PT1103564E

PT1103564E - Antigénios de cancro com base no produto do gene supressor de tumor wt1

Info

Publication number: PT1103564E
Application number: PT99933205T
Authority: PT
Inventors: Haruo Sugiyama; Yoshihiro Oka
Original assignee: Int Inst Cancer Immunology Inc
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2009-03-13
Also published as: ES2318898T3; HK1153761A1; ATE420112T1; US7517950B2; CN102198266A; US20160243209A1; US20090281043A1; CN1560078B; CN1560078A; CN1178956C; EP1103564B1; JP5230579B2; DK1103564T3; KR20010072112A; HK1038929A1; CN1314916A; US7807792B2; EP1103564A4; EP1103564A1; US7390871B2

Description

DESCRIÇÃO

"ANTIGÉNIOS DE CANCRO COM BASE NO PRODUTO DO GENE SUPRESSOR DE TUMOR WT1"

Campo técnico A presente invenção refere-se a antigénios de tumor com base nos produtos de WT1, o gene supressor de tumor do tumor de Wilms. Os antigénios de tumor são úteis como vacinas anticancro contra tumores do sangue, tais como leucemia, síndromas mielodisplásicos, mieloma múltiplo e linfoma maligno, ou tumores sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, tumor das células germinais, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical e cancro do ovário, assim como todos os cancros que expressam WT1.

Antecedentes da técnica

Os mecanismos imunológicos para rejeitar material estranho são geralmente compreendidos por: a imunidade humoral que envolve macrófagos que reconhecem antigénios e funcionam como células apresentadoras de antigénio, células T auxiliares que activam outras células T, etc., através do reconhecimento do antigénio apresentado pelos referidos macrófagos e produzindo depois várias citocinas, células B que se diferenciam em células produtoras de anticorpo pela acção das referidas linfocinas, etc., assim como a imunidade celular em que as células T 1 assassinas que sofrem diferenciação em resposta à apresentaçao do antigénio e atacam e destroem as células alvo.

Actualmente, a imunidade ao cancro é principalmente considerada como sendo derivada da imunidade celular, em que as células T assassinas participam. Na imunidade celular que envolve a célula T, as células T precursoras que reconheceram um antigénio de tumor, apresentado na forma de um complexo entre o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e o antigénio de tumor, diferencia-se e propaga-se para produzir células T assassinas que atacam e destroem as células de tumor. Nesta altura, as células de tumor apresentam, à sua superfície, o antigénio do complexo do MHC classe I e o antigénio de tumor, que é o alvo das células T assassinas (Cur. Opin. Immunol., 5: 709, 1993; Cur. Opin, Immunol, 5: 719, 1993; Cell, 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995). O antigénio de tumor apresentado acima pelo MHC classe I, antigénio à superfície das células de tumor alvo, é considerado como sendo um péptido composto por cerca de 8 a 12 aminoácidos produzidos após a proteína do antigénio sintetizada nas células de tumor sofrer processamento através de proteases intracelulares (Cur. Opin. Immunol., 5: 709, 1993; Cur. Opin,

Immunol, 5: 719, 1993; Cell, 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995).

Actualmente, as proteínas antigénio têm sido procuradas para vários cancros, mas apenas algumas demonstraram ser antigénios específicos de cancro. WT1, um gene supressor do tumor de Wilms (gene WT1) foi isolado do cromossoma llpl3 como um dos genes causadores do 2 tumor de Wilms com base na análise do síndroma de WAGR que teve complicação de Tumor de Wilms, aniridia, anomalia urogenital, atraso mental, etc. (Gessler, M. et al. , Nature, 343: 774-778 (1990)) e o ADN genómico tem cerca de 50 Kb e é composto de dez exões, dos quais o ADNc tem cerca de 3 Kb. A sequência de aminoácidos deduzida do ADNc é como apresentado na SEQ ID N° : 1 (Mol. Cell. Biol.r 11: 1707, 1991). A partir dos factos de que o gene WT1 é altamente expresso em leucemia humana e que o tratamento de células de leucemia com oligómeros anti-sentido para WTl resulta na supressão de crescimento celular (Publicação de Patente Japonesa Não examinada (Kokai) N° 9-104627), foi sugerido que o gene WTl promovia o crescimento de células de leucemia. Além disso, verificou-se que WTl era altamente expresso em tumores sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro das células de pulmão, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical e cancro do ovário (Pedido da Patente Japonesa (Tokugan) 9-191635) e foi demonstrado que o gene WTl era um novo marcador de tumor em leucemia e tumores sólidos. Contudo, não foi confirmado que os produtos da expressão do gene WTl são antigénios específicos de tumor úteis como uma vacina para o cancro.

Divulgação da Invenção

Deste modo, a presente invenção pretende confirmar a possibilidade do produto de expressão do gene WTl ser um antigénio de tumor e proporcionar um novo antigénio de tumor. 3

Após pesquisa intensa para resolver os problemas acima, a requerente da presente invenção sintetizou polipéptidos possuindo 7 a 30 aminoácidos contíguos contendo, pelo menos, um aminoácido que se espera funcionar como um aminoácido de âncora na ligação com MHC classe I e MHC classe II de murganho e de humano na sequência de aminoácidos do produto de expressão do gene WT1, confirmou que estes péptidos se ligam a proteínas do MHC e, quando ligadas ao antigénio de MHC classe I, induzem células T assassinas e exercem efeitos citocidas na célula alvo e completaram, deste modo, a presente invenção.

Assim, a presente invenção proporciona um antigénio de tumor compreendendo um produto de expressão de WT1 de murganho ou uma sua porção. De acordo com uma forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um antigénio de tumor que compreende, como um ingrediente activo, um péptido possuindo 6 a 30 aminoácidos contendo um aminoácido âncora necessário para ligação às moléculas MHC na sequência de aminoácidos como apresentado em SEQ ID N°: 1 que corresponde ao ADNc de WT1.

Além disso, a presente invenção proporciona um antigénio de tumor que compreende, como um ingrediente activo, um péptido possuindo 7 a 30 aminoácidos contendo um aminoácido âncora para ligação às moléculas MHC na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2 que corresponde ao ADNc de WT1 humano. A presente invenção também proporciona uma vacina para cancro compreendendo o antigénio de tumor acima. 4

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um gráfico apresentando uma proporção de células CD4+ e CD8+ em citometria de fluxo nas células imunizadas com o péptido Db 126 e células não imunizadas no Exemplo 1. A Figura 2 é um gráfico que compara o efeito citocida das células imunizadas com o péptido Db 126 nas células alvo pulsadas com o péptido Db 126 e as células alvo não pulsadas no Exemplo 2. A Figura 3 é um gráfico possuindo o mesmo significado como na Figura 2. A Figura 4 é um gráfico em que A representa o efeito citocida de CTL induzido pelo péptido Db 126 nas células T2 pulsadas com o péptido Db 126 no Exemplo 3, e B representa o efeito citocida de CTL induzido pelo péptido WH 187 nas células T2 pulsadas com o péptido WH 187 no Exemplo 3. A Figura 5 é um gráfico apresentando o resultado da análise de FACS aos marcadores de superfície de CTL induzidos pelo péptido Db 126 (células CD19 e células CD3). A Figura 6 é um gráfico semelhante à Figura 5 no que respeita às células CD4 e às células CD8. A Figura 7 é um gráfico semelhante à Figura 5 no que respeita às células CD56. 5 A Figura 8 é um gráfico apresentando o resultado da análise de FACS aos marcadores de superfície de CTL induzidos pelo péptido WH 187 (células CD19 e células CD3). A Figura 9 é um gráfico semelhante à Figura 8 no que respeita às células CD4 e às células CD8. A Figura 10 é um gráfico semelhante à Figura 8 no que respeita às células CD56. A Figura 11 é um gráfico apresentando o efeito do anticorpo antÍ-HLA-A2.1 na lise específica de células T2 pulsadas com o péptido Db 126 pelos CTL específicos para o péptido Db 126 . A Figura 12 é um gráfico comparando a actividade lítica dos CTL específicos para o péptido Db 126 nas células alvo que expressam ou não expressam WT1. Na figura, a apresenta o resultado obtido quando a proporção E:T é 7,5:1 e b apresenta o resultado obtido quando a proporção E:T é 15:1. A Figura 13 é um gráfico que compara a actividade lítica dos CTL específicos para o péptido Db 126 em células de tumor (FBL3) que inerentemente expressam WT1 e as células de tumor (RMA) que não expressam WT1. A Figura 14 é um gráfico que compara a actividade lítica de CTL específicos para o péptido Db 126 nas células que foram transformadas com o gene WTl e as mesmas células que não foram transformadas. 6 A Figura 15 é um gráfico apresentando o efeito do anticorpo anti-H-2Db na citotoxicidade dos CTL específicos para o péptido Db 126. A Figura 16 é um gráfico apresentando o efeito imunológico in vivo quando os murganhos foram imunizados com o péptido Db 126 como uma vacina. A Figura 17 é um gráfico apresentando o efeito imunológico quando um plasmídeo que expressa WT1 é administrado a murganhos como uma vacina de ADN. A Figura 18 é um gráfico apresentando a ausência do efeito imunológico quando um plasmídeo que não expressa WT1 é administrado.

Melhor Forma de Realização da Invenção

De acordo com a presente invenção, Kb e Db de MHC classe I de murganhos e A* 0201 de HLA humano foram seleccionados como uma base para o desenho de péptidos antigénio de tumor e foram seleccionados péptidos que se esperava tivessem uma elevada afinidade com estes.

Com base na descrição em Immunogenetics 41: 178-228 (1995), espera-se que Phe e Tyr na posição 5 e Leu e Met na posição 8, etc., sejam aminoácidos âncora para ligação a Kb e espera-se que Asn na posição 5 e Met e Ile na posição 9, etc., sejam aminoácidos âncora para ligação a Db. 7 É também conhecido que o tamanho do péptido antigénio de tumor apresentado por MHC de classe I à superfície de células de tumor é cerca de 8 a 12. Deste modo, o péptido antigénio de tumor da presente invenção é um péptido possuindo 7 a 30 aminoácidos contíguos contendo um aminoácido âncora na sequência de aminoácidos do produto de expressão do gene WT1 como apresentado em SEQ ID N° : 1. O número de aminoácidos é, de um modo preferido, 8 a 12, por exemplo 8 ou 9.

Como uma forma de realização específica na presente invenção, os péptidos seguintes compreendendo 8 aminoácidos:

Kb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu (SEQ ID N°: 3), e

Kb 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (SEQ ID N°: 4) foram utilizados como péptidos de ligação a Kb de MHC classe I e os péptidos seguintes compreendendo 9 aminoácidos:

Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID N 0 : 5) , Db 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met (SEQ ID N 0 : 6) , Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID N 0 : 7) foram utilizados como péptidos de ligação a Db de MHC classe I. Os aminoácidos sublinhados nas sequências acima são os aminoácidos que se espera funcionarem como âncoras.

Depois, entre estes péptidos, para Kb 45 e Kb 330 a actividade de ligação com Kb de MHC classe I foi medida, e para Db 126, Db 221 e Db 235 a actividade de ligação com Db de MHC classe I foi medida utilizando a linha celular (RMA-S) que não expressa o péptido antigénio endógeno (vazio) e a linha celular (RMA-S) que expressa as moléculas Kb e Db.

Deste modo, RMA-S foi cultivada a 26 °C para produzir expressão elevada de MHC classe I e as células cultivadas foram incubadas com as soluções dos péptidos de teste a 37 °C durante 1 hora. Isto torna a molécula de MHC instável que não se liga ao péptido levando ao seu desaparecimento da superfície da célula e deixando moléculas isoladas de MHC classe I que se ligam ao péptido. Depois, utilizando anticorpo monoclonal marcado com fluorescência que reconhece MHC classe I (Kb, Db), as células RMA-S foram coradas. Finalmente, a constante de dissociação de ligação foi calculada a partir da quantidade média de fluorescência por célula (Immunol. Lett., 47: 1, 1995).

Como resultado, foi obtido o seguinte resultado:

Kb 45 -4,5784838 (log)

Kb 330 -5,7617732 Db 126 -6,2834968 Db 221 -5,7545398 Db 235 -6,1457624

Como aqui referido acima, ambos possuem uma afinidade de ligação forte a moderada (valor de Kd) com Kb ou Db, e o péptido Db 126 possuindo a afinidade de ligação mais elevada foi utilizado na experiência seguinte.

Também para humanos, com base na descrição em Immunogenetics 41: 178-228 (1995), é esperado que Leu e Met na posição 2 do terminal N e Vai e Leu na posição 9 do terminal N sejam aminoácidos âncora para ligação a HLA-A* 0201. Deste modo, os dois péptidos seguintes, possuindo 9 aminoácidos que vão de encontro aos requisitos acima, foram sintetizados na sequência 9 11: de aminoácidos da proteína humana WT1 (Mol. Coll. Biol. 1707-1712, 1991) (SEQ ID N°: 2):

Db 126; Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID N°: 5) (a mesma que a sequência de Db 126 em murganho) WH 187; Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Vai (SEQ ID N°: 8) (os aminoácidos âncora estão sublinhados). A actividade de ligação dos péptidos acima com HLA-A* 0201 foi medida como se segue:

Os péptidos acima e células T2 possuindo as moléculas HLA-A* 0201 vazias (J. Immunol., 150: 1763, 1993; Blood, 88: 2450, 1996) foram incubados a 37 °C durante 1 hora e, depois, as células T2 foram coradas com anticorpo monoclonal marcado com fluorescência que reconhece HLA-A2.1, para calcular a constante de dissociação de ligação com base na quantidade média de fluorescência por célula na análise de FACS.

Actividade de ligação Péptido Kd (M)

Db 126 1, 89 x 10-6 WH 18 7 7, 61 x IO-6

Os dois péptidos possuem uma afinidade de ligação de grau moderado ou superior.

Utilizando a Db 126 e WH 187 acima como um péptido que pode combinar com moléculas de MHC humano de Classe I, foi realizada a experiência aqui descrita posteriormente. 10 A presente invenção também se refere a uma vacina para cancro compreendendo o antigénio acima como um ingrediente activo. Esta vacina pode ser utilizada para profilaxia ou tratamento de tumores do sangue, tais como leucemia, síndromas mielodisplásicos, mieloma múltiplo e linfoma maligno, ou tumores sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, tumor das células germinais, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical e cancro do ovário. A vacina pode ser administrada por via oral ou parentérica, tais como por administração intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e nasal.

Como método de administrar a vacina da presente invenção, pode ser utilizado um método, em que as células mononucleares são recolhidas do sangue periférico do doente, a partir do qual as células dendríticas são removidas e o péptido da presente invenção é pulsado para estas que são, então, devolvidas ao doente através de administração subcutânea, etc.

As vacinas podem conter, adicionalmente ao péptido administrado como o ingrediente activo acima, veículos farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, adjuvantes adequados, tal como um gel mineral como o hidróxido de alumínio; um tensioactivo, tais como lisolecitina, poliól plurónico; um polianião; um péptido; ou uma emulsão oleosa. Alternativamente, podem ser utilizados outros agregados que podem ser misturados em lipossomas ou misturados em polissacáridos e/ou vacinas. A dosagem é normalmente de 0,1 pg até 1 mg/kg por dia.

Na presente invenção, o ADN que codifica a vacina de polipéptido acima pode também ser utilizado como uma vacina 11 (vacina de ADN) . Deste modo, após um ácido nucleico que codifica WT1 ou uma sua porção, de um modo preferido, ADN, ser inserido num vector adequado, de um modo preferido, um vector de expressão, é administrado a um animal para produzir imunidade a cancro. Um exemplo específico é apresentado no Exemplo 9.

Exemplos

Depois, os exemplos seguintes irão demonstrar que o péptido da presente invenção é útil como um antigénio de tumor ou uma vacina para cancro.

Exemplo 1.

Cem pg do péptido Db 126, 200 pg de desidrogenase de lactato porcino e 0,5 mL de adjuvante incompleto de Freund foram injectados intraperitonealmente em murganhos C57BL/6 duas vezes por semana para tratamento por imunização. Uma semana após o tratamento de imunização, o baço de murganho foi extraído, a partir do qual as suspensões de células do baço foram preparadas. Por outro lado, as células de baço irradiadas dos murganhos singeneicos pulsadas com o péptido Db 126 foram incubadas com uma solução contendo 50 pg/mL de péptido a 37 °C, durante 30 minutos, que foi utilizada como a célula de apresentação do antigénio.

As células de baço imunizadas acima e as células de baço irradiadas foram co-cultivadas durante 5 dias para induzir ou preparar células T assassinas. Por outro lado, utilizando as células EL-4 marcadas com Európio (que expressa Kb e Db) pulsadas com o péptido Db 126 (incubadas a 37 °C, durante 30 minutos, com 12 uma solução de péptido de 100 pg/mL) como a célula alvo num método convencional, um ensaio de morte foi realizado no processo seguinte (Tabela 1).

Como resultado, quando as células EL-4 pulsadas com Db 126 foram utilizados como o alvo, foram observados efeitos citocidas, mas quando as células EL-4 não pulsadas com Db 126 foram utilizados como alvo, foram observados alguns efeitos citocidas.

Tabela 1

Murganho A Murganho B Péptido + 76,6% 37,2% Péptido - 4, 9% 0, 9% Proporção E/T 40:1

Depois, as amostras de baço que exibem efeito citocida significativo no ensaio de morte foram coradas com o anticorpo anti-CD4 marcado com fluorescência ou anticorpo anti· -CD8, que foram então sujeitos a citometria de fluxo para analisar a expressão de CD4 e CD8.

Como resultado, como mostrado na Figura 1, nas células de baço imunizadas com o péptido Db 126, houve um aumento nas células CD8+ representadas pelas células T assassinas e a proporção das células CD8+ em relação às células CD4+ representadas pelas células T auxiliares, etc. foi inversamente aumentada em comparação com as células de baço não imunizadas de controlo. 13

Exemplo 2. Células dendríticas (DC) derivadas da medula óssea de murganhos C57BL/6 foram preparadas do seguinte modo. De acordo com o método convencional, as células de medula óssea foram cultivadas na presença de GM-CSF para preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (J. Exp. Med. 182: 255, 1995) .

As células dendríticas cultivada durante 7 dias, 10 μΜ de OVAII (Ovalbumina II) e 1 μΜ de péptido Db 126 foram incubadas durante 3 horas e depois lavadas.

Depois, as células DC acima foram injectadas intradermicamente nas almofadas das patas dianteiras e posteriores de murganhos C57BL/6, e no dia 5 os nódulos linfáticos foram removidos para preparar suspensões celulares. Por outro lado, foram preparadas células B7.1-RMA-S (células RMA-S transf ectadas com um gene codificando B7.1 que é uma molécula co-estimuladora) pulsadas com Db 126 e irradiadas.

Depois, a suspensão de células acima derivadas do nódulo linfático relevante e as células B7.1-RMA-S foram misturadas e cultivadas para reestimulação in vitro.

Depois, no dia 5 após a reestimulação in vitro, foi realizado um ensaio de morte utilizando as células RMA-S marcadas com 51Cr como o alvo. Quando 1/8 dos linfócitos totais recuperados no dia 5 após reestimulação foi utilizado como a célula efectora, a proporção de E/T foi estabelecida como a mais elevada (1,0) . 14

Como mostrado nas Figuras 2 e 3, as células efectoras derivadas dos nódulos linfáticos dos murganhos imunizados com o péptido Db 126 mataram as células alvo pulsadas com o referido péptido, mas não mataram as células alvo que não foram pulsadas com o referido péptido. A análise da proporção das células CD4+ e das células CD8+ por citometria de fluxo realizada como no Exemplo 1 demonstra que CD4 : CD8 = 1 : 1,4 a 1,7 e que nas células de murganho imunizadas com o péptido Db 126 as células CD8+ foram aumentadas e a proporção das células CD4+ : as células CD8+ (cerca de 2 : 1 nas células de controlo) foi revertida nas células imunizadas com o péptido Db 126 em comparação com as células de murganho não imunizadas (controlo).

Exemplo 3.

Foram co-cult ivadas células T2 (5 X 104) que foram irradiadas após incubação durante 1 hora com o péptido Db 126 ou WH 187 (40 pg/mL) e as células mononucleares de sangues periférico (1 X 105) de um humano saudável possuindo HLA-A* 0201. Uma semana mais tarde, células T2 que foram irradiadas após incubação durante 1 hora com o péptido (20 pg/mL) foram adicionadas ao sistema de cultura acima para reestimulação. A partir do dia seguinte, foi adicionado à cultura IL-2 humana (concentração final 100 JRU/mL).

Subsequentemente, após repetir, durante cinco vezes, a estimulação com as células T2 que foram irradiadas após serem pulsadas com o péptido, foi realizado um ensaio de morte utilizando, como o alvo, as células T2 pulsadas com o péptido ou 15 as células T2 nao pulsadas com o péptido. Os marcadores de superfície das CTL induzidas foram sujeitas a análise de FACS. 0 ensaio de morte foi realizado de acordo com o método convencional utilizando, como alvo, as células T2 marcadas com Európio pulsadas com o péptido. A proporção Efector : Alvo (proporção E/T) é 10 : 1

Tempo de Co-cultura : 3 horas

A concentração do péptido na cultura: 5 pg/mL O resultado é mostrado na Figura 4. A na Figura 4 mostra o efeito citocida de CTL induzida utilizando péptido Db 126 nas células T2 pulsadas com o péptido Db 126, e B na Figura 4 mostra o efeito citocida de CTL induzida utilizando o péptido WH 187 nas células T2 pulsadas com o péptido WH 187.

Em qualquer dos casos, foram observados efeitos citocidas mais potentes nas células T2 pulsadas com o péptido.

Os resultados de análise de FACS são mostradas nas Figuras 5 a 10. As Figuras 5 a 7 mostram os resultados de CTL humanas induzidas com o péptido Db 126, indicando que a maioria das células foram CD8-positivas. As Figuras 8 a 10 mostram os resultados de CTL humanas induzidas com o péptido WH 187. As células CD4-positivas e as células CD8-positivas eram quase iguais em número. 16

Exemplo 4.

De modo a testar a dependência de MHC da actividade citolítica das CTL específicas para o péptido Db 126, foi utilizado o anticorpo monoclonal anti-HLA-A2.1 para bloquear a actividade citolítica de CTL nas células T2 pulsadas com o péptido. A citólise específica das células T2 pulsadas com o péptido Db 126 foi medida na presença ou ausência de anticorpo monoclonal (BB7.2) que bloqueia a molécula HLA-A2.1 a uma proporção de E/T de 5 : 1. 0 resultado é mostrado na Figura 11. Na figura, o símbolo * representa o resultado obtido utilizando anticorpo monoclonal anti-H-2Kb em vez de anticorpo monoclonal anti-HLA-A2.1. Como pode ser observado pela figura, a adição de 60 pg/mL de anticorpo monoclonal antÍ-HLA-A2.1 resultou na redução da citotoxicidade em relação ao fundo da citólise das células T2. O anticorpo monoclonal não relacionado (anticorpo monoclonal Y3 anti-H-2Kb) com o mesmo isotipo não tinha efeito na lise das células T2.

Exemplo 5.

Foi testado se as CTL de Db 126 específicas para o péptido podem matar as células de leucemia HLA-A2.1-positivas que expressam de forma hereditária WT1. como a célula alvo, as células TF1 (expressam WT-1, HLA-A2.1-positivas), as células JY (não expressam WT-1, HLA-A2.1-positivas) e as células Molt-4 (expressam WT1, HLA-A2.1-negativas) foram utilizadas e a citotoxicidade foi medida a uma proporção de E : T de 7,5 : 1 (a) ou 15 : 1 (b) . 17 0 resultado é mostrado na Figura 12. As CTL de Db 126 específicos para o péptido exibiram uma citotoxicidade significativa para uma célula de leucemia HLA-A2.1-positiva TF1 que expressa de modo inerente WT1, mas exibiu uma citólise de um nível de fundo para as células Molt-4 (que expressam WT1, HLA-A2.1-negativas) ou as JY (que não expressam WT1, HLA-A2.1-positivas) .

Exemplo 6.

Foi testado se as CTL de Db 126 específicas para o péptido podem reconhecer células de tumor que expressam de forma inerente WT1 e podem provocar a sua citólise. A lise específica foi medida na proporção de E/T apresentada nas Figuras 13 e 14 para células de tumor (FLB3) que expressam WT1 e células de tumor (RMA) que não expressam WT1 (Figura 13) ou para as células C1498 transf ectadas com o gene WT1 ou as células C1498 não transfectadas com o gene WT1 (Figura 14).

Como mostrado na Figura 13, as CTL de Db 126 específicas para o péptido provocaram a lise das células FBL3 que expressam de forma inerente WT1, mas não as células RMA que não expressam WT1. Como mostrado na Figura 14, as CTL de Db 126 específicas para o péptido ainda mataram as células C1498 transfectadas com o gene WT1 de murganho, em comparação com as células C1498 parentais que não expressam WT1. Isto confirmou que a molécula direccionada para morte celular por CTL, é na verdade, o péptido WT1. Estes resultados sugerem que as CTL de Db 126 específicos para o péptido podem reconhecer o péptido Db 126 ou os péptidos relacionados, que foram produzidos naturalmente pelo 18 processamento intracelular da proteína WT1 e apresentado nas moléculas de H-2Db do WTl-que expressa células.

Exemplo 7.

De modo a testar se a actividade citolítica de CTL é dependente de MHC, foi realizada a medição na presença de um anticorpo contra a molécula H-2 de classe I. Deste modo, a actividade citolítica das CTL de Db 126 específicas para o péptido contra as células RMA-S pulsadas com o péptido Db 126 foi medida na presença de um anticorpo monoclonal com o título ajustado contra H-2Kb (28.13.3S), H-2Db (28.11.5S) ou H-2Ld (MA143). Como o anticorpo monoclonal de controlo, foi utilizado o anticorpo monoclonal possuindo o mesmo isotipo. 0 resultado é apresentado na Figura 15. Dependendo das concentrações elevadas de anticorpo contra H-2Db, a actividade lítica de CTL contra as células RMA-S pulsadas com o péptido Db 126 foi suprimida, enquanto que os anticorpos contra H-2Kb ou H-2Ld não suprimiram a actividade lítica de CTL. Estes resultados indicam que CTL apresenta a actividade de citólise de um modo dependente de H-2Db.

Exemplo 8.

Foi testado se a imunidade tumoral in vivo pode ser induzida pela imunização activa com o péptido Db 126. Utilizando as células de baço activadas com LPS (linha sólida na Figura 16) pulsadas com o péptido Db 126, as células de baço activadas apenas com LPS (linha a sombreado) ou apenas com soro 19 fisiológico tamponado com fosfato (PBS) (linha a tracejado), os murganhos foram imunizadas uma vez por semana. Após imunização durante 3 semanas, 3 X 107 células de leucemia FBL3 foram administradas intraperitonealmente. 0 resultado é mostrado na Figura 16. Os murganhos imunizados com o péptido Db 126 ultrapassaram a exposição ao tumor e sobreviveram, enquanto que murganhos não imunizados e os murganhos imunizadas com as células de baço activadas com LPS não podem rejeitar a exposição ao tumor e morreram. Em ambos os murganhos, os imunizados e não imunizados, a presença de ascites foi observada três dias após a injecção intraperitoneal das células tumorais acima. As ascites continuaram a aumentar nos murganhos não imunizadas e os murganhos eventualmente morreram. Nos murganhos imunizados, por outro lado, as ascites começaram a diminuir gradualmente dai em diante, e os murganhos rejeitaram completamente a exposição ao tumor e sobreviveram. Nos murganhos não-imunizados, a regressão natural foi ocasionalmente observada. Espera-se que a regressão seja devido a indução natural de CTL especificas para vírus da leucemia de Friend (células de leucemia FBL3 são transformadas com este vírus). Porque essa indução de CTL foi observada ocasionalmente observada em murganhos C57BL/6.

Exemplo 9. Vacina de ADN

Cem pg de ADN plasmídico que expressa WT1 (plasmídeo que expressa continuamente WT1 que foi preparado ligando o fragmento Sau 3AI de ADNc de WT1 de murganho (Molecular and Cellular Biology, vol. 11, N°. 3, p. 1707-1712 (1991), a coluna da esquerda na p. 1709) ao promotor CMV-IE) (Proc. Natl. Acad. Sei. 20 USA., 92: 11105-11109 (1995)) foi injectado intramuscularmente em murganhos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade, a cada 10 dias para um total de três vezes. Dez dias após a última injecção intramuscular, os baços dos murganhos foram removidos para preparar as células do baço. Após as células do baço e as células mWTlC1498 (irradiadas com radiação de 40 Gy) que expressa WT1 foram co-cultivadas a 37 °C, durante 6 dias, um ensaio de morte (marcado com Európio) foi realizado utilizando C1498 (PM5G-mWTl) que expressou WT1 e C1498 (PM5G) que não expressem WT1 como a célula alvo. Como aqui utilizado, C1498 é uma linha celular de leucemia mielogénica de murganho que não expressa WT1.

Foram induzidas células T citotóxicas (CTL) que matam as células C1498 (FM5G-mWTl) que expressam WT1 mas não matam as células C1498 células (PM5G) que não expressam WT1. O resultado é apresentado na Figura 17.

Como um controlo, foi efectuada uma experiência semelhante como acima, em que o plasmídeo que não expressa WT1 (não contém ADC de WT1) foi injectado intramuscularmente em murganhos em vez de plasmideo que expressa WT1. Como na experiência acima, as células do baço foram removidas. Após estimulação in vitro com células C1498 (PM5G-mWTl) que expressam WT1, foi efectuado um ensaio de morte.

Como mostrado na Figura 18, não foram induzidos CTL específicos para WT1 por injecção intramuscular do ADN plasmidico controlo que não possui ADNc de WT1. 21

Os resultados acima demonstraram que o péptido da presente invenção funcionava, de facto, como um antigénio de tumor e que induzia o crescimento de células T assassinas contra células de tumor (células T tóxicas para as células de tumor) . Deste modo, o péptido antigénio de tumor da presente invenção é útil como uma vacina para cancro, para leucemia e tumores sólidos que são acompanhados pelo aumento da expressão do gene WT1.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> <120> Antigénio de Cancro com Base no Gene Supressor de Tumor WT1 <130> 983279 <160> 8 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Murganho <400> 1 22

Met Gly Ser Asp Vai Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Vai Ser 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Vai Ser Gly Ala 20 25 30 Arg Gin Trp Ala Pro Vai Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala 35 40 45 Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe 85 90 95 Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Thr Ile 130 135 140 Arg Asn. Gin Gly Tyr Ser Thr Vai Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Gin His Ser Phe 165 170 175 23

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Glr. Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190 Tyr Ser Vai Pro Pro Pro Vai Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Vai Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Glu Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Vai Phe Arg Gly Ile Gin Asp Vai Arg Arg Vai Ser 290 295 300 Gly Vai Ala Pro Thr Leu Vai Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Vai Lys Pro Phe Gin 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp His Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Vai 420 425 430 Arg His His Asn Met Hl s Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu His Vai Ala 435 440 445

Leu 449 24 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Humano <400> 2

Met Gly Ser Asp Vai Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Vai Pro 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Vai Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gin Trp Ala Pro Vai Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Vai His Phe 85 90 95 Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Vai Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Gin His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190 Tyr Ser Vai Pro Pro Pro Vai Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 25

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 As η Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Vai Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Vai Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Vai Phe Arg Gly Ile Gin Asp Vai Arg Arg Vai Pro 290 295 300 Gly Vai Ala Pro Thr Leu Vai Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Vai Lys Pro Phe Gin 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Vai 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445 Leu 449 26 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido Sintético <400> 3 Gly Aia Ser Ala Tyr Gly Ser Leu 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido Sintético <400> 4

Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 27 <223> Péptido Sintético <400> 5

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 6 9 PRT Sequência Artificial Péptido Sintético 6 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met 1 5 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 7 9 PRT Sequência Artificial Péptido Sintético 7 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5 28 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido Sintético <400> 8

Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Vai 1 5

Lisboa, 4 de Março de 2009 29

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido antigénio de tumor da proteína WT1, em que o referido péptido é qualquer um dos seguintes: Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID N°: 5) Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID N°: 7), e WH 187 Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Vai (SEQ ID N°: 8).
2. Péptido antigénio de tumor de acordo com a reivindicação 1 em que o referido péptido é Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID N°: 5) ou WH 187 Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Vai (SEQ ID N°: 8).
3. Vacina para cancro compreendendo, como um ingrediente activo, um péptido antigénio de tumor de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
4. Utilização de um péptido antigénio de tumor de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de uma composição farmacêutica para vacinação contra o cancro.
5. Péptido antigénio de tumor de acordo com reivindicação 1 ou 2 para utilização como uma vacina para cancro. Lisboa, 4 de Março de 2009 1