KR20070101610A

KR20070101610A - Ａｎｔ２ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 ｒｎａ를이용한 암 유전자 치료 및 항암제 내성 극복방법

Info

Publication number: KR20070101610A
Application number: KR1020060032823A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 장지영
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2007-10-17
Also published as: US20090202623A1; WO2007117121A2; WO2007117121A3; EP2010658A2; EP2010658A4

Abstract

본 발명은 아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide trnaslocator 2, ANT2) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)및 이를 포함하는 항암제에 관한 것으로, 구체적으로는 ANT2 mRNA의 염기서열 중 일부의 센스서열, 헤어핀 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성된 ANT2 siRNA를 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 ANT2 siRNA는 ANT2 유전자의 발현을 억제함으로써 ANT2가 과다발현되어 있는 암세포의 성장을 저해함으로써 암 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 더 나아가 항암제 내성으로 인한 항암치료 효과 저하를 극복할 수 있다.

ANT2, siRNA, 발현벡터, 유방암, 유전자 치료

Description

ＡＮＴ２ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 ＲＮＡ를 이용한 암 유전자 치료 및 항암제 내성 극복방법{Gene therapy for cancer using small interfering RNA specific to ANT2 and a method to overcome tolerance to antitumor agent}

도 1A와 B는 본 발명의 아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide translocator 2, ANT2) mRNA에 특이적인 siRNA(small interfering RNA)를 발현시키기 위한 발현벡터의 개열지도이고,

도 2A는 유방암 세포(MDA-MB-231)와 정상세포인 말초혈단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서의 ANT1 및 ANT2의 mRNA 발현양상을 RT-PCR로 나타낸 그림이고,

도 2B는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터가 유방암 세포에서의 ANT2 mRNA 발현을 감소시키는 양상을 RT-PCR로 나타낸 그림이다.

스크램블 siRNA : 음성대조군.

도 3A는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터가 유방암 세포에서 ATP 생산을 감소시키는 양상을 나타낸 그래프이고,

도 3B는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터가 유방암 세포의 증식을 억제하는 양상을 대조군인 스크램블 siRNA와 비교하여 나타낸 그래프이고,

도 3C 및 도 3D는 각각 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터에 의해 유도되는 암세포의 세포사멸을 세포 생존율(%) 그래프 및 게놈 DNA 단편화로 나타낸 그림이다.

도 4A는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터가 세포사멸과 관련된 인자인 Bcl-xL(세포사멸 억제 인자) 및 Bax(세포사멸 유도 인자)의 mRNA 레벨 또는 단백질의 발현에 미치는 효과를 각각 RT-PCR(좌측) 및 웨스턴-블럿(우측)으로 나타낸 그림이고,

도 4B는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터에 의한 유방암 세포주의 미토콘드리아 막 파괴 정도를 DiOC₆로 염색하여 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터에 의한 유방암 세포의 항암효과에 있어서, 직접적 사멸유도(상단) 및 간접적 사멸유도(하단)를 어넥신(Annexin) V 및 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)로 이중 염색한 후 FACS로 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터가 암 세포주에서 간접적으로 유도할 수 있는 항암효과의 기전을 나타낸 것으로,

도 6A는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터와 암세포에서 발현되는 TNF-α생산과의 관련성을 FACS로 나타낸 그래프이고,

도 6B는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터와 상기의 암세포에서 발현되는 TNF-α 수용체 중 하나인 TNF-α 수용체 1(TNFR1)의 mRNA 레벨과의 관련성을 RT-PCR로 측정하여 나타낸 그림과 상기의 도 6A와 같은 방법으로 본 발명의 ANT2 siRNA 발현 벡터와 TNF-α 수용체 1(TNFR1)과의 관련성을 FACS로 나타낸 그래프이고,

도 6C는 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터에 의한 암세포의 TNF-α생산의 증가가 간접적으로 암세포의 사멸을 유도했는지 확인해 보기 위하여, 배지내의 TNF-α를 항체를 이용하여 중화시킨 후 세포사멸에 미치는 효과를 FACS로 나타낸 그래프이다.

도 7A는 본 발명의 ANT2 siRNA 또는 음성 대조군인 스크램블 siRNA 발현벡터가 도입된 유방암 세포(MDA-MB-231)를 balb/c 누드마우스의 오른쪽 대퇴부에 피하이식한 후 나타나는 항암효과를 종양의 크기로 측정한 그래프이고

도 7B는 본 발명의 ANT2 siRNA 또는 음성 대조군인 스크램블 siRNA 발현벡터가 도입된 유방암 세포(MDA-MB-231)를 balb/c 누드마우스의 오른쪽 대퇴부에 피하이식한 후, 60일째 해부를 통해 종양을 분리하여 그 무게를 측정한 그래프이다.

도 8A는 본 발명의 ANT2 siRNA가 유방암 세포의(MDA-MB-231)의 항암제 내성 (multidrug resistance)에 미치는 영향을 FACS로 나타낸 그래프이고,

도 8B는 본 발명의 ANT2 siRNA와 유방암 세포의(MDA-MB-231)의 항암제 (gemcitabine)에 대한 반응성과의 관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide trnaslocator 2, ANT2) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것으로, 구체적으로는 ANT2 mRNA의 염기서열 중 일부의 센스서열, 헤어핀 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성된 ANT2 siRNA 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

종양(Tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비정상적이고 비제어적이며 무질서한 세포증식의 산물로서, 이러한 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor)으로 분류하게 된다. 특히, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 유전적 질환(genetic disease)이라고 할 수 있다.

현재까지 악성종양인 암을 치료하는 방법으로는 주로 3가지 치료법 즉, 외과적인 수술, 방사선 치료 및 화학요법 중 한 가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. 구체적으로, 외과적 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 방법으로서, 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예를 들면 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데는 매우 효과적이지만, 척추와 같은 일부 부위에 있는 종양을 치료하거나 분산성 종양을 치료하기에는 부적절하다.

방사선 치료의 대상으로는 급성염증성 질환, 양성 또는 악성 종양, 내분비기능장애 및 알레르기성 질환 등에 사용되며, 일반적으로는 급속히 분열하는 세포로 구성된 악성종양에 효과적으로 사용되고 있다. 이러한 방사선 치료의 단점으로는 방사선의 치료에 따라 정상조직의 기능 약화 또는 상실, 치료 후 치료부위에 피부질환 발생 우려 및 장기의 발육이 진행되는 소아의 경우 지능발달 지연 또는 골 발육 장애 등 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

화학요법은 암세포의 복제 또는 대사를 교란시킴으로써 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 널리 이용되고 있는데, 이러한 방법에 있어서 가장 큰 단점은 암 치료에 이용되는 전신성 화학요법에 의하여 유도되는 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 중요한 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 불안감을 증가시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 용량 제한 독성(dose limiting toxicity, DLT)이다. 예를 들면, 점막염은 여러 항암제(항대사물질 세포독소제인 5-플루오로우라실, 메소트렉세이트 및 항종양 항생제인 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성(DLT)이 있다. 이러한 화학요법의 부작용 중 대부분은 심한 경우, 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위하여 진통제를 필요로 하기도 한다. 이처럼, 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 치료에 있어서 중요한 문제로 부각되고 있다.

반면에, 유전자 치료(gene therapy)는 DNA 재조합 방법을 이용하여 치료용 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜서 유전자 결함을 교정하거나 세포에 새로운 기능을 추가하여 인체 세포의 유전적 변형으로 인한 각종 유전질환, 암, 심혈관질환, 감염성 질병 및 자가면역질환 등을 치료하거나 예방하는 방법이다. 구체적으로는, 치료 유전자(therapeutic gene)를 체내의 원하는 장기로 전달함으로써 세포 내에서 치료용 또는 정상 단백질이 발현될 수 있도록 유도하여 상기 질병들을 치료 하는 방법을 유전자 치료(gene thrapy)라고 한다. 이러한 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료법에 비하여 우수한 선택성을 가질 수 있으며 다른 치료법으로 조절하기 어려운 질병의 치료를 개선함으로써 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포에 전달하여 높은 효율로 발현할 수 있도록 하는 유전자 전달기술이 필요하다.

유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로써, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량 생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달 및 지속적으로 유전자를 발현할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체 기술은 유전자 치료 기술의 핵심 요소로서, 현재 유전자 치료에 많이 이용되는 대표적 유전자 전달체로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 바이러스성 전달체와 리포좀 및 폴리에틸렌이민과 같은 비바이러스성 전달체가 있다.

유전자 치료의 전략 중 종양세포를 제어하는 전략으로는 종양억제 유전자를 이용하는 방법, 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법, 자살 유전자를 이용하는 방법 및 면역조절 유전자를 도입하는 방법 등이 있다. 구체적으로 종양억제 유전자를 이용하는 방법은, 상당수의 암환자에서 유전자가 결핍 또는 변형되어 있는 p53과 같은 종양억제 유전자를 원형으로 인체에 전달하여 암을 치료하는 방법이며, 종양 선택적 살상바이러스를 이용하는 방법은, 암조직에서 변형되어 있는 종양억제 유전자의 활성을 이용하여 종양세포에서만 선택적으로 증식할 수 있는 바이러스 유전자 전달체를 인체에 도입하여 치료하는 방법으로서 두 가지 모두 종양세 포를 직접적으로 사멸시키는 전략이다. 또한, 자살 유전자를 이용하는 방법 예를 들면, HSK-TK와 같은 감수성 유전자를 도입하여 종양세포의 자살을 유도하는 방법도 이와 같은 범주에 포함된다. 반면에, 면역 조절 유전자를 도입하는 방법은 항종양 면역반응을 증가시키는 인터루킨 12(IL12), 인터루킨 4(IL4), 인터루킨 7(IL7), 감마 인터페론(γ-interferon) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 등의 유전자를 인체에 전달함으로써 T 세포를 매개로하여 종양을 인식하도록 유발하거나, 종양 유발 단백질을 차단함으로써 세포 자살을 유도하여 간접적으로 질병을 치료하는 전략이다.

상기와 같이, 암을 치료하는 다양한 방법 중 유전자 치료에 있어서 본 발명자들은 표적 유전자로 ANT(adenine nucleotide translocator)를 선택하여 효과적이며 안전한 항암 치료제 개발에 중점을 두었다.

아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터(ADP/ATP translocator, ANT)는 미토콘드리아 내막(inner membrane, IM)에 존재하는 효소로서 외막(outer membrane, OM)의 VDAC(voltage dependent anion channel)를 통하여 세포질로부터 미토콘드리아 내부로 ADP를 전달(import)하고 전자전달계(electron transfer chain system)을 거쳐 생성되는 ATP를 세포질로 방출(export)하는 기능을 수행하는 효소로 알려져 있다(HLA Vieira, et al., Cell Death and Differentiation, 7, 1146-1154, 2000).

덧붙여, 세포의 에너지 대사에 필수적인 역할을 수행하는 ANT는 3개의 유사체(isoform)인 ANT1, ANT2 및 ANT3가 알려져 있으며 이 중에서 특히 ANT2는 정상세포에서는 그 발현이 낮지만 암세포 또는 증식능이 높은 세포에서는 매우 높게 발현 되는 특징을 가지고 있는데 이는 혐기성 상태(anaerobic condition)에서의 해당(glycolysis)반응과 밀접한 관련이 있으며, 또한 최근에는 새로운 암 치료의 표적으로 제시된 바 있다(Chevrollier, A, et al., Med. Sci., 21(2), 156-161, 2005). 그러나, 상기 문헌은 ANT2가 암 치료에 사용될 수 있다는 가능성만을 제시하였을 뿐, 실제 상기 ANT2를 표적으로 하여 암 치료 효과가 있음을 보고한 사례는 전무하다.

한편, 최근에는 동식물에서 이중 가닥 RNA(double stranded RNA, dsRNA)를 세포 내에 도입할 경우, dsRNA는 이에 상응하는 염기서열을 갖는 특정 mRNA를 분해하고 이에 따른 특정 단백질의 합성이 특이적으로 저해되는 현상이 발견되었는데 이러한 현상을 RNA 간섭이라고 보고하였다(Sharp, P. A., et al., Genes Dev., 16, 485-490, 2001). 이 경우 dsRNA는 아직 명확히 규명되지 않은 기전에 의하여 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 전환되어 이에 상응하는 mRNA를 분해시키지만, 30개 이상의 염기서열을 갖는 dsRNA를 이용할 경우 이에 따른 비특이적 반응 때문에 세포 내에서 단백질 차단 효과가 일어나지 않거나 비효율적임을 시사하였다(Hunter, T. et al., J. Biol. Chem., 250, 409-417, 1975;및 Robertson, H. D. and Mathews, M. B., Biochemie., 78, 909-914, 1996). 이를 극복하기 위한 방법으로 21개의 올리고머로 구성된 이중 가닥 siRNA를 합성하여 포유동물세포 내에 도입하게 되면 이에 상응하는 mRNA가 효과적으로 분해되어 특정 단백질의 합성을 차단할 수 있는 기술이 개발되었다(Hutvagner, H. D. et al., Science, 29, 834-838, 2001).

특히, 21개의 올리고머로 구성된 이중 가닥 siRNA를 합성하여 이를 암을 포함하는 질병을 치료하기 위한 하기와 같은 연구가 생체 내/외에서 진행되고 있다. 예를 들면, 합성 베타-카테닌(β-catenin) siRNA를 이용하여 암세포의 빠른 증식에 관여하는 변이된 베타-카테닌(β-catenin)을 배양된 대장암세포 및 마우스 대장암 모델에서 효과적으로 제거할 수 있었다(Verma, U. N., et al., Clinical Cancer Res., 9, 1291-1300, 2003;및 Annick, H. B., et al., PNAS USA, 99, 14849-14854, 2002).

또한, 항암 화학요법에서 문제가 되는 약제내성 암세포의 약제 내성을 극복하기 위하여 다중약물 저항 단백질 1(multidrug resistance 1, MDR1) siRNA 합성 올리고머를 제작한 후 이를 MDR1 발현세포에 도입했을 때, MDR1 단백질 합성이 차단됨을 알 수 있었고(Wu, H. et al., Cancer Res., 63, 1515-1519, 2003), 사이클린 E(Cyclin E)가 과발현되어 있는 간암 세포주에 사이클린 E siRNA 합성 올리고머를 처리했을 경우에도 배양 간암세포 및 마우스에 이식된 간암세포의 증식이 억제되었다(Kaiyi, L. et al., Cancer Res., 63, 3593-3597, 2003).

상기의 결과들은, 암세포에 과발현되어 있으며 암세포의 빠른 증식에 필수적인 유전자의 단백질 합성을 특이적으로 차단할 수 있는 siRNA가 항암 치료제로서 개발될 수 있음을 시사하고 있다. 반면, 합성 siRNA 올리고머는 고비용이 들고 세포 내 전달효율이 낮으며 비특이적인 반응을 유도하여 세포에 독성을 유도할 수 있고, 생체 내에 적용할 경우 반감기가 짧아 그 효과가 지속적이지 않으며, 반복 투여가 필요하다는 단점으로 인하여 합성 siRNA 올리고머의 생체 내 적용에는 한계가 있는 것으로 보고 있다.

따라서, siRNA를 세포내에서 발현시킬 수 있는 바이러스성 및 비바이러스성 유전자 전달체들은 합성 siRNA 올리고머의 상기의 단점을 상당 부분 해결할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

이에, 본 발명자들은 ANT2 단백질 합성을 특이적으로 차단할 수 있는 본 발명의 ANT2 siRNA에 의하여 ANT2가 과발현되어 있는 암세포의 증식이 효과적으로 저해됨을 관찰하여, ANT2 siRNA를 항암제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 ANT2가 과발현되어 있는 세포의 암 발생 및 진행에 있어서 중요한 기능을 가진 ANT2의 발현을 특이적으로 차단함으로써 암세포의 증식을 효과적으로 저해할 수 있는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide translocator 2, ANT2)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA의 염기서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포 함하는 발현벡터를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide translocator 2, ANT2)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공한다.

본 발명에서, 상기의 siRNA는 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide translocator 2, ANT2)의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 17 내지 25머의 센스서열, 7 내지 11머의 헤어핀 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 상기의 센스서열은 서열번호 1로 기재되는 ANT2 mRNA의 염기서열부분에 해당하는 것으로서 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 염기서열이다. 헤어핀 루프서열 또한 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열이다.

또한, 본 발명은 ANT2 siRNA의 염기서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서, ANT2 siRNA의 염기서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 형태의 발현벡터는 H1(RNA polymerase III) 프로모터, 헤어핀 루프(hairpin loop)구조를 형성하도록 고안된 ANT2 siRNA의 염기서열에 상응하는 폴리 뉴클레오티드 및 전사 종료 서열인 다섯 개의 T염기(T₅)로 구성되었으며, 상기 ANT2 siRNA의 염기서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드는 H1 프로모터에 의하여 발현되도록 고안된 pSilencer 3.1-H1 puro 플라스미드 벡터(Ambion, Austin, TX)의 Bam H1/Hind III 부위에 클로닝하여 제작되었다(도 1A 및 도 1B 참조). 그러나, 본 발명에 있어서 ANT2 siRNA를 발현시키기 위한 벡터는 pSilencer 3.1-H1 puro 벡터에만 한정되지 않으며, ANT2 siRNA를 발현시키기 위한 프로모터 역시 H1 프로모터에만 한정되지 않는다. 예를 들면, U6 프로모터 또는 CMV 프로모터 등 포유동물세포에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터 및 진핵생물 RNA 폴리머라제 III에 의하여 전사개시가 가능한 Pol III 프로모터를 사용하는 것이 바람직하며 이에는 H1 및 U6 프로모터 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 ANT2 siRNA 발현벡터를 세포에 처리하였을 때, ANT2가 과발현된 유방암(MDA-MB-231) 세포주의 증식을 억제하고(도 3B 참조) 세포사멸(도 3C 및 3D 참조)을 유도할 수 있음을 확인하였다.

상기와 같은 ANT2 siRNA의 항암 효과에 대한 기전을 조사한 결과, 암 세포 사멸은 ANT2 siRNA에 의하여 직접적으로 유도될 뿐만 아니라(도 5 참조) 세포사멸을 유도하는 인자인 TNF-α 및 이 수용체 TNFR1의 발현을 특이적으로 유도하는 간접적인 사멸에 의하여 보다 효과적으로 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5 및 6 참조).

본 발명의 ANT2 siRNA가 생체 내에서도 항암효과를 나타내는지 알아보기 위해, ANT2 siRNA 발현벡터를 유방암 세포에 형질도입 시킨 후 이를 누드마우스의 오른쪽 대퇴부에 주입하여 종양의 크기변화를 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비해 ANT2 siRNA가 발현된 유방암 세포주를 투여한 경우 종양의 크기가 현저히 줄어들었다(도 7 참조).

또한 ANT2 siRNA를 유방암세포(MDA-MB-231)에 도입함으로써 세포의 항암제에 대한 내성(MDR : multidrug resistance)이 감소됨을 확인하였고, 더 나아가 겜시타빈(gemcitabine)과 같은 항암제의 반응성 또한 증가하여, 세포의 50%를 죽이는 IC₅₀값이 감소됨을 확인하였다 (도 8 참조). 이는 ANT2 siRNA를 암세포에 도입함으로써 항암제에 대한 내성을 극복하고, 더 낮은 농도의 항암제를 투여하더라도 더 큰 효과를 기대할 수 있음을 나타낸다.

상기 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터를 ANT2가 과발현되어 있는 암세포에 처리하면 ANT2의 발현을 억제함으로써 암세포 증식에 필수적인 에너지원인 ATP 합성을 차단하고 세포사멸 유도 인자인 TNF-α 및 이 수용체 1(TNFR1)의 발현을 증가시켜 세포사멸을 유도하여 종양의 증식을 억제하는 강력한 항암효과를 나타냄을 확인하였다.

대부분의 암, 즉 위암, 폐암, 간암, 난소암 등에서 ANT2가 과발현 되므로 본 발명의 ANT2 siRNA 발현벡터는 다양한 암 치료에 폭넓게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> ANT2 siRNA의 발현벡터 제작

미국 국립생명공학정보센터(Nationanl Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 입수한 ANT2 siRNA는 Genebank Accession No. NM_001152(서열번호 1)의 두 번째 엑손에 해당하는 염기서열(서열번호 2) 즉, siRNA 예측 프로그램(http://www.ambion.com/technical, resources/siRNA target finder)을 통하여 얻어진 후보 서열 중 가장 적합한 올리고머의 염기서열을 토대로 ANT2 siRNA를 제작하였다. ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다

구체적으로, ANT2의 발현을 저해할 수 있는 siRNA의 타겟 서열인 ANT2 mRNA(서열번호 1)의 197-217 부분에 해당하는 센스서열(5‘-GCAGAUCACUGCAGAUAAG-3', 서열번호 2), 헤어핀 루프서열(5‘-TTCAAGAGA-3', 서열번호 3) 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 디자인하였으며, 상기 센스서열에 이어 siRNA 발현유도의 효율을 증가시키도록 TT를 첨가하였고 이를 H1 프로모터에 의해 발현되도록 pSilencer 3.1-H1 puro 플라스미드 벡터(Ambion사)의 MCS(multi-cloning site)내 Bam HI과 Hind III 부위에 클로닝하여 제작하였다(도 1A 및 도 1B). 또한, ANT2 발현을 차단하지 못하는 음성대조군으로 사용한 스크램블 (scramble) siRNA는 특정 RNA 발현에 영향을 끼치지 않으면서 동일한 조건을 제공해주는 역할을 하는 것으로 Ambion사에서 구입하여 사용하였다.

<실시예 2> ANT2 siRNA 발현벡터의 활성 측정

<2-1> ANT2 siRNA에 의한 ANT2 발현 억제 효과 확인

본 발명에서는 다양한 인간 암세포주를 대상으로 ANT2의 발현 정도를 분석한 결과, 높은 ANT2 발현을 나타내는 유방암 세포주(MDA-MB-231)를 실험 대상 세포주로 선정하였다(도 2A). 본 발명의 MDA-MB-231 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Korean Cell Line Bank)에서 구입하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/ml의 페니실린 및 100 ug/ml의 스트렙토마이신(Sigma)을 포함하는 DMEM(Sigma) 배지에서 배양하였으며, 배양조건은 5% CO₂가 공급되며 37℃가 유지되는 세포배양기(Sanyo, 일본)에서 배양하였다.

이어, 본 발명의 ANT2 siRNA가 실제로 ANT2 발현을 차단할 수 있는지 알아보기 위하여, 상기의 유방암 세포주(MDA-MB-231)을 대상으로 ANT2 siRNA 존재 하에서 RT-PCR 분석으로 ANT2 발현을 측정하였다. 구체적으로, 세포를 6-웰 플레이트(2× 10⁵개) 또는 100 mm dish(2× 10⁶개)에 분주한 후 24시간 동안 배양하고 Lipofectamine2000(Invitrogen), pSilencer 3.1-H1 puro ANT2 siRNA 벡터 또는 pSilencer 3.1-H1 puro scramble siRNA 벡터를세포 수 2× 10⁵개당 2ug 씩 첨가하였다. 무혈청 배양액에서 실온에서 15분간 반응시켜 서로 결합할 수 있도록 한 후, 상기 유방암 세포주에 형질도입시켜 4시간 정도 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 다음 혈청 배양액에서 24시간 또는 48시간동안 배양하였다.

형질도입 후, 24시간 또는 48시간이 되는 시점에서 상기의 세포를 Trizol(Invitrogen)로 처리하여 전체 RNA를 분리한 다음, 5 ㎍의 전체 RNA(total RNA)를 RT-PCR kit(Promega, Madison, WI)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 이 cDNA를 94℃에서 5분 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간 35 사이클을 수행한 다음 다시 72℃에서 5분간 증폭시키고 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다. 이때 PCR에 사용된 프라이머의 염기서열은 하기와 같다:

1) ANT1 : (정방향) 5'-CTG AGA GCG TCG AGC TGT CA-3' (서열번호 4);및 (역방향) 5'-CTC AAT GAA GCA TCT CTT C-3' (서열번호 5);

2) ANT2 : (정방향) 5'-CCG CAG CGC CGT AGT CAA A-3' (서열번호 6);및 (역방향) 5'-AGT CTG TCA AGA ATG CTC AA-3' (서열번호 7);

3) Bcl-xL : (정방향) 5'-GAA TTC AAA TGT CTC AGA GCA ACC GGG AG-3' (서열번호 8);및 (역방향) 5'-GCG GCC GCA TTC CGA CTG AAG AGT GAG CCC-3' (서열번호 9);

4) Bax : (정방향) 5'-GAC GGG TCC GGG GAG C-3' (서열번호 10);및 (역방향) 5'-CAG CCC ATC TTC CAG ATG GT-3' (서열번호 11);

5) β-엑틴 : (정방향) 5'-GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA GG-3' (서열번호 12);및 (역방향) 5'-GGC TTT TAG GAT GGC AAG GGA C-3' (서열번호 13).

상기와 같이, RT-PCR을 실시하여 ANT2의 mRNA 발현 정도를 분석한 결과, 형질도입 후 24시간부터 ANT2 siRNA에 의한 MDA-MB-231 세포내의 ANT2 mRNA 발현이 억제되었으며, 48시간에서는 ANT2 siRNA에 의하여 현저하게 ANT2의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 2B).

<2-2> ANT2 siRNA에 의한 ATP 생산과 세포증식 억제 및 세포사멸 유도 확인

본 발명자들은 유방암 세포주(MDA-MB-231)에 ANT2 siRNA 및 음성대조군인 scramble siRNA를 각각 도입하여 배양한 다음, ATP 생산 정도, 세포증식 억제 및 세포사멸을 유도할 수 있는지 조사하였다.

ATP 생산 측정

세포 내 ATP 생산량을 측정하기 위하여 세포를 CellTiter-Glo^TM regent(CellTiter-Glo^TM 용액 및 CellTiter-Glo^TM 기질(Promega)과 반응시킨 후 실온에서 발광기(Luminometer, Tecan instruments)를 이용하여 세포의 발광(luminescence) 정도를 측정하였다

세포증식 억제 측정

또한, ANT2 siRNA가 상기 세포의 증식에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 배 양된 MDA-MB-231 세포주에 상기 실시예 2의 형질도입 방법으로 ANT2 siRNA 및 scramble siRNA를 Lipofectamine2000(Invitrogen)으로 각각 형질도입한 후, 당일, 1일 및 2일이 지난 상태에서 각각의 세포 수를 혈구계산판(hemacytometer)으로로 측정하였다(도 3B).

세포사멸 측정

또한, 형질도입된 상기의 세포를 어넥신(Annexin) V와 PI(propidium ionide, BD pharmingen사)로 어두운 실온에서 15분간 반응시킨 후 FACS 분석기(Epics XL, Coulter, 프랑스)를 이용하여 측정하였고, DNA 단편화(fragmentation)의 경우 게놈 DNA kit(Intron, 한국)를 이용하여 게놈 DNA를 분리한 후 2% 아가로스 겔에 전기 영동하여 세포사멸을 측정하였다.

상기의 실험결과, 형질도입 후 대조군(scramble siRNA)에 비하여 ANT2 siRNA를 도입한 MDA-MB-231 세포에서 ATP 생산이 감소함을 확인할 수 있었고(도 3A), 세포증식에 있어서도 형질도입 후 1일과 2일 모두에서 현저하게 세포증식이 감소됨을 확인하였다(도 3B). ANT2 siRNA에 의한 MDA-MB-231 세포주의 사멸에 있어서도, 형질도입 후 1일과 2일 모두에서 약 50% 정도의 사멸효과가 나타났고(도 3C), 게놈 DNA 단편화 분석에서도 24시간 및 48시간 모두에서 대조군에 비하여 ANT2 siRNA를 처리한 유방암 세포주의 DNA가 현저하게 단편화됨을 확인할 수 있었다(도 3D).

따라서, 본 발명자들은 ANT2 siRNA가 특징적으로 ANT2를 발현하는 세포의 ATP 합성과 증식억제 및 세포사멸을 유도함으로써 항암 효과를 나타냄을 확인하였다.

<2-3> ANT2 siRNA에 의한 세포사멸관련 인자의 발현 조절 및 미토콘드리아의 막 파괴 효과 확인

본 발명자들은 유방암 세포주에 ANT2 siRNA를 도입한 후 유도되는 세포사멸관련 인자의 발현 및 세포사멸과 밀접하게 관련되어 있는 미토콘드리아의 막에 나타나는 변화를 관찰하였다.

세포사멸관련 인자의 발현 조절 확인

본 발명자들은 MDA-MB-231 세포주에 ANT2 siRNA 및 스크램블 siRNA를 각각 형질도입하여 배양한 다음, 세포사멸관련 인자인 Bcl-xL(세포사멸 억제 인자) 및 Bax(세포사멸 유도 인자)의 mRNA 레벨을 실시예 2의 방법으로 측정하였다.

또한, 단백질 레벨을 분석하기 위하여 상기의 세포에 ANT2 siRNA 및 scramble siRNA를 각각 형질도입한 후 48시간이 지난 다음, 이 세포를 수취하여 분쇄 용액(세포파쇄 완충용액; 5 mmol/L EDTA, 300 mmol/L NaCL, 0.1% lgepa, 0.5 mmol/L NaF, 0.5 mmol/L Na3VO4, 0.5 mmol/L PMSF, 10 g/mL 아프로티닌, 펩스타틴) 및 leupeptin(Sigma사)를 이용하여 세포를 분쇄하고 원심분리(15,000 ×g, 30 min)한 다음, 이 상등액을 Bradford 용액(Bio-Rad사)으로 단백질 양을 정량하였다. 이 중 단백질 50 ㎍을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동한 후에 폴리비닐리 딘 디플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane, Millipore사)에 전달시키고, 항체(항-Bcl-xL, 항-Bax, 및 항-알파 튜블린, Santa Cruz Biotech사)를 처리한 후 형광 검출 시스템(chemiluminescence detection system, Amersham Pharmacia Biotech사)을 이용하여 발색시켰다.

그 결과, ANT2 siRNA가 도입된 세포군에서 세포사멸 억제인자인 Bcl-xL의 mRNA와 단백질 레벨의 감소 및 또 다른 세포사멸 유도인자인 Bax의 mRNA 및 단백질 레벨의 증가가 현저하게 유도됨을 관찰하였다(도 4A).

미토콘드리아의 막 파괴 효과 확인

본 발명자들은 미토콘드리아의 막에 끼어드는 DiOC6 염색을 이용하여 ANT2 siRNA에 의한 미토콘드리아 막에서의 파괴 정도를 관찰하였다. 즉, ANT2 siRNA를 형질도입한 유방암세포와 미토콘드리아의 막 파괴 효과를 측정하기 위하여 DiOC₆(Molecular Probes, Eugene, 미국)20 nM을 37'C에서 15 분간 반응시키고, 관찰한 결과, 도입 후 24시간(0.5% vs. 16.8%) 및 48시간(1.7% vs. 26.9%) 모두에서 스크램블 siRNA를 도입한 대조군 세포에 비하여 ANT2 siRNA를 도입한 세포에서 현저하게 높은 수준의 미토콘드리아 막 파괴를 관찰할 수 있었다(도 4B).

이는 본 발명의 ANT2 siRNA가 세포사멸관련 인자의 발현조절 및 세포사멸과 밀접하게 관련되어 있는 미토콘드리아의 막 파괴를 통하여 암세포주의 사멸을 유도함을 나타내는 것이다.

<2-4> ANT2 siRNA에 의한 직접 및 간접사멸 효과 확인

본 발명자들은 ANT2 siRNA에 의해 세포사멸이 직접적으로 유도되는지를 조사하기 위하여, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)와 어넥신(Annexin) V를 이용한 형광물질 염색을 실시하였다.

구체적으로, 각각 ANT2 siRNA 및 스크램블 siRNA를 상기 세포에 형질도입시킨 다음 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 PBS 완충액으로 세포를 세척하고, 이 세포에 프로피디움 아이오다이드(PI)와 어넥신(Annexin) V를 각각 첨가한 후 15분간 어두운 실온에서 반응시킨 후 FACS 분석기를 이용하여 488 nm에서 측정하였다(도 5).

그 결과, 대조군인 스크램블 siRNA에 비하여 ANT2 siRNA에 의한 직접적인 사멸이 24시간(스크램블 siRNA: 2.4% 대 ANT2 siRNA: 30.1%) 및 48시간(스크램블 siRNA: 4.7% 대 ANT2 siRNA: 52.9%) 모두에서 현저하게 높게 유도됨을 확인하였다(도 5).

이어, 본 발명자들은 ANT2 siRNA이 직접적인 세포사멸 뿐 아니라 간접적인 세포사멸을 유도할 수 있는지 조사하였다.

구체적으로, 유방암 세포주에 ANT2 siRNA 및 스크램블 siRNA를 각각 형질도입하여 48시간 동안 배양한 다음 원심분리를 통해 배양액 내의 세포를 제거한 후, 상기의 siRNA을 도입하지 않은 세포군에 각각 공급하여 24시간 및 48시간 동안 배양하여 세포사멸 정도를 관찰하였다.

그 결과, 상기의 직접적인 사멸효과에 비하여 그 효과가 높지는 않았지만, 24시간(대조군: 0.9% 대 ANT2 siRNA: 8.8%) 및 48시간(대조군: 1.8% 대 ANT2 siRNA: 13.2%) 모두에서 대조군인 스크램블 siRNA를 도입한 세포에 비하여 ANT2 siRNA를 도입한 세포에서 상대적으로 높은 사멸유도 효과를 관찰할 수 있었다(도 5). 상기 결과는 ANT2 siRNA 가 도입되지는 않았지만 ANT2 siRNA가 도입된 세포가 생산하는 TNF-a의 영향으로 주변의 세포가 죽는 간접적인 세포사멸 유도효과로부터 ANT2 siRNA를 이용한 암치료에 있어서 보다 높은 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.

<실시예 3> ANT2 siRNA에 의한 세포 사멸 기전 분석

본 발명자들은 상기의 ANT2 siRNA에 의한 간접적인 세포사멸 효과를 근거로 그 기전을 분석하기 위하여, ANT2 siRNA를 처리하였을 때, 상기 암세포주의 TNF(tumor necrosis factor)-α 및 이 수용체 중 하나인 TNF-α 수용체 1(TNFR1)의 발현 정도의 변화를 조사하였다. 구체적으로, MDA-MB-231 세포주에 ANT2 siRNA 및 대조군인 스크램블 siRNA를 각각 도입하여 24시간 동안 배양한 후 10 ㎍/ml의 BFA(brefeldin A : eBioscience, 미국)를 6시간 처리하여 TNF-α의 세포 밖으로의 유출을 차단시킨 다음 세포 내부의 TNF-α 및 TNFR1의 양을 RT-PCR 또는 FACS 분석 방법을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 상기의 세포내에서 ANT2 siRNA에 의한 TNF-α 및 TNF-α 수용체1(TNFR1)의 발현 정도가 대조군인 스크램블 siRNA에 비하여 현저하게 증가됨을 FACS 또는 RT-PCR 분석으로 확인하였다. 더불어 간접적인 세포 사멸효과가 TNF-a를 통한 것인지를 확인하기 위한 방법으로, ANT2 siRNA또는 scramble siRNA를 도입한 세포를 배양한 배양액을 TNF-a 항체를 이용하여 중화시킨 후 세포 배양에 사용 했을 경우 세포 사멸 효과가 감소하는 것을 통하여 TNF-a가 ANT2 siRNA에 의한 간접적인 세포 사멸효과에 관여하고 있음을 확인할 수 있었고, 그 효과가 부분적인 것으로 볼때, TNF-a 외에 다른 인자도 관여하고 있음을 알 수 있었다(도 6). 이러한 결과는, ANT2 siRNA에 의한 직접적인 세포 사멸효과와 더불어 추가적으로, TNF-α의 생산 및 이 수용체1(TNFR1)의 발현증가를 유도하여 암치료를 보다 상승적으로 치료할 수 있음을 시사하는 것이다. 특히, 최근에는 TNF-α DNA를 암세포에 직접 투여하거나 가용성 형태의 TNF-α 수용체를 암세포에 직접 도입함으로써 암세포를 치료한다는 보고들에 비추어 볼 때, 상기의 ANT2 siRNA를 이용한 방법은 매우 효과적인 암치료 방법이 될 수 있다고 판단된다.

<실시예 4> ANT2 siRNA에 의한 생체 내 항암 효과 분석

상기 실시예 2에서 유방암 세포주에 ANT2 siRNA을 처리했을 경우 세포증식이 현저하게 억제되는 것을 관찰하였는데, 이러한 현상이 생체 내에서도 일어나는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 MDA-MB-231 세포(5× 10⁶/100 ㎕)에 ANT2 siRNA 및 스크램블 siRNA를 각각 형질도입한 다음 이 MDA-MB-231 세포를 balb/c 누드마우스(Charles River Japan, 일본)의 오른쪽 대퇴부에 피하이식한 후(각 군당 5마리), 이로 인해 생긴 종양이 ANT2 siRNA에 의하여 억제되는지를 33일 동안 종양 크기를 측정하여 분석하였다(도 7). 종양의 크기는 하기의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

종양 부피(mm³) = 단축² × 장축 × 0.523

그 결과, 대조군인 스크램블 siRNA가 도입된 유방암 세포를 이식한 누드마우스에서는 정상적으로 암의 성장을 보이는 반면, 치료군인 ANT2 siRNA가 도입된 유방암 세포를 이식한 누드마우스에서는 암의 성장이 전혀 관찰되지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는, ANT2 siRNA가 생체 내 조건에서도 암세포의 증식을 현저하게 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 또한 60일 째의 마우스를 해부하여 종양의 무게를 측정하였다 (도 7).

<실시예 5> ANT2 siRNA에 의한 항암제 내성 감소효과 분석

본 발명자들은 ANT2 siRNA가 대부분의 암세포가 갖는 항암제 내성에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 Rho123 염색을 실시하였다. 즉, 항암제에 대한 내성은 세포 표면의 배출펌프(efflux pump)가 항암제를 세포외로 배출하여 세포내에 잔존 약제량이 적어져 나타나므로 ANT2 siRNA 투여 후, 세포 표면의 배출펌프들이 어 느 정도의 활성을 나타내는지를 측정하여 항암제 내성에 대한 ANT2 siRNA의 효과를 알아보았다.

구체적으로 세포내 배출 활성을 측정하기 위하여 MDA-MB-231 세포 2x10⁵ 에 Rhodamine 123(Sigma) 100 nM을 첨가한 후, 37'C에서 60 분간 반응시키고 관찰한 결과, 도입 후 24시간 후 스크램블 siRNA를 도입한 대조군 세포에 비하여 ANT2 siRNA를 도입한 세포에서 세포내 Rhodamine 123 축적이 증가되었음을 확인하였다. 이는 ANT2 siRNA의 도입이 암세포의 항암제 내성에 관여하는 세포막의 배출펌프의 활성을 저하시킨다는 것을 나타낸다. 더 나아가 겜시타빈(gemcitabine)과 같은 항암제에 대한 반응성 또한 증가하여 세포의 50%의 사멸을 유도하는 농도인 IC₅₀이 감소하는 것을 통해(도 8) siRNA를 이용한 유전자 치료가 항암제 내성을 극복함으로써 더 적은 농도의 항암제 사용으로 부작용은 최소화하고 효과는 최대화 할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide translocator 2, ANT2)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 이용한 암 유전자 치료에 관한 것이다. 이러한 ANT2 siRNA를 포함하는 발현벡터는 암세포의 증식에 필요한 에너지(ATP) 공급 감소, 세포사멸을 유도하는 TNF-α 생산 증가 및 이 수용체의 발현 증가를 직접 또는 간접 적으로 유도함으로써 ANT2가 과발현되어 있는 배양 암세포 및 이를 이식한 마우스 종양모델에서 현저하게 저해할 수 있으므로, ANT2 siRNA를 포함하는 발현벡터는 단독으로 또는 다른 항암 치료제와 병행하여 암을 치료하기 위한 유전자 치료방법으로서 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

<110> BioInfra, INC. <120> Gene therapy for cancer using small interfering RNA specific to ANT2 and a method to overcome tolerance to antitumor agent <130> 6P-02-49 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1225 <212> DNA <213> cDNA sequence of ANT2(adenine nucleotide translocator 2) <400> 1 ccgcagcgcc ggagtcaaac ggttcccggc ccagtcccgt cctgcagcag tctgcctcct 60 ctttcaacat gacagatgcc gctgtgtcct tcgccaagga cttcctggca ggtggagtgg 120 ccgcagccat ctccaagacg gcggtagcgc ccatcgagcg ggtcaagctg ctgctgcagg 180 tgcagcatgc cagcaagcag atcactgcag ataagcaata caaaggcatt atagactgcg 240 tggtccgtat tcccaaggag cagggagttc tgtccttctg gcgcggtaac ctggccaatg 300 tcatcagata cttccccacc caggctctta acttcgcctt caaagataaa tacaagcaga 360 tcttcctggg tggtgtggac aagagaaccc agttttggcg ctactttgca gggaatctgg 420 catcgggtgg tgccgcaggg gccacatccc tgtgttttgt gtaccctctt gattttgccc 480 gtacccgtct agcagctgat gtgggtaaag ctggagctga aagggaattc cgaggcctcg 540 gtgactgcct ggttaagatc tacaaatctg atgggattaa gggcctgtac caaggcttta 600 acgtgtctgt gcagggtatt atcatctacc gagccgccta cttcggtatc tatgacactg 660 caaagggaat gcttccggat cccaagaaca ctcacatcgt catcagctgg atgatcgcac 720 agactgtcac tgctgttgcc gggttgactt cctatccatt tgacaccgtt cgccgccgca 780 tgatgatgca gtcagggcgc aaaggaactg acatcatgta cacaggcacg cttgactgct 840 ggcggaagat tgctcgtgat gaaggaggca aagctttttt caagggtgca tggtccaatg 900 ttctcagagg catgggtggt gcttttgtgc ttgtcttgta tgatgaaatc aagaagtaca 960 cataagttat ttcctaggat ttttccccct gtgaacaggc atgttgtatt ctataacaca 1020 atcttgagca ttcttgacag actcctggct gtcagtttct cagtggcaac tactttactg 1080 gttgaaaatg ggaagcaata atattcatct gaccagtttt cctctaaagc catttccatg 1140 atgatgatga tgggactcaa ttgtattttt tatttcagtc actcctgata aataacaaat 1200 ttggagaaat aaaaatatct aaaat 1225 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> ANT2 siRNA sequence <400> 2 gcagaucacu gcagauaagu u 21 <210> 3 <211> 9 <212> RNA <213> hairpin loop sequence for the ANT2 siRNA <400> 3 uucaagaga 9 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the ANT1 <400> 4 ctgagagcgt cgagctgtca 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the ANT1 <400> 5 ctcaatgaag catctcttc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the ANT2 <400> 6 ccgcagcgcc gtagtcaaa 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the ANT2 <400> 7 agtctgtcaa gaatgctcaa 20 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the Bcl-xL <400> 8 gaattcaaat gtctcagagc aaccgggag 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the Bcl-xL <400> 9 gcggccgcat tccgactgaa gagtgagccc 30 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the Bax <400> 10 gacgggtccg gggagc 16 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the Bax <400> 11 cagcccatct tccagatggt 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the beta-actin <400> 12 ggaaatcgtg cgtgacatta agg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the beta-actin <400> 13 ggcttttagg atggcaaggg ac 22

Claims

아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(adenine nucleotide translocator 2, ANT2)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA).
제 1항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 아데닌뉴클레오티드 트랜스로케이터 2(ANT2)의 mRNA 염기서열로부터 선택되는 17 내지 25머의 센스서열을 포함하는 작은 간섭 RNA.
제 1항에 있어서, 제 2항의 센스서열, 7 내지 11머의 헤어핀 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
제 2항에 있어서, 상기 센스서열은 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
제 2항에 있어서, 상기 헤어핀 루프서열은 서열번호 3인 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
제 1항의 작은 간섭 RNA(siRNA)의 염기서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제 6항의 발현벡터는 프로모터, 헤어핀 루프 구조를 형성하도록 고안된 ANT2 작은 간섭 RNA 및 전사 종결 신호인 T₅로 구성되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵생물 RNA 폴리머라제 III에 의하여 전사 개시가 가능한 Pol III 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, 상기 Pol III 프로모터는 H1 또는 U6 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, pSilencer 3.1-H1 puro ANT2 siRNA인 것을 특징으로 하는 발현벡터.