
Silvermanら(Nat Biotechnol. 23: 1556-1561 (2005))は、「アビマー」と称する、複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質について記載している。アビマーは、インビトロエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインから開発され、様々な標的分子に対する親和性および特異性について抗体といくらか類似している結合タンパク質のクラスである。得られる多ドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して向上した親和性(場合によってはnM以下の)および特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーを構築および使用する方法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第20040175756号、同第20050048512号、同第20050053973号、同第20050089932号、および同第20050221384号に開示されている。
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体特性はまた、RNA分子および非天然オリゴマー(例えば、プロテアーゼインヒビター、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、およびβターン模倣体)を含むがこれらに限定されない物質においても模倣されており、その全てが本発明における使用に適している。
(vii)薬学的製剤:
本発明に従って用いられる本発明の抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵用に調製され得る。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用する投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖質;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);および/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
本発明に従って用いられる本発明の抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵用に調製され得る。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用する投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖質;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);および/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、国際公開公報第97/04801号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤を適切な希釈剤で高タンパク質濃度となるように再構成することができ、再構成した製剤を本明細書において治療される哺乳動物に皮下投与することができる。
本明細書における製剤はまた、治療される特定の徴候に関する必要に応じて2つ以上の活性物質、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する活性物質を含み得る。例えば、化学療法剤、サイトカイン、または免疫抑制剤をさらに供給することが望ましい場合がある。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患もしくは障害または治療の種類、および上記の他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書の上記で使用したのと同じ投与量および投与経路で、またはこれまでに使用された投与量の約1〜99%で用いられる。
有効成分はまた、例えばコアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)において、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に、封入してもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例には、剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性基質が含まれ、該基質は成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出基質の例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(メタクリル酸2−ヒドロキシエチル)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とエチル−L−グルタミン酸との共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフェア)などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が含まれる。インビボ投与に使用するための製剤は、無菌でなくてはならない。これは、無菌ろ過膜を介したろ過によって容易に達成される。
(x)抗体を用いた治療:
本発明の抗体を含む組成物は、適正な医療行為に沿った様式で製剤化、投薬、および投与することができる。好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体scFv、または抗体断片である。この文脈において考慮される要素には、治療を受ける特定の肺癌、治療を受ける特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患または障害の原因、剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の要素が含まれる。投与される抗体の治療的有効量は、このような考慮により管理される。
本発明の抗体を含む組成物は、適正な医療行為に沿った様式で製剤化、投薬、および投与することができる。好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体scFv、または抗体断片である。この文脈において考慮される要素には、治療を受ける特定の肺癌、治療を受ける特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患または障害の原因、剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の要素が含まれる。投与される抗体の治療的有効量は、このような考慮により管理される。
一般命題として、用量当たりの非経口投与される抗体の治療的有効量は、約0.1〜20mg/kg患者体重/日の範囲であり、使用される抗体の典型的な初期範囲は約2〜10mg/kgの範囲である。
しかしながら、上記のように、これらの提唱される抗体量は治療上の判断に大いに委ねられる。上記したように、適切な用量およびスケジューリングの選択における重要な要素とは、得られる結果である。
例えば、進行中および急性の疾患の治療に関しては、初期に比較的高い用量が必要とされ得る。疾患または障害に応じて最も効果的な結果を得るために、疾患もしくは障害の最初の徴候、診断、出現、もしくは発生に可能な限り近くで、または疾患もしくは障害の寛解中に、抗体を投与することができる。
抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、ならびに、必要であれば局所免疫抑制治療のための病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。
加えて、抗体は、例えば抗体の用量を減少させながらパルス注入により、適切に投与してもよい。好ましくは投薬は、投与が短期間であるか長期間であるかに一部応じて、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射により行われる。
さらに、細胞傷害性剤、化学療法剤、免疫抑制剤、および/またはサイトカインなどの他の物質を、本明細書に記載の抗体と共に投与してもよい。併用投与には、別個の製剤または単一の薬学的製剤を用いる同時投与、およびいずれかの順序での連続投与が含まれ、ここで、両方の(またはすべての)活性剤が同時にその生物学的活性を発揮する期間があることが好ましい。
患者への抗体の投与に加え、本発明は遺伝子治療による抗体の投与を意図する。抗体をコードする核酸のそのような投与は、「治療的有効量の抗体を投与する」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関する、1996年3月14日に公開された国際公開公報第96/07321号を参照されたい。
核酸(任意でベクター中に含まれる)を患者の細胞に導入するためには、2つの主要なアプローチがインビボおよびエクスビボにおいて存在する。インビボ送達については、通常は、抗体が必要とされる部位において、核酸を患者に直接注射する。エクスビボ治療については、患者の細胞を取り出し、これらの単離された細胞に核酸を導入し、改変された細胞を患者に直接投与するか、または例えば多孔性膜に封入してこれを患者に移植する(例えば、米国特許第4,892,538号および同第5,283,187号を参照されたい)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術が存在する。核酸を培養細胞にインビトロで導入するのか、意図される宿主の細胞にインビボで導入するのかに応じて、技術は異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適した技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等の使用が含まれる。遺伝子のエクスビボ送達に関して一般的に用いられるベクターは、レトロウイルスである。
現在好ましいインビボ核酸導入技術には、ウイルスベクター(アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、またはアデノ随伴ウイルスなど)を用いたトランスフェクション、および脂質ベースの系(遺伝子の脂質仲介性導入に有用な脂質は、例えばDOTMA、DOPE、およびDC−Cholである)が含まれる。場合によっては、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等などの、標的細胞を標的とする剤を、核酸供給源に提供することが望ましい。リポソームを使用する場合には、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の種類の細胞に指向するカプシドタンパク質またはその断片、循環中で内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、および、細胞内局在化を標的としかつ細胞内半減期を増大させるタンパク質を、標的とするためおよび/または取り込みを容易にするために用いてもよい。受容体仲介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987);およびWagner et al, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)によって記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子治療法プロトコールの総説については、Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)を参照されたい。また、国際公開公報第93/25673号およびその中で引用されている参考文献も参照されたい。
別の態様において、本発明はまた、CSTF2遺伝子を発現するがんを治療するための薬学的組成物を製造における、本発明のCSTF2に対する抗体の使用を提供する。
あるいは、本発明は、CSTF2遺伝子を発現するがんの治療の際に使用するための、本発明のCSTF2に対する抗体をさらに提供する。
あるいは、本発明は、薬学的または生理学的に許容される担体を、有効成分としてのCSTF2に対する抗体と共に製剤化する段階を含む、CSTF2遺伝子を発現するがんを治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供する。
別の態様において、本発明はまた、CSTF2に対する抗体である有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体を混合する段階を含む、CSTF2遺伝子を発現するがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供する。
二本鎖分子
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば、低分子干渉RNA(siRNA;例えば、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または低分子ヘアピンRNA(shRNA))および低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA;例えば、DNAとRNAの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)またはDNAとRNAの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))を含む。本明細書において、「二本鎖分子」は、「二本鎖核酸」、「二本鎖核酸分子」、「二本鎖ポリヌクレオチド」、「二本鎖ポリヌクレオチド分子」、「二本鎖オリゴヌクレオチド」、および「二本鎖オリゴヌクレオチド分子」とも称される。
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば、低分子干渉RNA(siRNA;例えば、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または低分子ヘアピンRNA(shRNA))および低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA;例えば、DNAとRNAの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)またはDNAとRNAの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))を含む。本明細書において、「二本鎖分子」は、「二本鎖核酸」、「二本鎖核酸分子」、「二本鎖ポリヌクレオチド」、「二本鎖ポリヌクレオチド分子」、「二本鎖オリゴヌクレオチド」、および「二本鎖オリゴヌクレオチド分子」とも称される。
本明細書で用いられる「標的配列」という用語は、標的遺伝子を発現する細胞に該配列を標的とする二本鎖分子が導入された場合に、該標的遺伝子のmRNA全体の翻訳の抑制をもたらす、標的遺伝子のmRNAまたはcDNA配列内のヌクレオチド配列を指す。標的配列に相当する配列を含む二本鎖分子が、遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合に、遺伝子のmRNAまたはcDNA配列内のヌクレオチド配列は標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列および2〜5ヌクレオチド長の3'オーバーハング(例えば、uu)からなってよい。
標的配列がcDNA配列によって示される場合、標的配列を規定するために、二本鎖cDNAのセンス鎖配列、すなわちmRNA配列がDNA配列に変換された配列が用いられる。二本鎖分子は、標的配列に相当する配列を有するセンス鎖、および該標的配列に対する相補配列を有するアンチセンス鎖からなり、アンチセンス鎖はセンス鎖と相補配列においてハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。
本明細書において、「〜に相当する」という語句は、二本鎖分子のセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて標的配列を変換することを意味する。例えば、標的配列がDNA配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がRNA領域を有する場合には、該RNA領域内の塩基「t」は塩基「u」に置き換えられる。一方、標的配列がRNA配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がDNA領域を有する場合には、該DNA領域内の塩基「u」は塩基「t」に置き換えられる。
例えば、標的配列がSEQ ID NO:10のRNA配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖が、DNAで構成される3'側半分の領域を有する場合、「標的配列に相当する配列」は「5'−CACUUUACUUTCTGTAACT−3'」である。
同様に、二本鎖分子のアンチセンス鎖に関して、標的配列に対する相補配列は、アンチセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて規定され得る。例えば、標的配列がSEQ ID NO:10のRNA配列で示され、二本鎖分子のアンチセンス鎖が、DNAで構成される5'側半分の領域を有する場合には、「標的配列に対する相補配列」は「3'−GUGAAAUGAAAGACATTGA−5'」である。
一方、二本鎖分子がRNAで構成される場合には、SEQ ID NO:10に示される標的配列に相当する配列はSEQ ID NO:10のRNA配列であり、SEQ ID NO:10に示される標的配列に相当する相補配列は、「3'−GUGAAAUGAAAGACAUUGA−5'」のRNA配列である。
一方、二本鎖分子がRNAで構成される場合には、SEQ ID NO:10に示される標的配列に相当する配列はSEQ ID NO:10のRNA配列であり、SEQ ID NO:10に示される標的配列に相当する相補配列は、「3'−GUGAAAUGAAAGACAUUGA−5'」のRNA配列である。
二本鎖分子は、標的配列に相当する配列およびそれに対する相補配列に加えて、2〜5ヌクレオチド長を有する1つもしくは2つの3'オーバーハング(例えば、uu)、および/または、センス鎖とアンチセンス鎖とを連結してヘアピン構造を形成するループ配列を有してよい。
本明細書で使用される「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨害する二本鎖RNA分子を指す。RNAが転写される鋳型をDNAとした技術を含む、siRNAを細胞に導入する標準的な技術を用いる。siRNAには、センス核酸配列(「センス鎖」とも称される)、アンチセンス核酸配列(「アンチセンス鎖」とも称される)、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、siRNAを構築してもよい。siRNAはdsRNAまたはshRNAのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「dsRNA」という用語は、互いに対する相補配列で構成され、且つ二本鎖RNA分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つのRNA分子の構築物を指す。2本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」RNAだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するRNA分子も含んでよい。
本明細書で使用される「shRNA」という用語は、互いに対して相補的である第1の領域および第2の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するsiRNAを指す。領域の相補性および指向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第1の領域および第2の領域がループ領域によって連結され、該ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)間の塩基対形成の欠失によってループが生じる。shRNAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用される「siD/R−NA」という用語は、RNAとDNAの両方からなる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、RNAとDNAのハイブリッドおよびキメラを含み、標的mRNAの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、DNAからなるポリヌクレオチドとRNAからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がRNAおよびDNAを含有できるものを示す。siD/R−NAを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。siD/R−NAには、CSTF2センス核酸配列(「センス鎖」とも称される)、CSTF2アンチセンス核酸配列(「アンチセンス鎖」とも称される)またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、siD/R−NAを構築することができる。siD/R−NAはdsD/R−NAまたはshD/R−NAのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「dsD/R−NA」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つの分子の構築物を指す。2本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。dsD/R−NAを構築する2つの分子の一方または両方がRNAおよびDNAの両方からなる(キメラ分子)か、あるいは代替的に、分子の一方がRNAからなり、もう一方がDNAからなる(ハイブリッド二本鎖)。
本明細書で使用される「shD/R−NA」という用語は、互いに対して相補的である第1の領域および第2の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するsiD/R−NAを指す。領域の相補性および指向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第1の領域および第2の領域がループ領域によって連結し、該ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)間の塩基対形成の欠失によってループが生じる。shD/R−NAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で用いられる「単離された核酸」とは、その元の環境(例えば、天然のものであれば自然環境)から取り出され、したがってその天然状態から人工的に変化した核酸である。本発明において、単離された核酸の例には、DNA、RNA、およびそれらの誘導体が含まれる。
標的mRNAにハイブリダイズするCSTF2遺伝子に対する二本鎖分子は、通常は該遺伝子の一本鎖mRNA転写物と結合し、それによってCSTF2タンパク質の翻訳を妨げ、したがって該タンパク質の発現を阻害することにより、CSTF2遺伝子によってコードされるCSTF2タンパク質の産生を低減または阻害する。
肺癌細胞株におけるCSTF2遺伝子の発現は、CSTF2遺伝子に対するdsRNAによって阻害され得る。したがって本発明は、CSTF2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し得る、単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、以下に言及されるものなどのsiRNA設計アルゴリズムにより設計することができる。
CSTF2標的配列には、例えばSEQ ID NO:9および10のヌクレオチド配列が含まれる。言い換えれば、本発明はまた、標的配列がSEQ ID NO:9または10を含むかまたはそれらからなる二本鎖分子も提供する。
具体的には、本発明は以下の二本鎖分子[1]〜[19]を提供する:
[1]細胞に導入された場合に、CSTF2遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、単離された二本鎖分子;
[2]SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[1]の二本鎖分子;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]の二本鎖分子;
[4]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[3]のいずれか1つの二本鎖分子;
[5]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[4]の二本鎖分子;
[6]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[5]の二本鎖分子;
[7]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[6]の二本鎖分子;
[8]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド長を有する二本鎖分子を形成する、[7]の二本鎖分子;
[9]介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[8]のいずれか1つの二本鎖分子;
[10]一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[9]の二本鎖分子;
[11]RNAで構成される、[1]〜[10]のいずれか1つの二本鎖分子;
[12]DNAおよびRNAの両方で構成される、[1]〜[10]のいずれか1つの二本鎖分子;
[13]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドのハイブリッドである、[12]の二本鎖分子;
[14]センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれDNAおよびRNAで構成される、[13]の二本鎖分子;
[15]DNAとRNAのキメラである、[12]の二本鎖分子;
[16]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAである、[15]の二本鎖分子;
[17]隣接領域が9〜13ヌクレオチドで構成される、[16]の二本鎖分子;ならびに
[18]1つまたは2つの3'オーバーハングを含む、[1]〜[17]のいずれか1つの二本鎖分子;ならびに
[19]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[3]の二本鎖分子。
[1]細胞に導入された場合に、CSTF2遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、単離された二本鎖分子;
[2]SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[1]の二本鎖分子;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]の二本鎖分子;
[4]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[3]のいずれか1つの二本鎖分子;
[5]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[4]の二本鎖分子;
[6]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[5]の二本鎖分子;
[7]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド長未満を有する二本鎖分子を形成する、[6]の二本鎖分子;
[8]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド長を有する二本鎖分子を形成する、[7]の二本鎖分子;
[9]介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[8]のいずれか1つの二本鎖分子;
[10]一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[9]の二本鎖分子;
[11]RNAで構成される、[1]〜[10]のいずれか1つの二本鎖分子;
[12]DNAおよびRNAの両方で構成される、[1]〜[10]のいずれか1つの二本鎖分子;
[13]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドのハイブリッドである、[12]の二本鎖分子;
[14]センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれDNAおよびRNAで構成される、[13]の二本鎖分子;
[15]DNAとRNAのキメラである、[12]の二本鎖分子;
[16]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAである、[15]の二本鎖分子;
[17]隣接領域が9〜13ヌクレオチドで構成される、[16]の二本鎖分子;ならびに
[18]1つまたは2つの3'オーバーハングを含む、[1]〜[17]のいずれか1つの二本鎖分子;ならびに
[19]センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[3]の二本鎖分子。
本発明の二本鎖分子について、以下でより詳細に説明する。
細胞における標的遺伝子発現の阻害能を有する二本鎖分子を設計するための方法は公知である。(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,506,559号を参照されたい。)例えば、siRNAを設計するためのコンピュータプログラムは、(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlにおける)Ambionのウェブサイトから利用可能である。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて、二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。
細胞における標的遺伝子発現の阻害能を有する二本鎖分子を設計するための方法は公知である。(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,506,559号を参照されたい。)例えば、siRNAを設計するためのコンピュータプログラムは、(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlにおける)Ambionのウェブサイトから利用可能である。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて、二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の選択:
1.転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン近傍(75塩基以内)の領域は、調節タンパク質結合部位がより多い可能性があること、ならびにUTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体がsiRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得ることから、これらに対するsiRNAの設計を避けることを推奨した。
2.潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるNCBIサーバー上で得られるBLASTを使用する(Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17):3389-402)。
3.合成に適格である標的配列を選択する。遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することが一般的である。
1.転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン近傍(75塩基以内)の領域は、調節タンパク質結合部位がより多い可能性があること、ならびにUTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体がsiRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得ることから、これらに対するsiRNAの設計を避けることを推奨した。
2.潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるNCBIサーバー上で得られるBLASTを使用する(Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17):3389-402)。
3.合成に適格である標的配列を選択する。遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することが一般的である。
上記のプロトコールを用いて、CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子の標的配列を、SEQ ID NO:9および10として設計した。
上記の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、該標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について調べた。したがって本発明は、SEQ ID NO:9および10からなる群より選択される配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
CSTF2遺伝子の上記の標的配列を標的とする二本鎖分子の例には、該標的配列に相当する核酸配列および/または該標的配列に対する相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが含まれる。CSTF2遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの好ましい例には、SEQ ID NO:9もしくは10に相当する配列および/またはこれらの配列に対する相補配列を含むものが含まれる。1つの態様において、二本鎖分子は2つのポリヌクレオチドからなり、一方のポリヌクレオチドは標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖を有し、もう一方のポリペプチドは該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖を有する。センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。そのような二本鎖分子の例には、dsRNAおよびdsD/R−NAが含まれる。
別の態様において、二本鎖分子は、標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖と、該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖の両方を有するポリヌクレオチドからなる。一般的に、センス鎖とアンチセンス鎖は介在鎖によって連結され、互いにハイブリダイズしてヘアピンループ構造を形成する。そのような二本鎖分子の例には、shRNAおよびshD/R−NAが含まれる。
言い換えれば、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチド、および該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを含み、両ポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。該ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部がRNAであってもよく、標的配列がDNA配列で規定される場合には、該標的配列およびそれに対する相補配列内のヌクレオチド「t」は「u」に置き換えられる。
本発明の1つの態様において、本発明のそのような二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるステムループ構造を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、ループによって結合され得る。したがって本発明はまた、介在一本鎖によって連結されたかまたは介在一本鎖が隣接しているセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子も提供する。
本発明において、CSTF2遺伝子を標的とする二本鎖分子は、標的配列として、SEQ ID NO:9および10より選択される配列を有し得る。したがって、本発明の二本鎖分子の好ましい例には、SEQ ID NO:9または10に相当する配列およびそれに対する相補配列において互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに、SEQ ID NO:9または10に相当する配列およびそれに対する相補配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
本発明の二本鎖分子は、単一の標的CSTF2遺伝子配列に指向してもよく、または、複数の標的CSTF2遺伝子配列に指向してもよい。
CSTF2遺伝子の上記の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列のいずれかおよび/または該標的配列に対する相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。CSTF2遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例には、SEQ ID NO:9もしくは10の配列、および/または該ヌクレオチドに対する相補配列を含むものが含まれる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、改変分子がCSTF2遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上記の核酸配列における軽微な改変は許容される。本明細書において、核酸配列に関連して用いられる語句「軽微な改変」とは、該配列に対する1個、2個、または数個の核酸の置換、欠失、付加、または挿入を示す。
本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加、および/または挿入に適用される場合の用語「数個」とは、3〜7個、好ましくは3〜5個、より好ましくは3〜4個、更により好ましくは3個の核酸残基を意味し得る。
本発明に従って、本発明の二本鎖分子を、実施例において利用される方法を用いてその能力について試験することができる。本明細書に後述する実施例では、CSTF2遺伝子のmRNAの様々な部分のセンス鎖またはそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従って、肺癌細胞株(例えば、A549およびSBC−5を用いて)におけるCSTF2遺伝子産物の産生を低減させる能力についてインビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞と比較した、該候補分子と接触させた細胞におけるCSTF2遺伝子産物の減少を、例えば、実施例:「半定量的RT−PCR」の下で記載されるCSTF2 mRNAに対するプライマーを用いるRT−PCRによって、検出することができる。次に、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてCSTF2遺伝子産物の産生を低減させる配列を、細胞増殖に対する阻害効果について試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植モデルを用いてインビボでの能力について試験し、CSTF2遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認することができる。
単離されたポリヌクレオチドがRNAまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「t」は「u」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、2つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび/または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合できる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。1つの好ましい態様において、このような二重鎖は10個のマッチあたりわずか1個のミスマッチしか含有しない。1つの特に好ましい態様において、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
CSTF2に関して、ポリヌクレオチドは好ましくは1009ヌクレオチド長未満である。例えば該遺伝子に関して、ポリヌクレオチドは500ヌクレオチド長未満、200ヌクレオチド長未満、100ヌクレオチド長未満、75ヌクレオチド長未満、50ヌクレオチド長未満、または25ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子を形成するため、または、二本鎖分子をコードする鋳型DNAを調製するために有用である。二本鎖分子を形成するためにポリヌクレオチドを使用する場合、該ポリヌクレオチドは19ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは21ヌクレオチドより長くてよく、より好ましくは約19〜25ヌクレオチド長である。
したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)のmRNAにおける相同配列を同定するためのガイドとして役立つ。同定された標的RNAはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該RNAによってコードされるポリペプチドの産生(発現)を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、CSTF2遺伝子のmRNAとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするmRNAの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、mRNAのRNA配列を用いてだけでなく、該mRNAから合成されたcDNAのDNA配列を用いても示すことができる。
本発明の二本鎖分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび/または非リン酸化ジエステル結合を含有してもよい。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および/または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう(国際公開公報第03/070744号、国際公開公報第2005/045037号)。1つの態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いてもよい。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、2'−O−メチルリボヌクレオチド(特に二本鎖分子のセンス鎖上で)、2'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、2'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基(universal base)」ヌクレオチド、5'−C−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基(inverted deoxybasic residue)の組み込み(US20060122137)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例には、二本鎖分子の相補鎖2つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の3'末端または5'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および/または骨格修飾、2−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび2'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる(国際公開公報第2004/029212号)が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的mRNAにおけるおよび/または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる(国際公開公報第2005/044976号)。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを2−チオピリミジン、5−アルキニルピリミジン、5−メチルピリミジン、または5−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを7−デアザプリン、7−アルキルプリン、または7−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様において、該二本鎖分子が3'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、3'末端ヌクレオチド突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換することができる(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。さらなる詳細については、US20060234970などの公開文献が入手可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
さらに、本発明の二本鎖分子はDNAおよびRNAの両方を含み得る(例えばdsD/R−NAまたはshD/R−NA)。特に、DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはDNA−RNAキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。DNAとRNAとの混合、即ちDNA鎖(ポリヌクレオチド)とRNA鎖(ポリヌクレオチド)からなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖(ポリヌクレオチド)の一方または両方にDNAおよびRNAの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がDNAでありアンチセンス鎖がRNAであるかまたはその反対である構造のいずれかを有しうる。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはDNAであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはRNAである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がDNAおよびRNAからなる構造、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がDNAおよびRNAからなる構造を有し得る。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのDNAを含有することが好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がRNAであることが必要である。
キメラ型二本鎖分子の好ましい例として、二本鎖分子の上流部分領域(即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域)はRNAである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の5'側(5'末端)およびアンチセンス鎖の3'側(3'末端)を示す。あるいは、センス鎖の5'末端および/またはアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域との両方がRNAからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖:5'−[−−−DNA−−−]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5':アンチセンス鎖、
センス鎖:5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5':アンチセンス鎖、および
センス鎖:5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(−−−RNA−−−)−5':アンチセンス鎖。
センス鎖:5'−[−−−DNA−−−]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5':アンチセンス鎖、
センス鎖:5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5':アンチセンス鎖、および
センス鎖:5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(−−−RNA−−−)−5':アンチセンス鎖。
好ましくは上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて9〜13ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例には、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域(センス鎖では5'側領域およびアンチセンス鎖では3'側領域)がRNAでありかつもう半分がDNAである、19〜21ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がRNAである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる(US20050004064)。
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンRNA(shRNA)および、DNAとRNAからなるショートヘアピン(shD/R−NA)を形成してもよい。shRNAまたはshD/R−NAは、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、RNAの配列またはRNAとDNAの混合物の配列である。shRNAまたはshD/R−NAは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機序によって切断されてdsRNAまたはdsD/R−NAとなり、続いてRISCと結合する。この複合体は、dsRNAまたはdsD/R−NAの標的配列に一致するmRNAと結合し、これを切断する。
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列で構成されるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は介在一本鎖であり、[A']は該標的配列に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えばSEQ ID NO:9および10のヌクレオチド配列の中より選択され得る。
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は介在一本鎖であり、[A']は該標的配列に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えばSEQ ID NO:9および10のヌクレオチド配列の中より選択され得る。
本発明はこれらの例には限定されず、[A]における標的配列は、標的CSTF2遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であり得る。領域[A]は領域[A']とハイブリダイズし、領域[B]からなるループを形成する。介在一本鎖部分[B]、即ちループ配列は、好ましくは3〜23ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中より選択することができる(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。さらに、23個のヌクレオチドからなるループ配列は活性siRNAも提供する(Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;および
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;および
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
ヘアピンループ構造を有する本発明の好ましい二本鎖分子の例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACCおよびUUCAAGAGAの中より選択することができるが、本発明はこれらに限定されない:
GGCUUUAGUCCCGGGCAGA−[B]−UCUGCCCGGGACUAAAGCC(標的配列SEQ ID NO:9);
CACUUUACUUUCUGUAACU−[B]−AGUUACAGAAAGUAAAGUG(標的配列SEQ ID NO:10);
GGCUUUAGUCCCGGGCAGA−[B]−UCUGCCCGGGACUAAAGCC(標的配列SEQ ID NO:9);
CACUUUACUUUCUGUAACU−[B]−AGUUACAGAAAGUAAAGUG(標的配列SEQ ID NO:10);
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、数個のヌクレオチドを3'オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも2個、一般に2〜10個、好ましくは2〜5個である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。3'オーバーハングのヌクレオチドは限定されないが、好ましくは「u」または「t」である。二本鎖分子がヘアピンループ構造を有する場合、アンチセンス鎖の3'末端に3'オーバーハングが付加される。
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する具体例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約3:7のモル比で、より好ましくは約4:6のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量(即ち約5:5のモル比)で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が含まれる。
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、CSTF2配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。CSTF2遺伝子鋳型を、例えば核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリIII転写ユニットまたはヒトH1 RNAプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
あるいは、二本鎖分子のコード配列を、適切な細胞内での該二本鎖分子の発現を支持する調節配列(例えば、核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリIII転写ユニットまたはヒトH1 RNAプロモーター)を該コード配列に隣接して含むベクター内にクローニングすることによって、その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、該二本鎖分子を細胞内で転写してもよい。二本鎖分子のコード配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。二本鎖分子を産生することができるベクターについての詳細を以下に述べる。
本発明の二本鎖分子をコードするベクター:
本明細書に記載の1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
本明細書に記載の1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
具体的には、本発明は以下の[1]〜[10]のベクターを提供する。
[1]細胞に導入された場合に、CSTF2遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、ベクター。
[2]SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する二本鎖分子をコードする、[1]のベクター;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]のベクター;
[4]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[3]のいずれか1つのベクター;
[5]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[4]のベクター;
[6]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]のベクター;
[7]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]のベクター;
[8]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]のベクター;
[9]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[8]のいずれか1つのベクター;
[10]一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[9]のベクター。
[1]細胞に導入された場合に、CSTF2遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、ベクター。
[2]SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する二本鎖分子をコードする、[1]のベクター;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]のベクター;
[4]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[3]のいずれか1つのベクター;
[5]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[4]のベクター;
[6]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]のベクター;
[7]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]のベクター;
[8]二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]のベクター;
[9]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[8]のいずれか1つのベクター;
[10]一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[9]のベクター。
本発明のベクターは好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。したがって、1つの態様において、発現ベクターは本発明の核酸配列をコードし、かつ該核酸配列の発現に適合している。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。
本発明のベクターは、例えば、CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする配列を、調節配列が(DNA分子の転写によって)両方の鎖の発現を可能にする様式で該鎖をコードする該配列に機能的に連結されるように発現ベクターにクローニングすることによって、作製することができる(Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5)。例えば、mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子が第1のプロモーター(例えばクローニングされるDNAの3'末端に隣接するプロモーター配列)によって転写され、該mRNAに対するセンス鎖であるRNA分子が第2のプロモーター(例えば該クローニングされるDNAの5'末端に隣接するプロモーター配列)によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする2つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造(例えばヘアピン)を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードしてもよい。
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するために包含されてもよい(例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい)。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第5,580,859号、同第5,589,466号、同第5,804,566号、同第5,739,118号、同第5,736,524号、同第5,679,647号、および国際公開公報第98/04720号を参照されたい。DNAベースの送達技術の例には、「ネイキッドDNA」、促進性(ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに仲介される)送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子仲介性(「遺伝子銃」)または圧力仲介性の送達が含まれる(例えば米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
本発明のベクターには、例えばウイルス性または細菌性のベクターが含まれる。発現ベクターの例には、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる(例えば米国特許第4,722,848号を参照されたい)。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin;BCG)が含まれる。BCGベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella typhi)ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
本発明の二本鎖分子を用いて、がん細胞の増殖を阻害もしくは低減するかまたはがんを治療する方法:
本発明は、CSTF2遺伝子の発現の阻害を介してCSTF2遺伝子の機能不全を誘導することにより、がん細胞増殖、例えば肺癌細胞増殖を阻害するための方法を提供する。CSTF2遺伝子発現は、CSTF2遺伝子を特異的に標的とする本発明の前述の二本鎖分子のいずれかによって、または該二本鎖分子の少なくとも一つを発現し得る本発明のベクターによって、阻害され得る。
本発明は、CSTF2遺伝子の発現の阻害を介してCSTF2遺伝子の機能不全を誘導することにより、がん細胞増殖、例えば肺癌細胞増殖を阻害するための方法を提供する。CSTF2遺伝子発現は、CSTF2遺伝子を特異的に標的とする本発明の前述の二本鎖分子のいずれかによって、または該二本鎖分子の少なくとも一つを発現し得る本発明のベクターによって、阻害され得る。
本発明の二本鎖分子およびベクターががん性細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力によって、それらを、がんを治療するための方法に使用できることが示される。したがって本発明は、正常な器官ではCSTF2遺伝子がほとんど検出されなかったことから、CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することにより、肺癌を有する患者を、有害作用を引き起こすことなく治療するための方法を提供する。
具体的には、本発明は以下の方法[1]〜[36]を提供する:
[1]CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にCSTF2遺伝子の発現を阻害する、方法;
[2]二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[1]の方法;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]の方法;
[4]複数種類の二本鎖分子が投与される、[1]〜[3]のいずれか1つの方法;
[5]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[4]のいずれか1つの方法;
[6]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]の方法;
[7]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]の方法;
[8]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]の方法;
[9]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[9]の方法;
[10]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[9]のいずれか1つの方法;
[11]二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[10]の方法;
[12]二本鎖分子がRNAである、[1]〜[11]のいずれか1つの方法;
[13]二本鎖分子がDNAおよびRNAの両方を含む、[1]〜[11]のいずれか1つの方法;
[14]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドのハイブリッドである、[13]の方法;
[15]センス鎖およびアンチセンス鎖のポリヌクレオチドがそれぞれDNAおよびRNAで構成される、[14]の方法;
[16]二本鎖分子がDNAとRNAのキメラである、[13]の方法;
[17]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAで構成される、[16]の方法;
[18]隣接領域が9〜13ヌクレオチドで構成される、[17]の方法;
[19]二本鎖分子が1つまたは複数の3'オーバーハングを含む、[1]〜[18]のいずれか1つの方法;
[20]二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、[1]〜[19]のいずれか1つの方法。
[21]二本鎖分子がベクターによってコードされる、[1]〜[20]のいずれか1つの方法;
[22]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[21]の方法。
[23]ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[21]の方法。
[24]複数種類の二本鎖分子が投与される、[21]〜[23]のいずれか1つの方法;
[25]ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が約100ヌクレオチド対未満の長さを有する、[21]〜[24]のいずれか1つの方法;
[26]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[25]の方法;
[27]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[26]の方法;
[28]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[27]の方法;
[29]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[28]の方法;
[30]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[21]〜[29]のいずれか1つの方法;
[31]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[30]の方法;
[34]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、[21]〜[31]のいずれか1つの方法;ならびに
[35]がんが肺癌である、[1]〜[34]のいずれか1つの方法。
[36]肺癌が腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞肺癌である、[35]の方法。
[1]CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にCSTF2遺伝子の発現を阻害する、方法;
[2]二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[1]の方法;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]の方法;
[4]複数種類の二本鎖分子が投与される、[1]〜[3]のいずれか1つの方法;
[5]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[4]のいずれか1つの方法;
[6]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]の方法;
[7]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]の方法;
[8]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]の方法;
[9]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[9]の方法;
[10]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[9]のいずれか1つの方法;
[11]二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[10]の方法;
[12]二本鎖分子がRNAである、[1]〜[11]のいずれか1つの方法;
[13]二本鎖分子がDNAおよびRNAの両方を含む、[1]〜[11]のいずれか1つの方法;
[14]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドのハイブリッドである、[13]の方法;
[15]センス鎖およびアンチセンス鎖のポリヌクレオチドがそれぞれDNAおよびRNAで構成される、[14]の方法;
[16]二本鎖分子がDNAとRNAのキメラである、[13]の方法;
[17]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAで構成される、[16]の方法;
[18]隣接領域が9〜13ヌクレオチドで構成される、[17]の方法;
[19]二本鎖分子が1つまたは複数の3'オーバーハングを含む、[1]〜[18]のいずれか1つの方法;
[20]二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、[1]〜[19]のいずれか1つの方法。
[21]二本鎖分子がベクターによってコードされる、[1]〜[20]のいずれか1つの方法;
[22]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[21]の方法。
[23]ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[21]の方法。
[24]複数種類の二本鎖分子が投与される、[21]〜[23]のいずれか1つの方法;
[25]ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が約100ヌクレオチド対未満の長さを有する、[21]〜[24]のいずれか1つの方法;
[26]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[25]の方法;
[27]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[26]の方法;
[28]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[27]の方法;
[29]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[28]の方法;
[30]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[21]〜[29]のいずれか1つの方法;
[31]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[30]の方法;
[34]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、[21]〜[31]のいずれか1つの方法;ならびに
[35]がんが肺癌である、[1]〜[34]のいずれか1つの方法。
[36]肺癌が腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞肺癌である、[35]の方法。
本発明の方法を以下により詳細に説明する。
CSTF2遺伝子を発現する細胞の増殖は、該細胞をCSTF2遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物と接触させることによって阻害することができる。該細胞をさらにトランスフェクション剤と接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、細胞が、該分子に曝露されていない細胞と比較してより低い速度で増殖するかまたは低下した生存率を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法によって、例えばMTT細胞増殖アッセイ法を用いて測定することができる。
CSTF2遺伝子を発現する細胞の増殖は、該細胞をCSTF2遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物と接触させることによって阻害することができる。該細胞をさらにトランスフェクション剤と接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、細胞が、該分子に曝露されていない細胞と比較してより低い速度で増殖するかまたは低下した生存率を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法によって、例えばMTT細胞増殖アッセイ法を用いて測定することができる。
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現する限り、いかなる種類の細胞の増殖も、本発明の方法に従って抑制され得る。例示的な細胞には、NSCLCおよびSCLCなどの肺癌細胞が含まれる。
したがって、CSTF2に関連する疾患、例えばがんに罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者を、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つ、該分子の少なくとも1つを発現する少なくとも1つのベクター、または該分子の少なくとも1つを含む少なくとも1つの組成物を投与することによって、治療することができる。例えば、肺癌患者を本発明の方法に従って治療することができる。がんの種類は、診断される特定の種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定することができる。肺癌は、例えば、癌胎児性抗原(CEA)、CYFRA、pro−GRP等を肺癌マーカーとして用いて、または胸部X線検査および/もしくは喀痰細胞診によって診断され得る。より好ましくは、本発明の方法によって治療を受ける患者は、当技術分野で公知の方法、例えばRT−PCRまたは免疫測定法により、患者から採取された生検標本中のCSTF2遺伝子の発現を検出することによって、選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、対象由来の生検標本を、当技術分野で公知の方法、例えば免疫組織化学的解析またはRT−PCRにより、CSTF2遺伝子の過剰発現について確認する。
細胞増殖を阻害し、それによってがんを治療するための本発明の方法によれば、複数種類の二本鎖分子(または、これを発現するベクターもしくはこれを含む組成物)を投与する場合、該分子はそれぞれ異なる構造を有しうるが、同一の標的配列と一致するmRNAに対して作用する。あるいは、複数種類の二本鎖分子は、同一遺伝子の異なる標的配列と一致するmRNAに対して作用し得、または、異なる遺伝子の異なる標的配列と一致するmRNAに対して作用し得る。例えば、本方法は、CSTF2遺伝子の異なる標的配列に指向する二本鎖分子を利用することができる。あるいは、例えば本方法は、CSTF2遺伝子および他の遺伝子の1つ、2つ、またはそれ以上の標的配列に指向する二本鎖分子を利用することができる。
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子と対応するmRNA転写物との結合を達成するための形態で、細胞に直接導入してもよい。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするDNAをベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばFuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(Wako pure Chemical)を使用してもよい。
治療により、CSTF2遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下などの臨床的恩恵がもたらされる場合に、該治療は「有効」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成が遅延もしくは阻害されるか、またはがんの臨床症状が予防もしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の種類の腫瘍を診断または治療するための任意の公知の方法と共同して判定される。
本発明の方法および組成物が「予防(preventionおよびprophylaxis)」の文脈において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の作用を指す。予防(preventionおよびprophylaxis)は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防(preventionおよびprophylaxis)は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防(preventionおよびprophylaxis)は、疾患の進行および症状の出現を予防(preventionおよびprophylaxis)することに加え、機能の回復および疾患関連の合併症の低減によって、既に確立された疾患の悪影響を低下させることを目的とした活動を包含する。あるいは、予防(preventionおよびprophylaxis)は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
がんの治療および/もしくは予防、ならびに/またはその術後再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などのいずれかを含む。がんの効果的な治療および/または予防は、死亡率を低下させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療の構成要素であり、かつ/または、予防は10%、20%、30%、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定な疾患を含む。
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でCSTF2 mRNAを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的mRNAの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態;投与経路などの要素;ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかを考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、約1ナノモル(nM)〜約100nM、好ましくは約2nM〜約50nM、より好ましくは約2.5nM〜約10nMの、がん部位またはその近傍での細胞間濃度である。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要となる正確な投与量は、当業者によって容易かつ慣行的に決定され得る。
本発明の方法を用いて、CSTF2遺伝子を発現するがん;例えば、NSCLCおよびSCLCを含む肺癌の、増殖または転移を阻害することができる。具体的には、SEQ ID NO:9または10の標的配列を含む二本鎖分子が、肺癌の治療のために特に好ましい。
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法(例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、5−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療)と組み合わせて投与することができる。
本方法において、二本鎖分子を、送達物質と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達物質には、Mirus Transit TKO親油性物質、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン(例えばポリリシン)またはリポソームが含まれる。好ましい送達物質はリポソームである。
リポソームは、肺腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および同第5,019,369号(その開示全体が参照により本明細書に引用される)に記載されたような様々な方法が知られている。
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾する。1つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,920,016号に記載されるように、マクロファージ−単球系(「MMS」)および網内系(「RES」)によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性(leaky)」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、RESによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量約500ダルトン〜約40000ダルトン、より好ましくは約2000ダルトン〜約20000ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体;例えばメトキシPEGまたはPPG、およびステアリン酸PEGまたはステアリン酸PPG;ポリアクリルアミドまたはポリN−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー;直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン;ポリアクリル酸;多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびに、ガングリオシドGM1などのガングリオシドが含まれる。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、PEGと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン;アミノ化多糖またはオリゴ糖(直鎖または分岐鎖);あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
好ましくは、オプソニン化阻害部分はPEG、PPG、またはその誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは「PEG化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか1つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、PEGのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Na(CN)BH3および溶媒混合物、例えば比率30:12のテトラヒドロフランと水を用いる60℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも1つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Mirus Transit LT1親油性物質、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン(例えばポリリシン)またはリポソームを含む好適な送達物質と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
好適な非経口投与経路には、静脈内投与(例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入);組織周囲および組織内注射(例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射);皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着(例えば浸透圧ポンプによる);例えばカテーテルもしくは他の留置装置(placement device)(例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント)によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用;ならびに吸入が含まれる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行うことが好ましい。
好適な非経口投与経路には、静脈内投与(例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入);組織周囲および組織内注射(例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射);皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着(例えば浸透圧ポンプによる);例えばカテーテルもしくは他の留置装置(placement device)(例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント)によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用;ならびに吸入が含まれる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行うことが好ましい。
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。がん部位のまたはその近傍の組織内へ、剤を直接注射することが好ましい。がん部位のまたはその近傍の組織へ、剤を複数回注射することが特に好ましい。
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約3日〜約28日、より好ましくは約7日〜約10日の期間にわたり、1日1回または2回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子を7日間、1日1回、がん部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
本発明において、CSTF2を過剰発現するがんを、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分によって治療することができる。
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分によって治療することができる。
がんには、肺癌が非限定的に含まれる。したがって、有効成分としての本発明の二本鎖分子の投与の前に、治療されるがん細胞または組織におけるCSTF2の発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。したがって、1つの態様において、本発明は、CSTF2を(過剰)発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
i)治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるCSTF2の発現レベルを測定する段階;
ii)CSTF2の該発現レベルを正常対照と比較する段階;ならびに
iii)正常対照と比較してCSTF2を過剰発現するがんを有する対象に対して、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を投与する段階
を含んでもよい。
あるいは本発明は、CSTF2を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるCSTF2の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。
i)治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるCSTF2の発現レベルを測定する段階;
ii)CSTF2の該発現レベルを正常対照と比較する段階;ならびに
iii)正常対照と比較してCSTF2を過剰発現するがんを有する対象に対して、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を投与する段階
を含んでもよい。
あるいは本発明は、CSTF2を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるCSTF2の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。
本発明のがん治療法を、以下でより詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
本発明に従って、対象から採取したがん細胞または組織におけるCSTF2の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルとして測定することができる。例えば、CSTF2のmRNAを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンハイブリダイゼーション)によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。CSTF2の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、CSTF2の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、CSTF2のcDNAをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、CSTF2(例えばSEQ ID NO:1)の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法(例えばRT−PCR)によって定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子についての入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、CSTF2のmRNAとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度のもとで)その標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Tmにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの50%が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0Mであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)に関しては少なくとも約30℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、CSTF2タンパク質(SEQ ID NO:2)の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がCSTF2タンパク質との結合能を保持している限り、該断片または修飾(例えばキメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
CSTF2遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、CSTF2タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量/レベルの増大を示すと同時に、CSTF2遺伝子の高い発現レベルを示す。
がん細胞における標的遺伝子、例えばCSTF2遺伝子の発現レベルは、該標的遺伝子の対照レベル(例えば、正常細胞におけるレベル)よりも、例えば10%、25%、もしくは50%増大していれば;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上に増大していれば、増大したと判定することができる。
疾患状態(がん性または非がん性)が既知である対象(複数可)から以前に採取して保存していた試料(複数可)を使用することによって、がん細胞と同時に対照レベルを決定してもよい。さらに、治療されるがんを有する臓器の非がん性領域から採取した正常細胞を正常対照として使用してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたCSTF2遺伝子の発現レベル(複数可)を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来することもできる。その上、本発明の一局面によれば、生物試料におけるCSTF2遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるCSTF2遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±2S.D.または平均±3S.D.の範囲を標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、非がん性であることが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
CSTF2遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している/同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断される。
本発明の二本鎖分子を含む組成物:
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つまたは該分子をコードするベクターを含む、薬学的組成物も提供する。具体的には、本発明は以下の組成物[1]〜[34]を提供する:
[1]CSTF2遺伝子に対する少なくとも1つの単離された二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、がん細胞の増殖を阻害するため、および/またはがんを治療もしくは予防するための組成物であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にCSTF2の発現および細胞増殖を阻害し、かつ、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、組成物;
[2]二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[1]の組成物;
[3]二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]の組成物;
[4]複数種類の二本鎖分子を含む、[1]の組成物;
[5]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[3]のいずれか1つの組成物;
[6]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]の組成物;
[7]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]の組成物;
[8]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]の組成物;
[9]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[8]の組成物;
[10]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[9]のいずれか1つの組成物;
[11]二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖配列であり、[B]は3〜23ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[10]の組成物;
[12]二本鎖分子がRNAである、[1]〜[11]のいずれか1つの組成物;
[13]二本鎖分子がDNAおよび/またはRNAである、[1]〜[11]のいずれか1つの組成物;
[14]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドのハイブリッドである、[13]の組成物;
[15]センス鎖およびアンチセンス鎖のポリヌクレオチドがそれぞれDNAおよびRNAで構成される、[14]の組成物;
[16]二本鎖分子がDNAとRNAのキメラである、[13]の組成物;
[17]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAで構成される、[16]の組成物;
[18]隣接領域が9〜13ヌクレオチドで構成される、[17]の組成物;
[19]二本鎖分子が1つまたは2つの3'オーバーハングを含む、[1]〜[18]のいずれか1つの組成物;
[20]トランスフェクション増強剤をさらに含む、[1]〜[19]のいずれか1つの組成物;
[21]二本鎖分子がベクターによってコードされ、かつ組成物中に含まれる、[1]〜[20]のいずれか1つの組成物;
[22]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[21]の組成物;
[23]ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[21]の組成物;
[24]複数種類の二本鎖分子が投与される、[21]〜[23]のいずれか1つの組成物;
[25]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[21]〜[24]のいずれか1つの組成物;
[26]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[25]の組成物;
[27]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[26]の組成物;
[28]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[27]の組成物;
[29]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[28]の組成物;
[30]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[21]〜[29]のいずれか1つの組成物;
[31]二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[30]の組成物;
[32]トランスフェクション増強剤をさらに含む、[21]〜[31]のいずれか1つの組成物;ならびに
[33]がんが肺癌である、[1]〜[32]のいずれか1つの組成物。
[34]肺癌が腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞肺癌である、[33]の組成物。
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つまたは該分子をコードするベクターを含む、薬学的組成物も提供する。具体的には、本発明は以下の組成物[1]〜[34]を提供する:
[1]CSTF2遺伝子に対する少なくとも1つの単離された二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、がん細胞の増殖を阻害するため、および/またはがんを治療もしくは予防するための組成物であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にCSTF2の発現および細胞増殖を阻害し、かつ、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、組成物;
[2]二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[1]の組成物;
[3]二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[1]の組成物;
[4]複数種類の二本鎖分子を含む、[1]の組成物;
[5]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[1]〜[3]のいずれか1つの組成物;
[6]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]の組成物;
[7]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]の組成物;
[8]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]の組成物;
[9]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[8]の組成物;
[10]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[1]〜[9]のいずれか1つの組成物;
[11]二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖配列であり、[B]は3〜23ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[10]の組成物;
[12]二本鎖分子がRNAである、[1]〜[11]のいずれか1つの組成物;
[13]二本鎖分子がDNAおよび/またはRNAである、[1]〜[11]のいずれか1つの組成物;
[14]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドのハイブリッドである、[13]の組成物;
[15]センス鎖およびアンチセンス鎖のポリヌクレオチドがそれぞれDNAおよびRNAで構成される、[14]の組成物;
[16]二本鎖分子がDNAとRNAのキメラである、[13]の組成物;
[17]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAで構成される、[16]の組成物;
[18]隣接領域が9〜13ヌクレオチドで構成される、[17]の組成物;
[19]二本鎖分子が1つまたは2つの3'オーバーハングを含む、[1]〜[18]のいずれか1つの組成物;
[20]トランスフェクション増強剤をさらに含む、[1]〜[19]のいずれか1つの組成物;
[21]二本鎖分子がベクターによってコードされ、かつ組成物中に含まれる、[1]〜[20]のいずれか1つの組成物;
[22]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10の中より選択される標的配列と一致するmRNAに対して作用する、[21]の組成物;
[23]ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、[21]の組成物;
[24]複数種類の二本鎖分子が投与される、[21]〜[23]のいずれか1つの組成物;
[25]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約100ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[21]〜[24]のいずれか1つの組成物;
[26]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約75ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[25]の組成物;
[27]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約50ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[26]の組成物;
[28]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約25ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[27]の組成物;
[29]二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約19〜約25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、[28]の組成物;
[30]ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、[21]〜[29]のいずれか1つの組成物;
[31]二本鎖分子が、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は、SEQ ID NO:9および10の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、[30]の組成物;
[32]トランスフェクション増強剤をさらに含む、[21]〜[31]のいずれか1つの組成物;ならびに
[33]がんが肺癌である、[1]〜[32]のいずれか1つの組成物。
[34]肺癌が腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞肺癌である、[33]の組成物。
本発明の適切な組成物を、以下でさらに詳細に説明する。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として製剤化することが好ましい。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつ発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で用いられる「薬学的製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製するための方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されるような、当技術分野における技術の範囲内である。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として製剤化することが好ましい。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつ発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で用いられる「薬学的製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製するための方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されるような、当技術分野における技術の範囲内である。
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容される担体媒体と混合された、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つもしくはそれらをコードするベクター(例えば、0.1〜90重量%)、または該分子の生理学的に許容される塩を含む。生理学的に許容される担体媒体は、水、緩衝水、生理食塩水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸等であることが好ましい。
本発明によれば、組成物は複数種類の二本鎖分子を含んでよく、該分子のそれぞれは、同一遺伝子の異なる標的配列、または異なる遺伝子の異なる標的配列に指向し得る。例えば、組成物はCSTF2遺伝子の標的配列に指向する二本鎖分子を含み得る。あるいは、例えば組成物は、CSTF2遺伝子および他の遺伝子の1個、2個、またはそれ以上の標的配列に指向する二本鎖分子を含み得る。
さらに、本発明の組成物は、1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含み得る。例えば、ベクターは、1種類、2種類、または数種類の本発明の二本鎖分子をコードし得る。あるいは、本発明の組成物は、それぞれが異なる二本鎖分子をコードする、複数種類のベクターを含み得る。
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含まれ得る。リポソームの詳細に関しては、「本発明の二本鎖分子を用いて、がん細胞の増殖を阻害もしくは低減するかまたはがんを治療する方法」の項を参照されたい。
本発明の組成物は、薬学的組成物であってもよい。本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および/または添加剤も含み得る。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびpH調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のある緩衝液(例えば、トロメタミン塩酸塩)、キレート剤(例えば、DTPAまたはDTPA−ビスアミドなど)もしくはカルシウムキレート錯体(例えば、カルシウムDTPA、CaNaDTPA−ビスアミド)の添加、または任意で、カルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加(例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム)が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装することができ、または凍結乾燥することもできる。
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を用いることができる。
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上記の担体および賦形剤のいずれか、ならびに10〜95%、好ましくは25〜75%の本発明の二本鎖分子の1つまたは複数を含み得る。エアロゾル(吸入)投与のための薬学的組成物は、上記のようにリポソーム中に封入される0.01〜20重量%、好ましくは1〜10重量%の本発明の二本鎖分子の1つまたは複数、および噴霧剤を含み得る。必要に応じて、担体、例えば鼻腔内送達の場合はレシチンを含めることもできる。
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的有効成分を含み得る。例えば、本組成物は、がんを治療するために従来用いられている化学療法剤を含み得る。
別の態様において、本発明はまた、CSTF2の発現を特徴とする肺癌を治療するための薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、CSTF2を発現する肺癌の治療用の薬学的組成物の製造のための、細胞におけるCSTF2遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、ここで該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO:9および10の中より選択される配列を標的とする。
あるいは、本発明はさらに、CSTF2遺伝子を発現するがんの治療に使用するための、本発明の二本鎖核酸分子を提供する。
あるいは、本発明はさらに、薬学的または生理学的に許容される担体を、該遺伝子を過剰発現する細胞におけるCSTF2の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に製剤化する段階を含む、CSTF2の発現を特徴とする肺癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつ有効成分として、SEQ ID NO:9および10の中より選択される配列を標的とする。
あるいは、本発明はさらに、薬学的または生理学的に許容される担体を、該遺伝子を過剰発現する細胞におけるCSTF2の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に製剤化する段階を含む、CSTF2の発現を特徴とする肺癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつ有効成分として、SEQ ID NO:9および10の中より選択される配列を標的とする。
別の態様において、本発明はまた、有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、CSTF2の発現を特徴とする肺癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、ここで、該有効成分が、該遺伝子を過剰発現する細胞におけるCSTF2の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO:9および10の中より選択される配列を標的とする。
肺癌を検出または診断する方法
CSTF2遺伝子の発現は、肺癌細胞において特異的に上昇することが見出された(図1A〜C)。したがって、本発明において同定された遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、肺癌のマーカーとして診断的に有用であり、かつ、細胞試料中のCSTF2遺伝子の発現を測定することにより、肺癌を診断することができる。具体的には、本発明は、対象におけるCSTF2の発現レベルを測定することにより、肺癌を診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断可能な肺癌には、NSCLCおよびSCLCが含まれる。さらに、肺腺癌(ADC)、肺扁平上皮癌(SCC)、および大細胞癌(LCC)を含むNSCLCも、本発明により診断または検出することが可能である。
CSTF2遺伝子の発現は、肺癌細胞において特異的に上昇することが見出された(図1A〜C)。したがって、本発明において同定された遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、肺癌のマーカーとして診断的に有用であり、かつ、細胞試料中のCSTF2遺伝子の発現を測定することにより、肺癌を診断することができる。具体的には、本発明は、対象におけるCSTF2の発現レベルを測定することにより、肺癌を診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断可能な肺癌には、NSCLCおよびSCLCが含まれる。さらに、肺腺癌(ADC)、肺扁平上皮癌(SCC)、および大細胞癌(LCC)を含むNSCLCも、本発明により診断または検出することが可能である。
本発明に従って、対象の状態を調べるための中間的な結果が提供され得る。そのような中間的な結果を付加的な情報と組み合わせて、医師、看護師、または他の実務者が、対象が疾患に罹患していると診断するのを補助してもよい。すなわち、本発明は、癌を調べるための診断マーカーCSTF2を提供する。あるいは、本発明は、対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象由来の肺組織試料中の癌細胞を検出または同定するための方法を提供し、ここで、該発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該組織中の癌細胞の存在または疑いが示される。対象が疾患に罹患していると診断する際、医師、看護師、または他の医療実務者を補助するために、そのような結果を付加的な情報と組み合わせることができる。言い換えれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明に従って、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関して疑いがある場合には、CSTF2遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、血中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および該対象の臨床経過等を含む該疾患の別の局面を考慮することにより、臨床決定に至ることができる。例えば、いくつかの周知の血中の診断用肺腫瘍マーカーは、IAP、ACT、BFP、CA19−9、CA50、CA72−4、CA130、CEA、KMO−1、NSE、SCC、SP1、Span−1、TPA、CSLEX、SLX、STN、およびCYFRAである。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
具体的には、本発明は以下の方法[1]〜[11]を提供する:
[1]対象における肺癌または肺癌発症の素因を診断するための方法であって、
(a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;ならびに
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較して検出した発現レベルの上昇を、該対象における疾患の存在と関連付ける段階
を含む、方法。
[2]発現レベルが正常対照レベルを少なくとも10%上回る、[1]の方法;
[3]発現レベルが、
(a)CSTF2遺伝子によってコードされるmRNAを検出すること、
(b)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、ならびに
(c)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
の中より選択される方法によって検出される、[1]または[2]の方法;
[4]発現レベルが、CSTF2遺伝子によってコードされるmRNAに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、[3]の方法;
[5]発現レベルが、CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質へのCSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定される、[3]の方法;
[6]生物学的試料が生検試料、痰、または血液を含む、[1]〜[5]のいずれか1つの方法;
[7]対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、[1]〜[6]のいずれか1つの方法;
[8]対象由来の生物学的試料ががん性細胞を含む、[1]〜[7]のいずれか1つの方法;
[9]対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、[8]の方法。
[10]対象由来の生物学的試料が肺組織または肺細胞を含む、[1]〜[9]のいずれか1つの方法。
[11]肺癌がNSCLCまたはSCLCである、[1]〜[10]のいずれか1つの方法;
[1]対象における肺癌または肺癌発症の素因を診断するための方法であって、
(a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;ならびに
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較して検出した発現レベルの上昇を、該対象における疾患の存在と関連付ける段階
を含む、方法。
[2]発現レベルが正常対照レベルを少なくとも10%上回る、[1]の方法;
[3]発現レベルが、
(a)CSTF2遺伝子によってコードされるmRNAを検出すること、
(b)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、ならびに
(c)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
の中より選択される方法によって検出される、[1]または[2]の方法;
[4]発現レベルが、CSTF2遺伝子によってコードされるmRNAに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、[3]の方法;
[5]発現レベルが、CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質へのCSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定される、[3]の方法;
[6]生物学的試料が生検試料、痰、または血液を含む、[1]〜[5]のいずれか1つの方法;
[7]対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、[1]〜[6]のいずれか1つの方法;
[8]対象由来の生物学的試料ががん性細胞を含む、[1]〜[7]のいずれか1つの方法;
[9]対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、[8]の方法。
[10]対象由来の生物学的試料が肺組織または肺細胞を含む、[1]〜[9]のいずれか1つの方法。
[11]肺癌がNSCLCまたはSCLCである、[1]〜[10]のいずれか1つの方法;
肺癌を診断する方法を、以下でより詳細に説明する。
本発明の方法によって診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明の方法によって診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
診断される対象から生物学的試料を採取して、診断を行うことが好ましい。CSTF2遺伝子の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を測定のための生物学的試料として用いることができる。生物学的試料には、がんの診断のために望ましいかまたはがんに罹患していると疑われる身体組織、ならびに体液、例えば血液、痰、胸水、および尿が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは癌性上皮細胞、または癌性と疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞群を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後生物学的試料として用いてもよい。好ましい態様において、生物学的試料は肺組織または肺細胞を含む。そのような生物学的試料は、対象の肺において癌性であると疑われる領域から肺組織または肺細胞を採取することによって、例えば生検によって、得ることができる。
本発明に従って、対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写(mRNA)産物レベルで測定することができる。例えば、CSTF2遺伝子のmRNAを、ハイブリダイゼーション法(例えば、ノーザンハイブリダイゼーション)によってプローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で行ってもよい。アレイの使用は好ましくは、CSTF2遺伝子を含む複数の遺伝子(例えば、様々ながん特異的遺伝子)の発現レベルを検出するためである。当業者は、CSTF2遺伝子(SEQ ID NO:1;GenBankアクセッション番号:NM_001325)の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、CSTF2遺伝子のcDNAをプローブとして用いてもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法(例えば、RT−PCR)によりプライマーを用いて、CSTF2遺伝子の転写産物を定量することができる。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、「実施例」で用いられるプライマーまたはプローブ(SEQ ID NO:3、4、7、および8)を、RT−PCRまたはノーザンブロットによる検出に使用することができるが、本発明はそれらに限定されるわけではない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、CSTF2遺伝子のmRNAとハイブリダイズする。上記で定義されたのと同様、本明細書で用いられる「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別々の状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有される。通常、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がpH7.0〜8.3においてナトリウムイオン約1.0M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0Mであり、温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、CSTF2タンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がCSTF2タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)を検出に用いることができる。タンパク質検出のためのこのような種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用してもよい。
CSTF2遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、CSTF2タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色が観察されることにより、該タンパク質の存在量の増加、および同時にCSTF2遺伝子の高い発現レベルが示される。
さらに、診断の精度を向上させるために、CSTF2遺伝子の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えば肺癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。
生物学的試料中のCSTF2遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば10%、25%、もしくは50%上昇しているか、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇したと見なすことができる。
対照レベルは、疾患状態(がん性または非がん性)が判明している一名/複数名の対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象由来の試料中のCSTF2遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の1つの局面に従って、生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定された複数の対照レベルと比較することもできる。患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が判明している群におけるCSTF2遺伝子の発現レベルの基準値を使用することが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±2S.D.または平均値±3S.D.の範囲を基準値として用いることができる。
本発明の文脈において、がん性でないと判明している生物学的試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生物学的試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。
CSTF2遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象を、がんに罹患しているかまたはその発症リスクを有すると診断することができる。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象が、がんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの差を、細胞のがん性状態および非がん性状態によって発現レベルが相違しないことが既知である対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質P1が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
あるいは、本発明は、がんの診断用の診断試薬を調製するための試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、該試薬は、
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)CSTF2タンパク質を検出するための試薬;および
(c)CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)CSTF2タンパク質を検出するための試薬;および
(c)CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
具体的には、そのような試薬は、CSTF2ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはCSTF2ポリペプチドに結合する抗体である。
本発明において、CSTF2は有用な診断マーカーであるだけでなく、がん療法のための適切な標的であることが、明らかになっている。したがって、本発明によって、CSTF2を標的とするがん治療を達成することができる。本発明において、CSTF2を標的とするがん治療とは、がん細胞におけるCSTF2の活性および/または発現の抑制または阻害を指す。CSTF2を標的とするがん治療のために、任意の抗CSTF2剤を用いることができる。本発明において、抗CSTF2剤は、有効成分として以下の物質を含む:
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター。
したがって好ましい態様において、本発明は、(i)対象が抗CSTF2剤で治療すべきがんを有するかどうかを診断しかつ/または(ii)CSTF2を標的とするがん治療のために対象を選択する方法を提供し、該方法は、
(a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
(c)CSTF2の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階;および
(d)段階(c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は
(a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
(c)CSTF2遺伝子の発現レベルががん性対照レベルと類似しているかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階;および
(d)段階(c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター。
したがって好ましい態様において、本発明は、(i)対象が抗CSTF2剤で治療すべきがんを有するかどうかを診断しかつ/または(ii)CSTF2を標的とするがん治療のために対象を選択する方法を提供し、該方法は、
(a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
(c)CSTF2の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階;および
(d)段階(c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は
(a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
(c)CSTF2遺伝子の発現レベルががん性対照レベルと類似しているかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階;および
(d)段階(c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
がんの予後を評価する方法
本発明は、CSTF2発現が患者の予後不良と有意に関連しているという新規発見に関連する。したがって本発明は、患者の生物学的試料中のCSTF2の発現レベルを検出し;検出された発現レベルを対照レベルと比較し;かつ、対照レベルに対する発現レベルの上昇が予後不良(生存率低下)を示すと判定することによって、がん、特に肺癌を有する患者の予後を判定または評価する方法を提供する。具体的には、本発明は、肺癌を有する対象の予後を評価または判定するための方法を提供し、該方法は、
(a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;
(b)検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階;および
(c)(b)の比較に基づいて該対象の予後を判定する段階
を含む。
本発明は、CSTF2発現が患者の予後不良と有意に関連しているという新規発見に関連する。したがって本発明は、患者の生物学的試料中のCSTF2の発現レベルを検出し;検出された発現レベルを対照レベルと比較し;かつ、対照レベルに対する発現レベルの上昇が予後不良(生存率低下)を示すと判定することによって、がん、特に肺癌を有する患者の予後を判定または評価する方法を提供する。具体的には、本発明は、肺癌を有する対象の予後を評価または判定するための方法を提供し、該方法は、
(a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;
(b)検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階;および
(c)(b)の比較に基づいて該対象の予後を判定する段階
を含む。
本明細書において、「予後」という用語は、症例の性質および症状によって示される、疾患の推定される転帰および該疾患からの回復見込みに関する予想を指す。したがって、あまり好ましくない、ネガティブな、不良な予後は、短い治療後生存期間または低い生存率によって定義される。逆に、ポジティブな、好ましい、または良好な予後は、長い治療後生存期間または高い生存率によって定義される。
「予後を評価する」という用語は、患者のがんの将来の転帰(例えば、悪性度、がんが治癒する見込み、生存等)を予測する、予想する、または所与の検出もしくは測定と関連付ける能力を指す。例えば、経時的なCSTF2遺伝子の発現レベルの測定によって、患者の転帰(例えば、悪性度の上下、がんのグレードの上下、がんが治癒する見込み、生存期間等)を予測することが可能になる。
本発明の文脈において、「予後を評価する(または判定する)」という語句は、がん、進行、特にがんの再発、転移拡散、および疾患再発の予測および尤度解析を包含することが意図される。予後を評価するための本発明の方法は、治療的介入、病期分類などの診断基準、ならびに、新生物性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む、治療様式に関する判断において臨床的に用いられることが意図される。
本方法に用いられる患者由来の生物学的試料は、CSTF2遺伝子が試料中で検出され得る限り、評価される対象に由来する任意の試料であってよい。好ましくは、生物学的試料は肺細胞(肺から採取された細胞)である。さらに、生物学的試料は、痰、血液、血清、または血漿などの体液を含み得る。さらに、試料は組織から精製された細胞であってよい。生物学的試料は、治療前、治療中、および/または治療後を含む様々な時点で、患者から採取することができる。例えば、評価される対象から採取された肺癌細胞は、好ましい生物学的試料である。
本発明に従って、患者由来の生物学的試料中で測定されたCSTF2遺伝子の発現レベルが高いほど、治療後の寛解、回復、および/または生存率に関する予後がより不良であり、かつ臨床転帰不良の可能性がより高いことが示された。したがって、本発明の方法によれば、比較に用いられる「対照レベル」は、例えば、治療後にがんの良好なまたはポジティブな予後を示した個体または個体群において、任意の種類の治療の前に検出されたCSTF2遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後良好対照レベル」と称される。あるいは、「対照レベル」は、治療後にがんの不良なまたはネガティブな予後を示した個体または個体群において、あらゆる種類の治療の前に検出されたCSTF2遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後不良対照レベル」と称される。「対照レベル」は、単一の参照群に由来する単一の発現パターンであるか、または複数の発現パターンに由来する。したがって対照レベルは、疾患状態(予後良好または予後不良)が判明しているがん患者またはがん患者群におけるあらゆる種類の治療の前に検出されたCSTF2遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。本発明の文脈において、がんは肺癌である。疾患状態が判明している患者群におけるCSTF2遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±2S.D.または平均値±3S.D.の範囲を基準値として用いることができる。
対照レベルは、疾患状態(予後良好または予後不良)が判明しているがん患者(対照または対照群)から、あらゆる種類の治療前に予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。
あるいは、対照レベルは、対照群から予め採取し保存しておいた試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。
さらに、本発明の1つの局面に従って、生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することができる。患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。
本発明に従って、CSTF2遺伝子の発現レベルが予後良好対照レベルに類似していることにより、患者の予後がより好ましいことが示され、該発現レベルが予後良好対照レベルまで上昇していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および/または臨床転帰に関する予後がより好ましくなく不良であることが示される。一方、CSTF2の発現レベルが予後不良対照レベルまで低下していることにより、患者の予後がより好ましいことが示され、該発現レベルが予後不良対照レベルと類似していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および/または臨床転帰に関する予後がより好ましくなく不良であることが示される。例えば、治療後に癌の良好なまたは不良な予後を示した対象から採取された肺癌細胞は、それぞれ予後良好対照レベルまたは予後不良対照レベルの好ましい生物学的試料である。
生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルは、該発現レベルが対照レベルと1.0倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10.0倍、またはそれ以上異なる場合に、変化したと見なすことができる。
試験生物学的試料と対照レベルとの間の発現レベルの差は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。例えば、がん性細胞と非がん性細胞との間で発現レベルが相違しないことが既知であるポリヌクレオチド、例えばβ−アクチン、グリセルアルデヒド3−リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質P1をコードするポリヌクレオチドを用いて、CSTF2遺伝子の発現レベルを正規化することができる。
当技術分野で周知の技術を用いて患者由来の生物学的試料中の遺伝子転写物を検出することによって、発現レベルを測定することができる。本発明の方法によって検出される遺伝子転写物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばmRNAおよびタンパク質が含まれる。
例えば、CSTF2遺伝子の転写産物は、該遺伝子転写物に対するCSTF2遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析により、検出することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。CSTF2遺伝子の発現レベルを検出するために、アレイの使用が好ましい。別の例として、例えばCSTF2遺伝子に特異的なプライマーを用いる、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)といった増幅に基づく検出法を、該検出に使用することができる(実施例を参照されたい)。CSTF2遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーは、CSTF2遺伝子の全配列(SEQ ID NO:1)を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製することができる。例えば、実施例で用いられるプライマー(SEQ ID NO:3および4)を、RT−PCRによる検出に使用してもよいが、本発明はそれらに限定されるわけではない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、CSTF2遺伝子のmRNAとハイブリダイズする。
あるいは、本発明の評価のために翻訳産物を検出することができる。例えば、CSTF2タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、CSTF2タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がCSTF2タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)を検出に用いてもよい。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製することができる。
CSTF2遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、CSTF2タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強力な染色の観察により、CSTF2タンパク質の存在の増加、およびそれと同時にCSTF2遺伝子の高発現レベルが示される。
さらに、CSTF2タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、そのような細胞増殖活性を指標として用いて、CSTF2遺伝子の発現レベルを測定することができる。例えば、CSTF2を発現する細胞を調製し、生物学的試料の存在下で培養した後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。
さらに、評価の精度を向上させるために、CSTF2遺伝子の発現レベルに加えて、その他の肺癌関連遺伝子、例えば肺癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。そのような他の肺細胞関連遺伝子の例には、本明細書においてその全文が参照により組み入れられている国際公開公報第2004/031413号および国際公開公報第2005/090603号に記載のものが含まれる。
あるいは、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果もまた提供され得る。そのような中間結果は、医師、看護師、または他の実務者が対象の予後を評価、判定、または推定するのを補助することができる。予後を評価するために、本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮され得るさらなる情報には、対象の臨床症状および身体状態が含まれる。
言い換えれば、CSTF2遺伝子の発現レベルは、肺癌(例えば、NSCLC)に罹患している対象の予後を評価、予測、または判定するのに有用な予後マーカーである。したがって本発明はまた、NSCLCを含む肺癌に罹患している対象の予後を評価、予測、または判定するために予後マーカーを検出するための方法も提供し、該方法は、
a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出または測定する段階、および
b)段階a)において検出または測定された発現レベルを該対象の予後と関連付ける段階
を含む。
詳細には、本発明によると、対照レベルに対する発現レベルの上昇は、予後不良(低い生存率)の可能性または疑いを示す。
a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出または測定する段階、および
b)段階a)において検出または測定された発現レベルを該対象の予後と関連付ける段階
を含む。
詳細には、本発明によると、対照レベルに対する発現レベルの上昇は、予後不良(低い生存率)の可能性または疑いを示す。
本方法に従いがんの予後について評価を受ける患者は、好ましくは哺乳動物であり、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
あるいは、本発明は、がんの予後を評価するための試薬を調製するための試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、該試薬は、
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)CSTF2を検出するための試薬;および
(c)CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択される。
具体的には、そのような試薬は、CSTF2ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはCSTF2ポリペプチドに結合する抗体である。
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)CSTF2を検出するための試薬;および
(c)CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択される。
具体的には、そのような試薬は、CSTF2ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはCSTF2ポリペプチドに結合する抗体である。
がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキット:
本発明は、がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキットを提供する。あるいは本発明は、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターで治療可能ながんに罹患している対象を判定するためのキットも提供し、これはまた、がん治療の有効性を評価および/またはモニタリングするのにも有用であり得る。好ましい態様において、がんは肺癌である。具体的には、本キットは、患者由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現を検出するための少なくとも1つの物質または試薬を含み、該物質は以下の群より選択され得る:
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための物質または試薬;
(b)CSTF2タンパク質を検出するための物質または試薬;および
(c)CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための物質または試薬。
CSTF2遺伝子のmRNAを検出するのに適した物質または試薬には、CSTF2 mRNAに特異的に結合するか、または該mRNAを同定する核酸、例えばCSTF2 mRNAの一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、CSTF2 mRNAに特異的であるプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、CSTF2 mRNAを検出するための物質または試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、CSTF2 mRNAを検出するための2つ以上の物質または試薬をキットに含めることもできる。
本発明は、がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキットを提供する。あるいは本発明は、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターで治療可能ながんに罹患している対象を判定するためのキットも提供し、これはまた、がん治療の有効性を評価および/またはモニタリングするのにも有用であり得る。好ましい態様において、がんは肺癌である。具体的には、本キットは、患者由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現を検出するための少なくとも1つの物質または試薬を含み、該物質は以下の群より選択され得る:
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための物質または試薬;
(b)CSTF2タンパク質を検出するための物質または試薬;および
(c)CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための物質または試薬。
CSTF2遺伝子のmRNAを検出するのに適した物質または試薬には、CSTF2 mRNAに特異的に結合するか、または該mRNAを同定する核酸、例えばCSTF2 mRNAの一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、CSTF2 mRNAに特異的であるプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、CSTF2 mRNAを検出するための物質または試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、CSTF2 mRNAを検出するための2つ以上の物質または試薬をキットに含めることもできる。
プローブまたはプライマーは、特定のサイズのものであってよい。サイズは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチドからなる群より選択され、プローブおよびプライマーは5〜10ヌクレオチド、10〜15ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、および25〜30ヌクレオチドのサイズ範囲であってよい。
一方、CSTF2タンパク質を検出するのに適した物質または試薬には、CSTF2タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がCSTF2タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)を物質または試薬として用いてもよい。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。さらに、直接連結または間接標識技術により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識および、抗体を標識してその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、CSTF2タンパク質を検出するための2つ以上の物質または試薬をキットに含めることもできる。
さらに、例えば、生物学的試料中の発現したCSTF2タンパク質による細胞増殖活性を測定することにより、生物学的活性を測定することができる。例えば、患者由来の生物学的試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。必要に応じて、CSTF2 mRNAを検出するための物質または試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、CSTF2タンパク質の生物学的活性を検出するための2つ以上の物質をキットに含めてもよい。
キットは、前述の物質または試薬のうちの2つ以上を含んでもよい。さらに、キットは、CSTF2遺伝子に対するプローブまたはCSTF2タンパク質に対する抗体を結合させるための固体基質および物質、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照物質または試薬、ならびにCSTF2タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、予後良好または予後不良である患者から採取された組織試料は、有用な対照物質または試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書(例えば、文書、テープ、CD−ROM等)を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの物質または試薬等は、ラベルを貼った容器内に含まれ得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
本発明の1つの態様として、物質または試薬がCSTF2 mRNAに対するプローブである場合には、該物質または試薬を、多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも1つの検出部位を形成させてもよい。多孔性ストリップの測定領域または検出領域には、核酸(プローブ)をそれぞれ含む複数の部位が含まれ得る。検査ストリップはまた、陰性および/または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第1検出部位ではより大量、以降の部位ではより少量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するCSTF2 mRNAの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットは、陽性対照試料またはCSTF2標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、CSTF2陽性血液試料を回収することによって調製することができ、次にそれらのCSTF2レベルを分析する。あるいは、精製されたCSTF2のタンパク質またはポリヌクレオチドを、CSTF2を含まない血清に添加して、陽性試料すなわちCSTF2標準物質を形成してもよい。
抗肺癌物質のスクリーニング
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される物質は、任意の物質、または複数の物質を含む組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の物質であってもよく、物質の組み合わせであってもよい。本方法において物質の組み合わせを使用する場合、該物質を連続的にまたは同時に接触させることができる。
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される物質は、任意の物質、または複数の物質を含む組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の物質であってもよく、物質の組み合わせであってもよい。本方法において物質の組み合わせを使用する場合、該物質を連続的にまたは同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド物質、合成微小分子物質(アンチセンスRNA、siRNA、リボザイム、およびアプタマー等の核酸構築物を含む)、および天然物質を使用することができる。本発明の試験物質は、(1)生物学的ライブラリ法、(2)空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、(3)逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、(4)「一ビーズ一物質」ライブラリ法、および(5)アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の4つのアプローチは物質のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67)。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51)。物質のライブラリは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい)、または、ビーズ(Lam, Nature 1991, 354: 82-4)、チップ(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9)、もしくはファージ(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第2002103360号)の表面に提供され得る。
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた物質の構造の一部が付加、欠失、および/または置換により変換された物質は、本発明のスクリーニング法により得られる物質に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験物質がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするDNAを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴDNAをプローブとして調製し、該プローブを用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするDNAを得ることができる。得られたDNAは、がんを治療または予防するための候補である試験物質の調製におけるその有用性を確認される。
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤とは、CSTF2タンパク質または元のタンパク質の生物学的活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する抗体でもあり得る。
試験剤ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下の本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験物質の同定およびそのような物質のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
本発明において、CSTF2の発現レベルおよび/または生物学的活性の抑制ががん細胞の増殖の抑制をもたらすことが明らかとなる。したがって、物質がCSTF2の発現および/または活性を抑制する場合、該抑制は対象における潜在的治療効果を示す。本発明において、潜在的治療効果とは、合理的に予想される臨床的利点を指す。本発明において、そのような臨床的利点には、
(a)CSTF2遺伝子の発現の低下、
(b)対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下、
(c)がんの形成の妨害、または
(d)がんの臨床症状の妨害もしくは緩和
が含まれる。
(a)CSTF2遺伝子の発現の低下、
(b)対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下、
(c)がんの形成の妨害、または
(d)がんの臨床症状の妨害もしくは緩和
が含まれる。
(i)分子モデリング:
試験剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である物質の分子構造、および/または、CSTF2の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤とその標的の間の相互作用のコンピュータモデリングである。
試験剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である物質の分子構造、および/または、CSTF2の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤とその標的の間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな物質の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のX線結晶解析またはNMRイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな物質が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該物質および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−物質間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型(computationally intensive)コンピュータが必要である。
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、CHARMmプログラムおよびQUANTAプログラム(Polygen Corporation,Waltham,Mass)が含まれる。CHARMmは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。QUANTAは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。QUANTAにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.(Pasadena,Calif.)、Allelix, Inc(Mississauga,Ontario,Canada)、およびHypercube, Inc.(Cambridge,Ontario)等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターすなわち「試験物質」のライブラリを、肺癌を治療または予防する試験剤を同定するための本発明の方法を用いて、スクリーニングしてもよい。
(ii)コンビナトリアル化学合成:
試験物質のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが6アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは6アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
試験物質のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが6アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは6アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成することができる。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ(例えば米国特許第5,010,175号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい)が非限定的に含まれる。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド(例えば国際公開公報第91/19735号)、コード化ペプチド(例えば国際公開公報第93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(random bio-oligomer)(例えば国際公開公報第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(例えば米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー(diversomer)(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13)、ビニローグ(vinylogous)ポリペプチド(Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568)、グルコース骨格を有する非ペプチド性(nonpeptidal)ペプチド模倣体(Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8)、低分子化合物ライブラリの類似有機合成(Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661)、オリゴカルバメート(oligocarbamate)(Cho et al., Science 1993, 261: 1303)、および/またはペプチジルホスホネート(peptidylphosphonate)(Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658)、核酸ライブラリ(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリ(例えば米国特許第5,539,083号を参照されたい)、抗体ライブラリ(例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願PCT/US96/10287号を参照されたい)、糖質ライブラリ(例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第5,593,853号を参照されたい)、ならびに有機低分子ライブラリ(例えば、ベンゾジアゼピン(Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.)、イソプレノイド(米国特許第5,569,588号)、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン(metathiazanone)(米国特許第5,549,974号)、ピロリジン(米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号)、モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337号)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)等を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は市販されている(例えば、357 MPS,390 MPS,Advanced Chem Tech,Louisville KY、Symphony,Rainin,Woburn,MA、433A Applied Biosystems,Foster City,CA、9050 Plus,Millipore,Bedford,MAを参照されたい)。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリがそれ自体で市販されている(例えば、ComGenex、Princeton,N.J.、Tripos,Inc.、St.Louis,MO、3D Pharmaceuticals、Exton,PA、Martek Biosciences、Columbia,MD等を参照されたい)。
(iii)その他の候補:
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、およびFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号)、およびRutter et al.(米国特許第5,010,175号)は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、およびFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号)、およびRutter et al.(米国特許第5,010,175号)は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
アプタマーは、特定の分子標的に強く結合する核酸からなる巨大分子である。TuerkおよびGold(Science. 249: 505-510 (1990))は、アプタマー選択のためのSELEX(指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化)法を開示している。SELEX法では、核酸分子の大きなライブラリ{例えば、1015個の異なる分子)をスクリーニングに使用することができる。
CSTF2結合物質のスクリーニング
本発明において、正常器官ではCSTF2遺伝子は発現しないにもかかわらず、肺癌においてCSTF2遺伝子の過剰発現が検出された(図1および2)。さらに、CSTF2遺伝子に対するsiRNAによるCSTF2遺伝子発現の抑制によって、がん細胞増殖の抑制が誘導された(図3)。これらの結果から、CSTF2遺伝子はがん細胞において重要な役割を果たすことが示される。したがって、CSTF2遺伝子、該遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて、本発明は、CSTF2ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。肺癌におけるCSTF2遺伝子の発現のために、CSTF2ポリペプチドに結合する物質は肺癌細胞の増殖を抑制すると予測され、かつしたがって、肺癌を治療または予防するために有用である。したがって本発明はまた、CSTF2ポリペプチドを用いた、肺癌細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、および肺癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。具体的には、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする本発明の方法の1つの態様において、該方法は、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階;
(b)該ポリペプチドまたはその断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階;および
(c)該ポリペプチドまたは断片に結合する試験物質を、がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階
を含む。
本発明において、正常器官ではCSTF2遺伝子は発現しないにもかかわらず、肺癌においてCSTF2遺伝子の過剰発現が検出された(図1および2)。さらに、CSTF2遺伝子に対するsiRNAによるCSTF2遺伝子発現の抑制によって、がん細胞増殖の抑制が誘導された(図3)。これらの結果から、CSTF2遺伝子はがん細胞において重要な役割を果たすことが示される。したがって、CSTF2遺伝子、該遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて、本発明は、CSTF2ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。肺癌におけるCSTF2遺伝子の発現のために、CSTF2ポリペプチドに結合する物質は肺癌細胞の増殖を抑制すると予測され、かつしたがって、肺癌を治療または予防するために有用である。したがって本発明はまた、CSTF2ポリペプチドを用いた、肺癌細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、および肺癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。具体的には、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする本発明の方法の1つの態様において、該方法は、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階;
(b)該ポリペプチドまたはその断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階;および
(c)該ポリペプチドまたは断片に結合する試験物質を、がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階
を含む。
別の態様において、本発明はまた、CSTF2ポリペプチドまたはその断片を用いて、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階;および
(b)段階(a)の、該ポリペプチドまたはその断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階、および
(c)(b)の結合活性を該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含む。
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階;および
(b)段階(a)の、該ポリペプチドまたはその断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階、および
(c)(b)の結合活性を該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含む。
あるいは、本発明に従って、がんの治療または予防に対する試験物質または化合物の潜在的治療効果を評価または推定することもできる。いくつかの態様において、本発明は、CSTF2の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防に対するまたは該がんの阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
(a)試験物質を、CSTF2のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b)該ポリペプチドと該試験物質との間の結合活性を検出する段階;および
(c)物質が該ポリペプチドに結合する場合に示される潜在的治療効果と該物質とを関連付ける段階
を含む。
(a)試験物質を、CSTF2のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b)該ポリペプチドと該試験物質との間の結合活性を検出する段階;および
(c)物質が該ポリペプチドに結合する場合に示される潜在的治療効果と該物質とを関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、CSTF2ポリペプチドまたはその機能的断片の結合活性と相関し得る。例えば、試験物質がCSTF2ポリペプチドまたはその機能的断片に結合する場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質がCSTF2ポリペプチドおよびその機能的断片に結合しない場合には、該試験剤または化合物を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
スクリーニングのために使用されるCSTF2ポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験物質と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
スクリーニングのために使用されるCSTF2ポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験物質と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
例えば、CSTF2ポリペプチドを用いてCSTF2ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって、特に以下の様式で実施することができる。CSTF2ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばpSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGSおよびpCD8に挿入することによって、該遺伝子を宿主(例えば、動物)細胞等において発現させる。
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby in Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))、EF−αプロモーター(Kim et al., Gene 91: 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108: 193(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988))、CMV前初期プロモーター(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987))、SV40後期プロモーター(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989))、HSV TKプロモーター等が含まれる。
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法(Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987))、リン酸カルシウム法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987))、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984))、リポフェクチン法(Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993))等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を該ポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってCSTF2ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜12アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。エピトープ、例えばポリヒスチジン(Hisタグ)、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc−myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSVタグ)、Eタグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)等、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、CSTF2ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、CSTF2ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、CSTF2ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもでき、該抗体は上述のように調製することができる。抗体がマウスIgG抗体である場合、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドを、GSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、CSTF2ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース4Bを用いて形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
SDS−PAGEは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。CSTF2ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、35S−メチオニンまたは35S−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
CSTF2ポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット解析(Skolnik et al., Cell 65: 83-90(1991))を使用することができる。具体的には、ファージベクター(例えばZAP)を用いて、CSTF2ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞(例えばLC176、LC319、A549、NCI−H23、NCI−H226、NCI−H522、PC3、PC9、PC14、SK−LU−1、EBC−1、RERF−LC−AI、SK−MES−1、SW900、およびSW1573)からcDNAライブラリを調製する段階、LB−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したCSTF2ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、CSTF2ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、CSTF2ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはCSTF2と特異的に結合する抗体、またはCSTF2ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド(例えばGST)を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい(「MATCHMAKER Two−Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two−Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one−Hybrid system」(Clontech)、「HybriZAP Two−Hybrid Vector System」(Stratagene)、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92(1994)」を参照されたい)。
ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドを、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらVP16またはGAL4の転写活性化領域と融合するように、cDNAライブラリを調製する。次に、該cDNAライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン(本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる)から、該ライブラリに由来するcDNAを単離する。上記で単離されたcDNAを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該cDNAによってコードされたタンパク質を調製することができる。HIS3遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する物質を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングしてもよい。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、本発明のポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験物質を該カラムにアプライする。本明細書における試験物質は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験物質をロードした後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した物質を調製することができる。試験物質がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴDNAを合成し、プローブとして該オリゴDNAを用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするDNAを得る。
本発明において結合した物質を検出または定量するための手段として、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサを使用することができる。そのようなバイオセンサを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験物質との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えばBIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreなどのバイオセンサを用いて、本発明のポリペプチドと試験物質との結合を評価することが可能である。
CSTF2タンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)も単離するための、固定化されたCSTF2ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法(Wrighton et al., Science 273: 458-64(1996)、Verdine, Nature 384: 11-13(1996)、Hogan, Nature 384: 17-9(1996))は、当業者に既知である。
天然のCSTF2ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を保持している限り、CSTF2ポリペプチドに加えて該ポリペプチドの断片を、本発明のスクリーニングに用いることができる。
ポリペプチドおよび断片がそれらの生物学的活性の少なくとも1つを保持する限り、該ポリペプチドまたはその断片を他の物質にさらに連結させてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。これらの種類の修飾を行って、付加的な機能を付与すること、または該ポリペプチドおよび断片を安定化することができる。
本発明の方法に用いられるポリペプチドまたは断片は、従来の精製法により天然タンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づいて化学合成により、得ることができる。例えば、合成のために採用できる従来のペプチド合成法には、以下が含まれる:
1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
3)ペプチド合成,丸善,1975;
4)ペプチド合成の基礎と実験,丸善,1985;
5)医薬品の開発(続 第14巻)ペプチド合成,広川書店,1991;
6)国際公開公報第99/67288号;および
7)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
3)ペプチド合成,丸善,1975;
4)ペプチド合成の基礎と実験,丸善,1985;
5)医薬品の開発(続 第14巻)ペプチド合成,広川書店,1991;
6)国際公開公報第99/67288号;および
7)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
あるいは、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を通じて、前記タンパク質を得ることができる(例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62)。例えば、最初に、目的タンパク質を発現可能な形態で(例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に)コードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換し、次に該宿主細胞を培養して、該タンパク質を産生させる。より具体的には、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、またはpCD8などの、外来遺伝子を発現させるためのベクターに、CSTF2ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入することにより、該遺伝子を宿主(例えば、動物)細胞等で発現させる。発現用に、プロモーターを用いることができる。例えばSV40初期プロモーター(Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141)、EF−αプロモーター(Kim et al., Gene 1990, 91:217-23)、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 1991, 108:193)、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704)、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466)、CMV最初期プロモーター(Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9)、SV40後期プロモーター(Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94)、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946)、HSV TKプロモーター等を含む、一般的に用いられている任意のプロモーターを使用することができる。CSTF2遺伝子を発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法(Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26)、リン酸カルシウム法(Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52)、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17;Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3)、Lipofectin法(Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37;Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30;Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4)等に従って行うことができる。
インビトロ翻訳系を採用して、CSTF2タンパク質をインビトロで作製することもできる。
試験物質と接触させるCSTF2ポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってよい。
本発明において、CSTF2遺伝子の発現を抑制することにより細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ポリペプチドCSTF2に結合する候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質または剤ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療物質を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
試験物質と接触させるCSTF2ポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってよい。
本発明において、CSTF2遺伝子の発現を抑制することにより細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ポリペプチドCSTF2に結合する候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質または剤ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療物質を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
CSTF2の生物学的活性を抑制する物質のスクリーニング
本発明は、がん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングするための方法、および肺癌を含むがんを治療または予防するための物質をスクリーニングするための方法を提供する。したがって本発明は、CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための物質をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
(c)試験物質の非存在下で検出されたCSTF2ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階
を含む。
本発明は、がん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングするための方法、および肺癌を含むがんを治療または予防するための物質をスクリーニングするための方法を提供する。したがって本発明は、CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための物質をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
(c)試験物質の非存在下で検出されたCSTF2ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階
を含む。
別の態様において、本発明はまた、CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドと接触させる段階;および
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階、および
(c)(b)の生物学的活性を該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含む。
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドと接触させる段階;および
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階、および
(c)(b)の生物学的活性を該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含む。
あるいは、いくつかの態様において、本発明は、CSTF2の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防に対するまたは該がんの阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
(c)試験物質の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該試験物質がCSTF2遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する場合に示される潜在的治療効果を、該試験物質と関連付ける段階
を含む。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
(c)試験物質の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該試験物質がCSTF2遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する場合に示される潜在的治療効果を、該試験物質と関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、CSTF2ポリペプチドの生物学的活性と相関し得る。例えば、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、CSTF2ポリペプチドの生物学的活性を抑制または阻害する場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、CSTF2ポリペプチドの生物学的活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
CSTF2タンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。このような生物学的活性には、CSTF2タンパク質の細胞増殖活性、RNA結合活性、mRNA切断活性、およびmRNAポリアデニル化活性が含まれる。例えば、CSTF2タンパク質を用いることができ、CSTF2タンパク質と機能的に同等のポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。
CSTF2タンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。このような生物学的活性には、CSTF2タンパク質の細胞増殖活性、RNA結合活性、mRNA切断活性、およびmRNAポリアデニル化活性が含まれる。例えば、CSTF2タンパク質を用いることができ、CSTF2タンパク質と機能的に同等のポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。
このスクリーニングにより単離された物質は、CSTF2遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、CSTF2をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された物質は、CSTF2ポリペプチドと分子(DNA、RNA、およびタンパク質を含む)のインビボ相互作用を阻害する物質の候補である。
本発明の方法において検出される生物学的活性が細胞増殖である場合、これは、例えば、CSTF2ポリペプチドを発現する細胞を調製し、その細胞を試験物質の存在下で培養し、細胞増殖の速度を決定すること、および細胞周期を測定すること等によって、ならびに、例えば図3または4に示す、生存細胞数またはコロニー形成活性を測定することによって、検出することができる。CSTF2を発現した細胞の増殖速度を低下させる物質は、肺癌を含むがんを治療または予防するための候補物質として選択される。
本発明において、CSTF2遺伝子の発現の抑制によって、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、CSTF2ポリペプチドの生物学的活性を低下させる候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療物質を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
より具体的には、本方法は、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を過剰発現する細胞と接触させる段階;
(b)細胞増殖活性を測定する段階;および
(c)試験物質の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験物質を選択する段階
を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は、
(d)CSTF2を全くまたはほとんど発現しない細胞に対する影響を有さない試験物質を選択する段階
をさらに含んでもよい。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を過剰発現する細胞と接触させる段階;
(b)細胞増殖活性を測定する段階;および
(c)試験物質の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験物質を選択する段階
を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は、
(d)CSTF2を全くまたはほとんど発現しない細胞に対する影響を有さない試験物質を選択する段階
をさらに含んでもよい。
本明細書において定義される「生物学的活性を抑制する」とは、物質の非存在下と比較した、CSTF2の生物学的活性の好ましくは少なくとも10%の抑制、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%の抑制、および最も好ましくは90%の抑制である。
好ましい態様では、CSTF2ポリペプチドを発現しない対照細胞が用いられる。したがって本発明はまた、CSTF2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質、またはCSTF2関連疾患を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
(a)試験物質の存在下で、CSTF2ポリペプチドまたはその機能的断片を発現する細胞、ならびにCSTF2ポリペプチドおよびその機能的断片を発現しない対照細胞を培養する段階;
(b)該タンパク質を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階;ならびに
(c)対照細胞でおよび試験物質の非存在下で検出された増殖と比較して、該タンパク質を発現する細胞において生物学的活性を阻害する試験物質を選択する段階
を含む。
(a)試験物質の存在下で、CSTF2ポリペプチドまたはその機能的断片を発現する細胞、ならびにCSTF2ポリペプチドおよびその機能的断片を発現しない対照細胞を培養する段階;
(b)該タンパク質を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階;ならびに
(c)対照細胞でおよび試験物質の非存在下で検出された増殖と比較して、該タンパク質を発現する細胞において生物学的活性を阻害する試験物質を選択する段階
を含む。
いくつかの態様では、本発明のスクリーニング法において検出されるCSTF2ポリペプチドの生物学的活性として、RNA結合活性、mRNA切断活性、またはmRNAポリアデニル化活性を用いることができる。これらの活性を検出するための方法は、当技術分野で周知である。スクリーニングにおいてそのような活性のいずれか1つを検出する場合には、CSTF2ポリペプチドのRNA認識モチーフを含むポリペプチドが、CSTF2ポリペプチドの機能的同等物として好ましく用いられ得る。例えば、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するCSTF2ポリペプチドのRNA認識モチーフは、SEQ ID NO:2のアミノ酸17〜90からなる領域である。
CSTF2の発現を変更する物質のスクリーニング
本発明は、CSTF2遺伝子の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。CSTF2遺伝子の発現を阻害する物質は、肺癌細胞の増殖を抑制すると予測され、よって肺癌を治療または予防するのに有用である。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、および肺癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、CSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階
を含み得る。
本発明は、CSTF2遺伝子の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。CSTF2遺伝子の発現を阻害する物質は、肺癌細胞の増殖を抑制すると予測され、よって肺癌を治療または予防するのに有用である。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、および肺癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、CSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階
を含み得る。
別の態様において、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、およびCSTF2関連疾患を治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)(b)の発現レベルを該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含み得る。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;
(b)CSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)(b)の発現レベルを該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含み得る。
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、CSTF2の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防に対するまたは該がんの阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供し、該方法は、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;および;
(b)試験物質が対照と比較してCSTF2の発現レベルを低下させる場合に示される潜在的治療効果と、該試験物質とを関連付ける段階
を含む。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;および;
(b)試験物質が対照と比較してCSTF2の発現レベルを低下させる場合に示される潜在的治療効果と、該試験物質とを関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、CSTF2遺伝子の発現レベルと相関し得る。例えば、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較してCSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較してCSTF2遺伝子の発現レベルを低下させない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
本発明の方法を以下により詳細に説明する。
CSTF2遺伝子を発現する細胞には、例えば肺癌から樹立された細胞株が含まれる;そのような細胞を、本発明の上記スクリーニングに用いることができる(例えば、A427、A549、LC319、PC14、PC3、PC9、NCI−H1373、NCI−H1781、NCI−H358、NCI−H226、NCI−H520、NCI−H1703、NCI−H2170、EBC−1、RERF−LC−AI、LX1、DMS114、DMS273、SBC−3、SBC−5、NCI−H196、NCI−H446、SK−MES−1、LU61)。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばRT−PCR、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」とは、物質の非存在下における発現レベルと比較した、CSTF2遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも10%の低下、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%のレベル低下、および最も好ましくは95%のレベル低下である。本明細書における物質には、化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法においては、CSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる物質を、肺癌の治療または予防に用いられる候補物質として選択することができる。
CSTF2遺伝子を発現する細胞には、例えば肺癌から樹立された細胞株が含まれる;そのような細胞を、本発明の上記スクリーニングに用いることができる(例えば、A427、A549、LC319、PC14、PC3、PC9、NCI−H1373、NCI−H1781、NCI−H358、NCI−H226、NCI−H520、NCI−H1703、NCI−H2170、EBC−1、RERF−LC−AI、LX1、DMS114、DMS273、SBC−3、SBC−5、NCI−H196、NCI−H446、SK−MES−1、LU61)。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばRT−PCR、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」とは、物質の非存在下における発現レベルと比較した、CSTF2遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも10%の低下、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%のレベル低下、および最も好ましくは95%のレベル低下である。本明細書における物質には、化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法においては、CSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる物質を、肺癌の治療または予防に用いられる候補物質として選択することができる。
本発明において、CSTF2遺伝子発現の抑制によって、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、CSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療物質を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;ならびに
(c)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる該試験物質を選択する段階
を含み得る。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;ならびに
(c)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる該試験物質を選択する段階
を含み得る。
別の態様において、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングする方法、ならびにCSTF2関連疾患を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する。
別の局面によると、本発明は、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階;ならびに
(c)(b)の発現レベルを該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階;ならびに
(c)(b)の発現レベルを該試験物質の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。
あるいは一部の態様において、本発明はまた、CSTF2の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防または該がんの阻害における試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;ならびに
(c)潜在的治療効果と該試験物質とを関連付ける段階であって、試験物質が該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合に該潜在的治療効果が示される、段階
を含む。
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;ならびに
(c)潜在的治療効果と該試験物質とを関連付ける段階であって、試験物質が該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合に該潜在的治療効果が示される、段階
を含む。
本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、物質が、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質(DsRed)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、lacZ、およびβ−グルクロニダーゼ(GUS)であり、宿主細胞はCOS7、HEK293、HeLa等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をCSTF2遺伝子の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるCSTF2の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも500bp上流まで、好ましくは1,000bpまで、より好ましくは5000または10,000bp上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、またはPCRによって増幅することができる。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を該遺伝子のいずれか一つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により(例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて)検出する。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、物質の非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の、好ましくは少なくとも10%の低下、より好ましくは少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも75%の低下、最も好ましくは95%の低下である。
本発明において、CSTF2遺伝子の発現を抑制することにより、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療物質を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
以下の実施例において本発明の局面を説明するが、これは添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
特記しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
特記しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
材料および方法
細胞株および組織試料。
本実施例で用いた15種のヒト肺癌細胞株は、腺癌5種(NCI−H1781、NCI−H1373、LC319、A549、およびPC−14)、扁平上皮癌5種(SK−MES−1、NCI−H520、NCI−H1703、NCI−H2170、およびLU61)、大細胞癌1種(LX1)、および小細胞肺癌4種(SBC−3、SBC−5、DMS114、およびDMS273)を含んだ。細胞はすべて、10%FCSを補充した適切な培地中で単層で増殖させ、5%CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で維持した。正常対照として使用したヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)は、最適化培地(Cambrex Bioscience, Inc)中で増殖させた。腫瘍切除の前に抗がん治療を全く受けていない患者由来の原発性NSCLC組織試料および切除縁部に隣接するそれらの対応する正常組織は、インフォームドコンセントを得て先に入手していた(Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003; 22:2192-205、Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 29: 567-75、Kato T, Daigo Y, Hayama S, et al. Cancer Res 2005; 65:5638-46)。腫瘍はすべて、国際対癌連合(International Union Against Cancer)のpathologic tumor−node−metastasis分類に基づいて病期分類した(表1;Sobin L, Wittekind CH. TNM classification of malignant tumours. 6th ed. New York: Wiley-Liss; 2002)。組織マイクロアレイにおける免疫染色に使用したホルマリン固定原発性肺腫瘍および隣接正常肺組織試料は、埼玉県立がんセンターにおいて手術を受けた327名の患者(腺癌196例、扁平上皮癌98例、大細胞癌23例、および腺扁平上皮癌10例;女性患者99名および男性患者228名;29〜85歳の範囲で年齢中央値は64.7歳)から入手していた。原発性癌を切除されたこれらの患者は、いかなる手術前の治療も受けておらず、その中で、リンパ節転移が陽性の患者だけは、術後に白金に基づく補助化学療法による治療を受けた。本研究および言及したすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
細胞株および組織試料。
本実施例で用いた15種のヒト肺癌細胞株は、腺癌5種(NCI−H1781、NCI−H1373、LC319、A549、およびPC−14)、扁平上皮癌5種(SK−MES−1、NCI−H520、NCI−H1703、NCI−H2170、およびLU61)、大細胞癌1種(LX1)、および小細胞肺癌4種(SBC−3、SBC−5、DMS114、およびDMS273)を含んだ。細胞はすべて、10%FCSを補充した適切な培地中で単層で増殖させ、5%CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で維持した。正常対照として使用したヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)は、最適化培地(Cambrex Bioscience, Inc)中で増殖させた。腫瘍切除の前に抗がん治療を全く受けていない患者由来の原発性NSCLC組織試料および切除縁部に隣接するそれらの対応する正常組織は、インフォームドコンセントを得て先に入手していた(Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003; 22:2192-205、Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 29: 567-75、Kato T, Daigo Y, Hayama S, et al. Cancer Res 2005; 65:5638-46)。腫瘍はすべて、国際対癌連合(International Union Against Cancer)のpathologic tumor−node−metastasis分類に基づいて病期分類した(表1;Sobin L, Wittekind CH. TNM classification of malignant tumours. 6th ed. New York: Wiley-Liss; 2002)。組織マイクロアレイにおける免疫染色に使用したホルマリン固定原発性肺腫瘍および隣接正常肺組織試料は、埼玉県立がんセンターにおいて手術を受けた327名の患者(腺癌196例、扁平上皮癌98例、大細胞癌23例、および腺扁平上皮癌10例;女性患者99名および男性患者228名;29〜85歳の範囲で年齢中央値は64.7歳)から入手していた。原発性癌を切除されたこれらの患者は、いかなる手術前の治療も受けておらず、その中で、リンパ節転移が陽性の患者だけは、術後に白金に基づく補助化学療法による治療を受けた。本研究および言及したすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
半定量的逆転写PCR。
各試料からの合計3μgのmRNAアリコートを、ランダムプライマー(Roche Diagnostics)およびSuperScript II(Invitrogen)を用いて一本鎖cDNAに逆転写した。ヒトCSTF2(Genアクセッション番号NM_001325)に特異的な合成プライマーの以下のセットを用いて、または内部対照としてのβ−アクチン(ACTB)特異的プライマーを用いて、半定量的逆転写PCR(RT−PCR)実験を行った:
CSTF2、5'−GTCATGCAGGGAACAGGAAT−3'(SEQ ID NO:3)および5'−TGAGTCATTCAAGGGTTAGGATG−3'(SEQ ID NO:4);
ACTB、5'−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3'(SEQ ID NO:5)および5'−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3'(SEQ ID NO:6)。PCR反応は、産物強度が増幅の直線位相の範囲内に確実に入るように、サイクル数を最適化した。
各試料からの合計3μgのmRNAアリコートを、ランダムプライマー(Roche Diagnostics)およびSuperScript II(Invitrogen)を用いて一本鎖cDNAに逆転写した。ヒトCSTF2(Genアクセッション番号NM_001325)に特異的な合成プライマーの以下のセットを用いて、または内部対照としてのβ−アクチン(ACTB)特異的プライマーを用いて、半定量的逆転写PCR(RT−PCR)実験を行った:
CSTF2、5'−GTCATGCAGGGAACAGGAAT−3'(SEQ ID NO:3)および5'−TGAGTCATTCAAGGGTTAGGATG−3'(SEQ ID NO:4);
ACTB、5'−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3'(SEQ ID NO:5)および5'−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3'(SEQ ID NO:6)。PCR反応は、産物強度が増幅の直線位相の範囲内に確実に入るように、サイクル数を最適化した。
ノーザンブロット解析。
23種の組織にわたるヒト多組織ブロット(BD Biosciences)を、以下のプライマーを用いてプローブとして調製した、CSTF2の32P標識した521bpのPCR産物とハイブリダイズさせた:
5'−CGAGGCTTGTTAGGAGATGC−3'(SEQ ID NO:7)および5'−CCCCCATGTTAAGGACTG−3'(SEQ ID NO:8)。製造業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用いて、−80℃で14日間、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。
23種の組織にわたるヒト多組織ブロット(BD Biosciences)を、以下のプライマーを用いてプローブとして調製した、CSTF2の32P標識した521bpのPCR産物とハイブリダイズさせた:
5'−CGAGGCTTGTTAGGAGATGC−3'(SEQ ID NO:7)および5'−CCCCCATGTTAAGGACTG−3'(SEQ ID NO:8)。製造業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用いて、−80℃で14日間、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。
ウェスタンブロッティング。
腫瘍細胞を、溶解緩衝液;50mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl、0.5%NP40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテルセットIII(Calbiochem)中で溶解した。ウシ血清アルブミンを標準物質として用いて、Bio−Radタンパク質アッセイキットにより、各溶解物のタンパク質含有量を測定した。各溶解物10μgを7.5%〜12%変性ポリアクリルアミドゲル(3%ポリアクリルアミド濃縮ゲルを含む)上で分離し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare Biosciences)に電気泳動で転写した。TBST(Tween 20を含むTris緩衝生理食塩水)中の5%脱脂粉乳でブロッキングした後、膜をウサギポリクローナル抗体と共に室温で1時間インキュベーションした。市販のウサギ抗CSTF2ポリクローナル抗体はATLAS,Inc.から購入し、これは、肺癌細胞株の溶解物を用いるウェスタンブロット解析により、ヒトCSTF2に特異的であることが証明された。免疫反応性タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(GE Healthcare Bio−sciences)と共に室温で1時間インキュベーションした。TBSTで洗浄した後、高感度化学発光キット(GE Healthcare Bio−sciences)を用いて反応物を発色させた。
腫瘍細胞を、溶解緩衝液;50mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl、0.5%NP40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテルセットIII(Calbiochem)中で溶解した。ウシ血清アルブミンを標準物質として用いて、Bio−Radタンパク質アッセイキットにより、各溶解物のタンパク質含有量を測定した。各溶解物10μgを7.5%〜12%変性ポリアクリルアミドゲル(3%ポリアクリルアミド濃縮ゲルを含む)上で分離し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare Biosciences)に電気泳動で転写した。TBST(Tween 20を含むTris緩衝生理食塩水)中の5%脱脂粉乳でブロッキングした後、膜をウサギポリクローナル抗体と共に室温で1時間インキュベーションした。市販のウサギ抗CSTF2ポリクローナル抗体はATLAS,Inc.から購入し、これは、肺癌細胞株の溶解物を用いるウェスタンブロット解析により、ヒトCSTF2に特異的であることが証明された。免疫反応性タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(GE Healthcare Bio−sciences)と共に室温で1時間インキュベーションした。TBSTで洗浄した後、高感度化学発光キット(GE Healthcare Bio−sciences)を用いて反応物を発色させた。
免疫蛍光解析。
培養細胞をPBS(−)で2回洗浄し、4%ホルムアルデヒド溶液中で4℃で60分間固定し、0.1%Triton X−100を含むPBS(−)で5分間処理することにより透過性を付与した。一次抗体反応の前に、非特異的結合をブロッキングするため、細胞をCAS Block(Zymed)で10分間覆った。次に細胞を、ヒトCSTF2またはc−mycタグ付タンパク質に対する抗体と共にインキュベーションした。
培養細胞をPBS(−)で2回洗浄し、4%ホルムアルデヒド溶液中で4℃で60分間固定し、0.1%Triton X−100を含むPBS(−)で5分間処理することにより透過性を付与した。一次抗体反応の前に、非特異的結合をブロッキングするため、細胞をCAS Block(Zymed)で10分間覆った。次に細胞を、ヒトCSTF2またはc−mycタグ付タンパク質に対する抗体と共にインキュベーションした。
免疫組織化学および組織マイクロアレイ。
ホルマリン固定してパラフィンブロック中に包埋した臨床肺癌試料中のCSTF2タンパク質の臨床病理学的意義を調べるため、Envision+キット/西洋ワサビペルオキシダーゼ(DakoCytomation)を以下の様式で用いて、切片を染色した。抗原回復のために、スライドをTarget Retrieval Solution pH9(DakoCytomation)中に浸漬し、オートクレーブ中で108℃で15分間煮沸した。内在性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、ウサギ抗ヒトCSTF2ポリクローナル抗体(0.06μg/ml;ATLAS)を各スライドに添加し、切片を二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG[Histofine Simple Stain MAX PO (G)、Nichirei]と共にインキュベーションした。基質−色素原を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。
ホルマリン固定してパラフィンブロック中に包埋した臨床肺癌試料中のCSTF2タンパク質の臨床病理学的意義を調べるため、Envision+キット/西洋ワサビペルオキシダーゼ(DakoCytomation)を以下の様式で用いて、切片を染色した。抗原回復のために、スライドをTarget Retrieval Solution pH9(DakoCytomation)中に浸漬し、オートクレーブ中で108℃で15分間煮沸した。内在性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、ウサギ抗ヒトCSTF2ポリクローナル抗体(0.06μg/ml;ATLAS)を各スライドに添加し、切片を二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG[Histofine Simple Stain MAX PO (G)、Nichirei]と共にインキュベーションした。基質−色素原を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。
切除後の組織を回収し、固定し、かつ保存するために同一のプロトコールを用いて単一の施設(上記を参照のこと)によって得られた327例のホルマリン固定した原発性NSCLCを用いて、腫瘍組織マイクロアレイを構築した(Chin S F, Daigo Y, Huang HE, et al. Mol Pathol 2003;56:275-9、Callagy G, Cattaneo E, Daigo Y, et al. Diagn Mol Pathol 2003;12:27-34、Callagy G, Pharoah P, Chin SF, et al. J Pathol 2005;205:388-96)。個々の腫瘍の組織学的不均一性を考慮し、スライド上の対応するH&E染色切片による視覚的配置に基づいて、試料採取用の組織領域を選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された3つ、4つ、または5つの組織コア(直径0.6mm;深さ3〜4mm)を、組織マイクロアレイヤー(Beecher Instruments)を用いて、レシピエントパラフィンブロック中に配置した。各症例から正常組織のコア1つを穿孔し、得られたマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学的解析に使用した。3名の独立した研究者が、臨床病理学的データの事前知識を持たずに、CSTF2陽性度を半定量的に評価した。各腫瘍組織コア内の染色強度はほとんど均一であったため、以下の基準を用いて、CSTF2染色の強度を半定量的に評価した:強陽性(スコア2+)、腫瘍細胞の>50%における、核および細胞質を完全に覆い隠す暗褐色染色;弱陽性(1+)、腫瘍細胞の核および細胞質内で認識可能な任意のより低度の褐色染色;なし(スコア0)、腫瘍細胞内の染色は認識不可能。レビューワーらが独立に症例を強陽性と規定した場合にのみ、症例を強陽性と認定した。
統計解析。
StartView統計プログラム(SaS)を用いて、統計解析を行った。フィッシャーの直接確率検定を用いて、強いCSTF2免疫反応性を、年齢、性別、pathologic tumor−node−metastasis病期、および組織型などの臨床病理学的変数との関連性について評価した。手術日からNSCLCに関連する死亡時点までの、または最終経過観察時点までの腫瘍特異的生存曲線を算出した。各関連変数に関して、およびCSTF2発現に関して、カプラン・マイヤー曲線を算出し;ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数とがん関連死亡率との関連性を判定した。最初に、死亡と、年齢、性別、組織像、pT分類、およびpN分類を含む考えられる予後因子との関連性を、一度に1つの因子を考慮して解析した。次に、多変量解析を、P<0.05の開始レベルを満たしたありとあらゆる変数と共に、常にCSTF2強発現を強制的にモデルに当てはめる後退(段階)法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はP<0.05の終了レベルを超えなかった。
StartView統計プログラム(SaS)を用いて、統計解析を行った。フィッシャーの直接確率検定を用いて、強いCSTF2免疫反応性を、年齢、性別、pathologic tumor−node−metastasis病期、および組織型などの臨床病理学的変数との関連性について評価した。手術日からNSCLCに関連する死亡時点までの、または最終経過観察時点までの腫瘍特異的生存曲線を算出した。各関連変数に関して、およびCSTF2発現に関して、カプラン・マイヤー曲線を算出し;ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数とがん関連死亡率との関連性を判定した。最初に、死亡と、年齢、性別、組織像、pT分類、およびpN分類を含む考えられる予後因子との関連性を、一度に1つの因子を考慮して解析した。次に、多変量解析を、P<0.05の開始レベルを満たしたありとあらゆる変数と共に、常にCSTF2強発現を強制的にモデルに当てはめる後退(段階)法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はP<0.05の終了レベルを超えなかった。
RNA干渉アッセイ。
肺癌細胞および食道癌細胞におけるCSTF2の生物学的機能を評価するため、標的遺伝子に対する低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖(SIGMA)を使用した。RNA干渉のための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下のとおりであった:
si−CSTF2−#1、5'−GGCUUUAGUCCCGGGCAGA−3'(SEQ ID NO:9);
si−CSTF2−#2、5'−CACUUUACUUUCUGUAACU−3'(SEQ ID NO:10)、
control 1:(EGFP、高感度緑色蛍光タンパク質[GFP]遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea gictoria)GFPの変異体)、5'−GAAGCAGCACGACUUCUUC−3'(SEQ ID NO:11);
control 2(LUC、ホタル(Photinus pyralis)由来のルシフェラーゼ遺伝子)、5'−CGUACGCGGAAUACUUCGA−3'(SEQ ID NO:12)。肺癌細胞株、A549およびLC319を10cmディッシュにプレーティングし(8.0×105個/ディッシュ)、製造業者の説明書に従って30μlのLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、siRNAオリゴヌクレオチド(100nmol/L)のいずれかをトランスフェクトした。7日間インキュベーションした後、これらの細胞をギムザ液で染色してコロニー形成を評価し、臭化3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイにより細胞生存率を評価した。
肺癌細胞および食道癌細胞におけるCSTF2の生物学的機能を評価するため、標的遺伝子に対する低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖(SIGMA)を使用した。RNA干渉のための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下のとおりであった:
si−CSTF2−#1、5'−GGCUUUAGUCCCGGGCAGA−3'(SEQ ID NO:9);
si−CSTF2−#2、5'−CACUUUACUUUCUGUAACU−3'(SEQ ID NO:10)、
control 1:(EGFP、高感度緑色蛍光タンパク質[GFP]遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea gictoria)GFPの変異体)、5'−GAAGCAGCACGACUUCUUC−3'(SEQ ID NO:11);
control 2(LUC、ホタル(Photinus pyralis)由来のルシフェラーゼ遺伝子)、5'−CGUACGCGGAAUACUUCGA−3'(SEQ ID NO:12)。肺癌細胞株、A549およびLC319を10cmディッシュにプレーティングし(8.0×105個/ディッシュ)、製造業者の説明書に従って30μlのLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、siRNAオリゴヌクレオチド(100nmol/L)のいずれかをトランスフェクトした。7日間インキュベーションした後、これらの細胞をギムザ液で染色してコロニー形成を評価し、臭化3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイにより細胞生存率を評価した。
結果
肺癌および正常組織におけるCSTF2の発現。
肺癌の治療剤および/またはバイオマーカーを開発するための新規標的分子を同定するため、最初に、27,648個の遺伝子またはESTからなるcDNAマイクロアレイを用いて、101例の肺癌についてゲノム全域にわたる遺伝子発現プロファイル解析を行った(Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75)。調べた肺癌試料の大多数においてCSTF2転写物が過剰発現していることが同定されたが(3倍またはそれ以上)、一方、CSTF2は精巣を除く29例の正常組織のいずれにおいてもほとんど発現していなかった。結果として、CSTF2は新規分子標的の優れた候補遺伝子であると考えられた。調べた肺癌組織15例のうち12例において、および肺癌細胞株15例のうち15例において、半定量的RT−PCR実験によりCSTF2の過剰発現が確認された(図1A)。加えて、抗CSTF2抗体を用いるウェスタンブロット解析により、9例の肺癌細胞株においてCSTF2タンパク質の発現が確認された(図1B)。肺癌細胞における内因性CSTF2の細胞内局在性を判定するため、抗CSTF2抗体を用いて免疫蛍光解析を行い、SBC5細胞の核におけるその染色を認めた(図1C)。
肺癌および正常組織におけるCSTF2の発現。
肺癌の治療剤および/またはバイオマーカーを開発するための新規標的分子を同定するため、最初に、27,648個の遺伝子またはESTからなるcDNAマイクロアレイを用いて、101例の肺癌についてゲノム全域にわたる遺伝子発現プロファイル解析を行った(Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75)。調べた肺癌試料の大多数においてCSTF2転写物が過剰発現していることが同定されたが(3倍またはそれ以上)、一方、CSTF2は精巣を除く29例の正常組織のいずれにおいてもほとんど発現していなかった。結果として、CSTF2は新規分子標的の優れた候補遺伝子であると考えられた。調べた肺癌組織15例のうち12例において、および肺癌細胞株15例のうち15例において、半定量的RT−PCR実験によりCSTF2の過剰発現が確認された(図1A)。加えて、抗CSTF2抗体を用いるウェスタンブロット解析により、9例の肺癌細胞株においてCSTF2タンパク質の発現が確認された(図1B)。肺癌細胞における内因性CSTF2の細胞内局在性を判定するため、抗CSTF2抗体を用いて免疫蛍光解析を行い、SBC5細胞の核におけるその染色を認めた(図1C)。
プローブとしてCSTF2 cDNAを用いるノーザンブロット解析により、調べた16例の正常ヒト組織のうち精巣においてのみ、2.6−kbの転写物が同定された(図2A)。さらに、抗CSTF2抗体を用いて、正常組織5例(心臓、肺、肝臓、腎臓、および精巣)ならびに肺癌におけるCSTF2タンパク質の発現を調べた。CSTF2陽性染色は精巣細胞の核において観察されるが、他の正常組織では観察されないことが見出された(図2B)。
CSTF2過剰発現とNSCLC患者の予後不良との関連性。
肺発癌におけるCSTF2の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、根治的外科切除を受けた患者327名からの原発性NSCLC組織を含む組織マイクロアレイに対して、免疫組織化学的染色を行った。肺癌細胞の核において抗CSTF2ポリクローナル抗体によるCSTF2陽性染色が観察されたが、その隣接する正常肺細胞および、腫瘍細胞を取り囲む間質細胞の全てにおける染色は陰性であった。組織アレイにおけるCSTF2発現レベルを、なし(スコア0)〜弱/強陽性(スコア1+〜2+)の範囲に分類した(図2C)。NSCLC 327例中、CSTF2は77例で強く染色され(24%;スコア2+)、165例で弱く染色され(50%;スコア1+)、85例で染色されなかった(26%;スコア0;詳細を表1に示す)。次いで、CSTF2発現レベル(強陽性対弱陽性/なし)と様々な臨床病理学的変数との相関関係を調査し、CSTF2強発現は原発性腫瘍の切除後のNSCLC患者の予後不良と関連しているが(P=0.0079、ログラング検定;図2D)、いかなる他の臨床病理学的変数とも関連していないことを見出した。加えて、単変量解析を検討し、患者の予後と、年齢(>=65歳対<65歳)、性別(男性対女性)、組織像(非腺癌対腺癌)、喫煙歴(喫煙者対非喫煙者)、pT病期(腫瘍サイズ;T2〜T3対T1)、pN病期(リンパ節転移;N1〜N2対N0)、およびCSTF2発現(スコア2+対0、1+)を含むいくつかの臨床病理学的因子との関連性を評価した。喫煙歴を除くこれらのパラメータすべてが、予後不良と有意に関連していた(表2)。Cox比例ハザードモデルを用いる多変量解析により、pT病期、pN病期、年齢、および強いCSTF2陽性度が、NSCLCの独立予後因子であることが示された(表2)。
肺発癌におけるCSTF2の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、根治的外科切除を受けた患者327名からの原発性NSCLC組織を含む組織マイクロアレイに対して、免疫組織化学的染色を行った。肺癌細胞の核において抗CSTF2ポリクローナル抗体によるCSTF2陽性染色が観察されたが、その隣接する正常肺細胞および、腫瘍細胞を取り囲む間質細胞の全てにおける染色は陰性であった。組織アレイにおけるCSTF2発現レベルを、なし(スコア0)〜弱/強陽性(スコア1+〜2+)の範囲に分類した(図2C)。NSCLC 327例中、CSTF2は77例で強く染色され(24%;スコア2+)、165例で弱く染色され(50%;スコア1+)、85例で染色されなかった(26%;スコア0;詳細を表1に示す)。次いで、CSTF2発現レベル(強陽性対弱陽性/なし)と様々な臨床病理学的変数との相関関係を調査し、CSTF2強発現は原発性腫瘍の切除後のNSCLC患者の予後不良と関連しているが(P=0.0079、ログラング検定;図2D)、いかなる他の臨床病理学的変数とも関連していないことを見出した。加えて、単変量解析を検討し、患者の予後と、年齢(>=65歳対<65歳)、性別(男性対女性)、組織像(非腺癌対腺癌)、喫煙歴(喫煙者対非喫煙者)、pT病期(腫瘍サイズ;T2〜T3対T1)、pN病期(リンパ節転移;N1〜N2対N0)、およびCSTF2発現(スコア2+対0、1+)を含むいくつかの臨床病理学的因子との関連性を評価した。喫煙歴を除くこれらのパラメータすべてが、予後不良と有意に関連していた(表2)。Cox比例ハザードモデルを用いる多変量解析により、pT病期、pN病期、年齢、および強いCSTF2陽性度が、NSCLCの独立予後因子であることが示された(表2)。
CSTF2に対するsiRNAによる肺癌細胞の増殖の阻害。
CSTF2の上方制御が肺癌細胞の増殖または生存において役割を果たすかどうかを評価するため、CSTF2を内因的に過剰発現するA549細胞およびLC319細胞に、対照siRNA(si−LUCおよびsi−EGFP)に加えて、CSTF2に対する合成オリゴヌクレオチドsiRNA(si−CSTF2−#1およびsi−CSTF2−#2)をトランスフェクトした。si−CSTF2−#1およびsi−CSTF2−#2をトランスフェクトした細胞におけるCSTF2のmRNAレベルは、いずれかの対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して有意に低下した(図3A)。MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイによって調べた細胞生存率およびコロニー数は、si−CSTF2−#1およびsi−CSTF2−#2をトランスフェクトした細胞において有意に低下した(図3Bおよび3C)。
CSTF2の上方制御が肺癌細胞の増殖または生存において役割を果たすかどうかを評価するため、CSTF2を内因的に過剰発現するA549細胞およびLC319細胞に、対照siRNA(si−LUCおよびsi−EGFP)に加えて、CSTF2に対する合成オリゴヌクレオチドsiRNA(si−CSTF2−#1およびsi−CSTF2−#2)をトランスフェクトした。si−CSTF2−#1およびsi−CSTF2−#2をトランスフェクトした細胞におけるCSTF2のmRNAレベルは、いずれかの対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して有意に低下した(図3A)。MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイによって調べた細胞生存率およびコロニー数は、si−CSTF2−#1およびsi−CSTF2−#2をトランスフェクトした細胞において有意に低下した(図3Bおよび3C)。
CSTF2による哺乳動物細胞増殖の活性化。
腫瘍形成におけるCSTF2の潜在的役割を調べるため、CSTF2を発現するように設計されたプラスミド(pcDNA3.1/myc−His−CSTF2)を構築し、COS−7細胞にトランスフェクトした。ウェスタンブロット解析により、外因性CSTF2発現が確認された(図4A)。MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイを行い、CSTF2をトランスフェクトしたCOS−7細胞の増殖が、モックベクターをトランスフェクトしたCOS−7細胞と比較して有意に増強されることを見出した(図4Bおよび4C)。
腫瘍形成におけるCSTF2の潜在的役割を調べるため、CSTF2を発現するように設計されたプラスミド(pcDNA3.1/myc−His−CSTF2)を構築し、COS−7細胞にトランスフェクトした。ウェスタンブロット解析により、外因性CSTF2発現が確認された(図4A)。MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイを行い、CSTF2をトランスフェクトしたCOS−7細胞の増殖が、モックベクターをトランスフェクトしたCOS−7細胞と比較して有意に増強されることを見出した(図4Bおよび4C)。
考察
有害反応のリスクが最小であり、悪性細胞に対して高い特異性を有すると予測される分子標的抗がん剤を開発するため、強力な標的スクリーニング系を確立して、肺癌細胞において特異的に活性化されるタンパク質およびそれらの相互作用タンパク質を同定した。最初に、レーザーマイクロダイセクションと組み合わせた、27,648個の遺伝子を含むゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイシステムによって、101例の肺癌試料についてゲノム全域にわたる発現プロファイルを解析した。cDNAマイクロアレイ解析および多組織ノーザンブロット解析により、正常器官においてそのような遺伝子の発現が非常に低いかまたは無いことを検証した後、組織マイクロアレイ上の数百の臨床試料の中で候補標的のタンパク質発現を解析し、次いでRNA干渉システムを用いて機能表現型の喪失を調べ、該タンパク質のさらなる生物学的機能を規定した。これらの解析によって、新規診断バイオマーカー、治療薬、および/または免疫治療法を開発するための、がん細胞では上方制御されるが精巣、胎盤、および/または胎児組織を除く正常器官では発現しない候補遺伝子が同定された(Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75, Suzuki C, Daigo Y, Kikuchi T, Katagiri T, Nakamura Y. Cancer Res 2003;63:7038-41, Ishikawa N, Daigo Y, Yasui W, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70, Kato T, Daigo Y, Hayama S, et al. Cancer Res 2005;65:5638-46, Furukawa C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:7102-10, Ishikawa N, Daigo Y, Takano A, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84, Suzuki C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25, Ishikawa N, Daigo Y, Takano A, et al. Cancer Sci 2006;97:737-45, Takahashi K, Furukawa C, Takano A, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19, Hayama S, Daigo Y, Kato T, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48, Kato T, Hayama S, Yamabuki Y, et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42, Suzuki C, Takahashi K, Hayama S, et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51, Yamabuki T, Takano A, Hayama S, et al. Cancer Res 2007;67:2517-25, Hayama S, Daigo Y, Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22, Taniwaki M, Takano A, Ishikawa N, et al. Cancer. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31, Ishikawa N, Takano A, Yasui W, et al. Cancer Res 2007;67:11601-11, Mano Y, Takahashi, K, Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13, Kato T, Sato N, Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:8544-53, Kato T, Sato N, Takano A, et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70, Dunleavy EM, Roche D, Tagami H, et al. Cell 2009;137:485-97, Hirata D, Yamabuki T, Ito T, et al. Clin Cancer Res 2009,15:256-66, Suda T, Tsunoda T, Daigo Y, Nakamura Y, Tahara H. Cancer Sci 2007;98:1803-8, Mizukami Y, Kono K, Daigo Y, et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54)。
有害反応のリスクが最小であり、悪性細胞に対して高い特異性を有すると予測される分子標的抗がん剤を開発するため、強力な標的スクリーニング系を確立して、肺癌細胞において特異的に活性化されるタンパク質およびそれらの相互作用タンパク質を同定した。最初に、レーザーマイクロダイセクションと組み合わせた、27,648個の遺伝子を含むゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイシステムによって、101例の肺癌試料についてゲノム全域にわたる発現プロファイルを解析した。cDNAマイクロアレイ解析および多組織ノーザンブロット解析により、正常器官においてそのような遺伝子の発現が非常に低いかまたは無いことを検証した後、組織マイクロアレイ上の数百の臨床試料の中で候補標的のタンパク質発現を解析し、次いでRNA干渉システムを用いて機能表現型の喪失を調べ、該タンパク質のさらなる生物学的機能を規定した。これらの解析によって、新規診断バイオマーカー、治療薬、および/または免疫治療法を開発するための、がん細胞では上方制御されるが精巣、胎盤、および/または胎児組織を除く正常器官では発現しない候補遺伝子が同定された(Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75, Suzuki C, Daigo Y, Kikuchi T, Katagiri T, Nakamura Y. Cancer Res 2003;63:7038-41, Ishikawa N, Daigo Y, Yasui W, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70, Kato T, Daigo Y, Hayama S, et al. Cancer Res 2005;65:5638-46, Furukawa C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:7102-10, Ishikawa N, Daigo Y, Takano A, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84, Suzuki C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25, Ishikawa N, Daigo Y, Takano A, et al. Cancer Sci 2006;97:737-45, Takahashi K, Furukawa C, Takano A, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19, Hayama S, Daigo Y, Kato T, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48, Kato T, Hayama S, Yamabuki Y, et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42, Suzuki C, Takahashi K, Hayama S, et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51, Yamabuki T, Takano A, Hayama S, et al. Cancer Res 2007;67:2517-25, Hayama S, Daigo Y, Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22, Taniwaki M, Takano A, Ishikawa N, et al. Cancer. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31, Ishikawa N, Takano A, Yasui W, et al. Cancer Res 2007;67:11601-11, Mano Y, Takahashi, K, Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13, Kato T, Sato N, Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:8544-53, Kato T, Sato N, Takano A, et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70, Dunleavy EM, Roche D, Tagami H, et al. Cell 2009;137:485-97, Hirata D, Yamabuki T, Ito T, et al. Clin Cancer Res 2009,15:256-66, Suda T, Tsunoda T, Daigo Y, Nakamura Y, Tahara H. Cancer Sci 2007;98:1803-8, Mizukami Y, Kono K, Daigo Y, et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54)。
上記したように、切断刺激因子のメンバーをコードするCSTF2は肺癌において高頻度に過剰発現し、肺癌の増殖において重要な役割を果たす可能性があった。siRNAによるCSTF2発現のノックダウンにより、肺癌細胞の増殖が抑制された。さらに、本発明者らの組織マイクロアレイ実験により得られた臨床病理学的根拠から、CSTF2強陽性発現を有するNSCLC患者は、CSTF2弱陽性/陰性発現を有するNSCLC患者よりもがん特異的生存期間が短いことが示された。インビトロおよびインビボアッセイによって得られた結果から、CSTF2が重要な増殖因子でありかつ肺癌細胞のより悪性度の高い表現型と関連している可能性があることが示唆された。
結論として、CSTF2遺伝子は肺癌の増殖/進行において重要な役割を果たし得る。切除標本におけるCSTF2過剰発現は、予後不良の可能性がある肺癌患者に対する補助療法の有用な指標となり得る。
産業上の利用可能性
ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイを用いる、本明細書に記載されるがんの遺伝子発現解析により、がんの予防および治療法の標的として特定の遺伝子が同定された。差次的に発現する遺伝子であるCSTF2の発現に基づいて、本発明は、がん、特に肺癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイを用いる、本明細書に記載されるがんの遺伝子発現解析により、がんの予防および治療法の標的として特定の遺伝子が同定された。差次的に発現する遺伝子であるCSTF2の発現に基づいて、本発明は、がん、特に肺癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
本明細書において提供されるデータは、がんの包括的理解を高め、新規診断戦略の開発を促進し、かつ治療薬および予防剤のための分子標的の同定に手掛かりを与える。そのような情報は、腫瘍形成のより深い理解に寄与し、がんの診断、治療、および最終的には予防の新規戦略を開発するための指標を提供する。
本明細書において実証されるように、細胞増殖は、CSTF2遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制される。したがって、これらの新規二本鎖分子は抗がん医薬として有用である。
CSTF2遺伝子の発現は、正常器官と比較してがん、特に肺癌において顕著に上昇する。したがって、この遺伝子を、がん、特に肺癌の診断マーカーとして都合よく使用することができ、それによりコードされるタンパク質はがんの診断アッセイにおいて有用である。さらに、高発現レベルのCSTF2遺伝子を有するがん患者は、予後不良である傾向があることが見出された。したがって、CSTF2遺伝子はがん患者の予後を評価するのに有用である。
さらに、本発明は、肺癌を含むがんを治療するための新規治療アプローチを提供する。CSTF2遺伝子は、抗がん医薬を開発するのに有用な標的である。
本明細書において引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により組み入れられる。
本明細書において引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により組み入れられる。
さらに、本発明を詳細にかつその特定の態様に関して説明してきたが、前述の説明は本質的に、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。したがって本発明は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。
Claims (30)
- 対象におけるがんまたはがんを発症する素因を診断するための方法であって、
(a)(i)CSTF2遺伝子のmRNAを検出すること、
(ii)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、および
(iii)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか1つにより、対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを測定する段階;ならびに
(b)CSTF2遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階(a)で測定された発現レベルの上昇を、該対象におけるがんの存在と関連付ける段階
を含む、方法。 - 段階(a)で測定された発現レベルが前記正常対照レベルよりも少なくとも10%高い、請求項1記載の方法。
- 前記対象由来の生物学的試料が生検試料、痰、血液、胸水、または尿を含む、請求項1記載の方法。
- がんを有する対象の予後を評価または判定するための方法であって、
(a)対象由来の生物学的試料中のCSTF2遺伝子の発現レベルを検出する段階;
(b)検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階;および
(c)(b)の比較に基づいて、該対象の予後を判定する段階
を含む、方法。 - 前記対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較して発現レベルが上昇していることにより予後不良が示される、請求項4記載の方法。
- 前記上昇が前記対照レベルよりも少なくとも10%高い、請求項5記載の方法。
- 前記発現レベルが、
(a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出すること;
(b)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること;および
(c)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか1つによって測定される、請求項4記載の方法。 - 前記対象由来の生物学的試料が生検試料、痰、または血液、胸水、または尿を含む、請求項4記載の方法。
- (a)CSTF2遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬;および
(c)CSTF2遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択される試薬を含む、がんを診断するため、またはがんを有する対象の予後を評価もしくは判定するためのキット。 - 前記試薬が、CSTF2遺伝子の遺伝子転写物に対するプローブもしくはプライマー、またはCSTF2遺伝子の翻訳産物に対する抗体を含む、請求項9記載のキット。
- 細胞に導入された場合に、CSTF2遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、単離された二本鎖分子。
- 前記センス鎖が、SEQ ID NO:9および10からなる群より選択される標的配列に相当する配列を含む、請求項11記載の二本鎖分子。
- 前記センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、請求項11または12記載の二本鎖分子。
- 介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、請求項11〜13のいずれか一項記載の二本鎖分子。
- 一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有する二本鎖分子であって、[A]は、SEQ ID NO:9および10からなる群より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3〜23ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ[A']は、[A]において選択される標的配列に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、請求項14記載の二本鎖分子。 - 請求項11〜15のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
- CSTF2遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子が、CSTF2遺伝子を発現する細胞に導入された場合にCSTF2遺伝子の発現を阻害する、方法。
- 前記二本鎖分子が請求項11〜15のいずれか一項記載のものである、請求項17記載の方法。
- 前記ベクターが請求項16記載のものである、請求項17記載の方法。
- CSTF2遺伝子に対する少なくとも1つの単離された二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、CSTF2遺伝子を発現するがんを治療するための組成物であって、該二本鎖分子が、CSTF2遺伝子を発現する細胞に導入された場合にCSTF2遺伝子の発現を阻害する、組成物。
- 前記二本鎖分子が請求項11〜15のいずれか一項記載のものである、請求項20記載の組成物。
- 前記ベクターが請求項16記載のものである、請求項20記載の組成物。
- がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階;
(b)該ポリペプチドまたは断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階;および
(c)該ポリペプチドまたは断片に結合する試験物質を、がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階
を含む、方法。 - がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)試験物質をCSTF2ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階;
(b)該ポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階;
(c)該ポリペプチドまたは断片の生物学的活性を、該試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較する段階;および
(d)該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を、がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階
を含む、方法。 - 前記生物学的活性が細胞増殖活性、RNA結合活性、mRNA切断活性、またはmRNAポリアデニル化活性である、請求項24記載の方法。
- がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;および
(b)試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、CSTF2遺伝子の発現レベルを低下させる該試験物質を選択する段階
を含む、方法。 - がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞の増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)試験物質を、CSTF2遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;ならびに
(c)試験物質の非存在下で検出された発現または活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる該試験物質を選択する段階
を含む、方法。 - 抗CSTF2抗体またはその免疫学的活性断片を対象に投与する段階を含む、該対象におけるがんを治療または予防するための方法。
- がんが肺癌である、請求項1〜8、17〜19、および23〜28のいずれか一項記載の方法、請求項9もしくは10記載のキット、または請求項20〜22のいずれか一項記載の組成物。
- CSTF2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がSEQ ID NO:9または10に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、ベクター。
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