TWI666026B - Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗 - Google Patents

Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗 Download PDF

Info

Publication number
TWI666026B
TWI666026B TW103111843A TW103111843A TWI666026B TW I666026 B TWI666026 B TW I666026B TW 103111843 A TW103111843 A TW 103111843A TW 103111843 A TW103111843 A TW 103111843A TW I666026 B TWI666026 B TW I666026B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
peptide
sequence number
formula
amino acid
cancer antigen
Prior art date
Application number
TW103111843A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201505650A (zh
Inventor
李嘉強
阪仁志
西尾幸博
後藤正志
西原紀夫
高梨洋輔
Original Assignee
日商大日本住友製藥股份有限公司
日商癌免疫研究所股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商大日本住友製藥股份有限公司, 日商癌免疫研究所股份有限公司 filed Critical 日商大日本住友製藥股份有限公司
Publication of TW201505650A publication Critical patent/TW201505650A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI666026B publication Critical patent/TWI666026B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/001153—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Abstract

本發明提供式(1)所表示之化合物或其鹽等：
[式中，Xa及Ya表示單鍵等，癌抗原胜肽A表示包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽，R1表示氫原子、式(2)所表示之基、或癌抗原胜肽C：
(式中，Xb及Yb表示單鍵等，癌抗原胜肽B表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含7~30殘基之胺 基酸的MHC I類限制性WT1胜肽)，癌抗原胜肽C表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽或MHC II類限制性WT1胜肽]。

Description

WT1抗原胜肽結合疫苗
本發明係關於一種複合化(結合)疫苗，其屬於癌症免疫療法之領域，可受胜肽分解酵素ERAP1修整，經由硫-硫共價鍵使源自WT1抗原蛋白質之癌抗原胜肽前驅物複合化而成，有效地誘導細胞毒殺性T細胞。
活體之癌細胞消除中，主要是細胞性免疫、尤其是細胞毒殺性T細胞(細胞毒殺性T淋巴球，Cytotoxic T-lymphocyte，Cytotoxic T-cell。以下，稱為CTL)發揮重要作用。CTL係識別由源自癌抗原蛋白質之抗原胜肽(癌抗原胜肽)及MHC I類分子所形成之複合體的前驅物T細胞發生分化增殖而生成者，攻擊癌細胞。
一般認為Wilms腫瘤之癌抑制基因WT1(WT1基因)為白血病及實體癌中之新癌抗原蛋白質(參照非專利文獻1)。
關於該WT1蛋白質，例如報告有與以下之MHC I類結合而呈現之癌抗原胜肽(參照專利文獻1、2)。
WT1126-134胜肽：RMFPNAPYL(Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu)(序列編號：2)、WT1235-243胜肽：CMTWNQMNL(Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu)(序列編號：3)、WT110-18胜肽：ALLPAVPSL(Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Pro-Ser-Leu)(序列編號：5)、 WT1187-195胜肽：SLGEQQYSV(Ser-Leu-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val)(序列編號：6)、WT1302-310胜肽：RVPGVAPTL(Arg-Val-Pro-Gly-Val-Ala-Pro-Thr-Leu)(序列編號：7)等。
於癌症免疫療法中，輔助T細胞(helper T cell)之活化亦對包括CTL之其他T細胞之功能亢進較為重要。通常藉由如下方式使輔助T細胞活化：抗原蛋白質被細胞內溶素體分解，由包含13~17殘基左右之胺基酸之胜肽所構成的片段胜肽之一部分作為抗原胜肽而與MHC II類分子結合，並呈現為輔助T細胞之TCR‧CD3複合體。關於WT1蛋白質，例如報告有與以下之MHC II類結合而呈現之癌抗原胜肽(參照專利文獻3~5)。
WT1332-347胜肽：KRYFKLSHLQMHSRKH(Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His)(序列編號：8)、WT1328-349胜肽：PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(Pro-Gly-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His-Thr-Gly)(序列編號：10)、WT1122-140胜肽：SGQARMFPNAPYLPSCLES(Ser-Gly-Gln-Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser-Cys-Leu-Glu-Ser)(序列編號：11)等。
作為WT1之疫苗抗原，主要使用抗原蛋白質自身或如上所述之源自抗原蛋白質之抗原胜肽(參照非專利文獻2)。使用蛋白質之癌疫苗通常包含多種癌抗原胜肽，故而可同時誘導複數種CTL或輔助T細胞，另一方面，於穩定之供給或品質管理上有問題，故而廣泛使用製造、品質管理較容易之胜肽作為WT1之癌抗原。但是，一般而言，迄今為止之胜肽疫苗主要由單一之MHC I類呈現胜肽抗原所構成，為了以較佳之效率誘導CTL，近年來指出需要進一步改良(參照非專利文 獻3)。
作為其解決對策之一，可列舉多價抗原胜肽呈現型WT1胜肽癌疫苗。作為此種胜肽癌疫苗，報告有將複數種MHC I類及II類所呈現之胜肽抗原混合而成之混合疫苗(參照非專利文獻4)、以醯胺鍵連接MHC I類及II類所呈現之胜肽抗原而成之長鏈胜肽疫苗等(參照非專利文獻5)。但是，於為混合疫苗之情形時，由多種胺基酸所組成之各胜肽抗原顯示各種物性，故而在大多情況下以較佳之效率誘導與該等對應之CTL的最佳製劑之開發較為困難。又，於為長鏈胜肽疫苗之情形時，與蛋白質同樣，有其製造上存在問題之情況，進而，長鏈胜肽疫苗係經由任意之胜肽間隔子使I類及II類所呈現之胜肽抗原結合，故而細胞內酵素之切割部位之控制及預測較為困難。另一方面，報告有2個胜肽單體藉由雙硫鍵而相互鍵結之胜肽二聚物(參照專利文獻6)。該等與混合疫苗不同，為2個單一胜肽鍵結，故而具有單一物性且可簡便地製造。另一方面，為了使其複合化，WT1癌抗原胜肽必需於其胺基酸序列內包含半胱胺酸，其通用性較低。進而，亦報告有以雙硫鍵使癌抗原胜肽之N末端半胱胺酸與半胱胺酸、麩胱苷肽或硫代乙醇酸縮合而獲得之改型體(參照專利文獻7)。
複數種肽酶參與對MHC I類之癌抗原胜肽呈現。據報告稱，該等肽酶內，內質網胺基肽酶1(Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，以下，稱為ERAP1)為內質網(Endoplasmic reticulum。以下，稱為ER)內之修整酵素之一，識別特定之抗原胜肽序列及胜肽之長度，將癌抗原胜肽前驅物自N-末端切割，調整為最適合向MHC I類結合之長度(參照非專利文獻6-8)。但是，迄今為止，未報告藉由ERAP1之修整功能而自N-末端進行長度調節之包含半胱胺酸的WT1胜肽癌抗原前驅物。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第00/06602號
[專利文獻2]國際公開第00/18795號
[專利文獻3]國際公開第2005/045027號
[專利文獻4]國際公開第2007/047764號
[專利文獻5]國際公開第2007/120673號
[專利文獻6]國際公開第2004/063217號
[專利文獻7]國際公開第2007/063903號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]The Journal of Immunology, 2000; 164(4); 1873-1880
[非專利文獻2]The Oncologist, 2012; 17(2); 250-259
[非專利文獻3]Cancer Journal, 2011; 17(5); 343-350
[非專利文獻4]Blood, 2010; 166(2); 171-179
[非專利文獻5]Cancers, 2011; 3; 3991-4009
[非專利文獻6]Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 2005; 102(47); 17107-17112
[非專利文獻7]The Journal of Immunology, 2009; 183; 5526-5536
[非專利文獻8]The Journal of Immunology, 2010; 184; 4725-4732
本發明之課題在於提供一種以較佳之效率誘導CTL之WT1結合疫苗。
本發明者人為了解決上述問題而進行潛心研究，結果在對採用結合疫苗之情況進行研究的過程中，想到對WT1癌抗原胜肽加成半胱 胺酸，進而確認根據利用活體內動物模型之藥理試驗等之結果而強烈地暗示ERAP1自由細胞內之雙硫鍵之還原性開裂所產生的WT1癌抗原胜肽前驅物之N-末端切割半胱胺酸並以較高之效率轉變為癌抗原胜肽，藉此發現了可於體內誘導CTL之多價抗原胜肽呈現型結合疫苗，從而完成本發明。
具體而言，在研究上述問題之解決策之過程中，想到於使不同之2種WT1癌抗原胜肽複合化時，在不對向MHC I類之抗原呈現造成影響的情況下，將必要之半胱胺酸導入至N-末端或C-末端之任意位置的方法。進一步之研究結果，發明了於WT1癌抗原胜肽之N末端導入包含半胱胺酸之0~5個胺基酸的胜肽、或包含介隔該胜肽之半胱胺酸之雙硫鍵的結合體。並且，本發明者等人最初確認該胜肽或結合體容易在活體外及/或活體內進行利用ERAP1之修整，其結果生成癌抗原胜肽，從而完成本發明。
業界期待製造容易、通用性優異且以較佳之效率誘導CTL之新穎之多價WT1抗原胜肽呈現型胜肽癌疫苗的開發，結果藉由本發明者等人發明之結合體，可開發以較佳之效率誘導CTL，物理化學性質優異，製造容易，製造之管理亦容易，且通用性優異之WT1結合疫苗。
即，本發明係關於以下者。
1.第一態樣
項1.一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物係由式(1)表示：[化1]
[式中，Xa及Ya獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Xa之胺基酸殘基數與Ya之胺基酸殘基數的和為0~4之整數，癌抗原胜肽A表示包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽A之N末端胺基酸之胺基與式(1)中之Ya鍵結，癌抗原胜肽A之C末端胺基酸之羰基與式(1)中之羥基鍵結，R1表示氫原子、式(2)所表示之基、或癌抗原胜肽C：
(式中，Xb及Yb獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Xb之胺基酸殘基數與Yb之胺基酸殘基數的和為0~4之整數，癌抗原胜肽B表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽B之N末端胺基酸之胺基與式(2)中之Yb鍵結，癌抗原胜肽B之C末端胺基酸之羰基與式(2)中之羥基鍵結，式(2)中之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結)， 癌抗原胜肽C表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽或包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結。
其中，於R1為氫原子之情形時，式(1)所表示之化合物之序列與WT1蛋白之部分序列不同]；項2.如項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵，或Xa及Ya獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xa為單鍵且Ya為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xa為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵，或Xa為單鍵且Ya為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xa及Ya為單鍵；項3.如項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa為單鍵，Ya為單鍵、丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基；項4.如項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa為單鍵或包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Ya為單鍵；項5.如項1至4中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa及Ya為單鍵；項6.如項1至5中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項7.如項1至6中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及 RVPGVAPTL(序列編號：7)，或為包含在選自序列編號：2、3、5、6及7中之任一胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有CTL誘導活性者；項8.如項1至7中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、CYTWNQMNL(序列編號：4)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)；項9.如項1至8中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為氫原子；項10.如項1至9中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CRMFPNAPYL(序列編號：13)、CCMTWNQMNL(序列編號：14)、CCYTWNQMNL(序列編號：15)、CALLPAVPSL(序列編號：16)、CSLGEQQYSV(序列編號：17)、及CRVPGVAPTL(序列編號：18)；項11.如項1至8中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為式(2)所表示之基；項12.如項1至8及11中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽， 其中Xb為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵，或Xb及Yb獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xb為單鍵且Yb為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵，或Xb為單鍵且Yb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xb及Yb為單鍵；項13.如項1至8及11至12中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb為單鍵，Yb為單鍵、丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基；項14.如項1至8及11至12中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb為單鍵或包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Yb為單鍵；項15.如項1至8及11至14中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb及Yb為單鍵；項16.如項1至8及11至15中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項17.如項1至8及11至16中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，或者為包含在選自序列編號：2、3、5、6及7中之任一胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有CTL誘導活性 者；項18.如項1至8及11至17中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、CYTWNQMNL(序列編號：4)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)；項19.如項1至8及11至18中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(3)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項20.如項1至8中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為癌抗原胜肽C；項21.如項1至8及20中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項22.如項1至8及20至21中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含以下胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)， 或者為包含在序列編號：3之胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有CTL誘導活性者；項23.如項1至8及20至22中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)；項24.如項1至8及20至23中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(4)所表示者、或式(5)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項25.如項1至8及20中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含14~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽；項26.如項1至8、20及25中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者： SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)，或者為包含在選自序列編號：10~11及19~24中之任一胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有輔助T細胞誘導活性者；項27.如項1至8、20及25至26中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)；項28.如項1至8、20及25至27中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(6)所表示者、式(7)所表示 者、式(8)所表示者、或式(9)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項29.一種醫藥組合物，其含有如項1至28中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽及藥學上所容許之載體；項30.如項29之醫藥組合物，其係用作癌疫苗；項31.一種化合物或其藥學上所容許之鹽之用途，其係如項1至28 中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽的用途，其係用以製造癌疫苗；項32.一種治療或預防癌之方法，其包括將如項1至28中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽的對治療或預防有效之量投予至需要其之WT1陽性癌患者；及項33.一種方法，其係使如項1至28中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽與ERAP1反應，藉此獲得2種不同之MHC I類限制性抗原決定基或MHC I類限制性抗原決定基及MHC II類限制性抗原決定基。
2.第二態樣
項1.一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物係由式(1)所表示者：
[式中，Xa及Ya獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Xa之胺基酸殘基數與Ya之胺基酸殘基數的和為0~4之整數，癌抗原胜肽A表示包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽A之N末端胺基酸之胺基與式(1)中之Ya鍵結，癌抗原胜肽A之C末端胺基酸之羰基與式(1)中之羥基鍵結，R1表示氫原子、式(2)所表示之基、或癌抗原胜肽C：[化11]
(式中，Xb及Yb獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Xb之胺基酸殘基數與Yb之胺基酸殘基數的和為0~4之整數，癌抗原胜肽B表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽B之N末端胺基酸之胺基與式(2)中之Yb鍵結，癌抗原胜肽B之C末端胺基酸之羰基與式(2)中之羥基鍵結，式(2)中之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結)，癌抗原胜肽C表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽或包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結。
其中，於R1為氫原子之情形時，式(1)所表示之化合物之序列與WT1蛋白之部分序列不同]；項2.如項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵，或Xa及Ya獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xa為單鍵且Ya為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xa為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵，或Xa為單鍵且Ya為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xa及Ya為單鍵； 項3.如項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa為單鍵，Ya為單鍵、丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基；項4.如項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa為單鍵或包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Ya為單鍵；項5.如項1至4中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xa及Ya為單鍵；項6.如項1至5中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項7.如項1至6中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，或者為包含在序列編號：2、3、5、6及7中之任一胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有CTL誘導活性者；項8.如項1至7中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、CYTWNQMNL(序列編號：4)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)；項9.如項1至8中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1 為氫原子；項10.如項1至9中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CRMFPNAPYL(序列編號：13)、CCMTWNQMNL(序列編號：14)、CCYTWNQMNL(序列編號：15)、CALLPAVPSL(序列編號：16)、CSLGEQQYSV(序列編號：17)、及CRVPGVAPTL(序列編號：18)；項11.如項1至8中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為式(2)所表示之基；項12.如項1至8及11中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵，或Xb及Yb獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xb為單鍵且Yb為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵，或Xb為單鍵且Yb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xb及Yb為單鍵；項13.如項1至8及11至12中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb為單鍵，Yb為單鍵、丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基；項14.如項1至8及11至12中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb為單鍵或包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Yb為單鍵；項15.如項1至8及11至14中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xb及Yb為單鍵； 項16.如項1至8及11至15中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項17.如項1至8及11至16中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，或者為包含在序列編號：2、3、5、6及7中之任一胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有CTL誘導活性者；項18.如項1至8及11至17中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、CYTWNQMNL(序列編號：4)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)；項19.如項1至8及11至18中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(3)所表示者：[化12]
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項20.如項13之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Yb為丙胺酸殘基；項21.如項1至8、11至13及20中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中於癌抗原胜肽B為包含1個半胱胺酸殘基之MHC I類限制性WT1胜肽之情形時，癌抗原胜肽B中之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結：
(式中，Xd及Yd獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Xd之胺基酸殘基數與Yd之胺基酸殘基數的和為0~4之整數，癌抗原胜肽D表示包含7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽D之N末端胺基酸之胺基與式(16)中之Yd鍵結，癌抗原胜肽D之C末端胺基酸之羰基與式(16)中之羥基鍵結)，或者與包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽即癌抗原胜肽E之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結；項22.如項21之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽； 項23.如項21至22中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)；項24.如項21至23中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為單鍵，或Xd及Yd獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xd為單鍵且Yd為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為單鍵，或Xd為單鍵且Yd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xd及Yd為單鍵；項25.如項21至24中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd為單鍵，Yd為單鍵、丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基；項26.如項21至24中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd為單鍵或包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Yd為單鍵；項27.如項21至26中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd及Yd為單鍵；項28.如項21至27中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽D為包含14~30殘基之胺基酸之MHC II類限制性WT1胜肽；項29.如項21至28中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽D為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、 PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、及WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)；項30.如項1至8、11至13及20至29中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(15)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項31.如項21至23中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽E為包含14~30殘基之胺基酸之MHC II類限制性WT1胜肽；項32.如項21至23及31中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽E為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、 PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)；項33.如項1至8中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為癌抗原胜肽C；項34.如項1至8及33中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項35.如項1至8及33至34中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含以下胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)，或者為包含在序列編號：3之胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有CTL誘導活性者；項36.如項1至8及33至35中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)；項37.如項1至8及33至36中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(4)所表示者、或式(5)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項38.如項1至8及33中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中於包含包括1個半胱胺酸殘基之1~4殘基之胺基酸的胜肽進而鍵結於癌抗原胜肽C之N末端之情形時，鍵結於癌抗原胜肽C之N末端的胜肽之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結：
(式中，Xd及Yd獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Xd之胺基酸殘基數與Yd之胺基酸殘基數的和為0~4之整數，癌抗原胜肽D表示包含7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽，癌抗原胜肽D之N末端胺基酸之胺基與式(16)中之Yd鍵結，癌抗原胜肽D之C末端胺基酸之羰基與式(16)中之羥基鍵結)，或者與包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽即癌抗原胜肽E之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結；項39.如項38之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中鍵結於癌抗 原胜肽C之N末端之包含包括1個半胱胺酸殘基之1~4殘基之胺基酸之胜肽為包含CA之二胜肽；項40.如項38至39中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含7~15殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；項41.如項38至40中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)；項42.如項38至41中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為單鍵，或Xd及Yd獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xd為單鍵且Yd為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為單鍵，或Xd為單鍵且Yd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，或Xd及Yd為單鍵；項43.如項38至42中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd為單鍵，Yd為單鍵、丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基；項44.如項38至42中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd為單鍵或包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基，Yd為單鍵；項45.如項38至44中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中Xd及Yd為單鍵；項46.如項38至45中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽D為包含14~30殘基之胺基酸之MHC II類限制性WT1胜肽；項47.如項38至46中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽D為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者： SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、及WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)；項48.如項38至47中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(14)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項49.如項38至41及44中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽E為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、 SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)；項50.如項38至41及49中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(12)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項51.如項1至8及33中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含14~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽；項52.如項1至8、33及51中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、 PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)，或者為包含在序列編號：10~11及19~24中之任一胺基酸序列中包含胺基酸殘基之改型之改型胺基酸序列、且具有輔助T細胞誘導活性者；項53.如項1至8、33及51至52中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)；項54.如項1至8、33及51至53中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(6)所表示者、式(7)所表示者、式(8)所表示者、或式(9)所表示者：[化20]
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項55.一種MHC II類限制性WT1胜肽之改型體，其包含7~30殘基之胺基酸；項56.如項55之改型體，其係以下之胺基酸序列：CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)；項57.一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物係式(10)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項58.一種組合物，其包含選自由式(3)所表示之化合物、式(4)所表示之化合物、及式(5)所表示之化合物所構成之群中之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
及含有選自由以下胺基酸序列所構成之群中之胺基酸序列的胜肽： CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)；項59.一種醫藥組合物，其含有如項1至54及57中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽或如項58之組合物及藥學上所容許之載體；項60.如項59之醫藥組合物，其係用作癌疫苗；項61.一種如項1至54及57中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽或如項58之組合物之用途，其係用以製造癌疫苗；項62.一種方法，其係用以治療或預防癌之方法，且包括將如項1至54及57中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽或如項58之組合物以對治療或預防有效的量投予至需要其之WT1陽性癌患者之步驟；項63.一種方法，其係藉由使如項1至54及57中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽與ERAP1反應而獲得2種不同MHC I類限制性抗原決定基或MHC I類限制性抗原決定基及MHC II類限制性抗原決定基；及項64.一種化合物之合成方法，其包括以下之步驟：步驟(1)，其係使用Fmoc-C(Mmt)A-SBn及癌抗原胜肽C合成C(Mmt)A之C末端胺基酸之羰基與癌抗原胜肽C之N末端胺基鍵結而成之胜肽的步驟，抗原胜肽C表示包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽或包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽；步驟(2)，其係使用上述步驟(1)中所獲得之胜肽及由Npys基(3-Nitro-2-pyridinesulfenyl，3-硝基-2-吡啶次磺醯基)保護之1個半胱胺酸 殘基鍵結於N末端之癌抗原胜肽A，合成上述步驟(1)中所獲得之胜肽中之癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基及鍵結於癌抗原胜肽A之N末端的半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結而成之胜肽的步驟，癌抗原胜肽A表示包含7~30殘基之胺基酸之MHC I類限制性WT1胜肽；及步驟(3)，其係使用上述步驟(2)中所獲得之胜肽及包含由SPy基保護之半胱胺酸殘基之癌抗原胜肽D，合成鍵結於上述步驟(2)中所獲得之胜肽中之癌抗原胜肽A的N末端之半胱胺酸殘基之硫醚基與癌抗原胜肽D之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結而成的胜肽之步驟，癌抗原胜肽D表示包含1個半胱胺酸殘基鍵結於N末端之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽或包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽。
3.第三態樣係關於：
項1.一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物係由式(1)所表示：
[式中，Xa及Ya表示單鍵，癌抗原胜肽A表示包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、 SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，癌抗原胜肽A之N末端胺基酸之胺基與式(1)中之Ya鍵結，癌抗原胜肽A之C末端胺基酸之羰基與式(1)中之羥基鍵結，R1表示癌抗原胜肽C，癌抗原胜肽C表示序列與癌抗原胜肽A不同且包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)，癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結]；項2.如項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(4)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)；項3.如項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)所表示之化合物為式(5)所表示者：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)； 項4.一種醫藥組合物，其含有如項1至3中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽及藥學上所容許之載體；項5.一種組合物，其係如項4之醫藥組合物，且含有包含選自由以下胺基酸序列所構成之群中之胺基酸序列的胜肽之一種以上：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)、及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)；及項6.一種組合物，其包含選自由式(4)所表示之化合物、及式(5)所表示之化合物所構成之群中之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
及包含選自由以下胺基酸序列所構成之群中之胺基酸序列的胜肽之一種以上： CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)、及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)。
根據本發明，可提供一種作為癌症免疫療法劑較為有用之上述式(1)所表示之化合物(以下，有時稱為本發明之化合物)。根據本發明之化合物，可提供一種於體內及體外有效地誘導CTL之癌疫苗或癌症免疫療法劑。詳細而言，根據本發明之化合物，可於體內及體外生成序列不同之2種MHC I類限制性WT1胜肽或序列不同之2種MHC I類限制性WT1抗原決定基、MHC I類WT1限制性胜肽及MHC II類限制性WT1胜肽、MHC I類WT1限制性WT1抗原決定基及MHC II類限制性WT1抗原決定基、序列不同之2種MHC I類限制性WT1胜肽及MHC II類限制性WT1胜肽、或序列不同之2種MHC I類限制性WT1抗原決定基及MHC II類限制性WT1抗原決定基，有效地誘導CTL。
其中，關於序列不同之2種MHC I類限制性WT1胜肽之HLA之亞型，尤佳為A02型(A-0201、A0206等)胜肽與A24型(A-2402等)胜肽組合而獲得的本發明之化合物(結合體)。歐美人(Caucasian)中，HLA-A0201型或HLA-A0206型之人最多約47%，其次，HLA-A2402型約13%，去除重複(即，重複計算了具有兩種類型之人)，該等類型之總和約占56%(Human Immnol.62：1009；2001)。另一方面，日本人等中，HLA-A2402之人最多約60%，其次HLA-A0201或HLA-A0206約39%，去除重複(即，重複計算了具有兩種類型之人)，該等類型之總和約占81%(www.bmdc.irc.or.jp/GF-A.htm)。因此，作為本發明之化合 物之優點，具體而言，可列舉以一種本發明之化合物覆蓋更大之Popuration的優點、及可不必在投予前篩選患者之HLA之亞型的優點等。就本發明之化合物之上述優點之觀點而言，較佳為式(3)、式(4)或式(5)所表示之化合物，更佳為式(5)所表示之化合物。
又，根據本發明之化合物，可提供一種物理化學性質或穩定性優異，製造或其控制較容易之癌疫苗之有效成分。藉此，癌疫苗之製劑化亦變得容易。
具體而言，作為物理化學性質，可列舉溶解度、溶液之黏度、伴隨其之純化之容易度、冷凍乾燥後之易操作性、伴隨其之純化之容易度等。作為穩定性，經鹽取代後之穩定性、吸濕性、熱穩定性、乳液形成後之穩定性等。進而作為藥理活性，可列舉作為癌疫苗之藥效、因API(Active Pharmaceutical Ingredient、醫藥品有效成分)而產生之差異、與製劑中之添加劑之相互作用等。其中，所謂因API而產生之差異，係由API所引起的作為癌疫苗之差異，具體而言，在溶解度差異較大之2種API中，於為溶解度較小之API之情形時容易析出，充分預想到無法對醫藥品進行作為必需要素之利用薄膜過濾器之過濾的殺菌處理之可能性。或者，可認為即便勉強進行利用溶解度較小之API之過濾的殺菌處理，濾液所含之API之量亦大幅減少，作為癌疫苗所必需之CTL誘導能力亦明顯下降。因此，關於溶解度較小之API，容易預想到生產上之效率明顯下降之缺點。
圖1係表示試驗例1中，針對於實施例2~5中合成之序列編號：13、16、17及18之各胜肽，藉由ERAP1試驗N末端胺基酸之修整經時變化的結果之圖。
圖2係表示試驗例2中，針對於實施例1中合成之式(5)所表示之化合物，藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析 (ELISPOT assay，Enzyme-linked Immunospot Assay)試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖3係表示試驗例2中，針對於實施例1中合成之式(5)所表示之化合物，藉由使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖4係表示試驗例4中，針對於實施例6中合成之式(3)所表示之化合物，藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖5係表示試驗例5中，針對於實施例7中合成之式(6)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之序列編號：24之胜肽反應性細胞之誘導能力的結果之圖。
圖6係表示試驗例5中，針對於實施例7中合成之式(6)所表示之化合物，在序列編號：24之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之序列編號：24之胜肽反應性細胞之誘導能力的結果之圖。
圖7係表示試驗例6中，針對於實施例9中合成之式(8)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖8係表示試驗例6中，針對於實施例9中合成之式(8)所表示之化合物，在序列編號：22之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之序列編號：22之胜肽反應性細胞之誘導能力的結果之圖。
圖9係表示試驗例8中，針對於實施例8中合成之式(7)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201 基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖10係表示試驗例8中，針對於實施例8中合成之式(7)所表示之化合物，在序列編號：23之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之序列編號：23之胜肽反應性細胞之誘導能力的結果之圖。
圖11係表示試驗例9中，針對於實施例10中合成之式(9)所表示之化合物，在序列編號：5之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖12係表示試驗例9中，針對於實施例10中合成之式(9)所表示之化合物，在序列編號：24之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之序列編號：24之胜肽反應性細胞之誘導能力的結果之圖。
圖13係表示比較例1中，針對於參考例8及9中合成之序列編號：238及239所表示之胜肽，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖14係表示比較例1中，針對於參考例8及9中合成之序列編號：238及239所表示之胜肽，在序列編號：4之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖15係表示比較例2中，針對於參考例10及11中合成之序列編號：240及241所表示之胜肽，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖16係表示比較例2中，針對於參考例10及11中合成之序列編號：240及241所表示之胜肽，在序列編號：4之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖17係表示試驗例11中，針對於實施例13中合成之式(10)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖18係表示比較例3中，針對於參考例12中合成之式(11)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖19係表示試驗例12中，針對於實施例14中合成之式(12)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖20係表示試驗例12中，針對於實施例14中合成之式(12)所表示之化合物，在序列編號：4之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖21係表示試驗例13中，針對於實施例15中合成之式(14)所表示之化合物，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖22係表示試驗例13中，針對於實施例15中合成之式(14)所表示之化合物，在序列編號：4之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA- A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖23係表示試驗例14中，針對於將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與參考例1中合成之序列編號：22所表示之胜肽混合而成的混合疫苗，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖24係表示試驗例15中，針對於將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與參考例13中合成之序列編號：244所表示之胜肽混合而成的混合疫苗，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖25係表示試驗例16中，針對於將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與參考例2中合成之序列編號：24所表示之胜肽混合而成的混合疫苗，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖26係表示試驗例17中，針對於將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與實施例11中合成之序列編號：242所表示之胜肽混合而成的混合疫苗，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導能力的結果之圖。
圖27係表示試驗例18中，針對於將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與實施例11中合成之序列編號：243所表示之胜肽混合而成的混合疫苗，在序列編號：2之胜肽之脈衝或非脈衝下藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析試驗活體內之CTL誘導 能力的結果之圖。
以下，對本發明之實施形態進行詳細地說明。
所謂本發明中之「胺基酸殘基」，係指於胜肽或蛋白質分子上，相當於構成胜肽或蛋白質之胺基酸之一單位的部分。作為「胺基酸殘基」，可列舉天然或非天然之α-胺基酸殘基、β-胺基酸殘基、γ-胺基酸殘基或δ-胺基酸殘基。具體而言，可列舉天然之α-胺基酸殘基、鳥胺酸殘基、高絲胺酸殘基、高半胱胺酸殘基、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸或δ-胺基戊酸等。於「胺基酸殘基」上可存在光學活性體之情形時，可為L體、D體中之任一者，較佳為L體。
於以略號表示本發明中之「胺基酸殘基」之情形時，根據以下之略號進行記述。
Ala或A：丙胺酸殘基
Arg或R：精胺酸殘基
Asn或N：天冬醯胺殘基
Asp或D：天冬胺酸殘基
Cys或C：半胱胺酸殘基
Gln或Q：麩醯胺殘基
Glu或E：麩胺酸殘基
Gly或G：甘胺酸殘基
His或H：組胺酸殘基
Ile或I：異白胺酸殘基
Leu或L：白胺酸殘基
Lys或K：離胺酸殘基
Met或M：甲硫胺酸殘基
Phe或F：苯基丙胺酸殘基
Pro或P：脯胺酸殘基
Ser或S：絲胺酸殘基
Thr或T：蘇胺酸殘基
Trp或W：色胺酸殘基
Tyr或Y：酪胺酸殘基
Val或V：纈胺酸殘基
Abu：2-胺基酪酸殘基(亦稱為α-胺基酪酸殘基)
Orn：鳥胺酸殘基
Cit：瓜胺酸殘基
本發明中之「胜肽」之胺基酸序列係根據常規方法以N末端胺基酸之胺基酸殘基位於左側，C末端胺基酸之胺基酸殘基位於右側之方式記述。又，「胜肽」中，只要無特別說明，則N末端胺基酸之胺基酸殘基之胺基與氫原子鍵結，C末端胺基酸之胺基酸殘基之羰基與羥基鍵結。所謂胜肽之二價基，係指經由N末端胺基酸之胺基酸殘基之胺基及C末端胺基酸之胺基酸殘基之羰基而鍵結的基。
於本發明之化合物中，例如式(3)~(9)所表示之化合物中，關於相當於其部分結構之胜肽，只要無特別說明，則N末端胺基酸之胺基酸殘基之胺基與氫原子鍵結，C末端胺基酸之胺基酸殘基之羰基與羥基鍵結。
本發明中之「Xa」及「Ya」獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基。Xa之胺基酸殘基數與Ya之胺基酸殘基數之和為0~4之整數。例如所謂該和為0之整數，係指Xa及Ya為單鍵。又，作為該和為4之整數之情形，例如可列舉Xa及Ya獨立為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、Xa為包含3殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、Xa為包含4殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵之情形等。
作為該和之整數，較佳為可列舉0~2，更佳為可列舉0~1，最佳為可列舉0。即，作為Xa及Ya，最佳為同時為單鍵之情形。
作為該和之整數為2之情形，可列舉Xa為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵之情形、Xa及Ya獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、或Xa為單鍵且Ya為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形。
作為該和之整數為1之情形，可列舉Xa為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Ya為單鍵之情形、或Xa為單鍵且Ya為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形。其中，較佳為可列舉Xa為單鍵且Ya為丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基之情形。
所謂本發明中之「癌抗原胜肽A」，係指包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽。式(1)中，癌抗原胜肽A係N末端胺基酸之胺基與式(1)中之Ya鍵結，C末端胺基酸之羰基與式(1)中之羥基鍵結。
首先，所謂本發明中之「MHC I類限制性」，係指與作為主要組織相容性抗原(Major Histocompatibility Complex、MHC)之I類的MHC I類分子結合而誘導CTL之特性。
MHC就人類而言稱為人類白血球型抗原(HLA)。相當於MHC I類分子之HLA分類為HLA-A、B、Cw、F及G等亞型。作為「MHC I類限制性」，較佳為可列舉HLA-A限制性、HLA-B限制性或HLA-Cw限制性。
關於HLA之各亞型，已知有多型(對立基因)。作為HLA-A之多型，可列舉HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A24等27種以上，作為HLA-B之多型，可列舉HLA-B7、HLA-B40、HLA-B4403等59種以上，作為HLA-Cw之多型，可列舉HLA-Cw0301、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等10種以上。該等多型中，較佳為可列舉HLA-A0201或HLA-A24。
其次，所謂本發明中之「WT1胜肽」，係指包含序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中連續之7~30殘基之胺基酸的部分胜肽。
因此，所謂本發明中之「MHC I類限制性WT1胜肽」，係於體外及/或體內與MHC I類抗原結合並作為複合體所呈現之胜肽，且係指在前驅物T細胞內識別該複合體之結果誘導CTL之胜肽。「MHC I類限制性WT1胜肽」之胺基酸殘基數為7~30，較佳為7~15，更佳為8~12，更佳為8~11，最佳為8或9。
包含7~12殘基或較佳為9殘基之胺基酸之「MHC I類限制性WT1胜肽」亦稱為「MHC I類限制性WT1抗原決定基」。所謂本發明中之「MHC I類限制性WT1抗原決定基」，係指與MHC I類抗原結合並作為複合體所呈現之胜肽本身。即，「MHC I類限制性WT1胜肽」藉由於體外及/或體內利用Gamma-Interferon-inducible Lysosomal Thiol Reductase(GILT，GLT)等蛋白體及/或蛋白酶使細胞內之本發明化合物之分解(Proteolysis、雙硫鍵之還原性開裂)、及/或利用Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1(ERAP1、ER-aminopeptidase 1)切割(亦稱為修整)成最佳殘基數，而生成「MHC I類限制性WT1抗原決定基」。關於該生成，主要考慮到首先利用蛋白體及/或蛋白酶進行分解之結果產生「MHC I類限制性WT1抗原決定基」之C末端胺基酸，其次利用ERAP1進行修整(切割)之結果產生「MHC I類限制性WT1抗原決定基」之N末端胺基酸的生成過程。其中，該生成亦可經由除該生成過程以外之過程。再者，現在ERAP1亦稱為ERAAP(ER aminopeptidase associated with antigen presentation)，並且亦稱為A-LAP、PILS-AP或ARTS-1。
因此，作為「MHC I類限制性WT1胜肽」，較佳為於包含7~12殘基之胺基酸的「MHC I類限制性WT1抗原決定基」之C末端胺基酸之 羰基上加成1~23殘基之胺基酸而生成的包含7~30殘基之胺基酸之胜肽。
作為「MHC I類限制性WT1胜肽」，例如可列舉表1~44中所記載之胜肽。各表中，所謂「位置」，係指序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中之位置。
作為「MHC I類限制性WT1胜肽」，較佳為可列舉包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、 SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，或者為包含在序列編號：2、3、5、6及7中之任一胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型的改型胺基酸序列且具有CTL誘導活性之胜肽。進而較佳為可列舉包含選自序列編號：2、3、5、6及7中之任一胺基酸序列之胜肽。
所謂本發明中之「包含胺基酸序列之胜肽」，係指如通常般在該胺基酸序列之N末端胺基酸及/或C末端胺基酸上進而加成胺基酸之胜肽。於加成有「癌抗原胜肽A」及「癌抗原胜肽B」中之「MHC I類限制性WT1胜肽」之情形時，較佳為加成於C末端側之胜肽。於加成有「MHC I類限制性WT1抗原決定基」之情形時，較佳為加成於C末端側。
本發明中之「包含在胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型的改型胺基酸序列且具有CTL誘導活性之胜肽」亦稱為「改型殺手胜肽」。該改型殺手胜肽係指包含在胺基酸序列中缺失、取代及/或加成1~3個胺基酸之胺基酸序列，且與MHC I類結合而誘導CTL之胜肽。作為取代之胺基酸之取代位置，於為包含9殘基之胺基酸的胜肽之情形時，可列舉1位(N末端)、2位、3位及9位。加成(亦包括插入)之胺基酸之數較佳為1或2，更佳為1。作為較佳之加成位置，可列舉C末端。缺失之胺基酸之數較佳為1。就改型而言，加成之胺基酸或取代之胺基酸亦可為除由基因所編碼之20種胺基酸以外之非天然胺基酸。
已知於HLA之亞型之每一多型中存在可與HLA抗原結合的胜肽之胺基酸序列之規則性(結合基元)。例如已知作為HLA-A24之結合基元，在包含8~11殘基之胺基酸的胜肽中，2位胺基酸為Tyr、Phe、Met或Trp，C末端之胺基酸為Phe、Leu、Ile、Trp或Met(J.Immunol.，152，p3913，1994、J.Immunol.，155，p4307，1994、 Immunogenetics，41，p178，1995)。因此，例如於為包含9殘基之胺基酸的胜肽之情形時，2位可藉由Tyr、Phe、Met或Trp而取代，及/或9位可藉由Phe、Leu、Ile、Trp或Met而取代，完成該取代之胜肽適合作為改型殺手胜肽。同樣，已知作為HLA-A0201之結合基元，在包含8~11殘基之胺基酸的胜肽中，2位胺基酸為Leu或Met，C末端之胺基酸為Val或Leu，因此例如於為包含9殘基之胺基酸的胜肽之情形時，2位可藉由Leu或Met而取代，及/或9位可藉由Val或Leu而取代，完成該取代之胜肽適合作為改型殺手胜肽。
作為改型殺手胜肽，例如可列舉如下胜肽。
作為RMFPNAPYL(序列編號：2)之改型殺手胜肽之RYFPNAPYL(序列編號：223)(參照國際公開03/106682號)；FMFPNAPYL(序列編號：224)、RLFPNAPYL(序列編號：225)、RMMPNAPYL(序列編號：226)、RMFPNAPYV(序列編號：227)或YMFPNAPYL(序列編號：228)(參照國際公開第2009/072610號)；作為CMTWNQMNL(序列編號：3)之改型殺手胜肽之CYTWNQMNL(序列編號：4)(參照國際公開第02/79253號)；Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu(序列編號：229)(本序列中，Xaa表示Ser或Ala)或Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu(序列編號：230)(本序列中，Xaa表示Ser、Ala、Abu、Arg、Lys、Orn、Cit、Leu、Phe或Asn)(參照國際公開2004/026897號)；作為ALLPAVPSL(序列編號：5)之改型殺手胜肽之AYLPAVPSL(序列編號：231)(參照國際公開第2003/106682號)； 作為SLGEQQYSV(序列編號：6)之改型殺手胜肽之FLGEQQYSV(序列編號：232)、SMGEQQYSV(序列編號：233)或SLMEQQYSV(序列編號：234)(參照國際公開第2009/072610號)；或作為RVPGVAPTL(序列編號：7)之改型殺手胜肽之RYPGVAPTL(序列編號：235)(參照國際公開第2003/106682號)。
本發明中之「R1」表示氫原子、上述式(2)所表示之基或癌抗原胜肽C，較佳為可列舉上述式(2)所表示之基或癌抗原胜肽C。
於R1為氫原子之情形時，式(1)之化合物為式(1-1)所表示之化合物、即胜肽：
(式中，Xa、Ya及癌抗原胜肽A與式(1)中之上述同義，Cys表示半胱胺酸殘基)。
關於R1為氫原子之式(1)之化合物即式(1-1)所表示之胜肽，其序列與WT1蛋白之部分序列不同。所謂式(1)之要素「序列與WT1蛋白之部分序列不同」，係指式(1-1)所表示之胜肽並非包含序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中連續之8~35殘基之胺基酸的部分胜肽。
即，R1為氫原子之式(1)之化合物並非包含序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中連續之8~35殘基之胺基酸的部分胜肽。列舉癌抗原胜肽A為WT1138-146胜肽之情形作為例子而進行具體地說明。 WT1138-146胜肽係其胺基酸序列為LESQPAIRN(序列編號：78)且包含序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中之138位~146位之連續之9殘基之胺基酸的部分胜肽。序列編號：1中，於WT1138-146胜肽之N末端側連續之137位為C。因此，WT1137-146胜肽(CLESQPAIRN)(序列編號：236)相當於包含序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中連續之10殘基之胺基酸的部分胜肽。另一方面，基於本案發明之要素「R1為氫原子之式(1)之化合物並非包含序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中連續之8~35殘基之胺基酸的部分胜肽」，在R1為氫原子之式(1)之化合物中，癌抗原胜肽A為WT1138-146胜肽(LESQPAIRN)(序列編號：78)之情形時，自本案發明之化合物中去除WT1137-146胜肽(CLESQPAIRN)(序列編號：236)，因此Xa及Ya不同時成為單鍵。
作為R1為氫原子之式(1)之化合物，較佳為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CRMFPNAPYL(序列編號：13)、CCMTWNQMNL(序列編號：14)、CCYTWNQMNL(序列編號：15)、CALLPAVPSL(序列編號：16)、CSLGEQQYSV(序列編號：17)、及CRVPGVAPTL(序列編號：18)。
於「R1」為上述式(2)所表示之基之情形時，式(1)之化合物為式(1-2)所表示之化合物：[化34]
(式中，Xa、Ya及癌抗原胜肽A與式(1)中之上述同義，Xb、Yb及癌抗原胜肽B與式(2)中之上述同義)。
本發明中之「Xb」及「Yb」獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基。Xb之胺基酸殘基數與Yb之胺基酸殘基數之和為0~4之整數。例如所謂該和為0之整數，係指Xb及Yb為單鍵。又，作為該和為4之整數之情形，例如可列舉Xb及Yb獨立為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、Xb為包含3殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、Xb為包含4殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵之情形等。
作為該和之整數，較佳為可列舉0~2，更佳為可列舉0~1，最佳為可列舉0。即，作為Xb及Yb，最佳為同時為單鍵之情形。
作為該和之整數為2之情形，可列舉Xb為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵之情形、Xb及Yb獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、或Xb為單鍵且Yb為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形。
作為該和之整數為1之情形，可列舉Xb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵之情形、或Xb為單鍵且Yb為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形。其中，較佳為可列舉Xb為單鍵且Yb為丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基之情形。
所謂本發明中之「癌抗原胜肽B」，係指包含7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽。該「MHC I類限制性WT1胜肽」係與上述同義。其中，式(1)所表示之化合物中，癌抗原胜肽A與癌抗原胜肽B不同時為相同之胜肽。即，癌抗原胜肽B受「與癌抗原胜肽A不同」之要素限定。
癌抗原胜肽A與癌抗原胜肽B不同時為相同之胜肽，因此關於R1為上述式(2)所表示之基的式(1)之化合物，即便假設Xa及Xb相同且Ya及Yb相同，亦並非均二聚物而為異二聚物。均二聚物係指使相同之胜肽單體二聚物化而成之二聚物，異二聚物係指使不同之胜肽單體二聚物化而成之二聚物。
於癌抗原胜肽B中，N末端胺基酸之胺基係在式(2)中與Yb鍵結(即，式(1-2)中，亦與Yb鍵結)，C末端胺基酸之羰基與式(2)中之羥基鍵結。
作為R1為式(2)所表示之基之情形時的式(1)之化合物、即式(1-2)之化合物，較佳為可列舉式(3)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
又，本發明中，於「癌抗原胜肽B」為包含1個半胱胺酸殘基之MHC I類限制性WT1胜肽之情形時，式(1)之化合物亦可為癌抗原胜肽B中之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結的化合物、或與癌抗原胜肽E之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結的化合物：[化36]
本發明中之「Xd」及「Yd」獨立地表示單鍵或包含1~4殘基之胺基酸的胜肽之二價基。Xd之胺基酸殘基數與Yd之胺基酸殘基數之和為0~4之整數。例如所謂該和為0之整數，係指Xd及Yd為單鍵。又，作為該和為4之整數之情形，例如可列舉Xd及Yd獨立為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、Xd為包含3殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、Xd為包含4殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為單鍵之情形等。
作為該和之整數，較佳為可列舉0~2，更佳為可列舉0~1，最佳為可列舉0。即，作為Xd及Yd，最佳為同時為單鍵之情形。
作為該和之整數為2之情形，可列舉Xd為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yb為單鍵之情形、Xd及Yd獨立為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形、或Xd為單鍵且Yd為包含2殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形。
作為該和之整數為1之情形，可列舉Xd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基且Yd為單鍵之情形、或Xd為單鍵且Yd為包含1殘基之胺基酸的胜肽之二價基之情形。其中，較佳為可列舉Xd為單鍵且Yd為丙胺酸殘基、白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基之情形。
所謂本發明中之「癌抗原胜肽D」，係包含7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽。式(16)中，癌抗原胜肽D係N末端胺基酸之胺基與式(16)中之Yd鍵結，C末端胺基酸之羰基與式(16)中之羥基鍵 結。
所謂本發明中之「MHC II類限制性」，係指與MHC II類分子結合而誘導輔助T細胞之特性，與下述「癌抗原胜肽C」中之定義同義。
相當於MHC II類分子之HLA分類為HLA-DR、DQ及DP等亞型。作為「MHC II類限制性」，較佳為可列舉HLA-DR限制性、HLA-DQ限制性或HLA-DP限制性。
因此，所謂本發明中之「MHC II類限制性WT1胜肽」，係指於體外及/或體內與MHC II類抗原結合而誘導輔助T細胞之胜肽。「MHC II類限制性WT1胜肽」之胺基酸殘基數為7~30，較佳為14~30。
作為「癌抗原胜肽D」，與下述「癌抗原胜肽C」中所列舉之胺基酸序列同樣，可列舉包含選自以下之胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、及WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)。
式(1)之化合物中，於「癌抗原胜肽B」為包含1個半胱胺酸殘基之MHC I類限制性WT1胜肽之情形時，作為癌抗原胜肽B中之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結之化合物，較佳為可列舉式(15)所表示之化 合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
所謂本發明中之「癌抗原胜肽E」，係指包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽，與下述「癌抗原胜肽C」中之「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽」之定義同義。
作為「癌抗原胜肽E」，與下述「癌抗原胜肽C」中所列舉之胺基酸序列同樣，可列舉包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)。
於R1為癌抗原胜肽C之情形時，癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結。
癌抗原胜肽C表示包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽或包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽。
本發明之「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽」中，只要在該胜肽之胺基酸序列中包含至少1個半胱胺酸殘基即可，作為所含之半胱胺酸殘基數，較佳為1~3，更佳為1~2，最佳為1。該「MHC I類限制性WT1胜肽」係與上述同義。R1為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽」之式(1)之化合物亦並非均二聚物而為異二聚物。
作為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽」，較佳為可列舉表45~52中所記載之胜肽。各表中，所謂「位置」，係指序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中之位置。
作為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽」，更佳為可列舉包含以下之胺基酸序列之胜肽：CMTWNQMNL(序列編號：3)、 或者包含在序列編號：3之胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型的改型胺基酸序列且具有CTL誘導活性之胜肽。該「包含胺基酸序列」及「包含在胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型的改型胺基酸序列且具有CTL誘導活性之胜肽」係與上述同義。最佳為可列舉包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)。
作為R1為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC I類限制性WT1胜肽」之情形時的式(1)之化合物，較佳為可列舉式(4)所表示之化合物、或式(5)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
其中，更佳為式(5)所表示之化合物。
又，本發明中，於包含包括1個半胱胺酸殘基之1~4殘基之胺基酸的胜肽進而鍵結於作為MHC I類限制性WT1胜肽之「癌抗原胜肽C」的N末端之情形時，上述式(1)之化合物亦可為鍵結於癌抗原胜肽C之N末端的胜肽之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結的化合物： 或與癌抗原胜肽E之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結的化合物。
本發明中之「Xd」、「Yd」、「癌抗原胜肽D」及「癌抗原胜肽E」係與上述「Xd」、「Yd」、「癌抗原胜肽D」及「癌抗原胜肽E」中之定義同義。
本發明中，鍵結於作為MHC I類限制性WT1胜肽之「癌抗原胜肽C」之N末端的「包含包括1個半胱胺酸殘基之1~4殘基之胺基酸的胜肽」較佳為包含CA之二胜肽。
式(1)之化合物中，於包含包括1個半胱胺酸殘基之1~4殘基之胺基酸的胜肽進而鍵結於作為MHC I類限制性WT1胜肽之「癌抗原胜肽C」的N末端之情形時，作為鍵結於癌抗原胜肽C之N末端的胜肽之半胱胺酸殘基之硫醚基與上述式(16)中之硫醚基鍵結的化合物，較佳為可列舉式(14)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
又，式(1)之化合物中，於包含包括1個半胱胺酸殘基之1~4殘基之胺基酸的胜肽進而鍵結於作為MHC I類限制性WT1胜肽之「癌抗原胜肽C」的N末端之情形時，作為鍵結於癌抗原胜肽C之N末端的胜肽之半胱胺酸殘基之硫醚基與「癌抗原胜肽E」中之硫醚基鍵結的化合物，較佳為可列舉式(12)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
於本發明之「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽」中，只要在該胜肽之胺基酸序列中包含至少1個半胱胺酸殘基即可，作為所含之半胱胺酸殘基數，較佳為1~3，更佳為1~2，最佳為1。
所謂本發明中之「MHC II類限制性」，係指與MHC II類分子結合而誘導輔助T細胞之特性。
相當於MHC II類分子之HLA分類為HLA-DR、DQ及DP等亞型。作為「MHC II類限制性」，較佳為可列舉HLA-DR限制性、HLA-DQ限 制性或HLA-DP限制性。
因此，所謂本發明中之「MHC II類限制性WT1胜肽」，係指於體外及/或體內與MHC II類抗原結合而誘導輔助T細胞之胜肽。「MHC II類限制性WT1胜肽」之胺基酸殘基數為7~30，較佳為14~30。
作為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽」之例，例如可列舉表53中所記載之胜肽。各表中，所謂「位置」，係指序列編號：1中所記載之人類WT1胺基酸序列中之位置。
作為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽」，較佳為可列舉包含選自以下之胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)及PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、或者包含在序列編號：10~11中之任一胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型的改型胺基酸序列且具有輔助T細胞誘導活性之胜肽。
所謂「包含胺基酸序列之胜肽」，係指如上所述般在該胺基酸序列之N末端胺基酸及/或C末端胺基酸上進而加成胺基酸之胜肽。「包含1個半胱胺酸殘基之MHC II類限制性WT1胜肽」中，於加成之情形時，亦可加成於N末端側或/及C末端側。
本發明中之「包含在胺基酸序列中含有胺基酸殘基之改型的改型胺基酸序列且具有輔助T細胞誘導活性之胜肽」亦稱為「改型輔助胜肽」。該改型輔助胜肽係指包含在胺基酸序列中缺失、取代及/或加成1~3個胺基酸之胺基酸序列且與MHC II類結合而誘導輔助T細胞之胜肽。加成(亦包括插入)之胺基酸之數較佳為1~3。缺失之胺基酸之數較佳為1~5。就改型而言，加成之胺基酸或取代之胺基酸亦可為除由基因所編碼之20種胺基酸以外之非天然胺基酸。
作為改型輔助胜肽，例如可列舉如下胜肽。
作為SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)之改型輔助胜肽之SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)(專利文獻6參照)、SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)或SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)；或作為PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)之改型輔助胜肽之PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)或CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)。
作為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽」，更佳為可列舉包含選自以下之胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：SGQARMFPNAPYLPSC(序列編號：19)、SGQAYMFPNAPYLPSC(序列編號：25)、SGQARMFPNAPYLPSCLES(序列編號：11)、 SGQAYMFPNAPYLPSCLES(序列編號：12)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：20)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：21)、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：10)、CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)。
作為R1為「包含包括1個半胱胺酸殘基之7~30殘基之胺基酸的MHC II類限制性WT1胜肽」之情形時之式(1)之化合物，較佳為可列舉式(6)所表示之化合物、式(7)所表示之化合物、式(8)所表示之化合物、或式(9)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
又，本發明提供一種包含本發明之化合物及1種以上之MHC II類限制性WT1胜肽的組合物。
作為本發明之組合物中所含之本發明之化合物，可列舉式(3)所表示之化合物、式(4)所表示之化合物、及式(5)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)。
作為本發明之組合物中所含之MHC II類限制性WT1胜肽，可列舉以下之胺基酸序列：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)、及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)。
又，本發明提供一種使2個不同MHC I類限制性WT1胜肽及MHC II類限制性WT1胜肽、或2個不同MHC I類限制性WT1抗原決定基及MHC II類限制性WT1抗原決定基分別經由雙硫鍵而鍵結的化合物之合成方法。本發明之方法包括以下之步驟(1)~(3)。
本發明之步驟(1)中，使用Fmoc-C(Mmt)A-SBn及癌抗原胜肽C合成C(Mmt)A之C末端胺基酸之羰基與癌抗原胜肽C之N末端胺基鍵結而成之胜肽。
「抗原胜肽C」係與上述「抗原胜肽C」之定義同義。「Fmoc」表示9-茀基甲氧基羰基。「Mmt」表示單甲氧基三苯甲基。「SBn」表示硫代苄基。
本發明之步驟(2)中，使用上述步驟(1)中所獲得之胜肽、及由Npys基所保護之1個半胱胺酸殘基鍵結於N末端之癌抗原胜肽A，合成上述步驟(1)中所獲得之胜肽中之癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基與鍵結於癌抗原胜肽A之N末端的半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結而成之胜肽。
「抗原胜肽A」係與上述「抗原胜肽A」之定義同義。「Npys」表 示3-硝基-2-吡啶基硫基。
本發明之步驟(3)中，使用上述步驟(2)中所獲得之胜肽及包含由SPy基所保護之半胱胺酸殘基之癌抗原胜肽D，合成鍵結於上述步驟(2)中所獲得之胜肽中之癌抗原胜肽A之N末端的半胱胺酸殘基之硫醚基與癌抗原胜肽D之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結而成之胜肽。
「癌抗原胜肽D」係與上述「抗原胜肽A」之定義同義。「SPy」表示2-吡啶基硫基。
本發明之化合物及胜肽及相當於該等之中間物之胜肽可根據本說明書之實施例中所記載之方法、或通常之胜肽合成所使用之方法而製造。作為製造方法，可列舉文獻(胜肽‧合成(Peptide Synthesis)，Interscience，New York，1966；蛋白質(The Proteins)，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；胜肽合成，丸善(股)，1975；胜肽合成之基礎與實驗、丸善(股)，1985；醫藥品之開發 續篇 第14卷‧胜肽合成，廣川書店，1991)等中所記載之方法。
例如可列舉利用Fmoc法或Boc法並使用固相合成機進行製造之方法、或利用液相合成法使Boc-胺基酸或Z-胺基酸逐次縮合而進行製造之方法(Fmoc表示9-茀基甲氧基羰基，Boc表示第三丁氧基羰基，Z表示苄氧基羰基)。
於用以製造本發明之化合物之中間物中，胺基、羧基、巰基等官能基可視需要使用保護、脫保護之技術並以適當之保護基進行保護且進行脫保護。作為較佳之保護基、保護方法、及脫保護方法，詳細地記載於「Protective Groups in Organic Synthesis 2nd Edition(John Wiley & Sons，Inc.；1990)」等中。例如作為巰基之保護基，可列舉乙醯胺甲基或三苯甲基等。
於本發明之化合物具有雙硫鍵之情形時，可根據通常之胜肽化學所使用之方法而於包含半胱胺酸殘基之不同的2個胜肽間、或包含 半胱胺酸殘基之胜肽及半胱胺酸間形成該雙硫鍵。雙硫鍵之形成方法可列舉文獻(胜肽‧合成(Peptide Synthesis)，Interscience，New York，1966；蛋白質(The Proteins)，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；胜肽合成，丸善(股)，1975；胜肽合成之基礎與實驗、丸善(股)，1985；醫藥品之開發 續篇 第14卷‧胜肽合成，廣川書店，1991)等中所記載之方法。
具體而言，於胜肽中所含之半胱胺酸殘基為1個之情形時，去除包括半胱胺酸側鏈上之巰基之保護基的所有保護基後，於惰性溶劑中氧化，藉此可製造具有雙硫鍵之化合物(二硫醚化合物)。又，可藉由將具有巰基之2種中間物混合於適當之溶劑中並氧化而製造。作為該氧化之方法，只要適當選擇利用通常之胜肽合成形成雙硫鍵的公知之方法即可。例如可列舉碘氧化、於鹼性條件下進行空氣氧化反應之方法、或於鹼性或酸性條件下添加氧化劑而形成雙硫鍵之方法等。此處，作為氧化劑，可列舉碘、二甲基亞碸(DMSO，Dimethyl sulfoxide)、鐵氰化鉀等。作為溶劑，可使用水、乙酸、甲醇、氯仿、DMF(Dimethylformamide，二甲基甲醯胺)或DMSO等或該等之混合液。藉由氧化反應而多次供給對稱、非對稱性二硫醚化合物之混合物。目標非對稱性二硫醚化合物可藉由利用各種層析法或再結晶等進行純化而獲得。或者，可藉由將具有活化之巰基之中間物與具有巰基之中間物混合而形成選擇性雙硫鍵。作為具有活化之巰基之中間物，可列舉Npys基(3-硝基-2-吡啶次磺醯基)鍵結而成之巰基等。或者，可預先藉由將一中間物與例如2,2'-二硫代雙(5-硝基吡啶)混合而使巰基活化後，藉由添加另一中間物而形成選擇性雙硫鍵(Tetrahedron Letters.Vol.37.No.9，pp.1347-1350)。
於胜肽中所含之半胱胺酸殘基為2個以上之情形時，亦可使用與上述同樣之方法。於該情形時，獲得雙硫鍵樣式不同之異構物。藉由 使半胱胺酸側鏈之保護基成為特定組合，可獲得於目標半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵之二聚物。作為上述保護基之組合，可列舉MeBzl(甲基苄基)基與Acm(乙醯胺甲基)基、Trt(三苯甲基)基與Acm基、Npys(3-硝基-2-吡啶基硫基)基與Acm基、S-Bu-t(S-第三丁基)基與Acm基等。例如於為MeBzl基與Acm基之組合之情形時，可列舉：首先去除MeBzl基及除半胱胺酸側鏈以外之其他保護基後，將包含胜肽單體之溶液賦予空氣氧化反應而於脫保護之半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵，其次，進行利用碘之脫保護及氧化而於由Acm基所保護之半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵的方法等。
所獲得之本發明之化合物、胜肽及中間物可根據業者公知之方法或通常之胜肽化學中所使用之方法而進行純化。例如可藉由各種層析法(例如矽膠管柱層析法、離子交換管柱層析法、凝膠過濾或逆相層析法)或再結晶等而進行純化。例如，作為再結晶溶劑，可使用甲醇、乙醇或2-丙醇等醇系溶劑、二乙醚等醚系溶劑、乙酸乙酯等酯系溶劑、苯或甲苯等芳香族烴系溶劑、丙酮等酮系溶劑、己烷等烴系溶劑、二甲基甲醯胺或乙腈等非質子系溶劑、水、或該等之混合溶劑等。作為其他純化方法，可使用實驗化學講座(日本化學會編、丸善)1卷等中所記載之方法等。
二硫醚化合物之純化方法記載於文獻(胜肽‧合成(Peptide Synthesis)，Interscience，New York，1966；蛋白質(The Proteins)，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；胜肽合成，丸善(股)，1975；胜肽合成之基礎與實驗、丸善(股)，1985；醫藥品之開發 續篇 第14卷‧胜肽合成，廣川書店，1991)等中。其中，較佳為HPLC(高效液相層析法，High performance liquid chromatography)。
於本發明之化合物中有1個以上之不對稱點之情形時，根據通常之方法，可藉由使用具有該不對稱點之原料(胺基酸)而製造。又，為 了提高本發明之化合物之光學純度，亦可於製造步驟之適當階段進行光學分割等。作為光學分割法，例如可藉由使本發明之化合物或其中間物於惰性溶劑中(例如甲醇、乙醇或2-丙醇等醇系溶劑、二乙醚等醚系溶劑、乙酸乙酯等酯系溶劑、甲苯等烴系溶劑、或乙腈等非質子系溶劑、及該等之混合溶劑)形成光學活性酸(例如苦杏仁酸、N-苄氧基丙胺酸或乳酸等單羧酸、酒石酸、鄰二亞異丙基酒石酸或蘋果酸等二羧酸、或樟腦磺酸或溴樟腦磺酸等磺酸)及鹽的非對映異構體法而進行。於本發明之化合物或中間物具有羧基等酸性官能基之情形時，亦可藉由形成光學活性胺(例如α-苯乙胺、激肽、奎尼丁、辛可尼丁、辛可寧、番木鼈鹼等有機胺)及鹽而進行光學分割。
作為形成鹽之溫度，選自室溫至溶劑之沸點之範圍內。為了提高光學純度，較理想為暫時將溫度提高至溶劑之沸點附近。於濾取析出之鹽時，視需要可進行冷卻而提高產率。光學活性酸或胺之使用量適合相對於基質而為約0.5~約2.0當量之範圍，較佳為1當量左右之範圍。視需要亦可使晶體於惰性溶劑中(例如甲醇、乙醇、2-丙醇等醇系溶劑、二乙醚等醚系溶劑、乙酸乙酯等酯系溶劑、甲苯等烴系溶劑、乙腈等非質子系溶劑及該等之混合溶劑)再結晶而獲得高純度之光學活性鹽。又，視需要亦可利用通常之方法並使用酸或鹼對光學分割之鹽進行處理而以游離體形式獲得。
作為本發明中之「藥學上所容許之鹽」，可列舉酸加成鹽及鹼加成鹽。例如作為酸加成鹽，可列舉鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、三氟乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等有機酸鹽，作為鹼加成鹽，可列舉鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽等無機鹼鹽、三乙基銨鹽、三乙醇銨鹽、吡啶鎓鹽、二異丙基銨鹽等有機鹼鹽等，進而可列舉精胺 酸、天冬胺酸、麩胺酸等鹼性或酸性胺基酸之胺基酸鹽。
本發明之化合物或其藥學上所容許之鹽之水合物、乙醇溶劑合物等溶劑合物亦包含於本發明中。進而，本發明亦包含式(1)所表示之化合物之所有非對映異構體、對映體等可存在之所有立體異構物、及所有態樣之晶形。
通常於胜肽之製造中，在使光學活性α-胺基酸縮合之步驟、去除各種保護基之步驟或自樹脂中切出胜肽之步驟等中產生胺基酸缺損之胜肽、經水解或氧化等分解之胜肽、胺基酸外消旋化之胜肽等各種副產物。關於實驗室標度，可藉由組合各種層析法(例如矽膠管柱層析法、離子交換管柱層析法、凝膠過濾或逆相層析法)而去除該等之雜質並獲得高純度之胜肽或化合物。然而，由於作為醫藥品而提供，故而不易以工業標度獲得高純度之胜肽或化合物。
本發明之化合物就其物理化學性質而言，亦具有可作為醫藥品原料藥而大量製造之性質。具體而言，具有溶解性較高、溶液中穩定性優異、或濃縮時難以凝膠化等性質，於利用逆相HPLC等管柱層析法之純化步驟中，就大量標度而言，亦可容易地作為原料藥而製造高純度化合物。
以此種方式製造之本發明之化合物由於半胱胺酸殘基形成雙硫鍵等，故而對於溶液中之氧化劑等之穩定性優異，作為醫藥品原料而保持一定品質及有效之CTL誘導活性。
本發明之化合物作為癌症免疫療法中之CTL誘導劑之有效成分，作為癌疫苗之有效成分，且作為醫藥組合物之有效成分，較為有用。即，本發明之化合物如本說明書之實施例所示，具有優異之免疫原性，可以較佳之效率顯示優異之CTL誘導活性。又，關於由本發明之化合物所誘導之CTL，令人震驚的是，可識別癌細胞本來具有之WT1之天然型部分胜肽。
CTL誘導活性可藉由利用HLA四聚物法(Int.J.Cancer：100，565-570(2002))或限制稀釋法(Nat.Med.：4，321-327(1998))測定CTL之數而確認。或者，例如於為HLA-A24限制性之CTL誘導活性之情形時，可藉由使用國際公開第02/47474號及Int.J.Cancer：100，565-570(2002)中所記述之HLA-A24模型小鼠等而進行調查。
因此，本發明之化合物可用作WT1基因所表現之癌或伴隨著WT1基因之表現水準之上升的癌之治療藥或預防藥(復發防止藥)。作為該癌，例如可列舉白血病、骨髄化生不良症候群、多發性骨髄瘤或惡性淋巴瘤等血液性癌、或胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌或腦腫瘤等實體癌。
本發明之化合物或其藥學上所容許之鹽根據各化合物或各鹽而形成為適當之形態，藉此可作為癌之細胞性免疫療法中之CTL誘導劑之有效成分、癌疫苗之有效成分或/及醫藥組合物之有效成分。
為了有效地實現本發明之化合物之細胞性免疫，亦可與醫藥上所容許之載體例如適當之佐劑一起投予。作為佐劑，可應用文獻(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中所記載者等，具體而言，可列舉：源自菌體之成分、GM-CSF、介白素-2、介白素-7或介白素-12等細胞激素、源自植物之成分、源自海洋生物之成分、如氫氧化鋁之礦物凝膠、脫脂酸卵磷脂、如普洛尼克多元醇之界面活性劑、聚陰離子、胜肽、或油乳濁液(乳膠製劑)等。作為源自菌體之成分，可列舉脂質A(lipid A)、作為其衍生物之單磷醯脂A(monophosphoryl lipid A)、細菌(可列舉BCG菌等Mycobacterium屬細菌)之死菌、源自細菌之蛋白質、聚核苷酸、富侖不完全佐劑(Freund's Incomplete Adjuvant)、富侖完全佐劑(Freund's Complete Adjuvant)、細胞壁骨架成分(例如可列舉BCG-CWS等)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM，Trehalose dimycolate) 等。
又，本發明之化合物亦可製成脂質體製劑、結合於直徑數微米之珠粒中之粒子狀製劑、結合有脂質之製劑等而投予。
進而，本發明之化合物(結合體)亦可與MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)一起投予。作為一起投予之方法，可分開投予結合體及輔助胜肽，更佳為在一種醫藥組合物中包含結合體及輔助胜肽之混合製劑(混合劑、混合)。本混合製劑係包含可產生MHC I類限制性WT1胜肽(即，殺手胜肽)之結合體及MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)者。因此，藉由作為癌症免疫療法中之癌疫苗投予含有輔助胜肽之本混合製劑，可使對於包含CTL之其他T細胞之功能亢進較為重要之輔助T細胞(helper T cell)活化，可提高結合體之功能‧藥效(細胞性免疫能力等)。
關於MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)，如本案說明書中所記載。作為本混合製劑之輔助胜肽，可列舉以下之胺基酸序列：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)、及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)。
其中，較佳為WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)。
如作為一例之本案說明書之實施例或試驗例所示，可確認本混合製劑提昇了細胞性免疫能力等作為癌疫苗之藥效。
製劑中之本發明之化合物之投予量可根據治療目的之疾病、患者之年齢、體重等而適當調整，通常0.0001mg~1000mg，較佳為0.001mg~1000mg，更佳為0.1mg~10mg。
作為投予方法，可列舉皮內投予、皮下投予、肌肉內投予、靜脈內投予、經皮投予等。較佳為以較佳之效率誘導CTL之皮內投予或皮下投予。投予次數及投予間隔可根據治療或預防目的之疾病、患者之個體差而適當調整，通常為複數次，較佳為數日至數月投予1次。
藉由對WT1陽性之患者投予以此種本發明之化合物作為有效成分之醫藥組合物，可提供用以治療或預防癌之方法。
[實施例]
以下，根據實施例而具體地說明本發明，但本發明並不受該等之任何限定。
實施例1
式(5)所表示之化合物之合成：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
步驟1. H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH之合成
(C(Npys)RMFPNAPYL之合成)
以Fmoc-Leu-Alko-樹脂(Alko為對烷氧基苄醇)282mg(渡邊化學製造；0.71mmol/g、0.2mmol)作為初始原料，藉由利用Fmoc/tBu法之固相合成進行胜肽鏈之組構。固相合成係使用CS Bio公司製造之CS336X型胜肽合成機，Fmoc基之脫保護係藉由使用20%哌啶之DMF溶液處理5分鐘及20分鐘而進行。保護胺基酸之偶合係藉由使1.05mmol之保護胺基酸、1mmol之HBTU(O-Benzotriazole-1-yl-N,N,N'N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲 基脲六氟磷酸酯)、2mmol之DIPEA(Diisopropylethylamine，二異丙基乙胺)之DMF溶液反應1小時而進行。藉由利用DMF及醚將所獲得之樹脂洗淨後進行減壓乾燥，而獲得Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-樹脂630mg。於該胜肽樹脂中添加TFA(Trifluoroacetic acid，三氟乙酸)/H2O/TIS(Thioanisole，硫代苯甲醚)=95/2.5/2.5之混合液10ml，於室溫下振盪2小時。濾去樹脂後，對反應液進行減壓濃縮。對反應液進行冰浴冷卻並添加二乙醚50ml。濾取產生之沈澱物並使用醚將其洗淨後進行減壓乾燥，藉此獲得粗胜肽217mg。將所獲得之粗胜肽溶液溶解於20%乙酸水7ml與乙腈1ml之混合液中並利用逆相HPLC進行純化。
泵：Shimazu製造；LC-8A型
管柱：YMC ODS-A 3cm×25cmL,10μm
溶出液1：H2O/0.1%TFA
溶出液2：CH3CN/0.1%TFA
流速：20ml/min
檢測：UV220nm
於以二液濃度15%平衡化之管柱內注入粗胜肽溶液。其後，歷經10分鐘將二液濃度提昇至37%，其後以每1分鐘0.24%之比率使其上升。聚集包含目標物之組分進行冷凍乾燥，藉此獲得H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH 53mg。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1366.1[M+1]+(理論值=1366.6)
步驟2.(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)雙硫鍵之合成
[即，式(5)所表示之化合物之合成：[化51]
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)]
將步驟1中所獲得之H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH 50mg與由公知之方法(例如WO07/063903)所合成之H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(即，CYTWNQMNL(序列編號：4))43mg混合，添加DMSO 1ml，於室溫下攪拌20分鐘。利用0.1%TFA水5ml稀釋反應液並利用逆相HPLC進行純化。
泵：Shimazu製造；LC-8A型
管柱：YMC ODS-A 3cm×25cmL,10μm
溶出液1：H2O/0.1%TFA
溶出液2：CH3CN/0.1%TFA
流速：20ml/min
檢測：UV220nm
於以二液濃度25%平衡化之管柱內注入該反應液。其後，以每1分鐘0.25%之比率使二液濃度上升。聚集包含目標物之組分進行冷凍乾燥後，進行利用逆相HPLC之再純化、冷凍乾燥，藉此獲得(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)雙硫鍵(即，式(5)所表示之化合物)21mg。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1191.8[M+2]2+(理論值=1191.9)
實施例2
包含以下胺基酸序列之胜肽之合成：CRMFPNAPYL(序列編號：13)
步驟1.以Fmoc-Leu-Alko-樹脂(Alko為對烷氧基苄醇)338mg(渡邊化學製造；0.74mmol/g、0.25mmol)作為初始原料，進行2次與實施 例1中所記載之方法相同之固相合成，藉此獲得H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-樹脂1.54g。於該胜肽樹脂中添加TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5之混合液15ml，於室溫下振盪3小時。濾去樹脂後，對反應液進行減壓濃縮。對反應液進行冰浴冷卻並添加二乙醚50ml。濾取產生之沈澱物並利用醚將其洗淨後進行減壓乾燥，藉此獲得粗胜肽637mg。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1211.9[M+1]+(理論值=1212.5)
步驟2.將步驟1中所獲得之粗胜肽321mg溶解於TFA 10ml中，使用HPLC之泵充滿以HPLC(Shimazu製造；LC6AD型)單液=H2O/0.1%TFA平衡化之YMC-PACK ODS-A 3cm×25cmL之管柱。於該狀態下保持約20分鐘，20分鐘後使二液=CH3CN/0.1%TFA之濃度上升至27%。其後，利用220nm之UV(Ultraviolet，紫外線)監測目標胜肽之溶出液，並且以每1分鐘0.25%之比率使二液濃度上升，聚集包含目標物之組分。再次於相同條件下對冷凍乾燥後所獲得之胜肽100mg進行逆相純化，減壓餾去乙腈並進行冷凍乾燥，藉此獲得目標胜肽(CRMFPNAPYL(序列編號：13))37.2mg。
泵：Shimazu製造；LC-6A型
管柱：YMC ODS-A 3cm×25cmL,10μm
溶出液1：H2O/0.1%TFA
溶出液2：CH3CN/0.1%TFA
流速：20ml/min檢測：UV220nm
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1212.0[M+1]+(理論值=1211.6)
實施例3~5
利用與實施例2相同之方法合成包含序列編號：16、18或17之胺基酸序列之胜肽。於表54中，表示合成量及質量分析結果。
[表54]
試驗例1
利用ERAP1之N末端胺基酸之修整之經時變化
對於實施例2~5中合成之序列編號：13、16、18及17之各胜肽，評價利用ERAP1(PLoS One November 2008，vol.3，Issue 11，e3658)之N末端胺基酸之修整。
將30μl ERAP1(2.0mg/ml)PBS緩衝劑溶液添加於258μl Tris‧HCl緩衝劑中。將10mM各胜肽之DMSO溶液12.0μl添加於上述ERAP1溶液中，充分地混和後於室溫下靜置。於1.0、2.0、4.0、8.0小時後將50μl樣品添加於150μl MeOH中並停止反應，將25μl注入至UFLC(Ultra Fast Liquid Chromatograph，超高速液相層析儀)(分析條件示於以下)中而求出目標胜肽之AUC。另外對由修整所獲得之胜肽進行化學合成，依據於無酵素之相同條件下進行分析而獲得之AUC，而求出由修整所獲得之胜肽之產率。
分析條件
泵：Shimazu公司製造之UFLC
管柱：Shim-pack XR-ODS 3.0mmi.d.x75mm
溶液：0.1% TFA H2O(A)-0.1% TFA CH3CN(B)
烘箱溫度：40℃
流速：1.0ml/min
檢測波長：λ=220nm
梯度：
歷經1.0.0min至5.0min將B液濃度自1.0%提昇至70%
歷經2.0.0min至5.0min將B液濃度自1.0%提昇至50%
目標胜肽：
關於實施例2~5中所合成之胜肽，將藉由利用ERAP1之N末端胺基酸之修整所獲得之胜肽之胺基酸序列示於表55。
將由修整所獲得之胜肽之產率之經時變化示於表56及圖1。
本修整結果強烈地暗示，對於任一Cys延長胜肽(序列編號：13、16、17及18)，ERAP-1均選擇性地切割經延長之N末端Cys，即，Cys延長胜肽不較大地依存於胜肽序列而進行利用ERAP-1之適當修整，最終轉變為目標癌抗原胜肽(序列編號：2、5、6及7)。
試驗例2
使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價實施例1中合成之式(5)所表示之化合物的CTL誘導能力。關於式(5)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)， 對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編號：2)且癌抗原胜肽B為CYTWNQMNL(序列編號：4)之化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A24限制性抗原決定基WT1胜肽。
HLA-A0201基因導入小鼠(C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)係缺少小鼠MHC且表現作為人類MHC之HLA-A0201與作為小鼠MHC之H-2Db的嵌合HLA及HLA-DRB1 ＊ 0101之小鼠，藉由使用本小鼠，可選擇能夠使HLA-A02陽性之人類誘導CTL的胜肽(Eur J Immunol.2004；34：3060-9)。另一方面，HLA-A2402基因導入小鼠(C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)係表現作為人類MHC之HLA-A2402與作為小鼠MHC之H-2Kb的嵌合HLA之小鼠，藉由使用本小鼠，可選擇可使HLA-A24陽性之人類誘導CTL的胜肽(Int J Cancer.2002；100：565-70)。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、4)對源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判 斷藉由投予式(5)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2、4)之CTL。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物溶解為40mg/mL，進而利用注射用水稀釋至5mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA，Incomplete Freund's adjuvant)混合而使其乳化。將乳化之化合物以250μg/site投予至小鼠尾部皮內之4處。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.15×106細胞/孔播種至經分區之ELISPOT板上，將源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞以1×106細胞/孔播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、4)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。又，將稀釋之胜肽(序列編號：4)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養20小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖2，將使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖3。
各圖中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖2之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源 自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，圖3之黑棒及白棒表示於序列編號：4所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予式(5)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於各圖中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。
因此，明確式(5)所表示之化合物可誘導序列編號：2所表示之胜肽特異性CTL及序列編號：4所表示之胜肽特異性CTL。強烈地暗示式(5)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2及序列編號：4之胜肽。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(5)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種WT1胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導不同之2種CTL之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
參考例1~7
利用與實施例2相同之方法合成包含序列編號：22、24、23、2、4、6及5之各胺基酸序列之各胜肽。於表57中表示質量分析結果。序列編號：22、24、23、2、4、6及5並非本案發明之化合物，因此均記作參考例。
實施例6~9
利用與實施例1相同之方法合成式(3)、(6)、(7)及(8)所表示之各化合物(結合體)。於表58中表示質量分析結果。(各式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
試驗例3
溶解度測定
步驟1.等張緩衝液之製備
將1.75%磷酸氫二鈉水溶液與5.53%檸檬酸水溶液混合而製備pH值6.0及7.4之各緩衝液。
步驟2.試驗溶液之製備
秤量被驗物1mg左右，添加等張緩衝液0.5mL，將其設為試驗溶液。製備之試驗溶液係於室溫下振盪90分鐘(振盪條件：TAITEC公司製造RECIPRO SHAKER SR-1N,Speed=8)後，進行離心分離(15000rpm、5分鐘、室溫)，將離心分離後之上清液設為試驗溶液。
步驟3.標準液之製備
精確稱量被驗物約1mg，以0.1%TFA水/乙腈=1/1進行溶解，將總量設為10mL，將其用作被驗物之標準液。
步驟4.被驗物之濃度測定
利用HPLC(分析條件記載於表59中)分析被驗物之標準液及試驗溶液，根據標準液之峰面積比算出被驗物之溶解度。
HPLC測定條件
管柱：ChemcoPack Quicksorb(4.6mm×150mm,5μm)Chemco股份有限公司製造
移動相：A液；0.1%TFA水、B液；0.1%TFA乙腈溶液
管柱溫度：室溫
流速：1ml/min
檢測波長：UV 254nm,230nm(2波長檢測)
樣品注入量：10μL
對於參考例1~2及4~7中合成之胜肽及實施例1、7及9中合成之化合物(結合體)，進行上述溶解度測定，將各溶解度示於表60。
試驗例4
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價實施例6中合成之式(3)所表示之化合物之CTL誘導能力。關於式(3)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)， 對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編號：2)且癌抗原胜肽B為SLGEQQYSV(序列編號：6)的化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)及SLGEQQYSV(序列編號：6)為HLA-A0201限制性WT1胜肽。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2所述。
藉由測定利用胜肽(序列編號：2、6)對源自投予式(3)所表示之化合物之上述小鼠的之脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(3)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2、6)之CTL。
具體而言，利用注射用水將式(3)所表示之化合物溶解為10mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以500μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.75×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用 DMSO將胜肽(序列編號：2、6)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2、6)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養20小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖4。
圖4中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖4之黑棒、斜線棒表示一面對序列編號：2、6所表示之各胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒或斜線棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，表示藉由投予式(3)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：2、6所表示之各胜肽有特異性之CTL。於圖4中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：2、6所表示之胜肽有特異性之IFNγ。
因此，明確式(3)所表示之化合物可誘導序列編號：2、6所表示之各胜肽特異性CTL。強烈地暗示式(3)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2及6所表示之胜肽。即，明確作為本發明之化合物之一例的式(3)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導不同之2種CTL之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
試驗例5
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例7中合成之式(6)所表示之化合物之CTL誘導能力藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價。關於式(6)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)， 對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編號：2)且癌抗原胜肽C為CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)的化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2所述。藉由使用本小鼠，可選擇可使HLA-A02陽性之人類誘導CTL的胜肽，並且亦可對可與人類之HLA-DRB1 ＊ 0101結合而誘導輔助T細胞的輔助胜肽之CTL誘導增強效果進行評價。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、24)對源自投予式(6)所表示之化合物之上述小鼠的之脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(6)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL及輔助胜肽(序列編號：24)反應性之細胞。又，比較利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(6)所表示之化合物之上述小鼠的之脾細胞、及源自投予序列編號：2所表示之化合物之上述小鼠的 脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數。
具體而言，利用注射用水將序列編號：2所表示之胜肽溶解為6mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之胜肽以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。利用注射用水將式(6)所表示之化合物溶解為19.8mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以495μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。式(6)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含之序列編號：2之胜肽的物質量係以與序列編號：2所表示之胜肽對於每1隻小鼠之投予量中所含的物質量相等之方式進行調整。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well或0.5×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、24)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2、24)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養20小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖5及6。
圖5及6中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數，橫軸表示對小鼠投予之化合物或胜肽。圖5之黑棒表示一面對序列編號：2所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結 果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，表示藉由投予序列編號：2所表示之胜肽或式(6)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。於圖5中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ。又，圖5中藉由投予式(6)所表示之化合物而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予序列編號：2所表示之胜肽而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
進而，圖6之黑棒表示一面對序列編號：24所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，表示藉由投予黑棒與白棒之值的差表示胜肽反應性細胞之數，式(6)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導序列編號：24所表示之輔助胜肽反應性細胞，藉由投予序列編號：2所表示之化合物而於小鼠活體內不誘導序列編號：24所表示之胜肽反應性細胞。於圖6中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。
因此，明確式(6)所表示之化合物可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL、及對序列編號：24所表示之輔助胜肽有反應性之細胞。強烈地暗示式(6)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2及24所表示之胜肽。藉由誘導對自式(6)所表示之化合物生成之序列編號：24所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導，推測與投予序列編號：2所表示之胜肽之情形相比，發現較多對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之 IFNγ產生細胞。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(6)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
試驗例6
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例9中合成之式(8)所表示之化合物之CTL誘導能力藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價。關於式(8)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)，對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編號：2)且癌抗原胜肽C為CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)的化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、22)對源自投予式(8)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(8)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL及輔助胜肽(序列編號：22)反應性之細胞。又，比較利 用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(8)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予序列編號：2所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數。
具體而言，利用注射用水將序列編號：2所表示之胜肽溶解為6mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之胜肽以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。利用注射用水將式(8)所表示之化合物溶解為18mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以450μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。式(8)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含之序列編號：2之胜肽的物質量係以與序列編號：2所表示之胜肽對於每1隻小鼠之投予量中所含的物質量相等之方式進行調整。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well或0.5×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、22)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2、22)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養20小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖7及8。
圖7及8中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數，橫軸表示對 小鼠投予之化合物或胜肽。圖7之黑棒表示一面對序列編號：2所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，藉由投予序列編號：2所表示之胜肽或式(8)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。於圖7中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ。又，圖7中藉由投予式(8)所表示之化合物而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予序列編號：2所表示之胜肽而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
進而，圖8之黑棒表示一面對序列編號：22所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽反應性細胞之數，表示藉由投予式(8)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導序列編號：22所表示之輔助胜肽反應性細胞，藉由投予序列編號：2所表示之胜肽而於小鼠活體內不誘導序列編號：22所表示之胜肽反應性細胞。於圖8中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。
因此，明確式(8)所表示之化合物可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL、及對序列編號：22所表示之輔助胜肽有反應性之細胞。強烈地暗示式(8)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2及22所表示之胜肽。藉由誘導對自式(8)所表示之化合物生成的序列編號：22所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示 之胜肽有特異性之CTL的誘導，推測與投予序列編號：2所表示之化合物之情形相比，發現較多對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(8)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
實施例10
利用與實施例1相同之方法合成式(9)所表示之各化合物(結合體)。於表61中表示質量分析結果。(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
參考例8~9
利用與實施例2相同之方法合成包含序列編號238~239之胺基酸序列之胜肽。於表62中表示質量分析結果。表中所記載之胜肽並非本發明之化合物，因此記作參考例。
參考例10~11
利用與實施例2相同之方法合成包含序列編號240~241之胺基酸序列之胜肽。於表63中表示質量分析結果。表中所記載之胜肽並非本發明之化合物，因此記作參考例。
表63所示之胜肽係參考非專利文獻Cancer Science January 2012,Vol.103,no.1,150-153.而進行合成。
試驗例7
結合體及混合化疫苗之穩定性試驗
步驟1
將結合體(式編號：(6))2.4mg溶解於120μL注射用水中，於遮光下且於室溫下保存。
步驟2
將作為混合化疫苗之序列編號：2所表示之胜肽1.1mg溶解於180μL注射用水中，使用其123μL溶解序列編號：24所表示之胜肽1.3mg，於遮光下且於室溫下保存。
步驟3
利用注射用水50μL稀釋步驟1及步驟2中所獲得之溶液2.5μL後，進行利用HPLC之分析(分析條件示於以下)，將保存剛開始後之面積值設為100%，測定結合體及胜肽於水溶液中之含有率，將結合體之含有率示於表64，將混合化疫苗中之各胜肽之含有率示於表65。
分析條件
泵：Shimazu公司製造之UFLC
管柱：Kinetex 2.6u C18 100A 3.0mmi.d.x75mm
移動相：A液；0.1%TFA水、B液；0.1%TFA乙腈溶液
管柱溫度：40℃
流速：1mL/min
檢測波長：UV 220、254nm(2波長檢測)
樣品注入量：10μL
試驗例7中式編號(6)所表示之結合體係於溶液製備後2週時，式(6)所表示之化合物殘存96%。相對於此，作為混合化疫苗之序列編號 2與序列編號24之混合溶液係於經過1天時，序列編號24之含有率下降至65%，2週後下降至6%。根據該等結果，顯示於水溶液中保存之結合體較於相同條件下保存之混合化疫苗更穩定。
試驗例8
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例8中合成之式(7)所表示之化合物之CTL誘導能力藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價。關於式(7)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)，對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編號：2)且癌抗原胜肽C為CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)的化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、23)對源自投予式(7)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(7)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL及輔助胜肽(序列編號：23)反應性之細胞。又，比較利 用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(7)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予序列編號：2所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數。
具體而言，利用注射用水將序列編號：2所表示之胜肽溶解為6mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之胜肽以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。利用注射用水將式(7)所表示之化合物溶解為19mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以475μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。式(7)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含之序列編號：2之胜肽的物質量係以與序列編號：2所表示之胜肽對於每1隻小鼠之投予量中所含的物質量相等之方式進行調整。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well或0.5×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、23)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2、23)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。藉由將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養17小時而施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖9及10。圖9及10中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數，橫軸表示對小鼠投予之化合物或胜肽。圖9之黑棒表示一面對序列編 號：2所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，表示藉由投予序列編號：2所表示之胜肽或式(7)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。於圖9中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ。又，圖9中藉由投予式(7)所表示之化合物而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予序列編號：2所表示之胜肽而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
進而，圖10之黑棒表示一面對序列編號：23所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽反應性細胞之數，表示藉由投予式(7)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導序列編號：23所表示之輔助胜肽反應性細胞，藉由投予序列編號：2所表示之胜肽而於小鼠活體內不誘導序列編號：23所表示之胜肽反應性細胞。於圖10中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。
因此，明確式(7)所表示之化合物可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL、及對序列編號：23所表示之輔助胜肽有反應性之細胞。強烈地暗示式(7)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2及23所表示之胜肽。藉由誘導對自式(7)所表示之化合物生成的序列編號：23所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導，推測與投予序列編號：2所表示之化 合物之情形相比，發現較多對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(7)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
試驗例9
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例10中合成之式(9)所表示之化合物之CTL誘導能力藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價。關於式(9)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)，對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為ALLPAVPSL(序列編號：5)且癌抗原胜肽C為CNKRYFKLSHLQMHSRKHG(序列編號：24)的化合物。ALLPAVPSL(序列編號：5)為HLA-A0201及HLA-A2402限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRKHG(序列編號：24)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：5、24)對源自投予式(9)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(9)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編 號：5)之CTL及輔助胜肽(序列編號：24)反應性之細胞。又，比較利用胜肽(序列編號：5)對源自投予式(9)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予序列編號：5所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數。
具體而言，利用注射用水將序列編號：5所表示之胜肽溶解為6mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之胜肽以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。利用注射用水將式(9)所表示之化合物溶解為23.6mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以590μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。式(9)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含之序列編號：5之胜肽的物質量係以與序列編號：5所表示之胜肽對於每1隻小鼠之投予量中所含的物質量相等之方式進行調整。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well或0.75×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：5、24)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：5、24)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。藉由將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養17小時而施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖11及12。圖11及12中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞 數，橫軸表示對小鼠投予之化合物或胜肽。圖11之黑棒表示一面對序列編號：5所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，表示藉由投予序列編號：5所表示之胜肽或式(9)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：5所表示之胜肽有特異性之CTL。於圖11中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：5所表示之胜肽有特異性之IFNγ。又，圖11中藉由投予式(9)所表示之化合物而誘導之對序列編號：5所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予序列編號：5所表示之胜肽而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
進而，圖12之黑棒表示一面對序列編號：24所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽反應性細胞之數，表示藉由投予式(9)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導序列編號：24所表示之輔助胜肽反應性細胞，藉由投予序列編號：5所表示之胜肽而於小鼠活體內不誘導序列編號：24所表示之胜肽反應性細胞。於圖12中幾乎未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞不反應。
因此，明確式(9)所表示之化合物可誘導對序列編號：5所表示之胜肽有特異性之CTL、及對序列編號：24所表示之輔助胜肽有反應性之細胞。強烈地暗示式(9)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：5及24所表示之胜肽。藉由誘導對自式(9)所表示之化合物生成之序列編號：24所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：5所表示 之胜肽有特異性之CTL的誘導，推測與投予序列編號：5所表示之化合物之情形相比，發現較多對序列編號：5所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(9)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
比較例1
使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價實施例1中合成之式(5)所表示之化合物、及參考例8及9中合成之序列編號：238及239所表示之胜肽的CTL誘導能力。式(5)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
係如試驗例2所述。序列編號：238及239所表示之胜肽係以醯胺鍵將作為HLA-A0201限制性WT1胜肽之RMFPNAPYL(序列編號：2)及作為HLA-A2402限制性WT1胜肽之CYTWNQMNL(序列編號：4)連接而成之長鏈胜肽。
關於HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠，係 如試驗例2所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、4)對源自投予式(5)所表示之化合物及序列編號：238、239所表示之胜肽之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物及序列編號：238、239所表示之胜肽而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2、4)之CTL。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物及序列編號：238、239所表示之胜肽分別溶解為40mg/mL，進而利用注射用水稀釋至5mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以250μg/site投予至小鼠尾部皮內之4處。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上，將源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞以1×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、4)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。又，將稀釋之胜肽(序列編號：4)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養18小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結 果示於圖13，將使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖14。
各圖中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖13之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，圖14之黑棒及白棒表示於序列編號：4所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予式(5)所表示之化合物及序列編號：238、239所表示之胜肽而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於各圖中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果分別確認，於源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。另一方面，雖然確認於源自投予序列編號238所表示之胜肽的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，但與源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞相比，其數非常少。確認於源自投予序列編號238所表示之胜肽的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。雖然確認於源自投予序列編號239所表示之胜肽的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，但與源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞相比，其數較少。確認於源自投予序列編號239所表示之胜肽的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。
因此，明確本發明之式(5)所表示之化合物可以較佳之效率同時誘導序列編號：2所表示之胜肽特異性CTL及序列編號：4所表示之胜肽特異性CTL之兩者。另一方面，序列編號：238、239所表示之長鏈胜肽無法以較佳之效率同時誘導序列編號：2所表示之胜肽特異性CTL及序列編號：4所表示之胜肽特異性CTL之兩者。
比較例2
使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價實施例1中合成之式(5)所表示之化合物、及參考例10及11中合成之序列編號：240及241所表示之胜肽的CTL誘導能力。式(5)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
係如試驗例2所述。序列編號：240及241所表示之胜肽係經由作為胜肽間隔子之6個甘胺酸以醯胺鍵將作為HLA-A0201限制性WT1胜肽之RMFPNAPYL(序列編號：2)及作為HLA-A2402限制性WT1胜肽之CYTWNQMNL(序列編號：4)連接而成的長鏈胜肽。
關於HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠，係如試驗例2所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、4)對源自投予式(5)所表示之化合物及序列編號：240、241所表示之胜肽之上述小鼠的脾細胞進行 再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物及序列編號：240、241所表示之胜肽而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2、4)之CTL。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至10mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以500μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。又，利用二甲基亞碸(DMSO)將序列編號：240、241所表示之胜肽溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至11mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以550μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上，將源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞以1.5×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、4)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。又，將稀釋之胜肽(序列編號：4)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中。藉由將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養17小時而施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結 果示於圖15，將使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖16。
各圖中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖15之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，圖16之黑棒及白棒表示於序列編號：4所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予式(5)所表示之化合物及序列編號：240、241所表示之胜肽而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於各圖中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果分別確認，於源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。另一方面，確認於源自投予序列編號240所表示之胜肽的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中極少產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自投予序列編號240所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，雖然確認於源自投予序列編號241所表示之胜肽的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中極少產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自投予序列編號241所表示之胜肽的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ，但與源自投予式(5)所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞相比，其數非常少。
因此，明確本發明之式(5)所表示之化合物可以較佳之效率同時誘導序列編號：2所表示之胜肽特異性CTL及序列編號：4所表示之胜 肽特異性CTL之兩者。另一方面，包含序列編號：240、241所表示之胜肽間隔子之長鏈胜肽無法以較佳之效率同時誘導序列編號：2所表示之胜肽特異性CTL及序列編號：4所表示之胜肽特異性CTL之兩者。
試驗例10
對於參考例3中合成之胜肽及實施例6及9中合成之化合物(結合體)，利用與試驗例3相同之方法進行溶解度測定，將各溶解度示於表66。
實施例11~12
利用與實施例2相同之方法合成包含序列編號242~243之胺基酸序列之胜肽。於表67中表示質量分析結果。表67中所記載之胜肽為本發明之化合物。
實施例13
利用與實施例1相同之方法合成式10所表示之各化合物(結合體)。於表68中表示質量分析結果。(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
參考例12
利用與實施例1相同之方法合成式11所表示之各化合物(結合體)。於表69中表示質量分析結果。(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)表中所記載之胜肽並非本發明之化合物，因此記作參考例。
實施例14
式(12)所表示之化合物之合成
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
步驟1. Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn之合成(Mmt為4-Methoxytrityl)
(Fmoc-C(Mmt)A-SBn之合成)
將Fmoc-Cys(Mmt)-OH(4.80g)、N,N-二異丙基乙胺(2.56mL)、六氟磷酸(苯并三唑-1-醯氧基)三吡咯烷基鏻(4.50g)及由公知之方法(例如Journal of Organic Chemistry,Vol.64,No.248761-8769)所合成之H-Ala-SBn之氯仿(20mL)溶液於室溫下攪拌1小時。藉由利用管柱層析法(溶出溶劑為己烷/乙酸乙酯)對反應液進行純化而獲得作為目標化合物之Fmoc-C(Mmt)A-SBn(2.80g)。
NMR：1H NMR(CDCl3)δ 7.72(t,J=7.6Hz,2H),7.54(d,J=7.2Hz,1H),7.38-7.34(m,7H),7.29-7.25(m,6H),7.23-7.15(m,7H),6.76(d,J=8.8Hz,2H),6.15(d,J=8.0Hz,1H),4.95(d,J=7.2Hz,1H),4.57(quin,J=7.6Hz,1H),4.35(d,J=6.8Hz,2H)4.19-4.17(m,1H),4.04(s,2H),3.73(s,3H),2.72(dd,J=13.2,8.4Hz,1H),2.61(d,J=9.6Hz,1H),1.31(d,J=7.2Hz,3H).
步驟2. H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH之合成
(C(Mmt)ACYTWNQMNL之合成)
步驟1中所獲得之Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn(11mg)與由公知之方法(例如WO07/063903)所合成之H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(21mg)、N,N-二異丙基乙胺(200μL)、3,3',3"-亞磷酸酯甲苯三丙酸鹽酸鹽(1mg)、4-巰基苯基乙酸(1mg)及0.1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.5、200μL)之DMF(400μL)溶液於室溫下攪拌4小時。於反應液中添加二乙胺(200μL)，進而攪拌15分鐘。藉由利用逆相HPLC對反應液進行純化而獲得作為目標化合物之C(Mmt)ACYTWNQMNL(7mg)。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=810.2[M+2H]2+(理論值=810.5)
步驟3.(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)雙硫鍵之合成
[即，式(13)所表示之化合物之合成：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)]
將步驟2中所獲得之H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(51mg)與實施例1步驟1中所獲得之(H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH(43mg)之DMF(4mL)溶液於室溫下攪拌2小時。藉由利用逆相HPLC對反應液進行純化而獲得作為目標化合物之(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)雙硫鍵[即，式(13)所表示之化合物]39mg。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1414.4[M+2H]2+(理論值=1415.2)
步驟4. H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH之合成
(C(SPy)NKRYFKLSHLQMHSRK之合成)
將參考例1中所獲得之H-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH(182mg)與2,2'-二吡啶基二硫(0.2M異丙醇溶液、544μL)之20%w/w乙酸水(4mL)溶液於室溫下攪拌17小時。藉由利用逆相HPLC對反應液進行純化而獲得作為目標化合物之H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln- Met-His-Ser-Arg-Lys-OH 177mg。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1143.5[M+2H]2+(理論值=1142.9)
步驟5.式(12)所表示之化合物之合成
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
將步驟3中所獲得之(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)雙硫鍵[即，式(13)所表示之化合物](9mg)、步驟4中所獲得之H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH(24mg)及三異丙基矽烷(10μL)之三氟乙酸(190μL)溶液於室溫下攪拌1小時。藉由利用逆相HPLC對反應液進行純化而獲得作為目標化合物之式(12)所表示之化合物5mg。
質量分析：LC-ESI/MS m/z=1577.2[M+3H]3+(理論值=1577.9)
實施例15~16
利用與實施例14相同之方法合成式14~15所表示之各化合物(結合體)。於表70中表示質量分析結果。(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
參考例13
利用與實施例2相同之方法合成包含序列編號244之胺基酸序列之胜肽。於表71中表示質量分析結果。表中所記載之胜肽並非本發明之化合物，因此記作參考例。
試驗例11
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例13中合成之式(10)所表示之化合物之CTL誘導能力藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價。關於式(10)所表示之化合物：[化63]
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)，對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編號：2)且癌抗原胜肽B為WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)的化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(10)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(10)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(10)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予序列編號：2所表示之胜肽之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷輔助胜肽(序列編號：244)是否於活體內發揮作用。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將序列編號：2所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至3mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。又，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(10)所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至8.5mg/mL後，立即與等量之傳氏不完全佐劑(IFA)混合而使其乳化。將乳化之化合物以425μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。式(10)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含之序列編號：2之胜肽的物質量係以與序列編號：2所表示之胜肽對於每1隻小鼠之投予量中所含的 物質量相等之方式進行調整。又，各乳液中所含之DMSO濃度亦固定。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.125×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養19小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖17。圖17中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數，橫軸表示對小鼠投予之化合物或胜肽。圖17之黑棒表示一面對序列編號：2所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，表示藉由投予序列編號：2所表示之胜肽或式(10)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。於圖17中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ。又，圖17中藉由投予式(10)所表示之化合物而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予序列編號：2所表示 之胜肽而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確式(10)所表示之化合物可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認於投予式(10)所表示之化合物之情形時，與投予序列編號：2所表示之胜肽之情形相比，對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對自式(10)所表示之化合物生成的序列編號：244所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，強烈地暗示式(10)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2及244所表示之胜肽。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(10)所表示之化合物係經由如式(1)所示之雙硫鍵使不同之2種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
比較例3
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
參考例12中合成之式(11)所表示之化合物之CTL誘導能力藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價。關於式(11)所表示之化合物：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)，對照上述式(1)，係尤其是癌抗原胜肽A為RMFPNAPYL(序列編 號：2)且癌抗原胜肽C為WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)的化合物。RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(11)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(11)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(11)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予序列編號：2所表示之胜肽之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷輔助胜肽(序列編號：244)是否於活體內發揮作用。
利用與試驗例11相同之方法進行CTL誘導試驗。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖18。圖18中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數，橫軸表示對小鼠投予之化合物或胜肽。圖18之黑棒表示一面對序列編號：2所表示之胜肽進行脈衝一面培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，白棒表示於非脈衝下培養之結果。即，黑棒與白棒之值的差表示胜肽特異性CTL之數，表示藉由投予序列編號：2所表示之胜肽或式(11)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。於圖18中未發現白棒之值。該情況表示於不對目標胜肽進行脈衝之情形時HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞完全不反應。本試驗之結果確認，於源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ。另一方面，圖18中，就式(11)所表示之化合物之投予而言，未確認有藉由投予序列編號：2所表示之胜肽而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有 特異性之IFNγ產生細胞的增加。
根據試驗例11與比較例3之結果，暗示於使用WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)作為MHC II類限制性WT1胜肽之情形時，上述式(1)中癌抗原胜肽B為WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)者較癌抗原胜肽C為WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)者，為更佳的發明之實施形態。
試驗例12
使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價實施例14中合成之式(12)所表示之化合物的CTL誘導能力。式(12)：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、4)對源自投予式(12)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(12)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2、4)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2、4)對源自投予式(12)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷輔助胜肽(序列編號：22)是否於活體內發揮作用。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至3mg/mL後，立即與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將乳化之化合物以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。又，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(12)所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至6mg/mL後，立即與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將乳化之化合物以300μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。式(12)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含之式(5)之化合物的物質量係以與式(5)所表示之化合物對於每1隻小鼠之投予量中所含的物質量相等之方式進行調整。又，各乳液中所含之DMSO濃度亦固定。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞、及源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞分別以0.25×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2、4)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。又，將稀釋之胜肽(序列編 號：4)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中。藉由將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養17小時而施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖19，將使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖20。
各圖中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖19之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，圖20之黑棒及白棒表示於序列編號：4所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予式(5)及式(12)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於各圖中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果分別確認，於源自投予式(5)及式(12)所表示之化合物的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自投予式(5)及式(12)所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，藉由投予圖19中式(12)所表示之化合物而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。另一方面，圖20中藉由投予式(12)所表示之化合物而誘導之對序列編號：4所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數與藉由投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性 IFNγ產生細胞的數相比，未發現較大差異。
因此，明確式(12)所表示之化合物可誘導對序列編號：2、4所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認於投予式(12)所表示之化合物之情形時，與投予式(5)所表示之化合物之情形相比，對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對自式(12)所表示之化合物生成的序列編號：22所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。另一方面，對投予式(12)所表示之化合物之情形與投予式(5)所表示之化合物之情形進行比較，未發現對序列編號：4所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞數有較大差異，推測其原因在於，HLA-A2402基因導入小鼠表現人類之MHC II類，因此不誘導對序列編號：22所表示之輔助胜肽有反應性之細胞。因此，強烈地暗示式(12)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2、4及22所表示之胜肽。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(12)所表示之化合物係經由雙硫鍵使不同之3種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
試驗例13
使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價實施例15中合成之式(14)所表示之化合物的CTL誘導能力。式(14)：[化66]
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402限制性WT1胜肽，WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠及HLA-A2402基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2、4)對源自投予式(14)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(14)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2、4)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(14)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷輔助胜肽(序列編號：244)是否於活體內發揮作用。
利用與試驗例12相同之方法進行CTL誘導試驗。其中，式(14)所表示之化合物係利用二甲基亞碸(DMSO)溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至5.6mg/mL後，立即與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將乳化之化合物以280μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖21，將使用HLA-A2402基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖22。
各圖中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖21之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果，圖22之黑棒及白棒表示於序列編號：4所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予式(5)及式(14)所表示之化合物而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於各圖中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果分別確認，於源自投予式(5)及式(14)所表示之化合物的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ，於源自投予式(5)及式(14)所表示之化合物的HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：4所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，圖21、22中藉由投予式(14)所表示之化合物而誘導之對序列編號：2、4所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確式(14)所表示之化合物可誘導對序列編號：2、4所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認於投予式(14)所表示之化合物之情形時，與投予式(5)所表示之化合物之情形相比，對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對自式(14)所表示之化合物生成的序列編號：244所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。另一方面，確認於投予式(14)所表示之化合物之情形時，與投予式(5)所表示之化合物之情形相比，對序列編號：4所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由序列編號：244所表示之胜肽與HLA-A2402基因導入小鼠所表現之小鼠MHC II類結合並誘導對輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：4所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，強烈地暗示式(14)所表示之化合物於小鼠活體內受到雙硫鍵之切割及利用ERAP-1之適當修整而實際上生成為序列編號：2、4及244所表示之胜肽。
即，明確作為本發明之化合物之一例的式(14)所表示之化合物係經由雙硫鍵使不同之3種胜肽複合化而成的結合體，係可實際上於活體內誘導CTL及輔助胜肽反應性細胞之WT1癌抗原胜肽結合疫苗。
試驗例14
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與參考例1中合成之序列編號：22所表示之胜肽混合而成之混合疫苗之CTL誘導能力。式(5)：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號： 2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自單獨投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物與序列編號：22所表示之胜肽之混合疫苗之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷與式(5)混合之輔助胜肽(序列編號：22)是否於活體內發揮作用。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至3mg/mL後，立即與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將乳化之化合物以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。又，以如下方式混合：利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物與序列編號：22所表示之胜肽溶解為80mg/mL後，利用注射用水稀釋後之濃度成為式(5)所表示之化合物3mg/mL、序列編號：22所表示之胜肽2.7mg/mL。將該稀釋液與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將包含該式(5)所表示之化合物150μg/site、序列編號：22所表示之胜肽137μg/site的混合疫苗投予至小鼠之尾部皮內之2處。各乳液中所含之DMSO濃度固定。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：2)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。藉由將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養17小時而施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司 製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖23。
圖23中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖23之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予包含式(5)所表示之化合物及輔助胜肽(序列編號：22)的混合疫苗而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於圖23中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果確認，於源自單獨投予式(5)所表示之化合物、及投予包含輔助胜肽(序列編號：22)之混合疫苗的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，圖23中藉由投予包含輔助胜肽(序列編號：22)之混合疫苗而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由單獨投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確將式(5)所表示之化合物與序列編號：22所表示之胜肽混合而成之混合疫苗可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認與單獨投予式(5)所表示之化合物之情形相比，於投予混合疫苗之情形時對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對混合疫苗中所含之序列編號：22所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，明確包含式(5)所表示之化合物與輔助胜肽之混合疫苗係與式(5)所表示之化合物的單獨投予相比，可於小鼠活體內更強地誘導CTL。
試驗例15
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與參考例13中合成之序列編號：244所表示之胜肽混合而成之混合疫苗之CTL誘導能力。式(5)：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402限制性WT1胜肽，WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自單獨投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物與序列編號：244所表示之胜肽之混合疫苗之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷與式(5)混合之輔助胜肽(序列編號：244)是否於活體內發揮作用。
利用與試驗例14相同之方法進行CTL誘導試驗。其中，混合疫苗係以如下方式混合：利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物與序列編號：244所表示之胜肽溶解為80mg/mL後，利用注射用水稀 釋後之濃度成為式(5)所表示之化合物3mg/mL、序列編號：244所表示之胜肽2.3mg/mL。將該稀釋液與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將包含該式(5)所表示之化合物150μg/site、序列編號：244所表示之胜肽115μg/site的混合疫苗投予至小鼠之尾部皮內之2處。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖24。
圖24中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖24之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予包含式(5)所表示之化合物及輔助胜肽(序列編號：244)的混合疫苗而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於圖24中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果確認，於源自單獨投予式(5)所表示之化合物、及投予包含輔助胜肽(序列編號：244)之混合疫苗的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，圖24中藉由投予包含輔助胜肽(序列編號：244)之混合疫苗而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由單獨投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確將式(5)所表示之化合物與序列編號：244所表示之胜肽混合而成之混合疫苗可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認與單獨投予式(5)所表示之化合物之情形相比，於投予混合疫苗之情形時對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對混合疫苗中所含之序列編號：244所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所 表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，明確包含式(5)所表示之化合物與輔助胜肽之混合疫苗係與式(5)所表示之化合物的單獨投予相比，可於小鼠活體內更強地誘導CTL。
作為製作含有2種WT1抗原胜肽之疫苗之情形時的一例，可列舉將2種不同胜肽製成一種製劑之混合化疫苗。於製作混合化疫苗時，混合成為問題者之癌抗原胜肽之物性成為一個問題。如表60及表66所示，於使2種WT1抗原胜肽混合化時，將溶解度即物性不同之2個胜肽製成一種製劑。相對於此，本發明之結合體係利用雙硫鍵使2種WT1抗原胜肽結合而成之化合物，顯示單一之溶解度即物性。該情況表示本發明之結合體為單一之物性，並且如試驗例2所示，具有引起對2種WT1抗原胜肽之應答之性質。就該方面而言，顯示本發明之結合體係如混合化疫苗般可不考慮2種WT1抗原胜肽彼此之相互作用等而引起對2種WT1抗原胜肽之應答的化合物。
試驗例16
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與參考例2中合成之序列編號：24所表示之胜肽混合而成之混合疫苗之CTL誘導能力。式(5)：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402 限制性WT1胜肽，CNKRYFKLSHLQMHSRKTG(序列編號：24)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自單獨投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物與序列編號：24所表示之胜肽之混合疫苗之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷與式(5)混合之輔助胜肽(序列編號：24)是否於活體內發揮作用。
具體而言，利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物溶解為80mg/mL，進而利用注射用水稀釋至3mg/mL後，立即與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將乳化之化合物以150μg/site投予至小鼠尾部皮內之2處。又，以如下方式混合：利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物與序列編號：24所表示之胜肽溶解為80mg/mL後，利用注射用水稀釋後之濃度成為式(5)所表示之化合物3mg/mL、序列編號：24所表示之胜肽3.11mg/mL。將該稀釋液與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將包含該式(5)所表示之化合物150μg/site、序列編號：24所表示之胜肽156μg/site的混合疫苗投予至小鼠之尾部皮內之2處。各乳液中所含之DMSO濃度固定。1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後立即摘出脾臟而脾細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備脾細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞以0.25×106cells/well播種至經分區之ELISPOT板上。利用 DMSO將胜肽(序列編號：2)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：2)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中。將添加有胜肽之脾細胞於37℃、5% CO2下培養19小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液，根據隨附之實驗室指南而使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖25。
圖25中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖25之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予包含式(5)所表示之化合物及輔助胜肽(序列編號：24)的混合疫苗而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於圖25中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果確認，於源自單獨投予式(5)所表示之化合物、及投予包含輔助胜肽(序列編號：24)之混合疫苗的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，圖25中藉由投予包含輔助胜肽(序列編號：24)之混合疫苗而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由單獨投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確將式(5)所表示之化合物與序列編號：24所表示之胜肽混合而成之混合疫苗可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認與單獨投予式(5)所表示之化合物之情形相比，於投予混合疫苗之情形時對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產 生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對混合疫苗中所含之序列編號：24所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，明確包含式(5)所表示之化合物與輔助胜肽之混合疫苗係與式(5)所表示之化合物的單獨投予相比，可於小鼠活體內更強地誘導CTL。
試驗例17
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例11中合成之序列編號：242係序列編號：244之N末端半胱胺酸延長體。又，序列編號：244於試驗例15所示之混合疫苗中顯示CTL誘導之增強效果。因此，本試驗係藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與序列編號：242所表示之胜肽混合而成的混合疫苗之CTL誘導能力。式(5)：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402限制性WT1胜肽，CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)中所含之WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(5)所表示之化 合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自單獨投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物與序列編號：242所表示之胜肽之混合疫苗之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷與式(5)混合之輔助胜肽(序列編號：242)是否於活體內發揮作用。
利用與試驗例16相同之方法進行CTL誘導試驗。其中，混合疫苗係以如下方式混合：利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物與序列編號：242所表示之胜肽溶解為80mg/mL後，利用注射用水稀釋後之濃度成為式(5)所表示之化合物3mg/mL、序列編號：242所表示之胜肽2.42mg/mL。將該稀釋液與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將包含該式(5)所表示之化合物150μg/site、序列編號：242所表示之胜肽121μg/site的混合疫苗投予至小鼠之尾部皮內之2處。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖26。
圖26中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖26之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予包含式(5)所表示之化合物及輔助胜肽(序列編號：242)的混合疫苗而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於圖26中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果確認，於源自單獨投予式(5)所表示之化合物、及投予包含輔助胜肽(序列編號：242)之混合疫苗的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示 之目標胜肽特異性IFNγ。又，圖26中藉由投予包含輔助胜肽(序列編號：242)之混合疫苗而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由單獨投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確將式(5)所表示之化合物與序列編號：242所表示之胜肽混合而成之混合疫苗可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認與單獨投予式(5)所表示之化合物之情形相比，於投予混合疫苗之情形時對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對混合疫苗中之序列編號：242所表示之胜肽中所含之序列編號：244所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，明確包含式(5)所表示之化合物與輔助胜肽之混合疫苗係與式(5)所表示之化合物的單獨投予相比，可於小鼠活體內更強地誘導CTL。
試驗例18
使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
實施例12中合成之序列編號：243係序列編號：244之C末端半胱胺酸延長體。又，序列編號：244於試驗例15所示之混合疫苗中顯示CTL誘導之增強效果。因此，本試驗係藉由使用HLA-A0201基因導入小鼠之活體內CTL誘導試驗而評價將實施例1中合成之式(5)所表示之化合物與序列編號：243所表示之胜肽混合而成之混合疫苗之CTL誘導能力。式(5)：
(式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵)
所表示之化合物中所含之RMFPNAPYL(序列編號：2)為HLA-A0201限制性WT1胜肽，CYTWNQMNL(序列編號：4)為HLA-A2402限制性WT1胜肽，WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)中所含之WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)為MHC II類限制性WT1胜肽(即，輔助胜肽)。
關於HLA-A0201基因導入小鼠，係如試驗例2、5所述。
藉由測定於利用胜肽(序列編號：2)對源自投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時是否產生IFNγ，而判斷藉由投予式(5)所表示之化合物而是否誘導對於目標胜肽(序列編號：2)之CTL。又，藉由比較利用胜肽(序列編號：2)對源自單獨投予式(5)所表示之化合物之上述小鼠的脾細胞、及源自投予式(5)所表示之化合物與序列編號：243所表示之胜肽之混合疫苗之上述小鼠的脾細胞進行再刺激之情形時之IFNγ產生細胞數，而判斷與式(5)混合之輔助胜肽(序列編號：243)是否於活體內發揮作用。
利用與試驗例16相同之方法進行CTL誘導試驗。其中，混合疫苗係以如下方式混合：利用二甲基亞碸(DMSO)將式(5)所表示之化合物與序列編號：243所表示之胜肽溶解為80mg/mL後，利用注射用水稀釋後之濃度成為式(5)所表示之化合物3mg/mL、序列編號：243所表示之胜肽2.42mg/mL。將該稀釋液與等量之Montanide ISA51VG混合而使其乳化。將包含該式(5)所表示之化合物150μg/site、序列編號：243所表示之胜肽121μg/site的混合疫苗投予至小鼠之尾部皮內之2處。
將使用HLA-A0201基因導入小鼠之IFNγ酶聯免疫斑點分析之結果示於圖27。
圖27中，縱軸表示播種細胞數中反應之細胞數。圖27之黑棒及白棒表示於序列編號：2所表示之目標胜肽之存在下及非存在下培養源自HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞的結果。即，黑棒與白棒之值的差表示藉由投予包含式(5)所表示之化合物及輔助胜肽(序列編號：243)的混合疫苗而於小鼠活體內誘導之目標各胜肽特異性CTL之數。
於圖27中未發現白棒之值。該情況表示於目標胜肽非存在下各基因導入小鼠之脾細胞不反應。本試驗之結果確認，於源自單獨投予式(5)所表示之化合物、及投予包含輔助胜肽(序列編號：243)之混合疫苗的HLA-A0201基因導入小鼠之脾細胞中產生序列編號：2所表示之目標胜肽特異性IFNγ。又，圖27中藉由投予包含輔助胜肽(序列編號：243)之混合疫苗而誘導之對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞的數多於藉由單獨投予式(5)所表示之化合物而誘導之胜肽特異性IFNγ產生細胞的數。
因此，明確將式(5)所表示之化合物與序列編號：243所表示之胜肽混合而成之混合疫苗可誘導對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL。又，確認與單獨投予式(5)所表示之化合物之情形相比，於投予混合疫苗之情形時對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之IFNγ產生細胞較多，推測其原因在於，藉由誘導對混合疫苗中之序列編號：243所表示之胜肽中所含之序列編號：244所表示之輔助胜肽有反應性之細胞而增強了對序列編號：2所表示之胜肽有特異性之CTL的誘導。因此，明確包含式(5)所表示之化合物與輔助胜肽之混合疫苗係與式(5)所表示之化合物的單獨投予相比，可於小鼠活體內更強地誘導CTL。
作為製作含有2種WT1抗原胜肽之疫苗之情形時的一例，可列舉將2種不同之胜肽製成一種製劑的混合化疫苗。製作混合化疫苗時，混合成為問題者之癌抗原胜肽之物性成為一個問題。如表60及表66所 示，使2種WT1抗原胜肽混合化時，將溶解度即物性不同之2種胜肽製成一種製劑。相對於此，本發明之結合體係利用雙硫鍵使2種WT1抗原胜肽結合而成之化合物，顯示單一之溶解度即物性。該情況表示本發明之結合體為單一之物性，且如試驗例2所示，具有引起對2種WT1抗原胜肽應答之性質。就該方面而言，顯示本發明之結合體係如混合化疫苗般，可不考慮2種WT1抗原胜肽彼此之相互作用等而引起對2種WT1抗原胜肽之應答的化合物。
試驗例19
經由過濾器過濾後使用HLA-A2402基因導入小鼠之活體內之CTL誘導能力之評價
將經由雙硫鍵形成之序列編號4之均二聚物及式(5)所表示之化合物以成為3-10mg/mL之方式溶解於注射用水中。以CTL誘導活性作為指標利用HLA-A2402基因導入小鼠(C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)評價各化合物之藥理活性。於對HLA-A2402基因導入小鼠進行投予時，利用蛋白質低結合性過濾器(以注射劑之殺菌處理為目的之等級之薄膜過濾器)對以注射用水溶解之化合物進行過濾殺菌後，立即與傳氏不完全佐劑混合而使其乳化。
將乳化之化合物投予至HLA-A2402基因導入小鼠之尾部皮內。投予1週後，利用CO2氣體使小鼠安樂死後，立即摘出脾臟或鼠蹊部淋巴結而製備脾細胞或淋巴結細胞。IFNγ產生之測定係使用IFNγ酶聯免疫斑點分析試劑盒。於製備細胞之前天，利用抗小鼠IFNγ抗體對ELISPOT板進行處理，當天利用包含10%FBS之RPMI1640培養基進行分區。將製備之源自小鼠之細胞播種於經分區之ELISPOT板上。利用DMSO將胜肽(序列編號：4)溶解為40mg/mL，進而利用包含10%FBS之RPMI1640培養基稀釋至40μg/mL。將稀釋之胜肽(序列編號：4)以最終濃度10μg/mL添加至源自HLA-A2402基因導入小鼠之脾細胞或淋 巴結細胞中。將添加有胜肽之細胞於37℃、5% CO2下培養16-20小時，藉此施加活體外之胜肽再刺激。培養後去除上清液後，立即根據隨附之實驗室指南使ELISPOT板顯色。顯色之點數係藉由ImmunoSpot Analyzer(C.T.L.公司製造)而進行測定。
[產業上之可利用性]
本發明之化合物作為以較佳之效率誘導CTL且製造較容易之癌疫苗之有效成分而較為有用。本申請案係以於日本申請之日本專利特願2013-072173(申請日：2013年3月29日)及日本專利特願2013-158383(申請日：2013年7月31日)為基礎，其內容全部包含於本說明書中。
<110> 大日本住友製藥股份有限公司 國際癌症免疫研究所股份有限公司
<120> WT1抗原胜肽結合疫苗
<130> 092147
<150> JP 2013-072173
<151> 2013-03-29
<150> JP 2013-158383
<151> 2013-07-31
<160> 244
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 6
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 7
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 8
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 10
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 11
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 12
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 13
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 14
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 15
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 16
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 17
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 18
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 19
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 21
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 22
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 23
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 27
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 28
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 29
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 30
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 31
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 32
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 33
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 34
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 35
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 37
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 38
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 39
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 40
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 41
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 42
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 44
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 45
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 46
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 47
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 48
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 49
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 50
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 51
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 52
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 53
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 54
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 55
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 56
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 57
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 58
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 60
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 61
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 64
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 65
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 66
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 67
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 70
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 72
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 73
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 74
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 76
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 77
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 78
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 79
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 80
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 81
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 83
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 84
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 85
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 86
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 87
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 88
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 89
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 90
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 91
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 92
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 93
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 94
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 95
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 96
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 97
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 98
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 99
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 100
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 101
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 102
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 103
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 104
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 105
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 106
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 107
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 108
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 109
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 110
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 111
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 112
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 113
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 114
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 115
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 116
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 117
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 118
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 119
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 120
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 121
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 122
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 123
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 124
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 125
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 126
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 127
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 128
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 129
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 130
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 131
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 132
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 133
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 134
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 135
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 136
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 137
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 138
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 139
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 140
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 141
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 142
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 143
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 144
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 145
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 146
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 147
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 148
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 149
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 150
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 151
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 152
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 153
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 154
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 155
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 156
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 157
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 158
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 159
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 160
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 161
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 162
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 163
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 164
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 165
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 166
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 167
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 168
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 169
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 170
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 171
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 172
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 173
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 174
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 175
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 176
<210> 177
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 177
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 178
<210> 179
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 179
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 180
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 181
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 182
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 183
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 184
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 185
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 186
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 187
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 188
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 189
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 190
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 191
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 192
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 193
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 194
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 195
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 196
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 197
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 198
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 199
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 200
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 201
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 202
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 203
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 204
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 205
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 206
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 207
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 208
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 209
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 210
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 211
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 212
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 213
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 214
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 215
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 216
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 217
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 218
<210> 219
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 219
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 220
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 221
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 222
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 223
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 224
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 225
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 226
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 227
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 228
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 尚未歸類特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Ser或Ala
<400> 229
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 尚未歸類特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa係選自由Ser、Ala、Abu、Arg、Lys、Orn、Cit、Leu、Phe及Asn所組成之群
<400> 230
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 231
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 232
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 233
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 234
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 235
<210> 236
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 236
<210> 237
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 237
<210> 238
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 238
<210> 239
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 239
<210> 240
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 240
<210> 241
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 241
<210> 242
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 242
<210> 243
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 243
<210> 244
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 244

Claims (15)

  1. 一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物係由式(1)所表示：
    Figure TWI666026B_C0001
    式中，Xa及Ya獨立地表示單鍵，癌抗原胜肽A表示包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、CYTWNQMNL(序列編號：4)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，癌抗原胜肽A之N末端胺基酸之胺基與式(1)中之Ya鍵結，癌抗原胜肽A之C末端胺基酸之羰基與式(1)中之羥基鍵結，R1表示式(2)所表示之基、或癌抗原胜肽C，癌抗原胜肽C表示與癌抗原胜肽A之序列不同且包含包括1個半胱胺酸殘基之選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CMTWNQMNL(序列編號：3)及CYTWNQMNL(序列編號：4)，或者包含包括1個半胱胺酸殘基之選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)；癌抗原胜肽C之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結，癌抗原胜肽C之N末端為半胱胺酸殘基之情形時，包含CA之二胜肽亦可進一步鍵結於癌抗原胜肽C之N末端；
    Figure TWI666026B_C0002
    式中，Xb表示單鍵，Yb表示單鍵或丙胺酸殘基，癌抗原胜肽B表示與癌抗原胜肽A不同且包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：RMFPNAPYL(序列編號：2)、CMTWNQMNL(序列編號：3)、CYTWNQMNL(序列編號：4)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)，癌抗原胜肽B之N末端胺基酸之胺基與式(2)中之Yb鍵結，癌抗原胜肽B之C末端胺基酸之羰基與式(2)中之羥基鍵結，式(2)中之硫醚基與式(1)中之硫醚基鍵結；其中，於R1表示式(2)、癌抗原胜肽B為序列編號3或4之情況，或者R1為癌抗原胜肽C之情況中，癌抗原胜肽A不為序列編號3或序列編號4之任一者。
  2. 如請求項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽A為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)。
  3. 如請求項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為式(2)所表示之基。
  4. 如請求項3之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：RMFPNAPYL(序列編號：2)、ALLPAVPSL(序列編號：5)、SLGEQQYSV(序列編號：6)、及RVPGVAPTL(序列編號：7)。
  5. 如請求項3之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽B為包含1個半胱胺酸殘基之MHC I類限制性WT1胜肽之情形時，癌抗原胜肽B中之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結、或與癌抗原胜肽E中之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結，[化3]
    Figure TWI666026B_C0003
    式中，Xd及Yd獨立地表示單鍵，癌抗原胜肽D表示WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)，癌抗原胜肽D之N末端胺基酸之胺基與式(16)中之Yd鍵結，C末端胺基酸之羰基與式(16)中之羥基鍵結；癌抗原胜肽E表示包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)。
  6. 如請求項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R1為癌抗原胜肽C。
  7. 如請求項6之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)之化合物為式(4)所表示之化合物：
    Figure TWI666026B_C0004
    式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵。
  8. 如請求項6之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中式(1)之化合物為式(5)所表示之化合物：[化5]
    Figure TWI666026B_C0005
    式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵。
  9. 如請求項6之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中癌抗原胜肽C為包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列者：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)。
  10. 如請求項6之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中包含CA之二胜肽進一步鍵結於癌抗原胜肽C之N末端之情形時，鍵結於癌抗原胜肽C之N末端的胜肽之半胱胺酸殘基之硫醚基與式(16)中之硫醚基鍵結、或與癌抗原胜肽E之半胱胺酸殘基之硫醚基鍵結，
    Figure TWI666026B_C0006
    式中，Xd及Yd獨立地表示單鍵，癌抗原胜肽D表示WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)，癌抗原胜肽D之N末端胺基酸之胺基與式(16)中之Yd鍵結，癌抗原胜肽D之C末端胺基酸之羰基與式(16)中之羥基鍵結；癌抗原胜肽E表示包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、及CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)。
  11. 一種組合物，其包含如請求項1之化合物或其藥學上所容許之鹽、及1種以上之包含選自以下胺基酸序列中之任一胺基酸序列之胜肽：CNKRYFKLSHLQMHSRK(序列編號：22)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH(序列編號：23)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(序列編號：24)、WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：242)、及WAPVLDFAPPGASAYGSLC(序列編號：243)。
  12. 一種組合物，其包含式(4)所表示之化合物、及包含胺基酸序列：WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)之胜肽，
    Figure TWI666026B_C0007
    式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵。
  13. 一種組合物，其包含式(5)所表示之化合物、及包含胺基酸序列：WAPVLDFAPPGASAYGSL(序列編號：244)之胜肽，
    Figure TWI666026B_C0008
    式中，C與C之間的鍵表示雙硫鍵。
  14. 一種醫藥組合物，其含有如請求項1至10中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽或者如請求項11至13中任一項之組合物、及藥學上所容許之載體。
  15. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽、如請求項11至13中任一項之組合物、或者如請求項14之醫藥組合物之用途，其係用於製造用以治療或預防癌之醫藥組合物，該用以治療或預防癌之醫藥組合物係以對治療或預防有效之量投予至需要其之WT1陽性癌患者。
TW103111843A 2013-03-29 2014-03-28 Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗 TWI666026B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-072173 2013-03-29
JP2013072173 2013-03-29
JP2013158383 2013-07-31
JP2013-158383 2013-07-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201505650A TW201505650A (zh) 2015-02-16
TWI666026B true TWI666026B (zh) 2019-07-21

Family

ID=51624648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103111843A TWI666026B (zh) 2013-03-29 2014-03-28 Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗

Country Status (20)

Country Link
US (4) US9181302B2 (zh)
EP (2) EP3461493A1 (zh)
JP (4) JP5885885B2 (zh)
KR (1) KR102121638B1 (zh)
CN (1) CN105308063B (zh)
AU (1) AU2014244860B2 (zh)
CA (1) CA2907782C (zh)
DK (1) DK2982681T3 (zh)
ES (1) ES2691091T3 (zh)
HK (1) HK1220471A1 (zh)
IL (1) IL241566B (zh)
MX (1) MX364459B (zh)
MY (1) MY171854A (zh)
NZ (1) NZ712148A (zh)
PH (1) PH12015502180A1 (zh)
RU (1) RU2668560C2 (zh)
SG (1) SG11201507883SA (zh)
TR (1) TR201816260T4 (zh)
TW (1) TWI666026B (zh)
WO (1) WO2014157692A1 (zh)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2626238C (en) 2005-10-17 2015-10-06 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Wt1 hla class ii-binding peptides and compositions and methods comprising same
ES2591029T3 (es) 2006-04-10 2016-11-24 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Péptidos WT-1 inmunogénicos y métodos para su uso
AU2013207669C1 (en) 2012-01-13 2018-05-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
CN109324190A (zh) 2012-12-11 2019-02-12 艾伯特叶史瓦大学爱因斯坦医学院 高通量受体:配体鉴定方法
US10815273B2 (en) 2013-01-15 2020-10-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
PL2945647T3 (pl) 2013-01-15 2021-03-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenne peptydy wt-1 i sposoby ich zastosowania
CA2907782C (en) * 2013-03-29 2021-01-05 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Wt1 antigen peptide conjugate vaccine
WO2014157704A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン
WO2016047797A1 (ja) * 2014-09-27 2016-03-31 大日本住友製薬株式会社 注射用医薬組成物
WO2016186177A1 (ja) * 2015-05-20 2016-11-24 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１抗原ペプチドおよび免疫調節剤の併用
GB201512369D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
EP3411475A4 (en) 2016-02-06 2019-09-11 President and Fellows of Harvard College REGENERATION OF THE HEMATOPOIETIC NICHE TO RECONSTITUTE IMMUNITY
JP2019522466A (ja) 2016-05-18 2019-08-15 アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン，インコーポレイティド 変異ｐｄ−ｌ１ポリペプチド、ｔ細胞調節多量体ポリペプチド、及びそれらの使用方法
CA3019005A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
AU2017295704B2 (en) 2016-07-13 2023-07-13 President And Fellows Of Harvard College Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same
JP6975716B2 (ja) * 2016-09-21 2021-12-01 一般財団法人阪大微生物病研究会 樹状細胞標的化ペプチド、当該ペプチドを利用したペプチド融合体、及び当該ペプチド融合体を利用したワクチン
EP3549957A4 (en) * 2016-11-30 2020-08-05 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. WT1-HELPER PEPTIDE AND COMBINATION OF THE SAYING PEPTIDE AND A CANCER ANTIGEN PEPTIDE CONJUGATE
CA3043630A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
EP3565829A4 (en) 2017-01-09 2021-01-27 Cue Biopharma, Inc. MULTIMER POLYPEPTIDES T-LYMPHOCYTE MODULATORS AND THEIR METHODS OF USE
CN111010875B (zh) 2017-03-15 2024-04-05 库尔生物制药有限公司 用于调节免疫应答的方法
WO2018181648A1 (ja) 2017-03-30 2018-10-04 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１癌抗原ペプチドおよびこれを含むペプチドコンジュゲート体
US20200368338A1 (en) * 2017-12-27 2020-11-26 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Conjugate of wt1-derived peptides and composition comprising the same
EP3737689A4 (en) 2018-01-09 2021-12-01 Cue Biopharma, Inc. MULTIMERIC T CELL-MODULATING POLYPEPTIDES AND METHOD OF USING THEREOF
KR20210068060A (ko) 2018-09-28 2021-06-08 다이니뽄 스미토모 세이야쿠 가부시키가이샤 주사용 조성물
AU2019352354A1 (en) * 2018-10-05 2021-05-13 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Prophylactic or therapeutic drug for benign tumor
TW202045528A (zh) * 2019-02-28 2020-12-16 日商大日本住友製藥股份有限公司 選擇可期待用於治療或預防癌之醫藥組合物之效果之對象之方法
EP3954382A4 (en) 2019-04-05 2022-12-21 Sumitomo Pharma Co., Ltd. WATER-SOLUBLE ADJUVANT, AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME
CN113966326A (zh) 2019-04-05 2022-01-21 大日本住友制药株式会社 水溶性佐剂
CN114945383A (zh) 2019-12-10 2022-08-26 住友制药株式会社 肽乳液制剂的调制方法
KR20220167288A (ko) * 2020-04-14 2022-12-20 유니버시떼 드 몬트리얼 급성 골수성 백혈병(aml)에 대한 신규한 종양-특이적 항원 및 이의 용도
JP2023526723A (ja) 2020-05-12 2023-06-23 キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド 多量体ｔ細胞調節性ポリペプチド及びその使用方法
TW202200188A (zh) 2020-05-12 2022-01-01 日商大日本住友製藥股份有限公司 用以處置癌症之醫藥組合物
CN111647066B (zh) * 2020-07-01 2020-12-18 维肽瀛(上海)生物技术有限公司 Wt1多肽肿瘤抑制剂
JP2022156071A (ja) 2021-03-31 2022-10-14 株式会社小糸製作所 画像投影装置
TW202315645A (zh) 2021-08-12 2023-04-16 日商癌免疫研究所股份有限公司 用以處置或預防癌症之醫藥組合物及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060217297A1 (en) * 2003-01-15 2006-09-28 Haruo Sugiyama Dimerized peptide

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410022B1 (en) 1995-05-01 2002-06-25 Avant Immunotherapeutics, Inc. Modulation of cholesteryl ester transfer protein (CETP) activity
JP4063879B2 (ja) 1996-01-24 2008-03-19 エピミューン インコーポレイテッド 所望の決定基に対する免疫応答の誘導
CA2337743C (en) 1998-07-31 2015-07-07 Yoshihiro Oka Tumor antigen based on products of the tumor suppressor gene wt1
US20120301492A1 (en) 1998-09-30 2012-11-29 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
RU2237674C2 (ru) 1998-09-30 2004-10-10 Корикса Корпорейшн Композиции и способы wt1-специфичной иммунотерапии
GB9823897D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Imp College Innovations Ltd Immunotherapeutic methods and molecules
GB9826143D0 (en) 1998-11-27 1999-01-20 Ludwig Inst Cancer Res Tumour rejection antigens
US20050050580A1 (en) 2000-12-13 2005-03-03 Masashi Gotoh Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof
ES2298353T3 (es) 2001-03-22 2008-05-16 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Peptido wt1 modificado.
WO2003106682A1 (ja) 2002-06-12 2003-12-24 中外製薬株式会社 Ｈｌａ−ａ２４拘束性癌抗原ペプチド
WO2004026897A1 (ja) 2002-09-20 2004-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ｗｔ１置換型ペプチド
US7700108B2 (en) 2002-09-27 2010-04-20 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Tumor antigen protein and use thereof
CA2511538C (en) 2002-12-30 2013-11-26 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory combinations
CA2520172C (en) 2003-03-27 2012-10-02 Lankenau Institute For Medical Research Novel methods for the treatment of cancer with an indoleamine 2, 3-dioxygenase inhibitor
US20040197312A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations
JPWO2004113530A1 (ja) 2003-06-18 2006-08-03 三菱化学株式会社 ラベル化蛋白質合成用ポリヌクレオチド
AU2004255470B2 (en) 2003-07-10 2010-08-19 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles
EP1670513B1 (en) 2003-10-06 2013-01-23 Cedars-Sinai Medical Center Cox-2 inhibitors and dendritic cells for use in the treatment of cancer.
ATE540111T1 (de) 2003-11-05 2012-01-15 Int Inst Cancer Immunology Inc Hla-dr-bindendes antigenpeptid, das von wt1 abgeleitet ist
EP1844789B8 (en) 2005-01-19 2014-10-08 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Emulsified composition for dilution and cancer vaccine composition
JP4719876B2 (ja) * 2005-04-04 2011-07-06 国立大学法人愛媛大学 Ｈｌａクラスｉｉ拘束性ｗｔ１抗原ペプチド
CA2626238C (en) 2005-10-17 2015-10-06 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Wt1 hla class ii-binding peptides and compositions and methods comprising same
KR101385805B1 (ko) 2005-11-30 2014-04-16 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 신규 펩티드 화합물
ES2591029T3 (es) 2006-04-10 2016-11-24 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Péptidos WT-1 inmunogénicos y métodos para su uso
JP5427027B2 (ja) 2006-05-03 2014-02-26 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・コロラド，ア・ボディー・コーポレイト Ｃｄ４０アゴニスト抗体／ｉ型インターフェロン相乗性アジュバントの結合体、それを含む複合体、および細胞性免疫を強化する治療としてのその使用
MX2008013993A (es) 2006-05-03 2009-05-11 Univ Colorado Combinación adyuvante sinergistica de anticuerpo agonista de cd40/interferona tipo 1, conjugados que la contienen y uso de los mismos como un terapeutico para aumentar la inmunidad celular.
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
EP2980219B1 (en) * 2006-12-28 2018-11-14 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Hla-a*1101-restricted wt1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
US9045556B2 (en) * 2007-02-07 2015-06-02 Nec Corporation Therapeutic agent for cancer
JP5463013B2 (ja) 2007-06-19 2014-04-09 国立大学法人 岡山大学 軟骨マーカー
WO2009036246A2 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Immunotope, Inc. Immunogens that induce cytotoxic t-lymphocytes and their use in prevention, treatment, and diagnosis of cancer
WO2009066462A1 (ja) * 2007-11-20 2009-05-28 Nec Corporation 細胞傷害性ｔ細胞の誘導方法、細胞傷害性ｔ細胞の誘導剤、およびそれを用いた医薬組成物およびワクチン
EP3384926A1 (en) 2007-12-05 2018-10-10 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Cancer vaccine composition
US20110318380A1 (en) 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring
DK2370593T3 (en) 2008-11-28 2016-07-04 Univ Emory A method for determining the effect of PD-1 Antagonists
SG174930A1 (en) 2009-04-01 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
AR076349A1 (es) 2009-04-23 2011-06-01 Int Inst Cancer Immunology Inc Peptido auxiliar del antigeno del cancer
KR101208587B1 (ko) 2009-06-24 2012-12-06 여오영 하이드록시클로로퀸을 포함하는 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물
WO2011110953A2 (en) 2010-03-09 2011-09-15 Artemev, Timur Polyepitope constructs and methods for their preparation and use
US20120213771A1 (en) 2010-04-13 2012-08-23 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
BR112012026227A2 (pt) 2010-04-13 2020-08-04 Celldex Therapeutics, Inc. anticorpo monoclonal humano ou humanizado, molécula biespecífica, vetor de expressão, célula transformada, composição, e, usos de um anticorpo
JPWO2012026309A1 (ja) * 2010-08-23 2013-10-28 公立大学法人横浜市立大学 抗ｐａｄ４抗体医薬の創成
US10654892B2 (en) 2010-10-05 2020-05-19 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for activating helper T cell
AU2012309417B2 (en) 2011-09-14 2017-09-14 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for measuring anti-WT1 antibody
JP5704034B2 (ja) 2011-09-26 2015-04-22 コベルコ建機株式会社 建設機械の燃料供給装置及び同装置の組立方法
CN103157108B (zh) 2011-12-13 2016-01-20 宁云山 免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用
CA2858876A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 The University Of Chicago Methods and compositions for cancer therapy using mutant light molecules with increased affinity to receptors
JP5883668B2 (ja) 2012-02-02 2016-03-15 Hoya株式会社 分光データ採取システム、及び電子内視鏡システム
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
ES2655031T3 (es) 2012-07-02 2018-02-16 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Preparación transdérmica de péptido antigénico del cáncer
CN103830211A (zh) 2012-11-27 2014-06-04 上海曼克尔瑞生物医药技术有限公司 一种β-catenin蛋白抑制剂-姜黄素在肝癌治疗方面的应用
RU2687026C2 (ru) 2013-02-05 2019-05-06 Нитто Денко Корпорейшн Вакцинная композиция против злокачественной опухоли на основе пептида wt1 для мукозального введения
KR102363191B1 (ko) 2013-02-26 2022-02-17 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
WO2014157704A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン
CA2907782C (en) 2013-03-29 2021-01-05 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Wt1 antigen peptide conjugate vaccine
JP2016527303A (ja) 2013-08-05 2016-09-08 ケンブリッジ エンタープライズ リミテッド がん免疫療法におけるｃｘｃｒ４シグナル伝達の阻害
JP6329834B2 (ja) * 2014-07-22 2018-05-23 株式会社アマダホールディングス レーザ切断加工方法及び装置
WO2016186177A1 (ja) 2015-05-20 2016-11-24 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１抗原ペプチドおよび免疫調節剤の併用
EP3549957A4 (en) 2016-11-30 2020-08-05 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. WT1-HELPER PEPTIDE AND COMBINATION OF THE SAYING PEPTIDE AND A CANCER ANTIGEN PEPTIDE CONJUGATE
WO2018181648A1 (ja) 2017-03-30 2018-10-04 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１癌抗原ペプチドおよびこれを含むペプチドコンジュゲート体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060217297A1 (en) * 2003-01-15 2006-09-28 Haruo Sugiyama Dimerized peptide

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gaiger A, "Immunity to WT1 in the animal model and in patients with acute myeloid leukemia.", Blood. 2000 Aug 15;96(4):1480-9. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016155813A (ja) 2016-09-01
HK1220471A1 (zh) 2017-05-05
BR112015024583A8 (pt) 2023-05-09
AU2014244860A1 (en) 2015-10-08
JPWO2014157692A1 (ja) 2017-02-16
DK2982681T3 (en) 2018-12-10
JP7248247B2 (ja) 2023-03-29
PH12015502180B1 (en) 2016-01-25
CN105308063A (zh) 2016-02-03
WO2014157692A1 (ja) 2014-10-02
EP2982681A4 (en) 2016-10-19
IL241566B (en) 2020-03-31
NZ712148A (en) 2019-11-29
CN105308063B (zh) 2019-11-08
MY171854A (en) 2019-11-05
MX364459B (es) 2019-04-26
RU2668560C2 (ru) 2018-10-02
JP5885885B2 (ja) 2016-03-16
JP6847089B2 (ja) 2021-03-24
KR102121638B1 (ko) 2020-06-10
JP6495839B2 (ja) 2019-04-03
EP2982681B1 (en) 2018-08-22
KR20150135454A (ko) 2015-12-02
AU2014244860B2 (en) 2018-07-26
US20160114019A1 (en) 2016-04-28
US9248173B2 (en) 2016-02-02
BR112015024583A2 (pt) 2017-10-31
US20150238587A1 (en) 2015-08-27
EP3461493A1 (en) 2019-04-03
RU2015146614A (ru) 2017-05-04
TR201816260T4 (tr) 2018-11-21
TW201505650A (zh) 2015-02-16
PH12015502180A1 (en) 2016-01-25
JP2019069970A (ja) 2019-05-09
CA2907782A1 (en) 2014-10-02
ES2691091T3 (es) 2018-11-23
EP2982681A1 (en) 2016-02-10
US11759509B2 (en) 2023-09-19
US20190030149A1 (en) 2019-01-31
CA2907782C (en) 2021-01-05
US20150080321A1 (en) 2015-03-19
MX2015013813A (es) 2016-03-01
EP2982681B8 (en) 2018-11-07
JP2021059580A (ja) 2021-04-15
SG11201507883SA (en) 2015-10-29
US9181302B2 (en) 2015-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI666026B (zh) Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗
CA2631292C (en) Derivatised wt1 cancer antigen peptides and their use
US20200171136A1 (en) Conjugate vaccine using trimming function of erap1
JP6580581B2 (ja) 注射用医薬組成物
WO2024043249A1 (ja) 環状ペプチドまたはその塩、およびｍｄｍｘ阻害剤
WO2024043250A1 (ja) 環状ペプチドまたはその塩、およびｍｄｍｘ阻害剤
BR112015024583B1 (pt) Composto, suas composições e seu uso para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer