세포성 면역, 특히 세포독성 T 세포 (이하, "CTL"로 칭함) 는 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포의 생체내 거부에 중요한 기능을 한다. CTL 은, 암 세포상의 종양 항원 단백질 유래의 항원 펩티드 ("종양 항원 펩티드") 와 MHC (major histocompatibility complex, 주 조직적합성 복합체) 클래스 I 항원 (인간의 경우는 "HLA 항원"이라 함) 간의 복합체를 인식하여, 상기 세포를 공격 및 파괴한다.
종양 항원 단백질의 대표적인 예로서, 문헌 [Immumity, vo1.10:281, 1999] 의 표 중에 기재된 것들을 들 수 있다. 구체적으로는, 멜라닌 세포 (melanocyte) 조직-특이적 단백질인 gp 100 (J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994) 및 티로시나제 (J. Exp. Med., 178:489, 1993), 등의 멜라닌 소체 (melanosome) 항원, 및 흑색종 (melanoma) 이외의 항원 단백질로서 HER2/neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995), CEA (J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995) 및 PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997) 등의 종양 표지자가 있다.
종양 항원 펩티드는, 종양 항원 단백질이 세포 내의 단백질분해효소에 의해 세포내 처리되어 생성될 수 있는 약 8 내지 11 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드이다(Cur. 0pin, Immunol., 5:709, 1993; Cur. Opin, Immunol., 5:719, 1993; Cell, 82:13, 1995; Immunol. Rev., 146:167, 1995). 상기한 바와 같이, 이렇게 생성된 종양 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 항원 (HLA 항원) 와 함께 복합체로서 세포 표면에 제시되어, CTL 에 의해 인식된다. 따라서, CTL 에 의한 종양 세포 파괴를 이용하는 암 면역요법제(암백신)를 개발하기 위해서는, 종양 항원 단백질에서 CTL 을 효율적으로 유도할 수 있는 종양 항원 펩티드를 동정하는 것이, 매우 중요하다.
발명의 개시
본 발명의 한 가지 목적은, 생체내에서 유용한 종양 항원 펩티드로부터 유래되는 신규한 종양 항원을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 종양 항원 펩티드로 증명된 일부 펩티드가 시스테인 잔기(들)를 포함하고 있고, 이러한 펩티드로 구성된 이량체는 투여시 놀랍게도 단량체와 동등한 CTL 유도 활성 ("CTL-유도 활성") 을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 확립하였다.
따라서, 본 발명은 하기를 포괄한다.
(1) 각각 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 7 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지고 CTL 유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 2 개의 펩티드 단량체가 이황화 결합 (disulfide bond) (들)에 의해 서로 결합되어 있는 펩티드 이량체.
(2) 상기 (1) 에 있어서, CTL-유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 펩티드 이량체.
(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, 2 개의 펩티드 단량체가 1 개 또는 2 개의 이황화 결합에 의해 결합된 펩티드 이량체.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 종양 억제 유전자의 발현 산물인 WT1 에서 유래하는 것인 펩티드 이량체.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 하기와 같은 펩티드 이량체:
Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa (서열번호: 72)
(이때, 위치 2 의 Xaa 는, Tyr, Phe, Met 및 Trp 에서 선택되는 1 개의 아미노산 잔기이고; 위치 9 의 Xaa 는, Phe, Leu, Ile, Trp 및 Met 에서 선택되는 1 개의 아미노산 잔기이다).
(6) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 하기 펩티드들로부터 선택되는 펩티드 이량체:
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 11)
Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe (서열번호: 18)
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr (서열번호: 19)
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu (서열번호: 20)
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (서열번호: 21)
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호: 22)
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu (서열번호: 23)
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 44).
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 펩티드 이량체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한 약학적 조성물.
(8) 암백신으로서 사용되는 상기 (7) 에 따른 약학적 조성물.
(9) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 펩티드 이량체의, 암백신의 제조에서의 용도.
(10) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 펩티드 이량체의 치료상 유효량을, 이를 필요로 하는 WT1-양성 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
본 발명의 펩티드 이량체에 있어서, 2 개의 펩티드 단량체는 이 단량체들 사이에 존재하는 1 쌍 이상의 시스테인 잔기의 SH 기들 간의 이황화 결합(들)을 통해 이량체화한다.
본 발명의 펩티드 이량체는 CTL-유도 활성을 가지며, 이렇게 유도된 CTL 은, 세포독성 작용 또는 림포카인 (lymphokine) 생성을 통해 항종양 작용을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이량체는, 암(종양)의 치료 또는 예방을 위한 암백신으로 사용할 수 있다.
본 발명의 펩티드 이량체를 구성하는 펩티드 단량체는, 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 7 내지 30 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, CTL-유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산한다. "종양 항원 펩티드를 생산한다"는 구절은, 상기 펩티드 단량체가 HLA 항원과 결합하여 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 특성을 가진 것을 의미한다. 본 발명에서는, CTL 유도 활성을 갖고 있는 한 제한없이 임의의 펩티드 단량체가 사용될 수 있고; 그러나, 인간 윌름스 종양의 종양 억제 유전자 WT1 에서 유래하고 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 펩티드 단량체가 바람직하다. 상기 종양 억제 유전자 WT1 는 다양한 종류의 종양에서 발현된다(Cell., 60:509, 1990; NCBI 데이터 베이스 등록번호 제 XP_034418, 서열번호: 1). 상기 WT1 유전자는, 윌름스 종양, 무홍채증 (aniridia), 비뇨생식 이상 (urogenital anomaly), 정신 지체 등의 합병증을 수반하는 WAGR 증후군의 분석에 기초하여 윌름스 종양의 원인 유전자 중 하나로서 염색체 11p13 으로부터 분리되었다(Nature, 343:774, 1990). 상기 WT1 의 게놈 DNA 는 약 50 kb 이고, 10 개의 엑손으로 이루어져 있으며, 이의 cDNA 는 약 3 kb 이다. 상기 cDNA 에서 추정된 아미노산 서열은, 서열번호: 1 에 나타난 바와 같다(Cell., 60:509, 1990). 상기 WT1 유전자가 인간 백혈병에서 고도로 발현되며, 상기 백혈병 세포를 WT1 안티센스 올리고머로 처리하면 이의 세포증식이 억제된다는 사실 (JP-A-104627/1997) 로부터, 상기 WT1 유전자는 백혈병 세포의 성장을 촉진하는 것으로 시사되었다. 그 후, 상기 WT1 유전자는, 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암 및 난소암 등의 고형암에 있어서도 고도 발현되고 있는 사실 (JP-A-104627/1997 및 WO00/06602) 로부터, 백혈병 및 고형암에 있어서의 새로운 종양 항원 단백질로 판명되었다(J. Immunol., 164: 1873-80, 2000 및 J. Clin. Immunol., 20, 195-202, 2000). 암 면역요법(암백신)은 가능한 한 많은 암환자에 대하여 적용가능한 것이 바람직하기 때문에, 많은 종류의 암에서 고도로 발현되고 있는 WT1 로부터의 종양 항원 펩티드의 동정, 및 결과적으로 생성되는 종양 항원 펩티드를 이용한 암백신의 개발은 중요하다. 이것에 관하여, WO 00/06602 및 WO 00/18795 에, WT 1 단백질의 부분적 절편으로 이루어진 수 개의 천연형의 종양 항원 펩티드가 기재되어 있지만, 이들의 생체내에서의 효과에 관해서는 알려진 것이 없다.
본 발명에 사용가능한 기타 펩티드 단량체로서는, 문헌 [Immunity, vo1.10:281, 1999] 의 표 중에 기재된 종양 항원 단백질에서 유래하고 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 종양 항원 펩티드가 있다.
CTL-유도 활성은, HLA 4량체법(Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)) 또는 한계 희석법 (Nat. Med.:4, 321-327 (1998)) 에 의해 CTL 의 수를 측정함으로써 확인할 수 있다. 다르게는, 예를 들어 HLA-A24-제한성 CTL-유도 활성의 경우, WO 02/47474 및 문헌 [Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)] 에 기술된 방법에 따라 HLA-A24 모델마우스를 사용하여 활성을 조사할 수 있다.
상기 펩티드 단량체는 7 내지 30 개, 바람직하게는 8 내지 12 개, 좀 더 바람직하게는 9 내지 11 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 상기 펩티드 단량체는, HLA 와의 결합에 대한 모티브와 펩티드의 길이를 고려하여, 바람직하게는 1 또는 2 개의 시스테인 잔기를 포함한다.
상기 펩티드 단량체는, 펩티드 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 준하여 합성할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 하기를 포함하는 문헌들에서 발견할 수 있다: Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; 및 Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991).
생성된 펩티드 단량체는, 펩티드 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 준하여 분자 사이의 이황화 결합을 형성하도록 할 수 있다. 이황화 결합의 형성 방법은, 하기를 포함한 문헌들에서 발견할 수 있다: Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; 및 Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991).
구체적으로는, 1 개의 시스테인 잔기를 포함한 펩티드 단량체는, 예를 들어, 시스테인 측쇄 상의 보호기를 포함하는 모든 보호기를 제거한 후, 생성된 단량체 용액을 알칼리 조건 하에서 공기-산화반응시킴으로써, 또는, 알칼리성 또는 산성 조건하에서 산화제를 첨가하여 이황화 결합(들)을 형성함으로써 합성할 수 있다. 산화제의 예로서, 요오드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 페리시안화 칼륨 등을 들 수 있다.
2 개 이상의 시스테인 잔기를 포함한 단량체 펩티드도, 상기한 방법에 따라 합성할 수 있다. 이 경우는, 상이한 결합 양식의 이황화 결합으로부터 생성되는 이성질체가 수득될 수 있다. 시스테인 측쇄에 대한 보호기들의 특정한 조합을 선택함으로써, 원하는 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합이 형성된 이량체를 제조할 수 있다. 상기 보호기 조합의 예로서는, MeBzl (메틸벤질) 기와 Acm (아세트아미드메틸) 기, Trt (트리틸) 기와 Acm 기, Npys (3-니트로-2-피리딜티오) 기와 Acm 기, S-Bu-t (S-tert-부틸) 기와 Acm 기 등을 들 수 있다. 예를 들어, MeBzl 기와 Acm 기의 조합의 경우, 우선 MeBzl 기와 시스테인측쇄 상의 보호기 외의 보호기를 제거한 뒤, 결과적인 단량체 용액을 공기-산화반응시켜 탈보호된 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합(들)을 형성하고, 그 후 요오드로 탈보호 및 산화하여 Acm 기로 보호되어 있던 시스테인 잔기들 사이에 이황화 결합(들)을 형성하는 것을 포함하는 방법으로 상기 제조를 수행할 수 있다.
상기 생성된 펩티드 이량체는, 펩티드 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 준하여 정제할 수 있다. 이러한 정제 방법은, 하기를 포함하는 문헌들에서 발견할 수 있다: Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; 및 Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991). HPLC 를 사용하는 방법이 바람직하다.
이렇게 생성된 본 발명의 펩티드 이량체는, 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합(들)에 기인하여, 용액 중에서의 산화제 등에 대한 안정성이 뛰어나고, 주어진 품질과 CTL-유도 활성을 유지한다.
본 발명에 사용가능한 바람직한 펩티드 단량체는 예로서 WT1 를 취하여 이하에 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 각 아미노산 잔기를 축약하기 위하여 하기의 1- 또는 3-문자-약어를 사용한다: Ala(A): 알라닌 잔기, Arg(R): 아르기닌 잔기, Asn(N): 아스파라긴 잔기, Asp(D): 아스파르트산 잔기, Cys(C): 시스테인 잔기, Gln(Q): 글루타민 잔기, Glu(E): 글루탐산 잔기, Gly(G): 글리신 잔기, His(H): 히스티딘 잔기, Ile(I): 이소류신 잔기, Leu(L): 류신 잔기, Lys(K): 리신 잔기, Met(M): 메티오닌 잔기, Phe(F): 페닐알라닌 잔기, Pro(P): 프롤린 잔기, Ser(S): 세린 잔기, Thr(T): 트레오닌 잔기, Trp(W): 트립토판 잔기, Tyr(Y): 티로신 잔기, Val(V): 발린 잔기.
하기 표 중, "위치" 라는 용어는 인간 WT1 에 있어서의 펩티드의 위치를 지칭한다.
HLA 분자에는 많은 아형이 존재하고, 각 아형에 결합하는 종양 항원 펩티드의 아미노산 서열은 일정한 규칙 (결합 모티브) 을 따르는 것으로 알려져 있다. HLA-A24 의 결합 모티브가, 8 내지 11 개의 아미노산 잔기들로 이루어진 펩티드 중에서, 위치 2 의 아미노산이 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met) 또는 트립토판(Trp)이고, C 말단의 아미노산이 페닐알라닌(Phe), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 트립토판(Trp) 또는 메티오닌 (Met) 인 것이 알려져 있다(J. Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol., 155, p4307, 1994). 따라서, 상기 표 4 에 있는 펩티드 단량체에 더하여, 하기 식의 펩티드 단량체 또한 HLA-24-제한성 펩티드 단량체로서 바람직하게 사용될 수 있다.
Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa (서열번호: 72)
(이 때, 위치 2 의 Xaa 는, Tyr, Phe, Met 및 Trp 로부터 선택되는 1 개의 아미노산 잔기이고, 위치 9 의 Xaa 는, Phe, Leu, Ile, Trp 및 Met 로부터 선택되는 아미노산 잔기이다).
또한, HLA-A0201 의 결합 모티브로서, 8 내지 11 개 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에서, 위치 2 의 아미노산이 류신(Leu) 또는 메티오닌(Met)이고, C 말단의 아미노산이 발린(Val) 또는 류신(Leu) 인 것이 알려져 있다. HLA-A0205 의 결합 모티브로서, 8 내지 11 개 아미노산으로 이루어진 펩티드에서, 위치 2 의 아미노산이 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile) 또는 메티오닌(Met)이고, C 말단의 아미노산이 류신(Leu) 인 것이 알려져 있다(Immunogenetics, 41, p178, 1995; J. Immunol., 155: p.4749, 1995). 따라서, 상기 표 2 또는 3 에 나타난 펩티드 단량체의 위치 2 의 아미노산 또는 C 말단의 아미노산을 상기 아미노산 모티브 중 어느 하나로 치환한 펩티드도 HLA-A0201 또는 HLA-A0205-제한성 펩티드 단량체로서 바람직하게 사용될 수 있다.
상기 표 4 에 나타나는 펩티드 단량체가 본 발명에 있어서는 특히 바람직하게 사용된다. 표 4 중, 서열번호:44 의 펩티드는, 서열번호:11 (위치 235 내지 243) 의 위치 236 의 메티오닌을 티로신으로 변경한 비천연의 변이 펩티드이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 단량체에는, 천연형 펩티드의 서열 중에서 시스테인 잔기 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경한 서열을 가지며 CTL 유도 활성을 나타내는 것들이 포함된다.
또 다른 구현예로서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 이량체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물 중의 활성 성분으로서 본 발명의 펩티드 이량체의 양은, 치료의 목적, 환자의 연령, 체중등에 따라 다양할 수 있지만, 통상 O.OOO1 ㎎ 내지 1OOO㎎, 바람직하게는 O.OO1 ㎎ 내지 1OOO ㎎, 보다 바람직하게는 0.1 ㎎ 내지 20 ㎎ 이다.
본 발명의 약학적 조성물은, 활성 성분으로서, 본 발명의 펩티드 이량체 외에도 펩티드 단량체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 중의 "펩티드 이량체" 의 함량은, CTL 유도 활성을 발휘하는 한 제한이 없으나; 전체 펩티드 중50% 이상, 바람직하게는 70 내지 100 %, 좀 더 바람직하게는 80 내지 100 % 일 수 있다. 펩티드 이량체의 함량은, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 확인할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는, 세포성 면역을 증강할 수 있는 것들이다. 이러한 담체로서는, 아주반트 (adjuvant) 를 들 수 있다. 아주반트로서는, 문헌 [Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994] 에 기재된 것들이 있고, 구체적으로는, 미생물에서 유래한 성분, 사이토카인, 식물에서 유래한 성분, 수산화알루미늄등의 광물 겔 (mineral gel), 리소레시틴, Pluronic
폴리올 등의 계면활성제, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션 (에멀션 제제) 등을 들 수 있다. 또한, 리포솜 제제, 직경 수 ㎛ 의 비드에 결합시킨 입자상의 제제, 지질에 결합시킨 제제 등의 제조에 필요한 성분도 담체에 포함된다.
투여는, 예를 들어, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내로 수행할 수 있다. 바람직한 경로는 CTL 을 효율적으로 유도하는 피내 또는 피하 투여이다. 투여 회수 및 투여 간격은, 치료 또는 예방되어야할 질환, 개별적 차이에 따라 적절히 조절할 수 있으나; 바람직하게는 수 일 내지 수 개월에 1회의 간격으로 1 회 이상 투여한다.
예를 들어, WT1 유래의 펩티드 단량체로 이루어진 펩티드 이량체를 포함한 본 발명의 약학적 조성물을 WT1-양성 환자에게 투여하는 경우, 항원-제시 세포의 HLA 항원에 상기 펩티드가 제시되어 복합체가 형성된다. 그 후, 상기 제시된 HLA 항원복합체에 특이적인 CTL 이 증식하여 암 세포를 파괴하고, 이로써, 암이 치료 또는 예방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은, 백혈병, 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 다발성 골수종 및 악성 림프종 등의 혈액성 암 및 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암을 포함하는, WT1 유전자의 발현 수준의 상승과 관련된 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
추가적인 구현예로서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 WT1-양성 환자에게 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예들에 의해 어떤 면으로든 한정되지 않는다.
제조예 1
1. 보호된 펩티드 수지의 합성 (H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-(Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지)
Fmoc-Leu-Alko-수지 (이때, Alko 는 p-알콕시벤질 알콜이다) (12 g) (0.81 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) 를 반응 용기 (500 ㎖, ACT90 형 고형상 합성기, Advanced ChemTech) 에 채워 넣고 DMF 등으로 1 회 세척하였다(공정 1). 그 후, 상기 수지를 25% Pip (피페리딘) 으로 처리 (3 분 × 1 회, 및 15 분 × 1 회) 하여 Fmoc 기를 절단하고(공정 2), 다시 DMF 등으로 세척하여 (공정 1), Pip 를 제거하였다. 이 반응 용기에, NMP (N-메틸피롤리디논) (150 ㎖) 중의 Fmoc-Asn(Trt)-OH (29.36 g) 및 HOBT (1-히드록시벤조트리아졸) (7.5 g) 의 용액을 가하였다. DIPCI (N,N'-디이소프로필카르보디이미드) (7.6 ㎖) 를 가한 후, 30 분간 실온에서 교반하였다(공정 3). 30분 후, 상기 수지를 NMP 로 세척하고(공정 4), Fmoc-Asn(Trt)-OH (29.36 g) 과 HOBT (7.5 g) 를 사용하여 다시 한번 커플링 반응을 하여(공정 5), Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko 수지를 합성하였다. 그 후, 공정 2 의 탈보호반응을 수행하여 생성된 수지를 H-Asn(Trt)-Leu-Alko 수지로 변환시켰다. 세척 (공정 1) 후, Fmoc-Met-OH (18.27 g), Fmoc-Gln(Trt)-OH (30.04 g), Fmoc-Asn(Trt)-OH (29.36 g), Fmoc-Trp(Boc)-OH (25.91 g), Fmoc-Thr(tBu)-OH (19.56 g), Fmoc-Tyr(tBu)-OH (22.60 g) 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH (28.82 g) 를 순차적으로 가하여, 커플링 반응 (공정 3) 을 수행하였는데, 이때 상기 커플링은 Fmoc-Thr(tBu)-OH 로 3 회 반복하였다. 생성된 수지를 DMF 로 세척한 후, 25% AC2O (무수아세트산) 로 처리 (15 분 × 2 회) 하여 미반응의 아미노기를 캡핑(capping)하였다. N-말단의 Fmoc-Cys(Trt)-OH 를 축합한 후, 탈보호 반응 (공정 2) 및 세척 (공정 6) 을 수행하여, H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지를 수득하였다. 상기 합성 방법은 표 33에 요약되어 있다.
합성 방법 |
공정 |
시약 |
처리 회수 |
시간(분) |
1) 세척 |
DMF |
100 ㎖×6 |
0.3 |
MeOH |
100 ㎖×1 |
0.3 |
DMF |
100 ㎖×3 |
0.3 |
2) 탈보호 |
25% 피페리딘/DMF |
100 ㎖ |
3.0 |
100 ㎖ |
15.0 |
3) 커플링 |
아미노-보호된 아미노산 (각 5 당량), HOBT (5 당량), DIPCI (5 당량)/NMP |
150 ㎖ |
30 ×1 |
4) 세척 |
NMP |
100 ㎖×2 |
0.3 |
5) 커플링 |
아미노-보호된 아미노산 (각 5 당량), HOBT (5 당량), DIPCI (5 당량)/NMP |
150 ㎖ |
30 ×1 |
6) 세척 |
DMF |
100 ㎖×5 |
0.3 |
MeOH |
100 ㎖×1 |
0.3 |
DMF |
100 ㎖×2 |
0.3 |
2. 보호된 펩티드 수지의 탈보호
상기 방법에 따라 수득된 상기 보호된 펩티드 수지 (H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) (14.06 g) 에 시약 K (5 % 페놀/5 % 티오아니솔/5 % H2O/2.5 % 에탄디올/TFA 용액, 100 ㎖) 와 트리이소프로필실란 (TIPS, 15 ㎖) 를 가하고, 실온에서 2.5 시간 교반하였다. 그 후, 디에틸에테르 (약 500 ㎖) 를 가한 후, 상기 혼합물을 글라스 필터로 여과하여, 시약 K와 디에틸에테르를 여과액으로서 제거하였다. 상기 필터 상의 잔류물을 디에틸에테르 (약 100 ㎖ × 3) 로 세척한 후, TFA (약 100 ㎖ × 3) 를 가하여 상기 목적 산물을 함유하는 여과액 (300 ㎖) 을 수득하였다. 이 여과액을 농축하여 TFA 를 제거하고, 아세토니트릴 (약 50 ㎖) 및 20% 아세트산 수용액 (약 250 ㎖) 를 첨가한 후, 동결건조하여, 파우더로서의 조 펩티드 (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH, 서열번호:44) (6.12 g) 를 수득하였다.
3. 조 펩티드의 정제
결과적인 조 펩티드 (749 ㎎) 을 TFA (10 ㎖) 에 용해시키고, 이를, 용액 1 (= H2O/0.1% TFA) 와 평형을 이루고 있는 HPLC (Shimadzu; LC8AD 형) 의 ODS C18 컬럼 (5 cm φ × 50 cm L, YMC, Co., Ltd.) 에 HPLC 의 펌프를 이용하여 채워넣었다. 상기 컬럼을 그 상태로 약 30 분간 유지하고, 그 후, 용액 2 (= CH3CN/0.1 % TFA) 의 농도를 30 분에 걸쳐 0 % 에서 15 % 로 증가시켰다. 그 후, 용액 2 의 농도를 330 분에 걸쳐 28 % 까지 상승시키는 한편, 목적 펩티드를 함유한 용출액을 220 nm 에서의 UV 흡광도로 모니터링하여 상기 목적물을 함유한 분획을 수집하였다. 상기 분획을 수합하고, 용액 1 (= H2O/0.1% TFA) 와 용액 2 (= CH3CN/0.1% TFA) 의 혼합물 중의 17 % 용액 2 (= CH3CN/0.1% TFA) 와 평형된, HPLC (Hitachi, L-4000 형) 에 부착된 ODS C18 컬럼 (4.6 ㎜ φ × 25 cm L, YMC, Co., Ltd.) 내로 주입한 후, 30 분에 걸쳐 220 nm 에서의 UV 흡광도로 상기 용출액을 모니터링하면서 용액 2 의 농도를 47 % 까지 30분간으로 상승시켜, 유지시간 (retention time) 14.79 분의 정제된 목적 펩티드 단량체 (227.5 mg) 을 수득하였다.
아미노산 분석
가수분해: 1% 페놀/6N 염산 수용액
110 ℃, 10 시간
분석 방법: 닌히드린법
Asx:1.71(2) Thr:0.75(1) Glx:1.07(1) Met:0.91(1) *Leu:(1) Tyr:0.82(1)
*) Leu = 기준 아미노산
괄호( )안의 값: 이론치
질량분석: LC/MS M+1 = 1173.0 (이론치 = 1172.36)
펩티드 서열분석: N-말단으로부터의 두번째 잔기 (Tyr) 에서부터, C-말단의 Leu 까지 순차적으로 서열을 확인하였다.
실시예 1
하기 식의 이량체의 합성:
제조예 1 에서 제조된 펩티드 단량체 (227.5 mg), N-메틸글루카민 (NMG) (227.5 mg) 및 물 (23 ㎖) 의 혼합물을 실온에서 약 2 일간 교반함으로써, 공기 산화를 수행하였다. 그 후, 상기 반응 용액에 물 (5 ㎖) 중의 아세트산 나트륨 (2 g) 수용액을 가하고, 혼합물을 실온에서 약 20 분간 교반하였다. 물 (200 ㎖) 및 아세토니트릴 (약 200 ㎖) 을 가한 후, Kiriyama Roht (여과지 No. 5C) 로 여과하고, 필터 상의 잔류물을 물 (약 50 ㎖ × 3 회) 로 세척하였다. 상기 필터 상의 잔류물을 수집하고, 물 (약 200 ㎖) 을 가하여 동결건조하여, 목적 펩티드 이량체의 조 생성물 (158 mg) 을 수득하였다.
조 펩티드 이량체의 정제
조 펩티드 이량체 (158 mg) 를 DMSO (9 ㎖) 에 용해시키고, 용액 1 (= H2O/1% AcOH) 와 평형 상태인 HPLC (Shimadzu; LC8AD 형) 의 ODS C18 컬럼 (5 cm φ × 50 cm L, YMC, Co., Ltd.) 에 HPLC 펌프를 이용하여 채워넣었다. 상기 컬럼을 그 상태로 약 30 분간 유지한 후, 용액 2 (= CH3CN/1% AcOH) 의 농도를 360 분에 걸쳐 0 % 에서 40 % 까지 상승시켰다. 그 후, 220 nm 에서의 UV 흡광도로 목적 펩티드 이량체를 함유한 용출액을 모니터링하면서, 자동분획수집기에 의해 상기 목적 생성물을 함유한 분획을 수집하였다. 분획을 수합하고, 용액 1 (= H2O/0.1% TFA) 와 용액 2 (= CH3CN/0.1% TFA) 의 혼합물 중의 17 % 용액 2 (= CH3CN/0.1% TFA) 와 평형된, HPLC (Hitachi, L-4000 형) 에 부착된 ODS C18 컬럼 (4.6 ㎜ φ × 25 cm L, YMC, Co., Ltd.) 내로 주입하였다. 그 후, 30 분에 걸쳐 220 nm 에서의 UV 흡광도로 상기 용출액을 모니터링하면서 용액 2 의 농도를 0 % 에서 47 % 까지 30분간으로 상승시켜, 유지시간이 20.51 분인 정제된 목적 펩티드 이량체 (46.6 mg) 을 수득하였다.
FAB.MS 2365.0 (이론치: 2342.70) Na+ F = 0.25 %
시험예 1
펩티드 이량체에 의한 CTL 유도
실시예 1 에서 제조된 펩티드 이량체의 CTL-유도 활성을 HLA-A24 형질전환 마우스 (Int. J. Cancer: 100, 565, 2002) 를 사용하여 평가하였다. 상기 펩티드 이량체를 디메틸술폭시드 (DMS0) 에 용해시켜 40 mg/㎖ 의 펩티드 용액을 수득하였다. 그 후, 이 펩티드 용액 (35 ㎕) 을 10 mM 인산완충액 (pH 7.5) (581 ㎕) 에 첨가하여 펩티드 현탁액을 수득하였다. 상기 생성된 펩티드 현탁액 (550 ㎕) 및 Montanide ISA51 (Seppic 사) (700 ㎕) 을, 연결된 유리 시린지를 사용하여 혼합하여, 투여 용액으로서의 에멀션을 제조하였다.
상기 투여 용액 (200 ㎕) 을 HLA-A24 형질전환 마우스에 꼬리 기부에 피하 주입하였다. 3 마리의 마우스를 사용하였다. 주입 7 일 후, 비장을 제거하고, 비장 세포를 제조하였다. 비장 세포의 일부를 상기 펩티드 이량체 (1OO ㎍/㎖) 로 1 시간동안 펄스하였다. 펩티드로 펄스되지 않은 비장 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 7 × 106 세포로 시딩(seeding)하고, 여기에 상기 언급한 펩티드로 펄스된 비장 세포 (웰당 1 × 1O6 세포) 를 첨가하고, 상기 플레이트를 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션은, 10% FCS, 10 mM HEPES, 20 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM MEM 비필수 아미노산, 1 % MEM 비타민 및 55μM 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI1640 배지에서, 5일간 수행되었다.
51Cr 방출 검정 (J. Immunol.: 159, 4753, 1997) 으로, 상기 배양된 비장 세포에 대하여, 상기 투여에 사용된 펩티드에 대하여 특이적인 세포독성 활성이 있는지 조사하였다. 표적 세포로서는, HLA-A24 와 H2Kb 의 키메라 MHC 클래스 I 분자 (Int. J. Cancer: 100, 565, 2002) 를 안정적으로 발현하도록 EL-4 세포 (ATCC No. TIB-39) 를 형질전환하여 수득된 EL4-A2402/Kb 를 사용하였다. 상기 표적 세포를 51Cr (3.7 MBq/106 세포) 로 표지하고, 상기 펩티드로 100 ㎍/㎖ 가 되도록 1 시간동안 펄스하였다. 대조군에 있어서, 상기 펩티드로 펄스되지 않은 표적 세포를 2 시간동안 51Cr 로 표지하였다. 이들 표지된 표적 세포와 먼저 제조된 비장 세포를 1:120 의 비율로 혼합하고, 4 시간동안 배양하고, 상해를 받은 표적 세포의 비율을 기준으로 CTL 활성을 평가하였다. 결과를 도 1 에 나타내었다. 상기 펩티드가 주입된 마우스로부터 제조된 비장 세포는, 펩티드로 펄스된 표적 세포를 강하게 상해하였다. 그러나, 이들은 상기 펩티드로 펄스되지 않은 표적 세포에 대하여는 약한 세포독성을 보였다. 이 결과는 상기 펩티드에 대하여 특이적인 CTL 이 유도된 것을 분명히 나타내었다.