ES2268705T3 - Inhibidor del crecimiento de celulas leucemicas que contienen un derivado oligonucleotidico antisentido frente al gen del tumor de wiloms (wt1). - Google Patents
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Abstract
UN INHIBIDOR DEL CRECIMIENTO DE CELULAS LEUCEMICAS QUE CONTIENE DERIVADOS DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA EL GEN DEL TUMOR DE WILM (WT1).
Description
Inhibidor del crecimiento de células leucémicas
que contiene un derivado oligonucleotídico antisentido frente al gen
del tumor de Wilms (WT1).
La presente invención se refiere a un inhibidor
del crecimiento para células de leucemia, que comprende un derivado
nucleotídico antisentido.
El tumor de Wilms es un tumor de riñón
pediátrico que ocurre como resultado de la desactivación de ambos
alelos del gen del tumor de Wilms (WT1) ubicado en el cromosoma
11p13 (Call, K.M., et al., Cell 60: 509, 1990). Una secuencia
de WT1 en dirección 5', no codificante (C.E. Campbell, et
al., Oncogene 9: 583-595, 1994) y una región
codificante que incluye el intrón (D.A. Haber, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9618-9622, 1991) han sido
dadas a conocer previamente, y es de suponer que estén implicadas en
el crecimiento y la diferenciación del tumor y demás (D.A. Haber,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:
9618-9622, 1991).
Pritchard-Jones et al en
Human Molecular Genetics, Vol 3, 1994, p.1633-1637
sugieren que el gen WT1 está implicado en la regulación de la
diferenciación hematopoyética y en la leucemogénesis. Rothenpieler
en The Journal of The American Society of Nephrology, vol 5, 1994,
página 635 describe oligonucleótidos antisentido dirigidos contra
WT1. Phelan et al en Cell Growth & Differentiation, vol
5, Junio 1994, páginas 667-686 indican que el mRNA
de WT1 es regulado a la baja en células K562 durante cierta
inducción estudiada de diferenciación eritroide y megacariocítica,
indicando que esta regulación a la baja no es un fenómeno
generalizado de inhibición del crecimiento. Sugieren experimentos
antisentido y sentido para estudiar el papel de la proteína WT1 en
la diferenciación de células K562.
La presente invención proporciona un inhibidor
del crecimiento para células de leucemia que comprende un
oligonucleótido antisentido que se dirigen contra el gen del tumor
de Wilms (WT1), según se define en las reivindicaciones anejas.
Fig. 1 es una gráfica que indica los efectos
inhibidores del oligonucleótido sobre el crecimiento de la línea
celular de leucemia K562.
Fig. 2 es una gráfica que indica la relación
entre las concentraciones de oligonucleótidos SE3 y AS3 y el
crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 3 es una gráfica que indica la relación
entre las concentraciones de oligonucleótidos SE4 y AS4 y el
crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 4 es una gráfica que indica los efectos en
función del tiempo de los oligonucleótidos SE3 y AS3 sobre el
crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 5 es una gráfica que indica los efectos de
diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la línea celular
de leucemia K562.
Fig. 6 es una gráfica que indica los efectos
inhibidores de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la
línea celular de leucemia HEL positiva para la expresión de WT1.
Fig. 7 es una gráfica que indica los efectos
inhibidores de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la
línea celular de leucemia THP-1 positiva para la
expresión de WT1.
Fig. 8 es una gráfica que indica los efectos
inhibidores de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la
línea celular de linfoma maligno U937 negativa para la expresión de
WT1.
Fig. 9 es una gráfica que indica los efectos de
los oligonucleótidos SE3 y AS3 sobre la formación de colonias de
células de leucemia a partir de células mononucleares de médula ósea
obtenidas a partir de pacientes leucémicos.
Fig. 10 es una gráfica que indica los efectos de
los oligonucleótidos SE3 y AS3 sobre la formación de colonias de
macrófagos granulocíticos a partir de células mononucleares de
médula ósea obtenidas a partir de voluntarios sanos.
Fig. 11, el panel A es una fotografía de los
resultados de la electroforesis que indica una disminución en el
nivel de la proteína WT1 en células en el caso de añadir diversos
oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra WT1 a un cultivo
de células K562; el panel B indica una disminución en el nivel de
proteína WT1 en las células en el caso de añadir oligonucleótidos
antisentido que se dirigen contra WT1 a células de leucemia recién
obtenidas de un paciente con AML.
La presente invención proporciona un inhibidor
del crecimiento de células de leucemia, que comprende un
oligonucleótido antisentido que se dirigen contra WT1. Los
oligonucleótidos antisentido usados en la presente invención son
oligonucleótidos antisentido que se dirige contra WT1, ejemplos de
los cuales incluyen uno dirigido contra el sitio caperuza de inicio
de la transcripción de WT1, uno dirigido contra la región de inicio
de la traducción, uno dirigido contra un exón o un dirigido contra
un intrón.
Por ejemplo, una secuencia nucleotídica de una
cadena de DNA sentido de la región que contiene el sitio caperuza
de inicio de la transcripción de WT1 se representa por SEQ ID Nº: 9.
Además, una secuencia nucleotídica de una cadena de DNA sentido de
los exones 1 a 10 de la región codificante de WT1 se representa por
la SEQ ID NO: 10 a 19. La presente invención hace uso de un
oligonucleótido antisentido que se dirige contra tal secuencia
nucleotídica de la cadena de ADN sentido de WT1. Este
oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido antisentido que
comprende 9 a 30 nucleótidos de cadena de DNA o RNA antisentido para
WT1.
Ejemplos de oligonucleótidos antisentido que se
dirigen contra el sitio caperuza de inicio de la transcripción
incluyen los que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos:
5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' (SEQ ID Nº:
2) y 5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ
ID Nº: 4). Además, ejemplos de oligonucleótidos antisentido que se
dirigen contra la región de inicio de la traducción incluyen
oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra el codón ATG de
iniciación de la traducción y su región en 5' y/o en 3' tal como la
secuencia nucleotídica siguiente:
5'-GTCGGAGCC
CATTTGCTG-3' (SEQ ID Nº: 6).
CATTTGCTG-3' (SEQ ID Nº: 6).
Además, hay diez exones contenidos en la región
codificante de WT1 y los ejemplos de los oligonucleótidos
antisentido incluyen los que se dirigen contra las secuencias
contenidas en cualquiera de estos exones, los que se dirigen contra
las secuencias que se extienden a lo largo de dos exones
consecutivos cualesquiera después de la maduración por corte y
empalme, o los que se dirigen a las secuencias que se extienden a lo
largo de un intrón y un exón consecutivos, y los que se extienden a
secuencias de todos los intrones y las regiones no codificantes en
3' y 5'. Un ejemplo de un oligonucleótido antisentido de la presente
invención es el que se dirige al 6º exón, uno de cuyos ejemplos es
el que se dirige a la siguiente secuencia de nucleótidos:
5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID
NO: 8).
Además, se incluyen aquellos oligonucleótidos
similares a ribozimas con la función de escindir la cadena de DNA o
la cadena de RNA para WT1.
La estructura del oligonucleótido antisentido
usado en la presente invención es la indicada en la fórmula química
1, donde X puede ser independientemente un oxígeno (O), un azufre
(O), un grupo alquilo inferior, amina primaria o amina secundaria.
Y puede ser independientemente oxígeno (O) o azufre (S). Z es un
átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo. B se elige entre adenina,
guanina, timina o citosina cuando Z es un átomo de hidrógeno, o se
elige entre adenina, guanina, uracilo o citosina cuando Z es un
grupo hidroxilo, y principalmente es un oligonucleótido
complementario al DNA o mRNA codificante de WT1. R es,
independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo dimetoxitritilo
o un grupo alquilo inferior. N es un número entero de
7-28.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Fórmula pasa a página
siguiente)
Fórmula química
1
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos preferibles de oligonucleótidos
antisentido incluyen no sólo los oligonucleótidos antisentido no
modificados, sino también los oligonucleótidos antisentido
modificados. Ejemplos de estas formas modificadas incluyen formas
alquil inferior fosfonato, como la forma metilfosfonato o la forma
etilfosfonato mencionada anteriormente, y otras formas fosforotioato
o fosforoamidato (véase la fórmula química 2).
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Fórmula pasa a página
siguiente)
Fórmula química
2
\vskip1.000000\baselineskip
Estos oligonucleótidos antisentido se pueden
obtener de acuerdo con los siguientes métodos convencionales.
Los oligonucleótidos antisentido en que X e Y en
la fórmula química 1 son 0 y Z es un átomo de hidrógeno o grupo
hidroxilo son sintetizados fácilmente por un sintetizador de DNA
disponible en el mercado (por ejemplo, el fabricado por Applied
Biosystems).
El oligodesoxirribonucleótido antisentido en el
que Z es un átomo de hidrógeno se puede obtener por un método tal
como síntesis en fase sólida usando fosforoamidito o síntesis en
fase sólida usando hidrógeno fosfonato.
Véase, por ejemplo, T. Atkinson y M. Smith en
Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, ed. M.J. Gait, IRL
Press, 35-81 (1984); M.H. Caruthers, Science, 230,
281 (1985); A. Kume, M. Fujii, M. Sekine and M. Hata, J. Org.
Chem., 49, 2139 (1984); B.C. Froehler y M. Matteucci, Tetrahedron
Lett., 27, 469 (1986); P.J. Garegg, I. Lindh, T. Regberg, J.
Stawinski, R. Stromberg y C. Henrichson, ibid., 27, 4051 (1986);
B.S. Sproat y M.J. Gait en Oligonucleotide Synthesis: A Practical
Approach, ed. M.J. Gait, IRL Press, 83-115 (1984);
S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 22,
1859-1862 (1981); M.D. Matteucci y M.H. Caruthers,
Tetrahedron Lett., 21, 719-722 (1980); y, M.D.
Matteucci y M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103,
3185-3191 (1981).
Las formas modificadas con triéster fosfato, en
las que X es un grupo alcoxi inferior, se pueden obtener por
métodos ordinarios, tales como tratamiento de un oligonucleótido
obtenido por síntesis química con una solución de cloruro de tosilo
en DMF, metanol y 2,6-lutidina (Moody H.M., et
al., Nucleic Acids Res., 17, 4769-4782
(1989).
Las formas modificadas con alquilfosfonato, en
que X es un grupo alquilo, se pueden obtener por métodos
convencionales, utilizando, por ejemplo, fosfoamidito (M.A. Dorman,
et al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984); y,
K.L. Agarwal y F. Riftina, Nucleic Acids Res., 6,
3009-3024 (1979)).
Las formas modificadas con fosforotioato en las
que Z es S se pueden obtener por métodos convencionales como la
síntesis en fase sólida (C.A. Stein, et al., Nucleic Acids
Res., 16, 3209-3221 (1988) o la síntesis en fase
sólida utilizando disulfuro de tetraetiltiolam (H. Vu y B.L.
Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008
(1991)).
Las formas modificadas con fosforoditioato en
las que X e Y son ambos S se pueden obtener, por ejemplo, por
síntesis en fase sólida convirtiendo el bis-amidito
en tioamidito y dejando actuar el azufre sobre el tioamidito (W.K.D.
Brill, et al., J. Am. Chem. Soc., 111,
2321-2322 (1989)).
Las formas modificadas con fosforoamidato en que
X es una amina primaria o amina secundaria se pueden obtener, por
ejemplo, por síntesis en fase sólida, tratando el hidrógeno
fosfonato con una amina primaria o secundaria (B. Froehler, et
al., Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839 (1988)),
u oxidando el amidito con hidroperóxido de
terc-butilo (H. Ozaki, et al., Tetrahedron
Lett., 30, 5899-5902 (1989)).
Aunque la síntesis del oligorribonucleótido
antisentido en el que Z es un grupo hidroxilo es extremadamente
difícil en comparación con la síntesis del
oligodesoxirribonucleótido antisentido ya que debe protegerse el
grupo 2'-hidroxilo de la ribosa (azúcar), puede
sintetizarse eligiendo adecuadamente el grupo protector y el método
de fosforilación (véase, Basic Microbiology Course, Vol. 8, Genetic
Engineering, E. Ohtsuka, K. Miura, ed. T. Ando y K. Sakaguchi, Oct.
10, 1987, Kyoritsu Publishing Co., Ltd.).
La purificación y la confirmación de la pureza
se pueden llevar a cabo por cromatografía de líquidos de alta
eficacia y electroforesis en gel de poliacrilamida. La confirmación
del peso molecular se puede realizar por espectrometría de masas
con ionización por electropulverización, o por espectrometría de
masas con bombardeo de átomos rápidos.
El oligonucleótido antisentido de la presente
invención actúa en cualquier estadio desde DNA genómico hasta mRNA
maduro, y se cree que la supresión de su expresión inhibe el
crecimiento de las células de leucemia. Así, cabe suponer que los
oligonucleótidos antisentido de la presente invención serán eficaces
en el tratamiento de la leucemia.
Más aún, como se describe más adelante, se cree
que los oligonucleótidos antisentido de la presente invención
inhiben específicamente células de leucemia sin inhibir el
crecimiento de células de médula ósea sanas. Así, también se pueden
aplicar al "transplante autólogo de médula ósea" y al
"transplante autólogo de células pluripotenciales de sangre
periférica" en los que, por ejemplo, después de separar primero
las células de médula ósea o las células pluripotenciales de sangre
periférica del cuerpo y tratarlas in vitro con los
oligonucleótidos antisentido de la presente invención para inhibir
el crecimiento de células de leucemia, sólo las células de médula
ósea sanas o las células pluripotenciales de sangre periférica sanas
se devuelven al cuerpo.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente
invención también se pueden utilizar en forma de una preparación
externa tal como un linimento o una cataplasma por mezcla con una
base inactiva adecuada.
Además, los oligonucleótidos antisentido de la
presente invención también se pueden utilizar en forma de
comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposomas,
preparados inyectables, líquidos o gotas nasales por adición de un
vehículo, agente isotónico, coadyuvante de solubilidad,
estabilizante, conservante o analgésico, etc, lo que sea necesario,
o se pueden producir como preparados liofilizados. Estas
formulaciones se pueden preparar de acuerdo con métodos
rutinarios.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente
invención se pueden aplicar directamente a la zona afectada de los
pacientes, o de manera que puedan llegar a la zona afectada como
resultado de la administración intravascular, etc. Además, los
materiales de inclusión antisentido también se pueden utilizar para
mejorar la duración y la penetración en la membrana. Ejemplos de
estos incluyen los liposomas,
poli-L-lisina, lípidos, colesterol,
lipofectina, y sus derivados.
La dosis del oligonucleótido antisentido de la
presente invención es tal que se puede utilizar una cantidad
preferible preparando adecuadamente una dosis de acuerdo con el
estado, la edad, el sexo y el peso corporal del paciente.
Adicionalmente, el método de administración se puede elegir
adecuadamente a partir de varios métodos de administración,
incluida la administración oral, la administración intramuscular, la
administración intraperitoneal, la administración intradérmica, la
administración subcutánea, la administración intravenosa, la
administración intraarterial y la administración rectal, de acuerdo
con el estado del paciente, las formas farmacéuticas, etc.
A continuación se proporciona una explicación
detallada de la presente invención a través de Ejemplos.
Ejemplo de síntesis
1
Los oligodesoxirribonucleótidos utilizados más
abajo (SEQ ID NOS: 1 a 8) fueron sintetizados utilizando un
sintetizador automático (Applied Biosystems), purificados por
cromatografía de líquidos de alta eficacia, precipitados tres veces
con etanol y suspendidos en tampón fosfato. Los oligonucleótidos
sintetizados fueron los enumerados a continuación.
SEQ ID NO: 1: Secuencia sentido del sitio
caperuza de inicio de la transcripción (SE1)
SEQ ID NO: 2: Secuencia antisentido del sitio
caperuza de inicio de la transcripción (AS1)
SEQ ID NO: 3: Secuencia sentido de la región
caperuza de inicio de la transcripción (SE2)
SEQ ID NO: 4: Secuencia antisentido de la región
caperuza de inicio de la transcripción (AS2)
SEQ ID NO: 5: Secuencia sentido de la región de
inicio de la traducción (SE3)
SEQ ID NO: 6: Secuencia antisentido de la región
de inicio de la traducción (AS3)
SEQ ID NO: 7: Secuencia sentido del exón 6
(SE4)
SEQ ID NO: 8: Secuencia antisentido del exón 6
(AS4).
Se inocularon 5 x 10^{4} células/ml de la
línea celular de leucemia K562 positiva para la expresión de WT1 en
medio RPMI 1640 que no incluía suero vacuno fetal (FCS), contenido
en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano en la
cantidad de 100 \mul/pocillo. Cada oligonucleótido fue añadido a
una serie de tres pocillos hasta una concentración final de 200
\mug/pocillo. Después de incubar durante 2 horas, se añadió FCS a
cada pocillo a una concentración final de 10%. Después se añadieron
los oligonucleótidos al cultivo en una cantidad igual a la mitad de
la cantidad mencionada anteriormente cada 24 horas.
Después de cultivar durante 96 horas, se contó
el número de células viables utilizando el método de eliminación de
pigmento. Se añadió un volumen igual de PBS que no contenía
nucleótido, como cultivo control, y se tomó como 100% el número de
células de este cultivo control.
Los resultados se indican en la Fig. 1. Como es
evidente a partir de esta figura, todos los oligonucleótidos
antisentido inhibían poderosamente el crecimiento celular comparando
con los correspondientes oligonucleótidos sentido.
Se realizó el mismo experimento descrito en el
Ejemplo 1, pero se añadieron los oligonucleótidos SE3 y AS3 a
diversas concentraciones. Como es evidente a partir de la Fig. 2,
aunque el oligonucleótido sentido (SE3) virtualmente no inhibía el
crecimiento celular, el oligonucleótido antisentido (AS3) inhibió el
crecimiento celular de manera dependiente de la dosis.
Se realizó el mismo experimento descrito en el
Ejemplo 1, pero se añadieron los oligonucleótidos SE4 y AS4 a
diversas concentraciones. Como es evidente a partir de la Fig. 3,
aunque el oligonucleótido sentido (SE4) virtualmente no inhibía el
crecimiento celular, el oligonucleótido antisentido (AS4) inhibió el
crecimiento celular de manera dependiente de la dosis.
Se realizó el mismo experimento descrito en el
Ejemplo 1. Sin embargo, las células se cultivaron en una placa de
24 pocillos de fondo plano a una concentración de 5 x 10^{4}
células/ml y en la cantidad de 1 ml/pocillo. Se añadieron los
oligonucleótidos SE3 y AS3 y se contó diariamente el número de
células viables durante 2 a 5 días. Los resultados se muestran en
la Fig. 4. Como es evidente a partir de esta figura, aunque se
observó crecimiento celular similar al del control en el caso de
añadir oligonucleótido sentido, en el caso de añadir
oligonucleótido antisentido, el crecimiento celular se inhibía.
Se realizó el mismo experimento descrito en el
Ejemplo 1. Sin embargo, SE3, AS3, un oligonucleótido antisentido
5'-AGAGAAGAAGGGAACCCC-3' (SEQ ID NO:
20) (MPO-AS) dirigido contra el gen de
mieloperoxidasa (MPO), y un oligonucleótido antisentido
5'-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-3' (SEQ ID NO:
21) (FV-AS) contra el factor V de coagulación (FV)
de la sangre se utilizaron como oligonucleótidos. Como es evidente
de la Fig. 5, el crecimiento celular sólo se inhibió en el caso de
utilizar AS3.
Se realizó el mismo experimento descrito en el
Ejemplo 1, pero se usaron las líneas celulares HEL y
THP-1 positivas en expresión de WT1, así como la
línea celular U937 negativa en expresión de WT-1,
como células experimentales. Como oligonucleótidos se utilizaron
los ocho mismos tipos de oligonucleótidos utilizados en el Ejemplo
1. En el caso de usar la línea celular HEL (Fig. 6) o
THP-1 (Fig. 7) positiva en expresión de WT1, el
crecimiento celular se inhibía por el oligonucleótido antisentido.
En cambio, en el caso de usar la línea celular U937 negativa en
expresión de WT-1 (Fig. 8), el crecimiento celular
no se inhibía ni siquiera cuando se añadía el oligonucleótido
antisentido.
Células de médula ósea de pacientes con leucemia
y de voluntarios sanos se trataron con heparina y se suspendieron
en medio RPMI 1640 para obtener células mononucleares de médula ósea
por centrifugación en gradiente de densidad
Ficoll-Hypaque. Se añadió una proteína (100
\mul/pocillo) de las células mononucleares mencionadas
anteriormente a una densidad celular de 1,5 x 10^{6} células/ml a
una placa de 96 pocillos de fondo plano que contenía
\alpha-MEM que contenía GM-CSF
(100 ng/ml) y IL-3 (100 unidades/ml). El tratamiento
con oligonucleótidos (SE3 y AS3) se realizó de la misma manera que
en el Ejemplo 1.
Después de 96 horas, las células se recogieron y
cultivaron en placas en medio de metilcelulosa [1,2% de
metilcelulosa \alpha-MEM, 20% de FCS,
GM-CSF (100 ng/ml), G-CSF (100
ng/ml), IL-3 (100 unidades/ml) y SCF (10 ng/ml)].
El cultivo se realizó en tres series. El día 14 se contó el número
de colonias (CFU-L) y de colonias de macrófagos
granulocíticos (CFU-GM).
La Fig. 9 indica la morfología de las colonias
leucémicas en muestras de cuatro pacientes con leucemia (dos con
leucemia mieloide aguda (AML) y dos con leucemia mieloide crónica
(CML)). Se puede ver que la formación de colonias era inhibida por
el oligonucleótido antisentido. La Fig. 10 indica la apariencia de
las colonias de macrófagos granulocíticos en muestras de
voluntarios sanos. La formación de colonias no es inhibida por
ninguno de los oligonucleótidos antisentido.
Se añadió oligonucleótido al azar,
oligonucleótido AS1, oligonucleótido AS2 u oligonucleótido AS3 a una
concentración de 200 \mug/ml a células K562 (A) o células de
leucemia recién extraídas de un paciente con AML (B) a una densidad
celular de 5 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 24 pocillos,
seguido de la adición de los oligonucleótidos a una concentración de
100 \mug/ml cada 24 horas. Las células se recogieron 4 días
después del tratamiento inicial con oligonucleótido, se lavaron con
PBS y se lisaron con tampón de muestra Laemli.
Cada lisado celular de 2 x 10^{4} células se
calentó a ebullición durante 5 minutos, y después se aplicó a cada
calle de un gel de poliacrilamida con 5% de dodecilsulfato de sodio.
Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a un filtro
de difluoruro de polivinilideno Immobilon (Millipore Corp. MA,
EE.UU). Después este filtro se hibridó usando un anticuerpo
policlonal anti-WT1 a un polipéptido sintético
(posiciones de aminoácidos 177 a 192: Lys His Glu Asp Pro Met Gly
Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln (SEQ ID NO: 22)). Esto fue
seguido de tratamiento con anticuerpo
anti-inmunoglobulina unida a peroxidasa de rábano
picante (Amersham, Little Chalfont, U.K.). Después de lavarlo, el
filtro se sumergió en reactivo de detección (Amersham, Little
Chalfont, U.K.) durante 1 hora seguida de tratamiento
autorradiográfico durante 1 a 5 minutos.
Después de lavar dos veces con TBST (tampón Tris
conteniendo 0,05% de Tween 20), el filtro se hibridó con anticuerpo
monoclonal anti-actina (Oncogene Science Inc., NY,
USA) seguido de autorradiografía de la manera descrita más
arriba.
La densidad de las bandas correspondientes a
proteína WT1 y actina se midió con un densitómetro
CS-9000 (Shimizu, Kyoto) y seguidamente se calculó
la relación WT1/actina.
Los resultados se muestran en la Fig. 11 A y B.
En estas figuras, la calle 1 muestra los resultados en el caso de
añadir oligonucleótido al azar, la calle 2 en el caso de añadir
oligonucleótido AS3, la calle 3 en el caso de añadir
oligonucleótido AS1, y la calle 4 en el caso de añadir
oligonucleótido AS2. En estas figuras, A indica los resultados en
el caso de usar células K562, mientras que B los muestra en el caso
de utilizar células de leucemia recientes de un paciente con
AML.
Como es evidente a partir de la Fig. 11A, en el
caso de añadir oligonucleótido WT1 a medio que contiene células
K562, el nivel de proteína WT1 disminuía significativamente. Por
otro lado, el control en forma de nucleótido al azar no afectó al
nivel de proteína WT1. Además, como es evidente a partir de la Fig.
11B, en el caso de añadir oligonucleótido WT1 a medio que contiene
células leucémicas recién aisladas de un paciente con AML, el nivel
de proteína WT1 disminuía significativamente. Estos resultados
mostraban claramente que el oligonucleótido antisentido WT1 inhibe
específicamente el crecimiento de células de leucemia disminuyendo
el nivel de proteína WT1.
Como se ha expuesto anteriormente, los
oligonucleótidos antisentido de la presente invención son eficaces
inhibiendo el crecimiento de células leucémicas y, por lo tanto,
cabe esperar que sean útiles como nuevo tratamiento para la
leucemia.
SEQ ID Nº: 1
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
CCCACCGCAT TCGACCCT |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 2
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
AGGGTCGAAT GCGGTGGG |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 3
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
CCGGCCCCTC TTATTTGA |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 4
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
TCAAATAAGA GGGGCCGG |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 5
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
CAGCAAATGG GCTCCGAC |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 6
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
GTCGGAGCCC ATTTGCTG |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 7
Longitud de la secuencia: 18 |
de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
AGCGATAACC ACACAACG |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 8
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
CGTTGTGTGG TTATCGCT |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 9
Longitud de la secuencia: 1272 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 10
Longitud de la secuencia: 457 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
Característica de la secuencia: Porción de exón 1 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 11
Longitud de la secuencia: 123 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
de la secuencia: Exón 2 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 12
Longitud de la secuencia: 103 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Característica de la secuencia: Exón 3 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 13
Longitud de la secuencia: 78 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
de la secuencia: Exón 4 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 14
Longitud de la secuencia: 51 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Característica de la secuencia: Exón 5 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGAA ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 15
Longitud de la secuencia: 97 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Característica de la secuencia: Exón 6 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 16
Longitud de la secuencia: 151 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
de la secuencia: Exón 7 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 17
Longitud de la secuencia: 90 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
Característica de la secuencia: Exón 8 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 18
Longitud de la secuencia: 93 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Característica de la secuencia: Exón 9 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 19
Longitud de la secuencia: 158 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
de molécula: DNA sintético |
de la secuencia: Porción de exón 10 del gen WT1 |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 20
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
AGAGAAGAAG GGAACCCC |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 21
Longitud de la secuencia: 18 |
Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
Tipo de cadena: Monocatenaria |
Tipo de molécula: DNA sintético |
Secuencia: |
GCGTGGGCAG CCTGGGAA |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 22
Longitud de la secuencia: 16 |
Tipo de secuencia: Aminoácido |
Tipo de molécula: Péptido sintético |
Secuencia: |
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
Leu Gly Gln Gln Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: KISHIMOTO, TADAMITSU
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DOMICILIO: 3-5-31, NAKANO-CHO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: TONDABAYASHI-SHI
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: OSAKA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: JAPÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 562/JP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBIDOR DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS LEUCÉMICAS QUE CONTIENE DERIVADO OLIGONUCLEOTÍDICO ANTISENTIDO CONTRA EL GEN DEL TUMOR DE WILMS (WT1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96914430.2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCACCGCAT TCGACCCT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGTCGAAT GCGGTGGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGCCCCTC TTATTTGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAAATAAGA GGGGCCGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAAATGG GCTCCGAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGGAGCCC ATTTGCTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGATAACC ACACAACG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTGTGTGG TTATCGCT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1272 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 457 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 103 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGAA ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 151 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGAAGAAG GGAACCCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTGGGCAG CCTGGGAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
Leu Gly Glu Gln Gln}
Claims (4)
1. Un inhibidor del crecimiento para células de
leucemia que contiene un oligonucleótido antisentido frente al gen
del tumor de Wilms (WT1), en donde el oligonucleótido tiene
9-30 nucleótidos de longitud y comprende al menos
nueve nucleótidos continuos de una de las siguientes secuencias de
nucleótidos
2. Un inhibidor del crecimiento de células de
leucemia según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido
consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos
3. Un inhibidor del crecimiento de células de
leucemia según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido
consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos
4. Un inhibidor del crecimiento de células de
leucemia según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido
consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos
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