DE69636339T2 - Wachstumsinhibitor gegen leukämische zellen, der antisense-oligonukleotidderivate gegen das wilms-tumorgen enthält - Google Patents

Wachstumsinhibitor gegen leukämische zellen, der antisense-oligonukleotidderivate gegen das wilms-tumorgen enthält Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Wachstumsinhibitor für Leukämiezellen, umfassend ein Antisinn-Nucleotidderivat.
  • STAND DER TECHNIK
  • Der Wilms'-Tumor ist ein pädiatrischer Nierentumor, der als Ergebnis der Deaktivierung von beiden Allelen des Wilms'-Tumorgens (WT1), lokalisiert auf dem Chromosom 11p13 (Call, K.M., et al., Cell 60: 509, 1990) auftritt. Eine nicht-kodierende stromaufwärts gelegene Sequenz von WT1 (C.E. Campbell, et al., Oncogene 9: 583–595, 1994) und eine kodierende Region, die das Intron beinhaltet (D.A. Haber, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9618–9622, 1991), wurden bereits dargestellt und es wird erwartet, dass sie an dem Wachstum oder der Differenzierung des Tumors usw. beteiligt sind (D.A. Haber, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9618–9622, 1991).
  • Pritchard-Jones et al. schlagen in Human Molecular Genetics, Bd. 3, 1994, S. 1633–1637 vor, dass das WT1-Gen an der Kontrolle der hämatopoetischen Differenzierung und der Leukämogenese beteiligt ist. Rothenpieler offenbart in Journal of The American Society of Nephrology, Bd. 5, 1994, S. 635 Antisinn-Oligonucleotide, die gegen WT1 gerichtet sind. Phelan et al. zeigen in Cell Growth & Diffentiation, Bd. 5, Juni 1994, S. 667–686, dass WT1-mRNA in K562-Zellen während einer bestimmten untersuchten Induktion der Erythroid- und megakaryocytischen Diffenzierung herabreguliert ist und stellen fest, dass diese Herabregulierung nicht ein generalisiertes Phänomen einer Wachstumsinhibition ist. Sie schlagen Antisinn- und Sinn-Experimente vor, um die Rolle von WT1-Protein bei der Differenzierung von K562-Zellen zu untersuchen.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Wachstumsinhibitor für Leukämiezellen bereit, umfassend ein Antisinn-Oligonucleotid gegen Wilms'-Tumorgen (WT1), wie definiert in den beigefügten Ansprüchen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Grafik, die die inhibitorischen Wirkungen von Oligonucleotid auf das Wachstum von der Leukämiezelllinie K562 darstellt.
  • 2 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen den Konzentrationen der Oligonucleotide SE3 und AS3 und dem Wachstum der Leukämiezelllinie K562 darstellt.
  • 3 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen den Konzentrationen der Oligonucleotide SE4 und AS4 und dem Wachstum der Leukämiezelllinie K562 darstellt.
  • 4 ist eine Grafik, die die auf Zeit basierenden Wirkungen der Oligonucleotide SE3 und AS3 auf das Wachstum der Leukämiezelllinie K562 darstellt.
  • 5 ist eine Grafik, die die Wirkungen verschiedener Oligonucleotide auf das Wachstum der Leukämiezelllinie K562 darstellt.
  • 6 ist eine Grafik, die die inhibitorischen Wirkungen verschiedener Oligonucleotide auf das Wachstum der Leukämiezelllinie HEL, die für die Expression von WT1 positiv ist, darstellt.
  • 7 ist eine Grafik, die die inhibitorischen Wirkungen verschiedener Oligonucleotide auf das Wachstum der Leukämiezelllinie THP-1, die für die Expression von WT1 positiv ist, darstellt.
  • 8 ist eine Grafik, die die inhibitorischen Wirkungen verschiedener Nucleotide auf das Wachstum der malignen Lymphomzelllinie U937, die für die Expression von WT1 negativ ist, darstellt.
  • 9 ist eine Grafik, die die Wirkungen der Oligonucleotide SE3 und AS3 auf die Bildung von Leukämie-Zellkolonien für Knochenmarks-mononucleären Zellen darstellt, abstammend von Leukämie-Patienten.
  • 10 ist eine Grafik, die die Wirkungen der Oligonucleotide SE3 und AS3 auf die Bildung von granulocytischen Makrophagenkolonien von Knochenmarksmononucleären Zellen darstellt, abstammend von gesunden Freiwilligen.
  • 11 Feld A ist eine Fotografie der Ergebnisse einer Elektrophorese, die eine Abnahme des Niveaus von WT1-Protein in Zellen, im Fall der Zugabe verschiedener WT1-Antisinn-Oligonucleotide zu einer Kultur von K562-Zellen anzeigt; Feld B zeigt die Abnahme von Niveau von WT1-Protein in Zellen, im Fall der Zugabe von WT1-Antisinn- Oligonucleotiden zu frischen Leukämiezellen von einem Patienten mit AML an.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Leukämie-Zellwachstumsinhibitor bereit, umfassend ein Antisinn-Oligonucleotid gegen WT1. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antisinn-Oligonucleotide sind Antisinn-Oligonucleotide gegen WT1, wobei Beispiele hierfür solche gegen die Transkriptions-Cap-Stelle von WT1, die Translationsstartregion, ein Exon oder ein Intron beinhalten.
  • Beispielsweise wird eine Nucleotidsequenz eines Sinn-DNA-Strangs der Region, der die Transkriptions-Cap-Stelle von WT1 enthält, durch SEQ ID NO: 9 dargestellt. Zusätzlich wird eine Nucleotidsequenz eines Sinn-DNA-Strangs der Exons 1 bis 10 der Region, die WT1 kodiert, durch SEQ ID NO: 10 bis 19 dargestellt. Die vorliegende Erfindung verwendet ein Antisinn-Oligonucleotid zu einer solchen Nucleotidsequenz des Sinn-DNA-Stranges von WT1. Dieses Antisinn-Oligonucleotid ist ein Antisinn-Oligonucleotid, umfassend 9 bis 30 Nucleotide der Antisinn-DNA- oder -RNA-Kette für WT1.
  • Beispiele für Antisinn-Oligonucleotide zu der Transkriptions-Cap-Stelle beinhalten diejenigen mit den folgenden Nucleotidsequenzen: 5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3', (SEQ ID NO: 2) und 5'-TCRAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID NO: 4). Zusätzlich beinhalten Beispiele für die Antisinn-Oligonucleotide zu der Translationsstartregion Antisinn-Oligonucleotide zu dem Translationsstartkodon ATG und dem stromaufwärts und/oder stromabwärts gelegenen Bereich, wie z.B. die folgende Nucleotidsequenz: 5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' (SEQ ID NO: 6).
  • Zusätzlich sind zehn Exons in dem Bereich enthalten, der WT1 kodiert und Beispiele für Antisinn-Oligonucleotide beinhalten diejenigen gegen die Sequenzen, enthalten in irgendeinem dieser Exons, diejenigen gegen die Sequenzen, die sich über irgendwelche von zwei aufeinanderfolgenden Exons nach einem Spleißen erstrecken, oder diejenigen gegen die Sequenzen, die sich über aufeinanderfolgende Introns und Exons erstrecken und diejenigen gegen die Sequenzen, die sich über aufeinanderfolgende Introns und Exons erstrecken und diejenigen gegen die Sequenzen aller Introns und der 3'- und 5'-nicht-kodierenden Bereiche. Ein Beispiel für ein Antisinn-Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung ist dasjenige gegen das sechste Exon, ein Beispiel davon ist das gegen die folgende Nucleotidsequenz: 5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID NO: 8).
  • Weiterhin sind diejenigen Oligonucleotide, die Ribozymen ähnlich sind, mit einer Funktion zur Spaltung der DNA- oder RNA-Kette für WT1 beinhaltet.
  • Die Struktur des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antisinn-Oligonucleotids ist in der chemischen Formel 1 dargestellt, worin X unabhängig ein Sauerstoff (O), Schwefel (O), eine Niederalkylgruppe, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin sein kann. Y kann unabhängig ein Sauerstoff (O) oder Schwefel (S) sein. Z ist ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe. B wird gewählt aus Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin, wenn Z ein Wasserstoffatom ist oder aus Adenin, Guanin, Uracil oder Cytosin, wenn Z eine Hydroxylgruppe ist und ist im wesentlichen ein Oligonucleotid, komplementär zu einer DNA oder mRNA, die WT1 kodiert. R ist unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Dimethoxytritylgruppe oder eine Niederalkylgruppe. N ist eine ganze Zahl von 7 bis 28.
  • Figure 00060001
    CHEMISCHE FORMEL 1
  • Bevorzugte Beispiele für Antisinn-Oligonucleotide beinhalten nicht nur nicht-modifizierte Antisinn-Oligonucleotide, sondern auch modifizierte Antisinn-Oligonucleotide. Beispiele für diese modifizierten Formen beinhalten Niederalkylphosphonatformen, wie die oben erwähnten Methylphosphonatformen oder Ethylphosphonatformen und andere Phosphorthioatformen oder Phosphoramidatformen (siehe chemische Formel 2).
  • Figure 00070001
    CHEMISCHE FORMEL 2
  • Diese Antisinn-Oligonucleotide können gemäß den folgenden konventionellen Verfahren erhalten werden.
  • Die Antisinn-Oligonucleotide, worin X und Y in der chemischen Formel 1 O sind und Z ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist, werden einfach durch einen kommerziell erhältlichen DNA-Synthetisierer synthetisiert (z.B. demjenigen, der von Applied Biosystems hergestellt wird).
  • Antisinn-Oligodeoxyribonucleotide, worin Z ein Wasserstoffatom ist, können durch ein Verfahren erhalten werden, wie z.B. eine Festphasensynthese unter Verwendung von Phosphoramidit oder eine Festphasensynthese unter Verwendung von Hydrogenphosphonat.
  • Siehe beispielsweise T. Atkinson und M. Smith in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Hrsg. M.J. Gait, IRL Press, 35–81 (1984); M.H. Caruthers, Science, 230, 281 (1985); A. Kume, M. Fujii, M. Sekine und M. Hata, J. Org. Chem., 49, 2139 (1984); B.C. Froehler und M. Matteucci, Tetrahedron Lett., 27, 469 (1986); P.J. Garegg, I.Lindh, T. Regberg, J. Stawinski, R. Stromberg und C. Henrichson, ibid., 27, 4051 (1986); B.S. Sproat und M.J. Gait in Oligonculeotide Synthesis: A Practical Approach, Hrsg. M.J. Gait, IRL Press, 83–115 (1984); S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859–1862 (1981); M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 21, 719–722 (1980); und M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185–3191 (1981).
  • Triesterphosphat-modifizierte Formen, worin X eine Niederalkoxygruppe ist, können durch gewöhnliche Verfahren erhalten werden, wie z.B. eine Behandlung eines Oligonuleotids, erhalten durch chemische Synthese mit einer Tosylchloridlösung von DM F, Methanol und 2,6-Lutidin (Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res., 17, 4769–4782 (1989).
  • Alkylphosphonat-modifizierte Formen, worin X eine Alkylgruppe ist, können durch übliche Verfahren erhalten werden, wobei beispielsweise Phosphatmidit verwendet wird (M.A. Dorman, et al., Tetrahedron, 40, 95–102 (1984); und K.L. Agarwal und F. Riftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009–3024 (1979)).
  • Phosphorthioat-modifizierte Formen, worin X S ist, können durch übliche Verfahren, wie z.B. eine Festphasensynthese unter Verwendung von Schwefel erhalten werden (C.A. Stein, et al., Nucleic Acids Res., 16, 3209–3221 (1988) oder unter Verwendung einer Festphasensynthese, wobei Tetraethylthiolamdisulfid verwendet wird (H. Vu und B.L. Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005–3008 (1991)).
  • Phosphordithioat-modifizierte Formen, worin X und Y beide S sind, können beispielsweise durch eine Festphasensynthese durch Umwandlung von Bis-Amidit zu Thioamidit und indem man Schwefel auf das Thioamidit wirken lässt, erhalten werden (W.K.D. Brill, et al., J. Am. Chem. Soc., 111, 2321–2322 (1989)).
  • Phosphoramidat-modifizierte Formen, worin X ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin ist, können beispielsweise durch eine Festphasensynthese durch Behandlung von Hydrogenphosphonat mit einem primären oder sekundären Amin erhalten werden (B. Froehler, et al., Nucleic Acids Res., 16, 4831–4839 (1988)) oder durch Oxidation von Amidit mit tert-Butylhydroperoxid (H. Ozaki, et al., Tetrahedron Lett., 30, 5899–5902 (1989)).
  • Obwohl eine Synthese von Antisinn-Oligoribonucleotiden, worin Z eine Hydroxylgruppe ist, im Vergleich mit der Synthese von Antisinn-Oligodeoxyribonucleotiden extrem schwierig ist, da die 2'-Hydroxylgruppe an der Ribose (dem Zucker) geschützt werden muss, können solche durch geeignete Wahl der Schutzgruppe und ein Phosphorylierungsverfahren synthetisiert werden (siehe Basic Microbiology Course, Bd. 8, Genetic Engineering, E. Ohtsuka, K. Miura, Hrsg. T. Ando und K. Sakaguchi, 10. Okt. 1989, Kyoritsu Publishing Co., Ltd.).
  • Die Reinigung und die Bestätigung der Reinheit kann durch eine Hochleistungsflüssigchromatografie und eine Polyacrylamidelektrophorese geschehen. Die Bestätigung des Molekulargewichts kann durch Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie oder Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie geschehen.
  • Das Antisinn-Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung wirkt auf jeder Stufe von genomischer DNA bis zu reifer mRNA und die Unterdrückung seiner Expression sollte das Wachstum von Leukämiezellen inhibieren. So wird erwartet, dass die Antisinn-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Leukämie effektiv sind.
  • Weiterhin wird angenommen, wie später beschrieben werden wird, dass die Antisinn-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung Leukämiezellen spezifisch inhibieren ohne das Wachstum normaler Knochenmarkszellen zu inhibieren. So können sie auch auf die "autologe Knochenmarkstransplantation" und die "autologe periphere Blutstammzelltransplantation" angewandt werden, worin beispielsweise nach zunächst einer Entfernung von Knochenmarkszellen oder peripheren Blutstammzellen aus dem Körper und Behandlung derselben in vitro mit den Antisinn-Oligonucleotiden der vorliegenden Erfindung zur Inhibition des Wachstums von Leukämiezellen, nur normale Knochenmarkszellen oder normale periphere Blutstammzellen in den Körper zurückgeführt werden.
  • Die Antisinn-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können auch in Form einer externen Präparation, die z.B. als Einreibemittel oder Breiumschlag durch Vermischen mit einer geeigneten inaktiven Basis verwendet werden.
  • Zusätzlich können die Antisinn-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung auch in Form von Tabletten, Pulvern, Körnern, Kapseln, Liposomenkapseln, Injektionspräparationen, Flüssigkeiten oder Nasentropfen durch Zugabe eines Vehikels, eines isotonischen Mittels, eines Löslichkeits-unterstützenden Mittels, eines Stabilisators, eines Konservierungsmittels oder eines Analgetikums usw. je nach Bedarf verwendet werden oder können zu gefriergetrockneten Präparationen formuliert werden. Diese Formulierungen können gemäß Routineverfahren hergestellt werden.
  • Die Antisinn-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können direkt auf den betroffenen Bereich der Patienten angewandt werden oder können so angewandt werden, dass sie den betroffenen Bereich als Ergebnis einer intravaskulären Verabreichung usw. erreichen können. Weiterhin können Antisinn-Einschlussmaterialien ebenfalls verwendet werden, um die Dauer und Membranpermeation zu verbessern. Beispiele für diese beinhalten Liposomen, Poly-L-Lysin, Lipide, Cholesterin Lipofectin und ihre Derivate.
  • Die Dosis des Antisinn-Oligonucleotids der vorliegenden Erfindung wird so gewählt, dass eine bevorzugte Menge verwendet werden kann, indem eine Dosis auf geeignete Weise gemäß dem Zustand des Patienten, seines Alters, Geschlechts und Körpergewichts hergestellt wird. Zusätzlich kann das Verabreichungsverfahren in geeigneter Weise aus verschiedenen Verabreichungsverfahren gewählt werden, einschließlich einer oralen Verabreichung, einer intramuskulären Verabreichung, einer intraperitonealen Verabreichung, einer intradermalen Verabreichung, einer subkutanen Verabreichung, einer intravenösen Verabreichung, einer intraarteriellen Verabreichung und einer rektalen Verabreichung gemäß dem Zustand des Patienten, der Arzneimittelform usw.
  • Im folgenden wird eine detaillierte Erklärung der vorliegenden Erfindung durch die Beispiele bereitgestellt.
  • BEISPIELE
  • SYNTHESEBEISPIEL 1
  • Die unten verwendeten Oligodeoxyribonucleotide (SEQ ID NOs: 1 bis 8) wurden unter Verwendung eines automatischen Synthetisierers (Applied Biosystems) synthetisiert, durch Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt, dreimal mit Ethanol ausgefällt und in Phopshatpuffer suspendiert. Die synthetisierten Oligonucleotide waren die unten aufgeführten.
    SEQ ID NO: 1: Sinnsequenz der Transkriptions-Cap-Stelle (SE1)
    SEQ ID NO: 2: Antisinn-Sequenz der Transkriptions-Cap-Stelle (AS1)
    SEQ ID NO: 3: Sinnsequenz der Transkriptions-Cap-Stelle (SE2)
    SEQ ID NO: 4: Antisinn-Sequenz der Transkriptions-Cap-Stelle (AS2)
    SEQ ID NO: 5: Sinnsequenz der Transkriptions-Startregion (SE3)
    SEQ ID NO: 6: Antisinn-Sequenz der Transkriptions-Startregion (AS3)
    SEQ ID NO: 7: Sinnsequenz von Exon 6 (SE4)
    SEQ ID NO: 8: Antisinn-Sequenz von Exon 6 (AS4)
  • BEISPIEL 1
  • 5 × 104 Zellen/ml der Leukämiezelllinie K562, die für die WT1-Expression positiv ist, wurden in RPMI 1640-Medium inokuliert, das kein fötales Kälberserum (FCS) enthielt, enthalten in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in einer Menge von 100 μl/Vertiefung. Jedes Oligonucleotid wurde zu einer Reihe von drei Vertiefungen auf eine Endkonzentration von 200 μg/Vertiefung zugefügt. Nach 2-stündiger Inkubation wurde FCS jeder Vertiefung auf eine Endkonzentration von 10 % zugefügt. Dann wurden der Kultur Oligonucleotide in einer entsprechenden Menge zu der Hälfte der oben erwähnten Menge alle 24 Stunden zugefügt.
  • Nach einer Kultivierung für 96 Stunden wurde die Zahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung des Pigmenteliminierungsverfahrens gezählt. Ein gleiches Volumen PBS, das keine Nucleotide enthielt, wurde als Kontrollkultur zugefügt und die Zahl von Zellen dieser Kontrollkultur wurde als 100 % angenommen.
  • Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Wie aus dieser Figur deutlich wird, inhibierten alle Antisinn-Oligonucleotide das Zellwachstum im Vergleich mit den korrespondierenden Sinn-Oligonucleotiden deutlich.
  • BEISPIEL 2
  • Dasselbe Experimente, wie das in Beispiels 1 beschriebene, wurde durchgeführt, jedoch wurden die Oligonucleotide SE3 und AS3 in unterschiedlichen Konzentrationen zugefügt. Wie aus 2 deutlich wird, inhibierte das Antisinn-Oligonucleotid (AS3) das Zellwachstum in dosisabhängiger Weise, obwohl das Sinn-Oligonucleotid (SE3) das Zellwachstum fast nicht inhibierte.
  • BEISPIEL 3
  • Dasselbe Experimente, wie das in Beispiels 1 beschriebene, wurde durchgeführt, jedoch wurden die Oligonucleotide SE4 und AS4 in unterschiedlichen Konzentrationen zugefügt. Wie aus 3 deutlich wird, inhibierte das Antisinn-Oligonucleotid (AS4) das Zellwachstum in dosisabhängiger Weise, obwohl das Sinn-Oligonucleotid (SE4) das Zellwachstum praktisch nicht inhibierte.
  • BEISPIEL 4
  • Dasselbe Experimente, wie das in Beispiels 1 beschriebene, wurde durchgeführt. Die Zellen wurden jedoch in einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen und einem flachen Boden mit einer Konzentrationen von 5 × 104 Zellen/ml und einer Menge von 1 ml/Vertiefung kultiviert. Die Oligonucleotide SE3 und AS3 wurden zugefügt und die Zahl der lebensfähigen Zellen wurde täglich für 2 bis 5 Tage gezählt. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Wie aus dieser Figur deutlich wird, wurde, obwohl das Zellwachstum ähnlich war wie bei der Kontrolle im Fall der Zugabe von Sinn-Oligonucleotiden, im Fall der Zugabe von Antisinn-Oligonucleotiden eine Inhibition des Zellwachstums beobachtet.
  • BEISPIEL 5
  • Dasselbe Experiment, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durchgeführt. Jedoch wurden SE3, AS3 und ein Antisinn-Oligonucleotid 5'-AGAGAAGAAGGGAACCCC-3' (SEQ ID NO: 20) (MPO-AS) gegen das Myeloperoxidase (MPO)-Gen und ein Antisinn-Oligonucleotid 5'-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-3' (SEQ ID NO: 21) (FV-AS) gegen den Blutkoagulationsfaktor V (FV) als Oligonucleotide verwendet. Wie aus 5 deutlich wird, wurde das Zellwachstum nur im Fall der Verwendung von AS3 inhibiert.
  • BEISPIEL 6
  • Dasselbe Experimente, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durchgeführt, jedoch wurden WT1-Expressionspositive Zelllinien HEL und THP-1, wie auch die WT1-Expressions-negative Zelllinie U937 als experimentelle Zellen verwendet. Dieselben acht Oligonucleotidtypen, die in Bespiel 1 verwendet wurden, wurden als Oligonucleotide verwendet. In Fall der Verwendung der WT1-Expressionspositiven Zelllinien HEL (6) oder THP-1 (7) wurde das Zellwachstum durch Antisinn-Oligonucleotid inhibiert. Demgegenüber wurde das Zellwachstum im Fall der Verwendung der WT1-Expressions-negativen Zelllinie U937 (8) nicht inhibiert, selbst wenn Antisinn-Oligonucleotid zugefügt wurde.
  • BEISPIEL 7
  • Knochenmarkszellen von Leukämie-Patienten und gesunden Freiwilligen wurden mit Heparin behandelt und in RPMI 1640-Medium suspendiert, um mononucleäre Knochenmarkszellen durch eine Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation zu erhalten. Ein Protein (100 μl/Vertiefung) der oben erwähnten mononucleären Zellen bei einer Zelldichte von 1,5 × 106 Zellen/ml wurde zu einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden, enthaltend α-MEM, enthaltend GM-CSF (100 ng/ml) und IL-3 (100 Einheiten/ml), zugefügt. Die Behandlung mit den Oligonucleotiden (SE3 und AS3) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
  • Nach 96 Stunden wurden die Zellen gesammelt und in Methylcellulosemedium [1,2 % Methylcellulose α-MEM, 20 FCS, GM-CSF (100 ng/ml), G-CSF (100 ng/ml), IL-3 (100 Einheiten/ml) und SCF (10 ng/ml)] ausplattiert. Die Kultivierung wurde in drei Reihen durchgeführt. Die Zahl der Leukämiezellkolonien (KBE-L) und der granulocytischen Makrophagenkolonien (KBE-GM) wurde am Tag 14 gezählt.
  • 9 zeigt die Morphologie der Leukämiekolonien in Proben von vier Leukämie-Patienten (zwei akute Myeloid-Leukämie (AML)-Patienten und zwei chronische Myeloid-Leukämie (CML)-Patienten). Es kann gesehen werden, dass die Bildung von Kolonien durch Antisinn-Oligonucleotid inhibiert wird. 10 zeigt das Erscheinen granulocytischer Makrophagenkolonien in Proben von gesunden Freiwilligen. Die Koloniebildung wird von keinem der Antisinn-Oligonucleotide inhibiert.
  • BEISPIEL 8
  • Zufälliges Oligonucleotid, Oligonucleotid AS1, Oligonucleotid AS2 oder Oligonucleotid AS3 wurden bei einer Konzentration von 200 μg/ml zu K562-Zellen (A) oder frischen Leukämiezellen von einem Patienten mit AML (B) bei einer Zelldichte von 5 × 104 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen zugefügt, gefolgt von einer Zugabe der Oligonucleotide bei einer Konzentration von 100 μg/ml alle 24 Stunden. Die Zellen wurden 4 Tage nach der anfänglichen Behandlung mit Oligonucleotid geerntet, mit PBS gewaschen und mit Laemli-Probenpuffer lysiert.
  • Jedes Zelllysat von 2 × 104 Zellen wurde 5 Minuten gekocht und dann auf jede Spur eines 5%igen Dodecylnatriumsulfat-Polyacrylamidgels aufgebracht. Folgend auf die Elektrophorese wurden die Proteine auf einen Immobilon-Polyvinylidendifluorid-Filter (Millipore Corp. MA, USA) übertragen. Dieser Filter wurde dann unter Verwendung eines Anti-WT1-polyklonalen Antikörpers zu synthetischem Polypeptid (Aminosäurepositionen 177 bis 192: Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln (SEQ ID NO: 22)) als Sonde durchsucht. Auf dies folgte eine Behandlung mit Meerrettich-Peroxidasegebundenem Anti-Immunglobulin-Antikörper (Amersham, Little Chalfont, U.K.). Nach einem Waschen wurde der Filter in Nachweisreagens (Amersham, Little Chalfon, U.K.) für 1 Stunde eingetaucht, gefolgt von einer Autoradiografiebehandlung für 1 bis 5 Minuten.
  • Nach zweimaligem Waschen mit TBST (Tris-Puffer, der 0,05 % Tween 20 enthält) wurde der Filter mit Anti-Actinmonoclonalem Antikörper (Oncogene Science Inc., NY, USA) als Sonde durchsucht, gefolgt von einer Autoradiografie auf dieselbe Weise wie oben beschrieben.
  • Die Dichte der Banden, korrespondierend zu dem WT1-Protein und Actin wurden mit einem CS-9000-Densitometer (Shimizu, Kyoto) gemessen, gefolgt von einer Berechnung des WT1/Actin-Verhältnisses.
  • Die Ergebnisse sind in 11A und B dargestellt. In diesen Figuren zeigt Spur 1 die Ergebnisse im Fall der Zugabe von zufälligem Oligonucleotid, Spur 2 den Fall der Zugabe von Oligonucleotid AS3, Spur 3 den Fall der Zugabe von Oligonucleotid AS1 und Spur 4 den Fall der Zugabe von Oligonucleotid AS2. In diesen Figuren gibt A die Ergebnisse im Fall der Verwendung von K562-Zellen an, während B diejenigen im Fall der Verwendung von frischen Leukämiezellen von einem Patienten mit AML angibt.
  • Wie aus 11A deutlich wird, verminderte sich im Fall der Zugabe von WT1-Oligonucleotid zu einem Medium, das K562-Zellen enthielt, das Niveau des WT1-Proteins signifikant. Andererseits beeinflusste die Kontrolle in Form eines Zufalls-Nucleotids das Niveau des WT1-Proteins nicht. Außerdem wird zusätzlich aus 11B deutlich, dass im Fall der Zugabe von WT1-Oligonucleotid zu einem Medium, das Leukämiezellen enthielt, die kurz zuvor von einem Patienten mit AML isoliert wurden, das Niveau von WT1-Protein signifikant abnahm. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass das WT1-Antisinn-Oligonucleotid das Wachstum von Leukämiezellen durch Verminderung des Niveaus des WT1-Proteins spezifisch inhibiert.
  • GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
  • Wie oben dargestellt, sind die Antisinn-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung bei der Inhibition des Wachstums von Leukämiezellen wirksam und es wird daher erwartet, dass sie als neue Leukämie-Behandlung nützlich sind.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (4)

  1. Wachstumsinhibitor für Leukämiezellen, enthaltend ein Antisinn-Oligonukleotid zu dem Wilms'-Tumorgen (WT1), wobei das Oligonukleotid eine Länge von 9-30 Nukleotiden aufweist und mindestens neun kontinuierliche Nukleotide von einer der folgenden Sequenzen umfasst: 5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' (SEQ ID NO:2), 5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID NO:4), 5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' (SEQ ID NO:6) oder 5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID NO:8).
  2. Wachstumsinhibitor für Leukämiezellen gemäss Anspruch 1, worin das Oligonukleotid aus der folgenden Nukleotidsequenz besteht: 5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' (SEQ ID NO:2), oder 5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID NO:4).
  3. Wachstumsinhibitor für Leukämiezellen gemäss Anspruch 1, worin das Oligonukleotid aus der folgenden Nukleotidsequenz besteht: 5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' (SEQ ID NO:6).
  4. Wachstumsinhibitor für Leukämiezellen gemäss Anspruch 1, worin das Oligonukleotid aus der folgenden Nukleotidsequenz besteht: 5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID NO:8).
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