BR112015024583B1 - Composto, suas composições e seu uso para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer - Google Patents

Abstract

COMPOSTO, SUAS COMPOSIÇÕES E SEU USO PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA CONTRA O CÂNCER. A presente invenção refere-se a um composto representado pela fórmula (1): em que Xa e Ya são, cada um, uma ligação simples e assim por diante, o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 30 resíduos de aminoácidos, R1 é um átomo de hidrogênio, um grupo representado pela fórmula (2): em que Xb e Yb são, cada um, uma ligação simples e assim por diante, o peptídeo antigênico de câncer B tem uma sequência diferente daquela do peptídeo antigênico de câncer A e é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 30 resíduos de aminoácidos ou o peptídeo antigênico de câncer C e o peptídeo antigênico de câncer C tem uma sequência diferente daquela do peptídeo antigênico de câncer A e é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I ou um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I, que consiste em 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína, ou um sal do mesmo e assim por (...).

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de imunoterapia de câncer e se refere a uma vacina conjugada que pode ser submetida a corte por peptidase ERAP1, é obtida por meio de conjugação de precursores peptídicos derivados da proteína antigênica WT1 através de uma ligação covalente de enxofre-enxofre e induz eficientemente a células T citotóxicas.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Para erradicação de células cancerosas no corpo, a imuni dade celular, particularmente células T citotóxicas (linfócitos T citotóxi- cos, células T citotóxicas, daqui em diante ditos como CTLs), desempenham principalmente um papel importante. CTLs são produzidos por meio de diferenciação e proliferação de uma célula T precursora que reconhece um complexo formado por um peptídeo antigênico derivado de uma proteína antigênica de câncer (peptídeo antigênico de câncer) e uma molécula do MHC de classe I e ataca as células cancerosas.

[003] Um gene supressor de câncer de tumor de Wilms, WT1 (gene WT1), é considerado uma nova proteína antigênica de câncer para leucemia e tumores sólidos (vide documento de não patente 1).

[004] Quanto à proteína WT1, por exemplo, os seguintes peptídeos antigênicos de câncer que estão relacionados a e apresentados por MHC de classe I foram reportados (vide documentos de patentes 1, 2).

[005] Peptídeo de WT1 I126-134: RMFPNAPYL (Arg-Met-Phe-Pro- Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu) (SEQ ID NO: 2),

[006] Peptídeo de WT1 I235-243: CMTWNQMNL (Cys-Met-Thr-Trp- Asn-Gln-Met-Asn-Leu) (SEQ ID NO: 3), 7

[007] Peptídeo de WT1 I10-18: ALLPAVPSL (Ala-Leu-Leu-Pro-Ala- Val-Pro-Ser-Leu) (SEQ ID NO: 5),

[008] Peptídeo de WT1 I187-195: SLGEQQYSV (Ser-Leu-Gly-Glu- Gln-Gln-Tyr-Ser-Val) (SEQ ID NO: 6),

[009] Peptídeo de WT1 I302-310: RVPGVAPTL (Arg-Val-Pro-Gly- Val-Ala-Pro-Thr-Leu) (SEQ ID NO: 7) e assimpordiante.

[0010] Emimunoterapia de câncer, aativação de células T auxilia restambém é importante para ativação de outrascélulas T, incluindo CTLs. Emgeral, umaproteína antigênica é degradadapelolisossomaintracelular, umaparte dos fragmentospeptídicos constituídos por um peptídeo que consisteemcerca de 13 - 17 resíduos de aminoácido se ligacomo um peptídeo antigênico à molécula do MHC de classe II e é apresentado um complexo de células T auxiliares- TCR-CD3 para ativar a célula T auxiliar. Quanto à proteína WT1, por exemplo, os seguintes peptídeos antigênicos de câncer que são apresentados através de ligação a moléculas do MHC de classe II, foram reportados (vide documentos de patente 3-5).

[0011] Peptídeo de WT1 I332-347: KRYFKLSHLQMHSRKH (Lys-Arg- Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His) (SEQ ID NO: 8),

[0012] Peptídeo de WT1 I328-349: PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (Pro-Gly-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His- Ser-Arg-Lys-His-Thr-Gly) (SEQ ID NO: 10),

[0013] Peptídeo de WT1 I122-140: SGQARMFPNAPYLPSCLES (Ser-Gly-Gln-Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser-Cys- Leu-Glu-Ser) (SEQ ID NO: 11) e assim por diante.

[0014] Como um antígeno de vacina de WT1, um antígeno de pro teína em si ou o peptídeo antigênico derivado da proteína antigênica supracitado é usado principalmente (vide documento de não patente 2). Uma vez que uma vacina contra o câncer que usa uma proteína em geral contém vários peptídeos antigênicos de câncer, ela pode induzir simultaneamente a umapluralidade de células T auxiliares e CTLs. Por outro lado, umavez que umavacina de proteína contra o câncer impõe problemas de fornecimentoestável e controle de qualidade, peptídeos que facilitam a produção e controle de qualidadesão amplamenteusadoscomoantígeno de câncer de WT1. Emgeral, no entanto,umavez que as vacinaspeptídicas convencionaissão essenci-almenteconstituídas por um único antígeno peptídico apresentadopormoléculas do MHC de classe I, foisalientadonosúltimos anos que aindução eficiente de CTLs requeraprimoramentosadicionais (vide documento de não patente 3).

[0015] Uma de tais soluções é umavacinapeptídica de WT1 con tra o câncer multivalente que apresentapeptídeo antigênico. Como talvacinapeptídica contra o câncer, umavacinaemcoquetel que contém umamistura de umapluralidade de antígenos peptídicos apresentadospormoléculas do MHC de classe I e classe II (videdocumento de não patente 4), umavacinapeptídica de cadeia longa que contém antíge- nospeptídicos apresentadospormoléculas do MHC de classe I e classe II, osquaissão ligadosporumaligação de amida e similaresforamreportadas (vide documento de não patente 5). No caso de umavacinaemcoquetel, no entanto, umavez que cadaantígeno peptídico composto de vários aminoácidos mostravárias propriedades, o desenvolvimento de umaformulação ideal capaz de induzireficientemente a CTLs que correspondemàmesmamuitasvezesé problemática. No caso de umavacinapeptídica de cadeia longa, algumasvezes, suaprodução levantaproblemas, talcomoproteína. Além disso, umavez que osantígenos peptídicos apresentadospormoléculas da classe I e classe II são ligadosatravés de qualquerespaçador peptídico emumavacinapeptídica de cadeia longa, o controle e previsão dos sítios de clivagemporenzimasintracelularessão difíceis. Entretanto, um díme- ropeptídico em que doismonômeros peptídicos são mutuamenteliga- dos porumaligação de dissulfuretofoireportado (vide documento de patente 6). Diferente da vacinaemcoquetel, doispeptídeos isoladossão ligados e, portanto, têm umapropriedadefísica única e podem ser convenientementeproduzidos. Por outro lado, para formar um conjugado,é necessário que ospeptídeos antigênicos de câncer WT1 contenhamcisteína nasequência de aminoácidos dos mesmos e, portan-to,aquelesaplicáveis são limitados. Além disso, um compostomodificadoobtidopormeio de condensação da cisteína N-terminal do peptí- deo antigênico de câncer com cisteína, glutationaouácido tioglicólico porumaligação de dissulfureto, também foireportado (vide documento de patente 7).

[0016] O processo de apresentação de peptídeo antigênico de câncer sobremoléculas do MHC de classe I envolveumapluralidade de peptidases. De tais peptidases, aminopeptidase 1 de retículo endo- plasmático (daquiemdiante dita como ERAP1) é uma das enzimas de corte no retículo endoplasmático (daquiemdiante a ditocomo ER) e foireportadacomoreconhecendoumasequência de peptídeo antigê- nico e comprimento de peptídeo particulares e cliva o peptídeo antigê- nico de câncer precursor do N-término de modo a controlar o comprimento para ser ideal para ligação a moléculas do MHC de classe I (vide documentosnão-patente 6-8). No entanto, não há qualquerrelatoaté o momentosobre um precursor de peptídeo antigênico de câncer WT1 contendocisteína que tenhacomprimentocontrolado a partir do N-término pela função de corte de ERAP1.

LISTA DE DOCUMENTOS DOCUMENTOS DE PATENTE

[0017] Documento de Patente 1: WO 00/06602

[0018] Documento de Patente 2: WO 00/18795

[0019] Documento de Patente 3: WO 2005/045027

[0020] Documento de Patente 4: WO 2007/047764

[0021] Documento de Patente 5: WO 2007/120673

[0022] Documento de Patente 6: WO 2004/063217

[0023] Documento de Patente 7: WO 2007/063903

DOCUMENTOS DE NÃO PATENTE

[0024] Documento de não Patente 1: The Journal of Immunology, 2000; 164 (4); 1873-1880

[0025] Documento de não Patente 2: The Oncologist, 2012; 17 (2); 250-259

[0026] Documento de não Patente 3: Cancer Journal, 2011; 17 (5); 343-350

[0027] Documento de não Patente 4: Sangue de 2010; 166 (2); 171-179

[0028] Documento de não Patente 5: Cancers, 2011; 3; 3991-4009

[0029] Documento de não Patente 6: Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 2005; 102 (47); 17107-17112

[0030] Documento de não Patente 7: The Journal of Immunology, 2009; 183; 5526-5536

[0031] Documento de não Patente 8: The Journal of Immunology, 2010; 184; 4725-4732

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[0032] O problema a ser resolvido pela presente invenção é forne cer uma vacina conjugada de WT1 que induz eficientemente a CTLs.

MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

[0033] Os presentes inventores conduziram estudos intensivos em uma tentativa de resolver o problema supracitado e conceberam, quando se considera a adoção de uma vacina conjugada, uma ideia de adição de cisteína no peptídeo antigênico de câncer WT1 e confirmaram adicionalmente que os resultados de ensaios farmacológicos e assimpordianteusando um modelo animal in vivosugeremfortemente que a ERAP1 cliva a cisteína do N-término de um WT1 precursor de peptídeo antigênico de câncer que é geradopormeio de clivagem re- dutivaintracelular da ligação de dissulfureto para converter eficientemente o mesmoem um peptídeo antigênico de câncer o que, porsuavez, levouà descoberta de umavacinaconjugada que apresenta um peptídeo antigênico polivalentecapaz de induzir a CTLs no corpo e concluíram a presenteinvenção.

[0034] Para ser específico, durante o processo de estudo do meio para resolver o problemasupracitado, elestiveram a ideia de um método para introdução de cisteína, a qual é necessária para formação de um conjugado de doispeptídeos antigênicos de câncer WT1 diferentes,emqualquerposição no N-término ouC-término, seminfluenciar a apresentação de antígeno pormoléculas do MHC de classe I. Como um resultado de estudosadicionais, elescriaram um peptídeo pormeio de introdução de umacisteína contendo 0 - 5 aminoácidos no N-término de um peptídeo antigênico de câncer WT1 e um conjugado dos peptídeos contendoumaligação de dissulfuretoatravés da cisteí- na.Além disso, ospresentesinventoresconfirmaram, pela primeiravez, que oditopeptídeo e o conjugadosão passíveis de corte por ERAP1 in vitro e/ouin vivo o que, porsuavez, resultanaformação de um peptídeo antigênico de câncer e, deste modo, concluíram a presenteinvenção.

[0035] Embora o desenvolvimento de uma nova vacinapeptídica contra o câncer que apresentapeptídeo antigênico WT1 multivalente, a qual pode ser produzidafacilmente, sejaaplicável a várias outras e induza a CTLs com altaeficiência sejadesejado, o conjugadoinventadopelospresentesinventorespermitiu o desenvolvimento de umavacinaconjugada de WT1 que induz a CTLs eficientemente, tempropriedadesfísico-químicas superiores, pode ser produzidafacilmente, facili- ta a gestão de produção e é aplicável a várias outras.

[0036] Consequentemente, a presenteinvenção se refereaose guinte.

1. Primeira Modalidade

[0037] 1. Um composto representado pela fórmula (1): em que Xa e Ya são, cada um independentemente, uma ligação simples ou um grupo peptídico divalente que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos e um total do número de resíduos de aminoácidos para Xa e do número de resíduos de aminoácidos para Ya é um número inteiro de 0 - 4,

[0038] o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 30 resíduos de aminoácidos, um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se liga a Ya na fórmula (1) e um grupo carbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se liga a um grupo hidroxila na fórmula (1),

[0039] R1 é um átomo de hidrogênio, um grupo representado pela fórmula (2): em que Xb e Yb são, cada um independentemente, uma ligação simples ou um grupo peptídico divalente que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos e um total donúmero de resíduos de aminoácidos para Xb e do número de resíduos de aminoácidos para Ybé um número inteirode 0 - 4,

[0040] o peptídeo antigênico de câncer B temumasequência dife rentedaquela do peptídeo antigênico de câncer A e é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos, um grupo amino de um aminoácido N- terminal do peptídeo antigênico de câncer B se liga a Ybnafórmula (2) e um grupocarbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo anti- gênico de câncer B se liga a um grupohidroxilanafórmula (2) e

[0041] um grupotioéter nafórmula (2) se ligaa um grupotioéter nafórmula (1),

[0042] ou o peptídeo antigênico de câncer C,

[0043] em que o peptídeo antigênico de câncer C temumase quência diferentedaquela do peptídeo antigênico de câncer A e é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ou um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína e um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigê- nico de câncer C se liga a um grupotioéter nafórmula (1),

[0044] contanto que, quando R1é um átomo de hidrogênio, a se quência de um compostorepresentado pela fórmula (1) não é a mesma que a sequência parcial de umaproteína WT1,

[0045] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0046] 2. o composto de acordo com 1, em que Xaé um grupo peptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos e Yaé umaligação simples ouXa e Yasão, cada um independentemente, um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido ouXaé umaligação simples e Yaé um grupopeptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos ouXaé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido e Yaé umaligação simples ouXaé umaligação simples e Yaé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduode aminoácido ouXa e Yasão, cada um, umaligação simples ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0047] 3. o composto de acordo com 1 ou 2, em que Xaé umali gação simples e Yaé umaligação simples, um resíduo de alanina, um resíduo de leucinaou um resíduo de metioninaou um salfarmaceuti- camenteaceitável domesmo;

[0048] 4. o composto de acordo com 1 ou 2, em que Xaé umali gação simples ou um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido e Yaé umaligaçãosimples ou um salfarmaceuti- camenteaceitável domesmo;

[0049] 5. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 4, em que Xa e Ya são, cada um, uma ligação simples ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo;

[0050] 6. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 5, em que o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0051] 7. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 6, em que o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[0052] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[0053] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[0054] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[0055] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[0056] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7) ou

[0057] um peptídeo que compreendeumasequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquersequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7,mas que contém a alteração de resí- duo(s) de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de CTLs ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0058] 8. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 7, em que o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[0059] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[0060] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[0061] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[0062] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[0063] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[0064] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),

[0065] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0066] 9. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, em que R1 é um átomo de hidrogênio ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0067] 10. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 9, em que o composto representado pela fórmula (1) é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[0068] CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13),

[0069] CCMTWNQMNL (SEQ ID NO: 14),

[0070] CCYTWNQMNL (SEQ ID NO: 15),

[0071] CALLPAVPSL (SEQ ID NO: 16),

[0072] CSLGEQQYSV (SEQ ID NO: 17) e

[0073] CRVPGVAPTL (SEQ ID NO: 18),

[0074] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0075] 11. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, em que R1 é um grupo representado pela fórmula (2) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo;

[0076] 12. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11, em que Xb é um grupo peptídico divalente que consiste em 2 resíduos de aminoácidos e Yb é uma ligação simples ou Xb e Yb são, cada um independentemente, um grupo peptídico divalente que consiste em 1 resíduo de aminoácido ou Xb é uma ligação simples e Yb é um grupo peptídico divalente que consiste em 2 resíduos de aminoácidos ou Xb é um grupo peptídico divalente que consiste em 1 resíduo de aminoá- cido e Yb é uma ligação simples ou Xb é uma ligação simples e Yb é um grupo peptídico divalente que consiste em 1 resíduo de aminoáci- do ou Xb e Yb são, cada um, uma ligação simples ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo;

[0077] 13. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 12, em que Xb é uma ligação simples e Yb é uma ligação simples, um resíduo de alanina, um resíduo de leucina ou um resíduo de metionina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0078] 14. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 13, em que Xb é uma ligação simples ou um grupo peptídico divalente que consiste em 1 resíduo de aminoácido e Yb é uma ligação simples ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0079] 15. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 14, em que Xb e Yb são, cada um, uma ligação simples ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo;

[0080] 16. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 15, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0081] 17. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 16, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo que compreendequalquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[0082] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[0083] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[0084] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[0085] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[0086] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7) ou

[0087] um peptídeo que compreendeumasequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquersequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7, mas que contém a alteração de resí- duo(s) de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de CTLs ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0088] 18. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 17, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo que con-sisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências deaminoácidos a seguir:

[0089] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[0090] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[0091] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[0092] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[0093] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[0094] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),

[0095] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0096] 19. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 18, em que ocompostorepresentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (3):

[0097]

[0098] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[0099] 20. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, em que R1é o peptídeo antigênico de câncer C ou um salfarmaceutica- menteaceitável domesmo;

[00100] 21. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 20, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo;

[00101] 22. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 20 - 21, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos a seguir:

[00102] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3), ou

[00103] um peptídeo que compreende uma sequência de aminoáci- dos alterada, a qual é uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, mas que contém a alteração de resíduo(s) de aminoácidos e tendo uma atividade de indução de CTLs ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00104] 23. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 20 - 22, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00105]

[00106]

[00107]

[00108] 23, em que o composto representado pela fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (4):

[00109]

[00110]em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto ou um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00111]

[00112] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00113] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00114] 25. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 20, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 14 - 30 resíduos de aminoácidos ou um salfarmaceuticamenteaceitável do mes- mo;

[00115] 26. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 20 e 25, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que compreendequalquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00116] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00117] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00118] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00119] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00120] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00121] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00122] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00123] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), ou

[00124] um peptídeo que compreendeumasequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquersequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 10 - 11 e 19 - 24, mas que contém a alteração de re- síduo(s) de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de células T auxiliaresou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00125] 27. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 20 e 26, - 26, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que consisteemumasequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00126] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00127] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00128] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00129] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00130] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00131] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00132] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00133] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00134] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00135] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00136] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00137] 28. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 20 e 25 - 27, em que o composto representado pela fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (6):

[00138]

[00139] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00140] um composto representado pela fórmula (7):

[00141]

[00142] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00143] um composto representado pela fórmula (8):

[00144]

[00145] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, ou

[00146] um composto representado pela fórmula (9):

[00147]

[00148] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00149] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00150] 29. uma composição farmacêutica que compreende o com- posto ade acordo com qualquer um de 1 - 28 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável;

[00151] 30. a composição farmacêutica de acordo com 29, a qual é usada como uma vacina contra o câncer;

[00152] 31. uso do composto de acordo com qualquer um de 1 - 28 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para a produção de uma vacina contra o câncer;

[00153] 32. um método de tratamento ou prevenção de câncer compreendendo administração de uma quantidade terapêutica ou pro- filaticamente eficaz do composto de acordo com qualquer um de 1 - 28 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo a um paciente com câncer positivo para WT1 que precisa do mesmo; e

[00154] 33. um método de obtenção de dois diferentes epítopos restritos a moléculas do MHC da classe I ou um epítopo restrito a moléculas do MHC da classe I e um epítopo restrito a moléculas do MHC da classe II, compreendendo reação do composto de acordo com qualquer um de 1 - 28 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo com ERAP1;

2. Segunda Modalidade

[00155] 1. Um composto representado pela fórmula (1):

[00156] em que Xa e Ya são, cada um independentemente, uma ligação simples ou um grupo peptídico divalente que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos e um total do número de resíduos de amino- ácidos para Xa e do número de resíduos de aminoácidos para Ya é um número inteiro de 0 - 4,

[00157] o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos, um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se liga a Yanafórmula (1) e um grupocarbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se ligaa um grupohidroxilanafórmula (1),

[00158] R1é um átomo de hidrogênio, um gruporepresentado pela fórmula (2):

[00159] em que Xb e Ybsão, cada um independentemente, umaligação simplesou um grupopeptídico divalente que consisteem 1 - 4 resíduos de aminoácidos e um total do número de resíduos de amino- ácidos para Xb e do número de resíduos de aminoácidos para Ybé um número inteiro de 0 - 4,

[00160] o peptídeo antigênico de câncer B temumasequência diferentedaquela do peptídeo antigênico de câncer A in a sequência e é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos, um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer B se liga a Yb nafórmula (2) e um grupocarbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncer B se ligaa um grupohidroxilanafórmula (2) e

[00161] um grupotioéter nafórmula (2) se ligaa um grupotioéter nafórmula (1),

[00162] ou o peptídeo antigênico de câncer C,

[00163] em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I different from o pep- tídeo antigênico de câncer A in a sequência e que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ou um pep- tídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína e um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer C se liga a um grupotioéter nafórmula (1),

[00164] contanto que, quando R1é um átomo de hidrogênio, a sequência docompostorepresentado pela fórmula (1) não é a mesma que a sequência parcial de umaproteína WT1,

[00165] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00166] 2. o composto de acordo com 1, em que Xaé um grupo peptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos e Yaé umaligação simples ouXa e Yasão, cada um independentemente, um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido ouXaé umaligação simples e Yaé um grupopeptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos ouXaé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido e Yaé umaligação simples ouXaé umaligação simples e Yaé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido ouXa e Yasão, cada um, umaligação simples ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00167] 3. o composto de acordo com 1 ou 2, em que Xaé umali gação simples e Yaé umaligação simples, um resíduo de alanina, um resíduo de leucinaou um resíduo de metioninaou um salfarmaceuti- camenteaceitável domesmo;

[00168] 4. o composto de acordo com 1 ou 2, em que Xaé umali gação simples ou um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido e Yaé umaligação simples ou um salfarmaceuti- camenteaceitável domesmo;

[00169] 5. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 4, em que Xa e Ya são, cada um, uma ligação simples ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo;

[00170] 6. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 5, em que o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00171] 7. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 6, em que o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00172] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[00173] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[00174] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[00175] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[00176] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), ou

[00177] um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoáci- dos alterada, que é qualquer sequência de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7, mas contendo a alteração de resíduo (s) de aminoácidos e que tem uma atividade de induo de CTL, ou uma sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00178] 8. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 7, em que o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00179] um peptídeo que compreende uma sequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquer sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7, mas que contém a alteração de resí- duo(s) de aminoácidos e tendo uma atividade de indução de CTLs ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo:

[00180] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[00181] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[00182] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[00183] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[00184] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[00185] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),

[00186] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00187] 9. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, em que R1 é um átomo de hidrogênio ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00188] 10. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 9, em que o composto representado pela fórmula (1) é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00189] CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13),

[00190] CCMTWNQMNL (SEQ ID NO: 14),

[00191] CCYTWNQMNL (SEQ ID NO: 15),

[00192] CALLPAVPSL (SEQ ID NO: 16),

[00193] CSLGEQQYSV (SEQ ID NO: 17) e

[00194] CRVPGVAPTL (SEQ ID NO: 18),

[00195] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00196] 11. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, em que R1 é um grupo representado pela fórmula (2) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo;

[00197] 12. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11, em que Xb é um grupo peptídico divalente que consiste em 2 resíduos de aminoácidos e Yb é uma ligação simples ou Xb e Yb são, cada um independentemente, um grupo peptídico divalente que consiste em 1 resíduo de aminoácido ou Xb é uma ligação simples e Yb é um grupo peptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos ouXbé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoá- cido e Ybé umaligação simples ouXbé umaligação simples e Ybé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoáci- do ouXb e Ybsão, cada um, umaligação simples ou um salfarmaceu- ticamenteaceitável domesmo;

[00198] 13. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 12, em que Xb é uma ligação simples e Yb é uma ligação simples, um resíduo de alanina, um resíduo de leucina ou um resíduo de metionina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00199] 14. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 13, em que Xb é uma ligação simples ou um grupo peptídico divalente que consiste em 1 resíduo de aminoácido e Yb é uma ligação simples ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00200] 15. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 14, em que Xb e Yb são, cada um, uma ligação simples ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo;

[00201] 16. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 15, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00202] 17. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 16, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00203] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[00204] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[00205] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[00206] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[00207] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), ou

[00208] um peptídeo que compreendeumasequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquersequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7, mas que contém a alteração de resí- duo(s) de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de CTLs ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00209] 18. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 17, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo que con-sisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00210] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[00211] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[00212] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[00213] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[00214] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[00215] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),

[00216] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00217] 19. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 18, em que ocompostorepresentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (3):

[00218]

[00219] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00220] 20. o composto de acordo com 13, em que Yb é um resíduo de alanina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00221] 21. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 11 - 13 e 20, em que, quando o peptídeo antigênico de câncer B é um pep- tídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I contendo um resíduo de cisteína, o grupo tioéter no peptídeo antigênico de câncer B é ligado ao grupo tioéter na fórmula (16):

[00222] em que Xd e Ydsão, cada um independentemente, umaligação simplesou um grupopeptídico divalente que consisteem 1 - 4 resíduos de aminoácidos e um total do número de resíduos de amino- ácidos para Xd e do número de resíduos de aminoácidos para Ydé um número inteiro de 0 - 4,

[00223] o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos, um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer D se liga a Ydnafórmula (16) e um grupocarbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncerD se liga a um grupohidroxilanafórmula (16) outo ogrupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer E, which é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo umresíduo de cisteína ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00224] 22. o composto de acordo com 21, em que o peptídeo anti- gênico de câncer B é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00225] 23. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 22, em que o peptídeo antigênico de câncer B é um peptídeo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00226] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) e

[00227] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[00228] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00229] 24. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 23, em que Xdé um grupopeptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos e Ydé umaligação simples ouXd e Ydsão, cada um independentemente, um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido ouXdé umaligação simples e Ydé um grupopeptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos ouXdé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoá- cido e Ydé umaligação simples ouXdé umaligação simples e Ydé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoáci- do ouXd e Ydsão, cada um, umaligação simples ou um salfarmaceu- ticamenteaceitável domesmo;

[00230] 25. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 24, em que Xdé umaligação simples, Ydé umaligação simples, um resíduo de alanina, um resíduo de leucinaou um resíduo de metioninaou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00231] 26. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 24, em que Xdé umaligação simples ou um grupopeptídico divalente que consisteem one resíduo de aminoácido e Ydé umaligação simples ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00232] 27. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 26, em que Xd e Ydsão, cada um, umaligação simples ou um salfarmaceuti- camenteaceitável domesmo;

[00233] 28. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 27, em que o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 14 - 30 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00234] 29. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 28, em que o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00235] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00236] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00237] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00238] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00239] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00240] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00241] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00242] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00243] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00244] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) e

[00245] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),

[00246] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00247] 30. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 11 - 13 e 20 - 29, em que o composto representado pela fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (15):

[00248]

[00249] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00250] 31. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 23, em que o peptídeo antigênico de câncer E é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 14 - 30 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00251] 32. o composto de acordo com qualquer um de 21 - 23 e 31, em que o peptídeo antigênico de câncer E é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00252] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00253] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00254] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00255] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00256] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00257] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00258] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00259] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00260] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00261] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00262] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00263] 33. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, em que R1é o peptídeo antigênico de câncer C ou um salfarmaceutica- menteaceitável domesmo;

[00264] 34. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 33, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00265] 35. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 33 - 34, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos a seguir:

[00266] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3), ou

[00267] um peptídeo que compreende uma sequência de aminoáci- dos alterada, a qual é uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, mas que contém a alteração de resíduo(s) de aminoácidos e tendo uma atividade de indução de CTLs ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00268] 36. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 33 - 35, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00269] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) e

[00270] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[00271] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00272] 37. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 33 - 36, em que ocompostorepresentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (4):

[00273]

[00274] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto ou um composto representado pela fórmula (5):

[00275]

[00276] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00277] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00278] 38. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 33, em que, quando o peptídeo que consiste em 1 - 4 resíduos de amino- ácidos contendo um resíduo de cisteína é ainda ligado ao N-término do peptídeo antigênico de câncer C, o grupo tioéter do resíduo de cis- teína do peptídeo ligado ao N-término do peptídeo antigênico de câncer C é ligado ao grupo tioéter na fórmula (16):

[00279] em que Xd e Yd são, cada um independentemente, uma ligação simples ou um grupo peptídico divalente que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos e um total do número de resíduos de amino- ácidos para Xd e do número de resíduos de aminoácidos para Yd é um número inteiro de 0 - 4,

[00280] o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 30 resí- duos de aminoácidos, um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer D se liga a Ydnafórmula (16) e um grupocarbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncer D se liga a um grupohidroxilanafórmula (16) outo ogrupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer E, which é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00281] 39. o composto de acordo com 38, em que o peptídeo que consisteem 1 - 4 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ligadoaoN-término do peptídeo antigênico de câncer C é um dipeptídeo que consisteem CA ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00282] 40. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 39, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 15 resíduos de aminoácidos ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00283] 41. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 40, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00284] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) e

[00285] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[00286] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00287] 42. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 41, em que Xdé um grupopeptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos e Ydé umaligação simples ouXd e Ydsão, cada um in-dependentemente, um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido ouXdé umaligação simples e Ydé um grupopeptídico divalente que consisteem 2 resíduos de aminoácidos ouXd é um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoá- cido e Ydé umaligação simples ouXdé umaligação simples e Ydé um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoáci- do ouXd e Ydsão, cada um, umaligação simples ou um salfarmaceu- ticamenteaceitável domesmo;

[00288] 43. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 42, em que Xdé umaligação simples e Ydé umaligação simples, um resíduo de alanina, um resíduo de leucinaou um resíduo de metioninaou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00289] 44. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 42, em que Xdé umaligação simples ou um grupopeptídico divalente que consisteem 1 resíduo de aminoácido e Ydé umaligação simples ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00290] 45. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 44, em que Xd e Yd são, cada um, uma ligação simples ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo;

[00291] 46. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 45, em que o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 14 - 30 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00292] 47. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 46, em que o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00293] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00294] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00295] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00296] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00297] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00298] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00299] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00300] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00301] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00302] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) e

[00303] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244)

[00304] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00305] 48. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 47, em que ocompostorepresentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (14):

[00306] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00307] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00308] 49. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 41 e 44, em que o peptídeo antigênico de câncer E é um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00309] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00310] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00311] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00312] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00313] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00314] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00315] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00316] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00317] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00318] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24)

[00319] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00320] 50. o composto de acordo com qualquer um de 38 - 41 e 49, em que o composto representado pela fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (12):

[00321] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00322] 51. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8 e 33, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 14 - 30 resíduos de aminoácidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00323] 52. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 33 e 51, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos selecionada das se-quências de aminoácidos a seguir:

[00324] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00325] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00326] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00327] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00328] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00329] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00330] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00331] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), ou

[00332] um peptídeo que compreende uma sequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquer sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 10 - 11 e 19 - 24, mas que contém a alteração de re- síduo(s) de aminoácidos e tendo uma atividade de indução de células T auxiliares ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00333] 53. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 33 e 51 - 52, em que o peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo que consisteemumasequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00334] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00335] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00336] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00337] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00338] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00339] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00340] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00341] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00342] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00343] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00344] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00345] 54. o composto de acordo com qualquer um de 1 - 8, 33 e 51 - 53, em que o composto representado pela fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (6):

[00346]

[00347] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00348] um compostorepresentado pela fórmula (7):

[00349]

[00350] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00351] um compostorepresentado pela fórmula (8):

[00352]

[00353] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto, ou um compostorepresentado pela fórmula (9):

[00354]

[00355] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00356] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00357] 55. uma forma alterada de um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos;

[00358] 56. a forma alterada de acordo com 55, a qual é a sequên cia deaminoácidos a seguir:

[00359] CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) ou

[00360] WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243);

[00361] 57. um compostorepresentado pela fórmula (10):

[00362]

[00363] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00364] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00365] 58. umacomposição compreendendo um compostoseleci onado do grupo que consisteem um compostorepresentado pela fórmula (3):

[00366]

[00367] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00368] um compostorepresentado pela fórmula (4):

[00369]

[00370] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00371] e um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00372]

[00373] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto, e

[00374] um peptídeo que consisteemumasequência de aminoáci- dos selecionada do grupo que consistenassequências de aminoáci- dos a seguir:

[00375] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00376] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00377] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00378] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),

[00379] CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e

[00380] WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243);

[00381] 59. umacomposição farmacêutica que compreende o com postoade acordo com qualquer um de 1 - 54 e 57 ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo ou a composição de acordo com 58 e um veículo farmaceuticamente aceitável;

[00382] 60. a composição farmacêutica de acordo com 59, a qual é usada como uma vacina contra o câncer;

[00383] 61. uso do composto de acordo com qualquer um de 1 - 54 e 57 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou a composição de acordo com 58 para a produção de uma vacina contra o câncer;

[00384] 62. um método de tratamento ou prevenção de câncer, compreendendo administração de uma quantidade terapêutica ou pro- filaticamente eficaz do composto de acordo com qualquer um de 1 - 54 e 57 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou a composição de acordo com 58 a um paciente com câncer positivo para WT1 que precisa do mesmo;

[00385] 63. um método de obtenção de dois diferentes epítopos restritos a moléculas do MHC da classe I ou um epítopo restrito a mo-léculas do MHC da classe I e um epítopo restrito a moléculas do MHC da classe II, compreendendo reação do composto de acordo com qualquer um de 1 - 54 e 57 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo com ERAP1; e

[00386] 64. um método de síntese um composto, compreendendo as etapas a seguir:

[00387] (1) umaetapa de síntese usando Fmoc-C(Mmt)A-SBn e o peptídeo antigênico de câncer C, um peptídeo em que um grupocarbonila do aminoácido C-terminal de C(Mmt)A e o grupo amino N- terminal do peptídeo antigênico de câncer C estão ligados, em que o peptídeo antigênico C é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ou um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoá- cidoscontendo um resíduo de cisteína,

[00388] (2) umaetapa de síntese usando o peptídeo obtidonaeta pasupracitada (1) e o peptídeo antigênico de câncer A em que um resíduo de cisteína protegidopelogrupoNpysé ligadoaoN-término, um peptídeo em que um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer C no peptídeo obtidonaetapasupracitada (1) e um grupotioéter do resíduo de cisteína ligadoaoN-término do peptí- deo antigênico de câncer A estão ligados, em que o peptídeo antigêni- co de câncer A é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos e

[00389] (3) umaetapa de síntese usando o peptídeo obtidonaeta pasupracitada (2) e o peptídeo antigênico de câncer D contendo um resíduo de cisteína protegidopor um grupo Spy, um peptídeo em que um grupotioéter do resíduo de cisteína ligadoaoN-término do peptí- deo antigênico de câncer A no peptídeo obtidonaetapasupracitada (2) e um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer D estão ligados, em que o peptídeo antigênico de câncer D é um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ligadoaoN-término ou um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoá- cidoscontendo um resíduo de cisteína,

3. Terceira Modalidade

[00390] 1. Um composto representado pela fórmula (1):

[00391] em que Xa e Ya são, cada um, uma ligação simples,

[00392] o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo que con siste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00393] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[00394] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),

[00395] SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[00396] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),

[00397] um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se liga a Ya na fórmula (1) e um grupo carbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se liga a um grupo hidroxila na fórmula (1),

[00398] R1 é a o peptídeo antigênico de câncer C,

[00399] o peptídeo antigênico de câncer C tem uma sequência diferente daquela do peptídeo antigênico de câncer A, o qual é um peptí- deo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00400] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) e

[00401] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) e um grupo tioéter do resí duo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer C é ligado ao grupo tioéter na fórmula (1),

[00402] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[00403] 2. o composto de acordo com 1, em que o composto repre- sentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (4):

[00404]

[00405] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto, ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00406] 3. o composto de acordo com 1, em que ocompostorepre sentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00407]

[00408] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00409] ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo;

[00410] 4. umacomposição farmacêutica que compreende o com postoade acordo com qualquer um de 1 - 3 ou um salfarmaceutica- menteaceitável domesmo e um veículo farmaceuticamenteaceitável;

[00411] 5. a composição farmacêutica de acordo com 4, compreen dendopelomenos um peptídeo que consisteemumasequência de aminoácidos selecionada do grupo que consistenassequências de aminoácidos a seguir:

[00412] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00413] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00414] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00415] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),

[00416] CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e

[00417] WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243); e

[00418] 6. umacomposição compreendendo um compostoselecio nado do grupo que consisteem um compostorepresentado pela fórmula (4):

[00419]

[00420] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto,

[00421] e um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00422]

[00423] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, e

[00424] pelo menos um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos a seguir:

[00425] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00426] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00427] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00428] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),

[00429] CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e

[00430] WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).

EFEITO DA INVENÇÃO

[00431] De acordo com a presente invenção, o composto supracitado representado pela fórmula (1) útil como um agente imunoterapêuti- co para o câncer (daqui em diante algumas vezes dito como o composto da presente invenção) pode ser fornecido. De acordo com o composto da presente invenção, podem ser fornecidas vacinas contra o câncer e agentes imunoterapêuticos para o câncer que induzem eficientemente a CTLs in vivo e in vitro. Para ser específico, de acordo com o composto da presente invenção, agora é possível produzir dois peptídeos WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I tendo diferentes sequências ou dois epítopos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I tendo sequências diferentes, um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I e um peptídeo de WT1 I e um peptídeo de WT1 I restrito a moléculas do MHC de classe II, um epíto- po de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I e um epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II, dois peptídeos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I e restrito a moléculas do MHC de classe II tendosequências diferentesoudoisepítopos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I e epítopos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe II tendodiferentessequências in vivo e in vitro e induzireficientemente a CTLs.

[00432] Quandoaossubtipos de HLA de doispeptídeos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I tendoumasequência diferente, o composto da presenteinvenção (conjugado), obtidopormeio de combinação do peptídeo de tipo A02 (A-0201, A0206 e assimpordiante) e do peptídeo de tipo A24 (A-2402 e assimpordiante) é particularmentepreferível. EmEuropeus e Americanos (Caucasiana), apopulação com subtipo HLA-A0201 ousubtipo HLA-A0206 é a maior e cerca de 47%, então, o subtipo HLA-A2402 é de cerca de 13% e o total destessubtiposocupacerca de 56%, excluindoduplicatas (istoé, duplicar o cálculo de sereshumanos que têm ambos ossubtipos) (Human Immunol 62: 1009; 2001). EmJaponeses e assimpordiante, a população de HLA-A2402 é a maior e cerca de 60%, então, HLA- A0201 ou HLA-A0206 é de cerca de 39% e o total destessubtiposocupacerca de 81%, excluindo as duplicatas (istoé, duplicar o cálculo de sereshumanos que têm ambos ossubtipos) (www.bmdc.irc.or.jp/GF-A.htm). Portanto, as vantagens do composto da presenteinvenção são, especificamente, umapopulação maior que é abrangidapor um único composto da presenteinvenção e seleção dosubtipo HLA dos pacientes antes de administração nem sempre é essencial e assimpordiante. Em vista de tais vantagens do composto da presenteinvenção, um compostorepresentado pela fórmula (3), fórmula (4) oufórmula (5) é preferível e um compostorepresentado pela fórmula (5) é maispreferível.

[00433] Além disso, de acordo com o composto da presenteinvenção, um ingredienteativo de umavacina contra o câncer de propriedadesfísico-químicas e estabilidadesuperiores e facilmenteproduzida e facilmentecontroladapode ser fornecido. Como um resultado, a formulação de umavacina contra o câncer foifacilitada.

[00434] Especificamente, exemplos de propriedadesfísico-químicas incluemsolubilidade, viscosidade de solução, facilidade de purificação resultante da mesma, fácil manipulação após liofilização, facilidade de purificação resultante da mesma e assimpordiante. Aestabilidadeincluiestabilidadeapós substituição de sal, higroscopicidade, estabilidadetérmica, estabilidadeapós formação da emulsão e assimpordi-ante. Aatividadefarmacológica incluieficácia comovacina contra o câncer, diferença causadapeloIngredienteFarmacêutico Ativo (Active Pharmaceutical Ingredient - API), interação com o aditivo no preparo e assimpordiante. Destes, a diferença causadapelo API é a diferença comoumavacina contra o câncer emvirtude do API. Especificamente, emdois APIs tendosolubilidadesmuitodiferentes, o API com menorsolubilidadeestá propenso a precipitar e espera-se que um tratamento de esterilização porfiltração com um filtro de membrana, o qual é um requisitoessencial para produtosfarmacêuticos, não possa ser reali-zado.Mesmo se um tratamento de esterilização porfiltração de um API com baixasolubilidaderaramentesejapossível, considera-se que a quantidade de API contido no filtradodiminuiacentuadamente e a capacidade de indução de CTLs essencial para umavacina contra o câncer diminuiacentuadamente. Portanto, um demérito de eficiência de produção de API acentuadamentereduzida com baixasolubilidadeé facilmenteprevisível.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00435] A Figura 1 é uma Figura que mostra os resultados de ensaio do Exemplo Experimental 1 quanto à variação dependente do tempo de corte de aminoácidos N-terminal por ERAP1 de cada peptí- deo de SEQ ID NOs: 13, 16, 17 e 18 sintetizado nos Exemplos 2 - 5.

[00436] A Figura 2 é uma Figura que mostra os resultados de en- saio do Exemplo Experimental 2 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando camun-dongostransgênicos para HLA-A0201.

[00437] A Figura 3 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 2 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A2402.

[00438] A Figura 4 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 4 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (3) sintetizado no Exemplo 6 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00439] A Figura 5 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 5 quantoà capacidade de um compostorepresentado pela fórmula (6) sintetizado no Exemplo 7 de induzir a células reativas com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 24 in vivo por um ensaio de ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgêni- cos para HLA-A0201 no estadopulsadoounão pulsado com o peptí- deo de SEQ ID NO: 24.

[00440] A Figura 6 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 5 quantoà capacidade de um compostorepresentado pela fórmula (6) sintetizado no Exemplo 7 de induzir a células reativas com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 24 in vivo por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicospara HLA-A0201 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 24.

[00441] A Figura 7 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 6 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (8) sintetizado no Exemplo 9 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00442] A Figura 8 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 6 quantoà capacidade de um compostorepresentado pela fórmula (8) sintetizado no Exemplo 9 de induzir a células reativas com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 22 in vivo por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 22.

[00443] A Figura 9 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 8 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (7) sintetizado no Exemplo 8 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00444] A Figura 10 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 8 quantoà capacidade de um compostorepresentado pela fórmula (7) sintetizado no Exemplo 8 de induzir a células reativas com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 23 in vivo por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 23.

[00445] A Figura 11 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 9 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (9) sintetizado no Exemplo 10 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 5 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00446] A Figura 12 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 9 quantoà capacidade de um compostorepresentado pela fórmula (9) sintetizado no Exemplo 10 de induzir a células reativas com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 24 in vivo por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 no estado pulsado ou não pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 24.

[00447] A Figura 13 é uma Figura que mostra os resultados de ensaio do Exemplo Comparativo 1 quanto à capacidade de indução de CTLs in vivo de peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 238 e 239 sintetizados nos Exemplos de Referência 8 e 9 no estado pulsado ou não pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A0201.

[00448] A Figura 14 é uma Figura que mostra os resultados de ensaio do Exemplo Comparativo 1 quanto à capacidade de indução de CTLs in vivo de peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 238 e 239 sintetizados nos Exemplos de Referência 8 e 9 no estado pulsado ou não pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 4 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A2402.

[00449] A Figura 15 é uma Figura que mostra os resultados de ensaio do Exemplo Comparativo 2 quanto à capacidade de indução de CTLs in vivo de peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 240 e 241 sintetizados nos Exemplos de Referência 10 e 11 no estado pulsado ou não pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELIS- POT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A0201.

[00450] A Figura 16 é uma Figura que mostra os resultados de ensaio do Exemplo Comparativo 2 quanto à capacidade de indução de CTLs in vivo de peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 240 e 241 sintetizados nos Exemplos de Referência 10 e 11 no estado pulsado ou não pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 4 por um ensaio ELIS- POT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A2402.

[00451] A Figura 17 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 11 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (10) sintetizado no Exemplo 13 no estadopulsadoounão pulsado com o peptí- deo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00452] A Figura 18 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemploComparativo 3 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (11) sintetizado no Exemplo de Referência 12 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongotransgênico HLA-A0201.

[00453] A Figura 19 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 12 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (12) sintetizado no Exemplo 14 no estadopulsadoounão pulsado com o peptí- deo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00454] A Figura 20 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 12 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (12) sintetizado no Exemplo 14 no estadopulsadoounão pulsado com o peptí- deo de SEQ ID NO: 4 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00455] A Figura 21 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 13quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (14) sintetizado no Exemplo 15 no estadopulsadoounão pulsado com o peptí- deo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando ca- mundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00456] A Figura 22 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 13 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de um compostorepresentado pela fórmula (14) sintetizado no Exemplo 15 no estadopulsadoounão pulsado com o peptí- deo de SEQ ID NO: 4 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usando ca-mundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00457] A Figura 23 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 14quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de umavacinaemcoquetel de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 22 sintetizado no Exemplo de Referência 1 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA- A0201.

[00458] A Figura 24 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 15 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de umavacinaemcoquetel de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 244 sintetizado no Exemplo de Referência 13 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00459] A Figura 25 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 16 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de umavacinaemcoquetel de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 24 sintetizado no Exemplo de Referência 2 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA- A0201.

[00460] A Figura 26 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 17 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de umavacinaemcoquetel de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 242 sintetizado no Exemplo 11 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELIS- POT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A0201.

[00461] A Figura 27 é umaFigura que mostraosresultados de en-saiodoExemplo Experimental 18 quantoà capacidade de indução de CTLs in vivo de umavacinaemcoquetel de um compostorepresentado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 243 sintetizado no Exemplo 11 no estadopulsadoounão pulsado com o peptídeo de SEQ ID NO: 2 por um ensaio ELIS- POT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A0201.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES

[00462] A modalidade da presente invenção é explicada em detalhes a seguir.

[00463] O "resíduo aminoácido" na presente invenção significa uma região que corresponde a uma unidade de aminoácido que constitui um peptídeo ou proteína em uma molécula de proteína ou peptídeo. Exemplos do "resíduo de aminoácido" incluem um µ-resíduo natural ou não-natural, um e-resíduo de aminoácido, um y-resíduo de aminoácido ou ô-resíduo de aminoácido. Exemplos específicos dos mesmos incluem um a-resíduo de aminoácido natural, um resíduo de ornitina, resíduo de homo-serina, resíduo de homocisteína, ß-alanina, ácido Y- aminobutanoico ou ácido ô-aminopentanoico e assim por diante. Quando o "resíduo de aminoácido" pode ser uma substância optica- mente ativa, ele pode ser qualquer um de uma forma L e uma forma D e uma forma L é preferível.

[00464] Quando o "resíduo de aminoácido", napresenteinvenção é mostradoabreviado, as abreviaturas a seguirsão usadas.

[00465] Ala ou A: resíduo de alanina

[00466] Arg ou R: resíduo de arginina

[00467] Asnou N: resíduo de asparagina

[00468] Asp ou D: resíduo de ácido aspártico

[00469] Cysou C: resíduo de cisteína

[00470] Gln ou Q: resíduo de glutamina

[00471] Glu ou E: resíduo de ácido glutâmico

[00472] Glyou G: resíduo de glicina

[00473] His ou H: resíduo de histidina

[00474] Ile ou I: resíduo de isoleucina

[00475] Leu ou L: resíduo de leucina

[00476] Lys ou K: resíduo de lisina

[00477] Met ou M: resíduo de metionina

[00478] Pheou F: resíduo de fenilalanina

[00479] Pro ou P: resíduo de prolina

[00480] Ser ou S: resíduo de serina

[00481] Throu T: resíduo de treonina

[00482] Trpou W: resíduo de triptofano

[00483] Tyr ou Y: resíduo de tirosina

[00484] Val ou V: resíduo de valina

[00485] Abu: resíduo de ácido 2-aminobutírico (também pode ser designado por resíduo de ácido a-aminobutírico)

[00486] Orn: resíduo de ornitina

[00487] Cit: resíduo de citrulina

[00488] A sequência de aminoácidos do "peptídeo" na presente invenção é descrita de acordo com o método convencional, em que o resíduo de aminoácido do aminoácido N-terminal está posicionado no lado esquerdo e o resíduo de aminoácido do aminoácido C-terminal está posicionado no ladodireito. No "peptídeo", a menos que particu-larmenteindicado, o grupo amino do resíduo de aminoácido do amino- ácido N-terminal está ligadoaoátomo de hidrogênio e o grupocarbonila do resíduo de aminoácido do aminoácido C-terminal está ligadoaogrupohidroxila. O grupodivalente do peptídeo significa um grupo de ligação através do grupo amino do resíduo de aminoácido do aminoá- cido N-terminal e do grupocarbonila do resíduo de aminoácido do aminoácido C-terminal.

[00489] No composto da presenteinvenção, porexemplo, noscom-postosrepresentadospelasfórmulas (3) - (9) e emrelação aopeptí- deo, o qual é umaestruturaparcial do mesmo, a menos que particu-larmenteindicado, o grupo amino do resíduo de aminoácido do amino- ácido N-terminal está ligadoaoátomo de hidrogênio e o grupocarbonila do resíduo de aminoácido do aminoácido C-terminal está ligadoaogrupohidroxila.

[00490] "Xa" e "Ya" napresenteinvenção significam, independente mente,umaligação simples ou um grupodivalente de peptídeos con-sisteem1 - 4 resíduos de aminoácidos. A soma donúmero de resíduos de aminoácidos de Xa e aquele de Yaé um número inteiro de 0 - 4. Por exemplo, um número inteiro da dita soma sendo 0 significa que Xa e Yasão, cada um, umaligação simples. Quando a soma é um númerointeiro de 4, exemplos dos mesmosincluemXa e Yasendoinde-pendentementegruposdivalentes de peptídeos que consistemem 2 resíduos de aminoácidos, Xasendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 3 resíduos de aminoácidos e Yasendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem um resíduo de aminoácido, Xasendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 4 resíduos de aminoácido e Yasendoumaligação simples e assimpordiante.

[00491] O número inteiro da dita soma é, de preferência 0 - 2, mais preferivelmente 0 - 1, maispreferivelmente 0. Istoé, Xa e Yasão, maispreferivelmente, ligações simples.

[00492] Quando a soma é um número inteiro de 2, exemplos dos mesmosincluemXasendo um grupodivalente de peptídeos que con-sistemem 2 resíduos de aminoácidos e Yasendoumaligação simples, Xa e Yasendoindependentementegruposdivalentes de peptídeos que consistemem 1 resíduo de aminoácido ouXasendoumaligação simples e Yasendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 2 resíduos de aminoácidos.

[00493] Quando a soma é um número inteiro de 1, exemplos dos mesmosincluemXasendo um grupodivalente de peptídeos que con-sistemem 1 resíduo de aminoácido e Yasendoumaligação simples e Xasendoumaligação simples e Yasendo um grupodivalente de pep- tídeos que consistemem 1 resíduo de aminoácido. Destes, é preferidoXasendoumaligação simples e Yasendo um resíduo de alanina, um resíduo de leucinaou um resíduo demetionina.

[00494] O "peptídeo antigênico de câncer A" napresenteinvenção é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos. No peptídeo antigênico de câncer de A nafórmula (1), o grupo amino do aminoácido N- terminal está ligado a Yanafórmula (1) e o grupocarbonila do aminoá- cido C-terminal está ligadoaogrupohidroxilanafórmula (1).

[00495] "Restrito a moléculas do MHC de classe I" napresenteinvenção significa a propriedade de induzir a CTLs pormeio de ligação a umamolécula do MHC classe I, a qual é a classe I do principal complexo de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex - MHC).

[00496] O MHC emsereshumanosé denominadoantígeno de tipoleucócito humano (Human Leukocyte Antigen - HLA). O HLA que corresponde a moléculas de classe I do MHC é classificadoemsubtipos de HLA-A, B, Q, F e G e assimpordiante. Exemplospreferidos de "restrito a moléculas do MHC de classe I" incluemrestritoao HLA-A, restritoao HLA-B e restritoao HLA-Cw.

[00497] Polimorfismo (alelo) de cadasubtipo de HLA é conhecido. Exemplos do polimorfismo de HLA-A incluemnão menos de 27 tipos, tais como HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A24 e assimpordiante, exem-plosdopolimorfismo de HLA-B incluemnão menos de 59 tipos, tais como HLA-B7 , HLA-B40, HLA-B4403 e assimpordiante e exemplos do polimorfismo de HLA-Cwincluemnão menos de 10 tipos, tais como HLA-Cw0301, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 e assimpordiante. Dentreestespolimorfismos, HLA-A0201 e HLA-A24 são preferíveis.

[00498] O "peptídeo de WT1 I" napresenteinvenção é um peptídeo parcial que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contínuos nasequência de aminoácidos de WT1 humanodescritoem SEQ ID NO: 1.

[00499] Portanto, o " peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" napresenteinvenção é um peptídeo que se ligaa um an- tígeno do MHC de classe I in vitro e/ouin vivo e é apresentadocomo um complexo e induz a CTLs como um resultado de reconhecimento do complexoporcélulas T precursoras. O número de resíduos de ami- noácidos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" é 7-30, de preferência 7-15, maispreferivelmente 8-12, aindamaispreferivelmente 8 - 11, maispreferivelmente 8 ou 9.

[00500] O "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" que consisteem 7 - 12, de preferência 9 resíduos de aminoácidos, também é denominado de "um epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I". O "epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" napresenteinvenção significa um peptídeo, per se, que se ligaa um antígeno do MHC de classe I e é apresentadocomo um complexo. Istoé, o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" produz um "epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" in vitro e/ouin vivopormeio de decomposição intracelular do composto da presenteinvenção porproteossoma e/ou protease, talcomoRedutase de TiolLisossômica indutível porInterferom-Gama (GILT, GLT) e similares(proteólise, clivagemredutiva de ligação de dissulfureto) e/ouclivagem no número de resíduos ideal (também de-nominadacompensação) pela aminopeptidase 1 de retículo endo- plasmático (ERAP1, ER-aminopeptidase 1). Nesta produção, um processo de produção em que o aminoácido C-terminal do "epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" resultaprimeiro de degradação peloproteassoma e/ou protease, após o que o ácido N- amino terminal do "epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" resulta de corte (clivagem) por ERAP1 é consideradoprincipalmente. Nesta produção, no entanto, um processodiferente do presenteprocesso de produção também é possível. No momento, ERAP1 é também dita como ERAAP (aminopeptidase ER associadaà apresentação de antígeno) e usadacomosendotambém denominada A- LAP, PILS-AP ou ARTS-1.

[00501] Portanto, o "peptídeo de WT1 restrito a moléculasdo MHC de classe I" é, de preferência, um peptídeo que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos produzidomedianteadição de 1 - 23 resíduos de aminoácidos aogrupocarbonila do aminoácido C-terminal do "epí- topo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" que consisteem 7 - 12 resíduos de aminoácidos.

[00502] Exemplos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" incluemospeptídeos descritosnasTabelas 1 - 44. Emcadatabela, a "posição" significaumaposição nasequência de aminoácidos de WT1 humanodescritaem SEQ ID NO: 1. Tabela 1

[00503] Exemplospreferidos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" incluem um peptídeo que compreendequalquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00504] RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),

[00505] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),

[00506] ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5), SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e

[00507] RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), e

[00508] um peptídeo que compreendeumasequência de aminoá- cidosalterada, a qual é qualquersequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7, mas contendoaalteração de re- síduo(s) de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de CTLs, maispreferivelmente um peptídeo de qualqueruma das sequências de aminoácidos selecionadas de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6 e 7.

[00509] O "peptídeo que compreendeumasequência de aminoá- cidos" napresenteinvenção significa, conforme habitual, um peptídeo em que um novo aminoácido é adicionadoaoaminoácido N-terminal e/ouaoaminoácido C-terminal da sequência de aminoácidos. Quando o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" no "peptídeo antigênico de câncer A" e "peptídeo antigênico de câncer B" é adicionado, um peptídeo com adição aolado C-terminal é preferível. Quando o "epítopo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" é adicionado, adição aolado C-terminal é preferível.

[00510] O "peptídeo que compreendeumasequência de aminoá- cidosalterada que contém aalteração de resíduo(s) de aminoácidos nasequência de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de CTLs" napresenteinvenção é também denominado um "peptídeo assassinoalterado". O peptídeo assassinoalteradosignifica um pep- tídeo que consisteemumasequência de aminoácidos em que 1 a 3 aminoácidos são eliminados, substituídos e/ouadicionados e se ligaao MHC de classe I para induzir a CTLs. A posição de substituição do aminoácido substituído inclui a 1a posição (N-terminal), a 2a posição, a 3a posição ou na 9a posição para um peptídeo que consiste em 9 resíduos de aminoácidos. O número de aminoácidos a serem adicionados (também incluindo inserção) é, de preferência, 1 ou 2, mais preferivelmente 1. Uma posição de adição preferível é o C-término. O número de aminoácidos a serem suprimidos é, de preferência, 1. Na alteração, o aminoácido a ser adicionado ou o aminoácido a ser substituído pode ser um outro aminoácido não natural que não os 20 tipos de aminoácidos codificados pelo gene.

[00511] Sabe-se que a sequência de aminoácidos de um peptídeo ligável ao antígeno HLA tem regularidade (motivo de ligação) para cada polimorfismo de subtipo de HLA. Por exemplo, como um motivo de ligação de HLA-A24, um peptídeo que consiste em 8 - 11 resíduos de aminoácidos, em que o aminoácido na 2a posição é Tyr, Phe, Met ou Trp e o aminoácido C-terminal é Phe, Leu, Ile, Trp ou Met, é conhecido (J. Immunol., 152, p3913, 1994, J. Immunol., 155, p4307, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995). Portanto, por exemplo, no caso de um peptídeo que consiste em 9 resíduos de aminoácidos, a 2a posição pode ser substituída por Tyr, Phe, Met ou Trp e/ou a 9a posição pode ser substituída por Phe, Leu, Ile, Trp ou Met e um pep- tídeo tendo tais substituições é preferível como um peptídeo assassino alterado. Similarmente, um peptídeo que consiste em 8 - 11 resíduos de aminoácidos, em que o aminoácido na 2a posição é Leu ou Met e o aminoácido C-terminal é Val ou Leu, é conhecido como um motivo de ligação de HLA-A0201. Portanto, por exemplo, no caso de um peptídeo que consiste em 9 resíduos de aminoácidos, a 2a posição pode ser substituída por Leu ou Met e/ou a 9a posição pode ser substituída por Val ou Leu e um peptídeo tendo tais substituições é preferível como um peptídeo assassinoalterado.

[00512] Exemplos do peptídeo assassinoalteradoincluemos pep- tídeos a seguir.

[00513] RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 223) (vide documento WO03/106682),

[00514] FMFPNAPYL (SEQ ID NO: 224),

[00515] RLFPNAPYL (SEQ ID NO: 225),

[00516] RMMPNAPYL (SEQ ID NO: 226),

[00517] RMFPNAPYV (SEQ ID NO: 227) e

[00518] YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 228) (vide WO2009/072610), osquaissão peptídeos assassinosalterados de RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2);

[00519] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) (vide documento WO02/79253);

[00520] Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 229)

[00521] (em que Xaaé Ser ou Ala) e

[00522] Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 230)

[00523] (em que Xaaé Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, PheouAsn) (vide documento WO2004/026897), osquaissão peptídeos assassinosalterados de CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3);

[00524] AYLPAVPSL (SEQ ID NO: 231) (vide documento WO2003/106682), o qual é um peptídeo assassinoalterado de ALL- PAVPSL (SEQ ID NO: 5);

[00525] FLGEQQYSV (SEQ ID NO: 232),

[00526] SMGEQQYSV (SEQ ID NO: 233) e

[00527] SLMEQQYSV (SEQ ID NO: 234) (WO2009/072610), osquaissão peptídeos assassinosalterados de SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6); e

[00528] RYPGVAPTL (SEQ ID NO: 235) (documento WO2003/106682), o qual é um peptídeoassassinoalterado de RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7).

[00529] "R1" napresenteinvenção é um átomo de hidrogênio, um gruporepresentado pela fórmula geral (2) supracitadaou o peptídeo antigênico de câncer C, de preferência um gruporepresentado pela fórmula geral (2) oupeptídeo antigênico de câncer C.

[00530] Quando R1é um átomo de hidrogênio, o composto da fór- mula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (1-1):

[00531] em que Xa, Ya e o peptídeo antigênico de câncer A são conformedefinido no acima para a fórmula (1) e Cysé um resíduo de cisteína, istoé, um peptídeo.

[00532] O composto da fórmula (1), em que R1é um átomo de hidrogênio, istoé, um peptídeo representado pela fórmula (1-1), temumasequência diferente de umasequência parcial de proteína WT1. o requisito da fórmula (1), "temumasequência diferente de umasequência parcial de proteína WT1" significa que um peptídeo representado pela fórmula (1-1) não é um peptídeo parcial que consisteem 8 - 35 resíduos de aminoácidos contínuos nasequência de aminoácidos de WT1 humanadescritaem SEQ ID NO: 1.

[00533] Istoé, o composto da fórmula (1), em que R1é um átomo de hidrogênio, não é um peptídeo parcial que consisteem 8 - 35 resíduos de aminoácidos contínuos nasequência de aminoácidos de WT1 humanadescritaem SEQ ID NO: 1. Uma explicação específica é fornecidatomando um casoquando o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo WT1138-146 como um exemplo. O peptídeo WT1138-146 é um peptídeo parcial que consisteem 9 resíduos de ami- noácidos contínuos na 138a posição - 146a posição da sequência de aminoácidos de WT1 humana descrita em SEQ ID NO: 1 e tem uma sequência de aminoácidos de LESQPAIRN (SEQ ID NO: 78). Em SEQ ID NO: 1, a 137a posição que continua a partir do lado N- terminal do peptídeo WT1138-146 é C. Portanto, o peptídeo WT1137-146 (CLESQPAIRN) (SEQ ID NO: 236) corresponde a um peptídeo parcial que consiste em 10 resíduos de aminoácidos contínuos da sequência de aminoácidos de WT1 humana descrita em SEQ ID NO: 1. Por outro lado, com base no requisito da presente invenção, "o composto da fórmula (1), em que R1 é um átomo de hidrogênio, não é um peptídeo parcial que consiste em 8 - 35 resíduos de aminoácidos contínuos na sequência de aminoácidos de WT1 humana descrita em SEQ ID NO: 1", no composto da fórmula (1) em que R1 é um átomo de hidrogênio, quando o peptídeo antigênico de câncer A é o peptí- deo WT1138-146 (LESQPAIRN) (SEQ ID NO: 78), o peptídeo WT1137-146 (CLESQPAIRN) (SEQ ID NO: 236) é excluído do composto da presente invenção e, portanto, Xa e Ya não são simultaneamente uma ligação simples.

[00534] Como um composto da fórmula (1) em que R1 é um átomo de hidrogênio, um peptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00535] CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13), CCMTWNQMNL (SEQ ID NO: 14),

[00536] CCYTWNQMNL (SEQ ID NO: 15),

[00537] CALLPAVPSL (SEQ ID NO: 16),

[00538] CSLGEQQYSV (SEQ ID NO: 17) e

[00539] CRVPGVAPTL (SEQ ID NO: 18)

[00540] é preferível.

[00541] Quando "R1" é um grupo representado pela fórmula (2) supracitada, um composto da fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (1-2):

[00542] em que Xa, Ya e o peptídeo antigênico de câncer A são conforme definido no acima para a fórmula (1) e Xb, Yb e o peptídeo anti- gênico de câncer B são conforme definido no acima para a fórmula (2).

[00543] "Xb" e "Yb" na presente invenção significam, independentemente, uma ligação simples ou um grupo divalente de peptídeos que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos. A soma do número de resíduos de aminoácidos de Xb e aquele de Yb é um número inteiro de 0 - 4. Por exemplo, um número inteiro da dita soma sendo 0 significa que Xb e Yb são, cada um, uma ligação simples. Quando a soma é um número inteiro de 4, exemplos do mesmo incluem Xb e Yb sendo independentemente grupos divalentes de peptídeos que consistem em 2 resíduos de aminoácidos, Xb sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 3 resíduos de aminoácidos e Yb sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 1 resíduo de aminoácido, Xb sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 4 resíduos de aminoácidos e Yb sendo uma ligação simples e assim por diante.

[00544] O número inteiro da dita soma é, de preferência, 0 - 2, mais preferivelmente 0 - 1, ainda mais preferivelmente 0. Isto é, Xb e Yb são, mais preferivelmente, ligações simples.

[00545] Quando a soma é um número inteiro de 2, exemplos do mesmo incluem Xb sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 2 resíduos de aminoácidos e Yb sendo uma ligação simples, Xb e Yb sendo independentemente grupos divalentes de peptídeos que consistem em 1 resíduo de aminoácido e Xb sendo uma ligação sim- ples e Ybsendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 2 resíduos de aminoácidos.

[00546] Quando a soma é um número inteiro de 1, exemplos do mesmoincluemXbsendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 1 resíduo de aminoácido e Ybsendoumaligação simples e Xbsendoumaligação simples e Ybsendo um grupodivalente de peptí- deos que consistemem 1 resíduo de aminoácido. Destes, preferidoé Xbsendoumaligação simples e Ybsendo um resíduo de alanina, resíduo de leucinasouresíduo de metionina.

[00547] O "peptídeo antigênico de câncer B" napresenteinvenção é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos. O "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" é conformedefinidoacima. No entanto, no compostorepresentado pela fórmula (1), o peptídeo anti- gênico de câncer A e o peptídeo antigênico de câncer B não são simultaneamente o mesmopeptídeo. Istoé, o peptídeo antigênico de câncer B é limitadopelorequisito, "diferente do peptídeo antigênico de câncer A".

[00548] Uma vez que o peptídeo antigênico de câncer A e o peptí- deo antigênico de câncer B não são simultaneamente o mesmopeptí- deo, o composto da fórmula (1), em que R1é um gruporepresentado pela fórmula (2) supracitada, não é um homodímero, mas um hetero- dímero, mesmoquandoXa e Xbsão osmesmos e Ya e Ybsão osmesmos. Homodímero significa um dímero em que osmesmosmo- nômeros peptídicos são dimerizados e heterodímero significa um dí- meroem que diferentesmonômeros peptídicos são dimerizados.

[00549] No peptídeo antigênico de câncer B, o grupo amino do ami- noácido N-terminal está ligado a Ybnafórmula (2) (istoé, também ligado a Ybnafórmula (1-2)) e o grupocarbonila do aminoácido C- terminal está ligadoaogrupohidroxilanafórmula (2).

[00550] Como um composto da fórmula (1) em que R1 é um gruporepresentado pela fórmula (2), isto é, um composto da fórmula (1-2), um compostorepresentado pela fórmula (3):

[00551]

[00552] é preferível.

[00553] Na presente invenção, além disso, quando o "peptídeo an- tigênico de câncer B" é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I contendo um resíduo de cisteína, o composto da fórmula (1) pode ser um composto em que o grupo tioéter no peptídeo antigênico de câncer B está ligado a um grupo tioéter na fórmula (16):

[00554] ou a um grupo tioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer E.

[00555] "Xd" e "Yd" na presente invenção significam, independente mente, uma ligação simples ou um grupo divalente de peptídeos que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos. A soma do número de re-síduos de aminoácidos de Xd e aquele de Yd é um número inteiro de 0 - 4. Por exemplo, um número inteiro da dita soma sendo 0 significa que Xd e Yd são, cada um, uma ligação simples. Quando a soma é um número inteiro de 4, exemplos do mesmo incluem Xd e Yd sendo independentemente grupos divalentes de peptídeos que consistem em 2 resíduos de aminoácidos, Xd sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 3 resíduos de aminoácidos e Yd sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 1 resíduo de aminoácido, Xd sendo um grupo divalente de peptídeos que consistem em 4 resíduos de aminoácidos e Ydsendoumaligação simples e assimpordiante.

[00556] O número inteiro da dita soma é, de preferência, 0 - 2, maispreferivelmente 0 - 1, aindamaispreferivelmente 0. Istoé, Xd e Ydsão, maispreferivelmente, ligações simples.

[00557] Quando a soma é um número inteiro de 2, exemplos do mesmoincluemXdsendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 2 resíduos de aminoácidos e Ybsendoumaligação simples, Xd e Ydsendoindependentementegruposdivalentes de peptídeos que consistemem 1 resíduo de aminoácido ouXdsendoumaligação simples e Ydsendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 2 resíduos de aminoácidos.

[00558] Quando a soma é um número inteiro de 1, exemplosdo mesmoincluemXdsendo um grupodivalente de peptídeos que consistemem 1 resíduo de aminoácido e Ydsendoumaligação simples e Xdsendoumaligação simples e Ydsendo um grupodivalente de peptí- deos que consistemem 1 resíduo de aminoácido. Destes, preferidoé Xdsendoumaligação simples e Ydsendo um resíduo de alanina, resíduo de leucinasouresíduo de metionina.

[00559] O "peptídeo antigênico de câncer D" napresenteinvenção é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos. Na fórmula (16), um grupo amino do aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer D se liga a Ydnafórmula (16) e um grupocarbonila do aminoácido C- terminal se ligaa um grupohidroxilanafórmula (16).

[00560] Na presenteinvenção, "restrito a moléculas do MHC de classe II" significa a propriedade de induzir a células T auxiliaresatravés de ligação a umamolécula do MHC de classe II e é conformedefinido para o "peptídeo antigênico de câncer C" citadoabaixo.

[00561] HLA que correspondeà molécula do MHC de classe II é classificadonossubtipos HLA-DR, DQ e DP e assimpordiante. Exemplospreferidos de "restrito a moléculas do MHC de classe II" in-cluemrestritoa HLA-DR, restrito a HLA-DQ e restrito a HLA-DP.

[00562] Portanto, o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II" napresenteinvenção é um peptídeo que se ligaa um an- tígeno do MHC de classe II in vitro e/ou in vivo e induz a células T auxiliares. O número dos resíduos de aminoácidos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II" é 7 - 30, de preferência 14 - 30.

[00563] Como o "peptídeo antigênico de câncer D", talcomo a sequência de aminoácidos citada no "o peptídeo antigênico de câncer C" citadoabaixo, um peptídeo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00564] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00565] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00566] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00567] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00568] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00569] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00570] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00571] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00572] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00573] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) e

[00574] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244).

[00575] No composto da fórmula (1), além disso, quando o "peptí- deo antigênico de câncer B" é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I contendo um resíduo de cisteína, como um compostoem que o grupotioéter no peptídeo antigênico de câncer B está ligadoa um grupotioéter nafórmula (16), de preferência, um compostorepresentado pela fórmula (15):

[00576]

[00577] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto, pode ser mencionado.

[00578] Na presenteinvenção, o "peptídeo antigênico de câncer E" é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína e é conformedefinido para o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II que consisteem 7 - 30 resíduos de ami- noácidos contendo um resíduo de cisteína" no "peptídeo antigênico de câncer C" mencionadoabaixo.

[00579] Como o "peptídeo antigênico de câncer E", talcomo a sequência de aminoácidos citada no "peptídeo antigênico de câncer C" citadoabaixo, um peptídeo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00580] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00581] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00582] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00583] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00584] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00585] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00586] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00587] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00588] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00589] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24)

[00590] pode ser mencionado.

[00591] Quando R1é o peptídeo antigênico de câncer C, o grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer C é ligadoaogrupotioéter nafórmula (1).

[00592] O peptídeo antigênico de câncer C é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína ou um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína.

[00593] No "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína" napresenteinvenção, a sequência de aminoácidos do peptídeo precisaconterapenaspelomenos um resíduo de cisteína. O número do resíduo de cisteínas que deveestarcontidoé, de preferência, 1 - 3, maispreferivelmente 1 - 2, aindamaispreferivelmente 1. O "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I" é conformedefinidoacima. Também, o composto da fórmula (1) em que R1 é "um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína" não é um homodímero, mas um heterodímero.

[00594] Exemplospreferidos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoá- cidoscontendo um resíduo de cisteína" incluempeptídeos descritosnasTabelas 45 - 52. EmcadaTabela, a "posição" significa a posição nasequência de aminoácidos de WT1 humanadescritaem SEQ ID NO: 1. Tabela 45

[00595] Exemplos mais preferidos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consiste em 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína" incluem um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos a seguir:

[00596] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3)

[00597] e um peptídeo que compreende uma sequência de aminoá- cidos alterada, a qual é uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, mas que contém a alteração de resíduo(s) de aminoácidos e tendo uma atividade de indução de CTLs. O dito "peptídeo contendo a sequência de aminoácidos" e "peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos alterada que contém a alteração de resíduo(s) de aminoácidos in uma sequência de aminoácidos e tendo uma atividade de indução de CTLs" são conforme definido acima. Ainda mais preferivelmente, um peptídeo que consiste em qualquer sequência de ami- noácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00598] CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) e

[00599] CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),

[00600] pode ser mencionado.

[00601] Como o composto da fórmula (1) em que R1é"um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína", um compostorepresentado pela fórmula (4):

[00602]

[00603] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto ou um composto representado pela fórmula (5):

[00604]

[00605] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é preferível. Destes, um composto representado pela fórmula (5) é mais preferível.

[00606] Na presente invenção, além disso, quando um peptídeo que consiste em 1 - 4 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína é ainda ligado ao N-término do "peptídeo antigênico de câncer C" a qual é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I, o composto da fórmula (1) pode ser um composto em que o grupo tioéter do resíduo de cisteína do peptídeo ligado ao N-término do peptídeo antigênico de câncer C está ligado a um grupo tioéter na fórmula (16):

[00607] ou a um grupo tioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer E.

[00608] "Xd", "Yd", "o peptídeo antigênico de câncer D" e "o peptí- deo antigênico de câncer E" na presente invenção são conforme defi- nido para "Xd", "Yd", "o peptídeo antigênico de câncer D" e "o peptídeo antigênico de câncer E" definidosacima.

[00609] Na presenteinvenção, o peptídeo que consisteem 1 - 4 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína, o qual é ligadoaoN-término do "peptídeo antigênico de câncer C" a qual é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I, é, de preferência, um dipeptídeo que consisteem CA.

[00610] No composto da fórmula (1), quando um peptídeo que consisteem 1 - 4 resíduosde aminoácidos contendo um resíduo de ciste- ína é aindaligadoaoN-término do "peptídeo antigênico de câncer C" a qual é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I, o compostoem que o grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo ligadoaoN-término do peptídeo antigênico de câncer C está ligado a um grupotioéter nafórmula (16) é, de preferência, um compostorepresentado pela fórmula (14):

[00611]

[00612] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto.

[00613] Alémdisso, no composto da fórmula (1), quando um peptí- deo que consisteem 1 - 4 resíduos de aminoácidoscontendo um resí- duo de cisteína é aindaligadoao N-término do "peptídeoantigênico de câncer C", o qual é um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I, o compostoem que o grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeoligadoao N-término do peptídeoantigênico de câncer C estáligado a um grupotioéter no "peptídeoantigênico de câncer E" é, de preferência, um compostorepresentado pela fórmula (12):

[00614]

[00615] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto

[00616] No "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína" napresenteinvenção, a sequência de aminoáci- dos do peptídeo precisaconterapenaspelomenos um resíduo de cis- teína. O número do resíduo de cisteínas que deveestarcontidoé, de preferência, 1 - 3, maispreferivelmente 1 - 2, aindamaispreferivelmente 1.

[00617] Na presenteinvenção, "restrito a moléculas do MHC de classe II" significa a propriedade de induzir a células T auxiliaresatravés de ligação a umamolécula do MHC de classe II.

[00618] HLA que correspondeà molécula do MHC de classe II é classificadonossubtipos HLA-DR, DQ e DP e assimpordiante. Exemplospreferidos de "restrito a moléculas do MHC de classe II" in-cluemrestritoa HLA-DR, restrito a HLA-DQ e restrito a HLA-DP.

[00619] Portanto, o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II" napresenteinvenção é um peptídeo que se ligaa um an- tígeno do MHC de classe II in vitro e/ouin vivo e induz a células T auxiliares. O número dos resíduos de aminoácidos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II" é7 - 30, de preferência 14 - 30.

[00620] Exemplos do "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína" incluemospeptídeos descritosnaTabela 53. EmcadaTabela, a "posição" significa a posição nasequência de aminoácidos de WT1 humanadescritaem SEQ ID NO: 1. Tabela 53

[00621] Como o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína", um peptídeo que compreendequalquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00622] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11) e

[00623] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10), ou

[00624] um peptídeo que compreendeumasequência de aminoáci- dos alterada, a qual é qualquersequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 10 - 11, mas que contém a alteração de resíduo(s) de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de células T auxiliaresé preferível.

[00625] O "peptídeo compreendendoumasequência de aminoáci- dos" significa, conformemencionadoacima, um peptídeo em que um outro aminoácido é adicionadoaoaminoácido N-terminal e/ouaminoá- cido C-terminal da sequência de aminoácidos. Quandoadicionadoao"peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II contendo um resíduo de cisteína", aadição pode ser feita no lado N-terminal e/ou no ladoC-terminal.

[00626] O "peptídeo compreendendoumasequência de aminoáci- dos alterada que contém aalteração de resíduo(s) de aminoácidos nasequência de aminoácidos e tendoumaatividade de indução de células T auxiliares" napresenteinvenção é também denominado um "peptídeo auxiliar alterado". O peptídeo auxiliar alteradosignifica um peptídeo que consisteemumasequência de aminoácidos em que 1 a 3 aminoácidos são eliminados, substituídos e/ouadicionados e se liga a moléculas do MHC de classe II parainduzir a células T auxiliares. O número dos aminoácidos a seremadicionados(também incluindoinserção) é, de preferência, 1 - 3. O número de the aminoácidos a seremeliminadosé, de preferência, 1 - 5. Na alteração, osaminoácidos a se-remadicionadosouaminoácidos a seremsubstituídos podem ser outro am não natural que não os 20 tipos de aminoácidos codificadospelo gene.

[00627] Como o peptídeo auxiliar alterado, porexemplo, ospeptí- deos a seguirpodem ser mencionados:

[00628] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12) (vide documento de patente 6),

[00629] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19) e

[00630] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25), osquaissão peptídeos auxiliaresalterados de SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11); e

[00631] GCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00632] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00633] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00634] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00635] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), osquaissão peptídeos auxiliaresalterados de PGCNKRYFKLSHLQMHS- RKHTG (SEQ ID NO: 10).

[00636] Como o "peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína", um peptídeo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir:

[00637] SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),

[00638] SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),

[00639] SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),

[00640] SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),

[00641] PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),

[00642] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),

[00643] PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),

[00644] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00645] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) e

[00646] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) é maispreferível.

[00647] Como o composto da fórmula (1) em que R1é "um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I que consisteem 7 - 30 resíduos de aminoácidos contendo um resíduo de cisteína", um compostorepresentado pela fórmula (6):

[00648]

[00649] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00650] um composto representado pela fórmula (7):

[00651]

[00652] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto,

[00653] um composto representado pela fórmula (8):

[00654]

[00655] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto e

[00656] um composto representado pela fórmula (9):

[00657]

[00658] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, são preferíveis.

[00659] A presente invenção também fornece uma composição que compreende o composto da presente invenção e um ou mais peptí- deos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe II.

[00660] Exemplos do composto da presenteinvenção que podemestarcontidosnacomposição da presenteinvenção incluem um com- postorepresentado pela fórmula (3):

[00661]

[00662] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto, um compostorepresentado pela fórmula (4):

[00663]

[00664] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto e um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00665]

[00666] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto.

[00667] Exemplos do peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II que deve estar contido na composição da presente invenção incluem as sequências de aminoácidos a seguir:

[00668] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00669] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00670] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00671] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),

[00672] CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e

[00673] WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).

[00674] A presente invenção também fornece um método de síntese de um composto em que dois diferentes peptídeos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I e peptídeos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe II ou dois diferentes epítopos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe I e epítopos de WT1 restritos a moléculas do MHC de classe II são, cada um, ligados via uma ligação de dis- sulfureto. O método da presente invenção inclui as etapas (1) - (3) a seguir .

[00675] Na etapa (1) da presenteinvenção, um peptídeo em que um grupocarbonila do aminoácido C-terminal de C(Mmt)A e o grupo amino N-terminal do peptídeo antigênico de câncer C estão ligadosé sintetizadousando Fmoc-C(Mmt)A-SBn e o peptídeo antigênico de câncer C.

[00676] O "peptídeo antigênico de câncer C" é conformedefinido para o "o peptídeo antigênico de câncer C" supracitado. "Fmoc" é um grupo 9-fluorenilmetoxicarbonila. "Mmt" é um grupomonometoxitritila. "SBn" é um grupotiobenzila.

[00677] Na etapa (2) da presenteinvenção, um peptídeo em que um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer C no peptídeo obtidonaetapa (1) supracitada e um grupotioéter do resíduo de cisteína ligadoaoN-término do peptídeo antigênico de câncer A estão ligadosé sintetizadousando o peptídeo obtidonaetapa (1) supracitada e o peptídeo antigênico de câncer A em que um resíduo de cisteína protegidopelogrupoNpysé ligadoaoN-término.

[00678] O "peptídeo antigênico de câncer A" é conformedefinido para o "peptídeo antigênico de câncer A" supracitado. "Npys" é um grupo 3-nitro-2-piridiltio.

[00679] Na etapa (3) da presenteinvenção, um peptídeo em que um grupotioéter do resíduo de cisteína ligadoaoN-término do peptí- deo antigênico de câncer A no peptídeo obtidonaetapa (2) supracitada e um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo antigênico de câncer D estão ligados, é sintetizadousando o peptídeo obtidonaetapa (2) supracitada e o peptídeo antigênico de câncer D contendo um resíduo de cisteína protegidopor um grupo Spy.

[00680] O "peptídeo antigênico de câncer D" é conformedefinido para o o"peptídeo antigênico de câncer D" supracitado. "SPy" é um gruposulfureto de 2-piridila.

[00681] O composto e o peptídeo da presenteinvenção e peptídeos intermediários para o mesmopodem ser produzidos de acordo com o método descritonosExemplos do presenterelatório descritivoou um método a ser usadoemgeral para a síntese de peptídeos. Exemplos do método de produção incluemosmétodos descritosnosdocumentos (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maru- zen Co., Ltda., 1975; Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Ma- ruzen Co., Ltda., 1985; Development of Pharmaceutical Product, volume 14 subsequente, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) e assimpordiante.

[00682] Exemplos dos mesmosincluem um método de produção por um sintetizador de fasesólida usando o método com Fmoc oumétodo com Boc e um método de produção pormeio de condensação sequencial de Boc-aminoácido ouZ-aminoácido através de um processo de síntese emfaselíquida (Fmoc representa um grupo 9- fluorenilmetoxicarbonila, Boc é um grupo t-butoxicarbonila e Z representa um grupobenziloxicarbonila).

[00683] No intermediário para a produção docomposto da presenteinvenção, um grupofuncional, talcomo um grupo amino, um grupocarbóxi, um grupomercapto e similares, pode ser protegidopor um grupo de proteção adequadooudesprotegido, se necessário usandotécnicas de proteção e desproteção. Como grupos de proteção, métodos de proteção e desproteção preferíveis estão o método descritoemdetalhes em "Protective Groups in Organic Synthesis, 2a Edição (John Wiley & Sons, Inc.; 1990)" e assimpordiante. Exemplos do grupo de proteção mercaptoincluem um grupoacetamidometila, um grupotritila e assimpordiante.

[00684] Quando o composto da presenteinvenção temumaligação de dissulfureto, a ligação de dissulfuretopode ser formada entre dois peptídeos diferentescontendo um resíduo de cisteína ou entre peptí- deoscontendo um resíduo de cisteína e cisteína de acordo com um método emgeralusado para química de peptídeos. Exemplos do método de formação da ligação de dissulfuretoincluemosmétodos des-critosnosdocumentos (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltda., 1975; Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltda., 1985; Development of Pharmaceutical Product, volume 14 subsequente, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) e similares.

[00685] Especificamente, quando um peptídeo contém um resíduo de cisteína, um compostotendoumaligação de dissulfureto (composto de dissulfureto) pode ser produzidoatravés da remoção de todososgrupos de proteção, incluindo o grupo de proteção mercaptonacadeia lateral da cisteína e oxidação em um solventeinerte. Além disso, elepode ser produzidopormeio de mistura de doisintermediários tendo um grupomercaptoem um solventeadequado para permitiroxidação. Como um método para oxidação, um método conhecidoporformarumaligação de dissulfuretoemsíntese de peptídeos emgeralpode ser selecionado, conformeapropriado. Por exemplo, oxidação de iodo, um método para a formação de umaligação de dissulfuretoatravés da adição de um oxidante sob condições alcalinasouácidas e um método que incluiumareação de oxidação emar sob condições alcalinaspodem ser mencionado. Aqui, como o oxidante, iodo, sulfóxido de dimeti- la (DMSO), ferricianeto de potássio e assimpordiantepodem ser mencionados. Como o solvente, água, ácido acético, metanol, clorofórmio, DMF, DMSO e assimpordianteouumamistura dos mesmospodem ser usados. Uma reação de oxidação frequentementeproporcionaumamistura de compostos de dissulfuretosimétricos e assimétricos. O composto de dissulfuretoassimétrico emquestão pode ser obtidopormeio de purificação através de cromatografia, recristaliza- ção e assimpordiante. Alternativamente, um intermediário tendo um grupomercaptoativado e um intermediário tendo um grupomercaptosão misturados para formarumaligação de dissulfuretoseletiva. Como o intermediário tendo um grupomercaptoativado, um grupomercaptoligado com um grupoNpys (grupo 3-nitro-2-piridina-sulfenila) e assimpordiantepode ser mencionado. Alternativamente, um intermediário e, porexemplo, 2,2'-ditiobis(5-nitropiridina), são misturadosantecipadamente para ativar o grupomercapto e, então, o outro intermediário é adicionado, em que umaligação de dissulfuretoseletivapode ser formada (Tetrahedron Letters. Vol. 37. N° 9, páginas 1347-1350).

[00686] Também, quandodoisoumaisresíduos de cisteína estão contidos no peptídeo, um método similar aométodo supracitadopode ser usado. Neste caso, um isômero com uma forma diferente de ligação de dissulfuretoé obtido. Um dímero em que umaligação de dissul- furetoé formada entre osresíduos de cisteína emquestão pode ser obtidousandoumacombinação particular de grupos de proteção de cadeia lateral de cisteína. Como a combinação dos grupos de proteção supracitados, um grupoMeBzl (metilbenzila) e umgrupoAcm (aceta- midometila), um grupoTrt (tritila) e um grupoAcm, Npys (3-nitro-2- piridiltio) e um grupoAcm, S-Bu-t (S-terc-butila) e um grupoAcm e assimpordiantepodem ser mencionados. Por exemplo, no caso de umacombinação do grupoMeBzl e do grupoAcm, um método para formação de umaligação de dissulfureto entre osresíduos de cisteína protegidos com um grupoAcm, o qual incluiremoção de outro grupo de proteção que não o grupoMeBzl e a cadeia lateral de cisteína, sujeição de umasolução contendo um monômero peptídico a umareação de oxidação emar para formarumaligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína desprotegidos e, então, realização de desproteção e oxidação com iodo e assimpordiantepodem ser mencionados.

[00687] O compostoobtido, peptídeo e intermediário da presenteinvenção podem ser purificados de acordo com um método conhecidoporaquelesversadosnatécnica e método emgeralusado para química de peptídeos. Por exemplo, elespodem ser purificadosatravés de várias técnicas de cromatografia (porexemplo, cromatografiaemcoluna de gel de sílica, cromatografiaemcoluna de permutaiônica, filtraçãoem gel, cromatografia de fasereversa), recristalização e assimpordiante. Por exemplo, como o solvente de recristalização, solventesalcoólicos, tais comometanol, etanol, 2-propanol e análogos, solventes de éter, talcomodietiléter e assimpordiante, solventes de éster, talcomoacetato de etila e assimpordiante, solventes de hidrocarbonetosaromáticos, tais comobenzeno, tolueno e assimpordiante, solventes de cetona, talcomoacetona e assimpordiante, solventes de hidro- carbonetos, talcomohexano e assimpordiante, solventesapróticos, tais comodimetilformamida, acetonitrilo e assimpordiante, água, um solvente misto dos mesmos e assimpordiante, podem ser usados. Como outros métodos de purificação, osmétodos descritosemJikken Kagaku Kouza (The Chemical Society of Japan ed., Maruzen) vol. 1, etc. e assimpordiantepodem ser usados.

[00688] Métodos de purificação docomposto de dissulfuretosão descritosnosdocumentos (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltda., 1975; Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltda., 1985; Development of Pharmaceutical Product, volume 14 subsequente, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) e similares. Dentreestes, HPLC é preferível.

[00689] Quando o composto da presenteinvenção tem um oumaispontosassimétricos, elepode ser produzido de acordo com um métodogeral e usando um material de iniciação tendoospontosassimétri-cos(aminoácidos). Para aumentar a purezaóptica docomposto da presenteinvenção, além disso, decomposição óptica eassimpordiantepode ser realizadaemumafaseadequada da etapa de produção. Como o método de decomposição óptica, porexemplo, um método com diastereômeros incluindoformação de um sal do composto da presenteinvenção ou um intermediário domesmo com um ácido opticamenteativo (porexemplo, ácidos monocarboxílicos, tais comoácido mandéli- co, N-benziloxialanina, ácido láctico e assimpordiante, ácidos dicarbo- xílicos, tais comoácido tartárico, ácido o-di-isopropilidenotartárico, ácido málico e assimpordiante, ouácidos sulfônicos, tais comoácido cânfor- sulfônico, ácido bromo-cânfor-sulfônico e assimpordiante) em um solventeinerte (porexemplo, solventesalcoólicos, tais comometanol, eta- nol, 2-propanol e assimpordiante, solventes de éter, talcomodietiléter e assimpordiante, solventes de éster, talcomoacetato de etila e assimpordiante, solventes de hidrocarbonetos, talcomotolueno e assimpordiante, solventesapróticos, talcomoacetonitrilo e assimpordiante, e um solvente misto dos mesmos) podem ser usados. Quando o compostoouintermediário da presenteinvenção tem um grupofuncionalácido, talcomo um grupocarboxila e assimpordiante, a decomposição óptica podetambém ser realizadaatravés da formação de um sal com umaaminaopticamenteativa (porexemplo, umaaminaorgânica, talcomo a- fenetilamina, quinina, quinidina, cinconidina, cinconina, estricnina e assimpordiante).

[00690] A temperatura para a formação de um salé selecionada a partir da faixa de temperaturaambienteaté o ponto de ebulição do solvente. Para melhorar a purezaóptica, é desejável elevar a temperatura para cerca do ponto de ebulição dosolvente. Quando o salprecipitadoé coletadopormeio de filtração, elepode ser esfriadoconformenecessário para aumentar o rendimento. Uma quantidadeadequada de ácido opticamenteativoouamina a ser usadaestá dentro da faixa de cerca de 0,5 - cerca de 2,0 equivalentes, de preferência cerca de 1 equivalen te, emrelação aosubstrato. Ondenecessário, oscristaispodem ser recristalizadosem um solventeinerte (porexemplo, solventesalcoólicos, tais comometanol, etanolou 2-propanol e análogos, solventes de éter, talcomodietiléter e assimpordiante, solventes de éster, talcomoacetato de etila e assimpordiante, solventes de hidrocarbonetos, talcomotolueno e assimpordiante, solventesapróticos, talcomoacetonitrilo e assimpordiante, e umamisturadestessolventes) para proporcionar um salopticamenteativo com altapureza. Ondenecessário, o salopticamentedecompostopode ser tratado com um ácido ou basepormeio de um método geral para proporcionaruma forma livre.

[00691] Exemplos do "salfarmaceuticamenteaceitável" napresenteinvenção incluem o sal de adição de ácido e o sal de adição de base. Exemplos do sal de adição de ácido incluemsais de ácidos inorgânicos, tais comocloridrato, bromidrato, sulfato, iodidrato, nitrato, fosfato e as-simpordiante, e sais de ácidos orgânicos, tais comocitrato, oxalato, acetato, formato, propionato, benzoato, trifluoroacetato, maleato, tarta- rato, metanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e assimpordiante. Exemplos do sal de adição de base incluemsais com uma base inorgânica, talcomo o sal de sódio, sal de potássio, sal de cálcio, sal de magnésio, sal de amônio e assimpordiante, sais com bases orgânicas, tais como o sal de trietilamônio, sal de trietanolamônio, sal de piridínio, sal de di-isopropilamônio, etc. e assimpordiante, além de sais de aminoácidos básicos ouaminoácidos ácidos, tais comoarginina, ácido aspártico, ácido glutâmico e assimpordiante.

[00692] A presenteinvenção também abrangesolvatos, hidratos, talcomo um solvato de etanol e assimpordiante do composto da presenteinvenção ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo. Além disso, a presenteinvenção abrangequaisquerestereoisômeros, tais comoqualquerdiastereômero, enantiômero e assimpordiante, e todososcristaisemquaisquermodalidades, do compostorepresentado pela fórmula (1) que possamestarpresentes.

[00693] Emgeral, naproduçãode peptídeo, vários subprodutos, tais comopeptídeos com aminoácidos defeituosos, peptídeos degradadosporhidrólise, oxidação e assimpordiante, peptídeos com racemização de aminoácidos e assimpordiante, ocorrememumaetapa de condensação de a-aminoácidos opticamente ativos, uma etapa de remoção de vários grupos de proteção, uma etapa de clivagem de peptídeo a partir de uma resina e similares. Em uma escala de laboratório, várias técnicas de cromatografias (por exemplo, cromatografia em coluna de gel de sílica, cromatografia em coluna de permuta iônica, filtração em gel e cromatografia de fase reversa) são combinadas para remover tais impu-rezas, pelo que um peptídeo e composto com alta pureza podem ser obtidos. No entanto, não é fácil obter um peptídeo e um composto com alta pureza em uma escala industrial para proporcionar produtos farmacêuticos.

[00694] O composto da presente invenção tem propriedades físico- químicas que permitem a produção em massa de uma substância me-dicamentosa para produtos farmacêuticos. Especificamente, ele tem uma alta solubilidade, estabilidade superior em uma solução, é difícil de se tornar gelificado quando concentrado e assim por diante e o composto pode ser produzido facilmente como uma substância medicamentosa com alta pureza em larga escala através de uma etapa de purificação usando cromatografia em coluna, tal como HPLC de fase inversa e assim por diante.

[00695] O composto assim produzido da presente invenção tem es-tabilidade a oxidante superior e assim por diante em uma solução, uma vez que os resíduos de cisteína formam uma ligação de dissulfureto e assim por diante, e retém uma determinada qualidade como uma substância medicamentosa para medicamentos e atividade de indução de CTLs eficiente.

[00696] O composto da presenteinvenção é útil como um ingredienteativo de um agente de indução de CTLs para imunoterapia de câncer, um ingredienteativo de umavacina contra o câncer ou um ingredienteativo de umacomposição farmacêutica. Istoé, o composto da presenteinvenção tem, conformedemonstradonosExemplos do presenterelatóriodescritivo, imunogenicidade superior e podemostrareficientementeumaatividade superior de indução de CTLs. Além disso, os CTL induzidospelocomposto da presenteinvenção podem, surpreendentemente, reconhecer o peptídeo de WT1 parcial de tipo natural inerentementepresenteemcélulas cancerosas.

[00697] A atividade de indução de CTLs pode ser detectadamedindo-se o número de CTLs pormeio do método de tetrâmero de HLA (Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)) oumétodo de diluição limitante (Nat. Med.: 4, 321-327 (1998)). Alternativamente, porexemplo, aatividade de indução de CTLs restritosao HLA-A24 pode ser examinadausando o modelo de camundongos HLA-A24 descrito no documento WO 02/47474 e Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002) e assimpordiante.

[00698] Portanto, o composto da presenteinvenção pode ser usadocomo um fármaco terapêutico oufármaco profilático (fármaco para prevenção de recorrência) para um câncer que expressa o gene de WT1 oucâncer associadoa um aumento no nível de expressão do gene de WT1. Exemplos de câncer incluemcânceres hematológicas, tais comoleucemia, síndrome mielodisplásica, mielomamúltiplo, linfomamaligno e assimpordiante, e tumoressólidos tais comocâncer gástrico, câncer coloretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células germinais,câncer de fígado, câncer de pele, câncer de bexigaurinária, câncer de próstata, câncer uterino, câncer de colo do útero, câncer de ovário, tumor cerebral e assimpordiante.

[00699] O composto da presenteinvenção ou um salfarmaceutica- menteaceitável domesmopode ser um ingredienteativo de um agente de indução de CTLs para imunoterapiacelular de câncer, um ingredien-teativo de umavacina contra o câncer e/ou um ingredienteativo de umacomposição farmacêutica através de formulação de cadacompos-toousalemuma forma apropriada.

[00700] O composto da presenteinvenção pode ser administrado junto com um veículo aceitável como um medicamento, talcomo um adjuvanteadequado, de modo que suaimunidadecelularsejaestabelecida de forma eficaz. Como o adjuvante, aquelesdescritos no documento (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) e assimpordiantesão aplicáveis. Especificamente, componentesderivados de fungos, GM-CSF, citocinas, tais como interleucina-2, interleucina-7, interleucina-12 e assimpordiante, componentesderivados de plantas, componentesderivados de organismosmarinhos, gel mineral, talcomohidróxido de alumínio, lisolecitina, tensoativos, talcomopoliol Pluronic, poliânion, peptí- deo, emulsão oleosa (preparadoememulsão) e assimpordiantepodem ser mencionados. Como oscomponentesderivados de fungos, lipídio A, monofosforillipídio A, o qual é um derivado do mesmo, bacté-riasmortas(bactérias Mycobacterium, tais comobactérias de BCG e similares), proteínas derivadas de bactérias, polinucleotídeos, AdjuvanteIncompleto de Freund, AdjuvanteCompleto de Freund, componentes do esqueleto da paredecelular (porexemplo, BCG-CWS e assimpordiante), dimicolato de trealose (TDM) e assimpordiantepodem ser mencionados.

[00701] Além disso, o composto da presenteinvenção também pode ser administradona forma de um preparadolipossômico, um preparadoempartículas, incluindoligação aesferas com um diâmetro de vários µm, um preparado incluindo ligação a um lipídio e assim por diante.

[00702] Além disso, o composto da presente invenção (conjugado) pode ser administrado junto com um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar). Como um método para coadministração, um conjugado de um peptídeo auxiliar pode ser administradoindividualmente. Um preparado de coquetel (agente de coquetel, coquetel) contendo um conjugado de um peptídeo auxiliar emumaúnica composição farmacêutica é maispreferível. O preparado de coquetelcontém um conjugadocapaz de produzir um peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe I (istoé, peptídeo assassino) e peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II (istoé, pep- tídeo auxiliar). Portanto, através de administração dopreparado de co-quetelcontendo um peptídeo auxiliar comoumavacina contra o câncer para imunoterapia de câncer, células T auxiliaresimportantes para promoção funcional de outrascélulas T, incluindo CTLs, podetambém ser ativadas e a função e eficácia (imunocompetência celular e assimpordiante) do conjugadopodem ser aprimoradas.

[00703] O peptídeo de WT1 restrito a moléculas do MHC de classe II (ouseja, peptídeo auxiliar) é conformedescritonadescrição. Exemplos do peptídeo auxiliar para o preparado de coquetelincluem as sequências de aminoácidos a seguir:

[00704] CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),

[00705] CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),

[00706] CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),

[00707] WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),

[00708] CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e

[00709] WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).

[00710] Destes, WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) é preferível.

[00711] Pôde ser confirmado que opreparado de coquetelmostraumaeficácia aprimoradacomoumavacina contra o câncer, talcomoimunocompetência celular e assimpordiante, conformemostrado, porexemplo, emExemplos e ExemplosExperimentaisnaDESCRIÇÃO.

[00712] Embora a dose docomposto da presenteinvenção no pre- paradopossa ser adequadamentecontrolada de acordo com o tratamento da doença emquestão, idade e peso corporal dos pacientes e assimpordiante, elaé, emgeral, de 0,0001 mg - 1000 mg, de preferência 0,001 mg - 1000 mg, maispreferivelmente 0,1 mg - 10 mg.

[00713] Como o método de administração, administração intradérmi- ca, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intravenosa, administração transdérmica e assimpordiantepodem ser mencionadas. Administração intradérmica e subcutânea são preferí-veis,umavez que elasinduzemeficientemente a CTLs. Embora a frequência de administração e intervalos de administração possam ser adequadamentecontrolados de acordo com a profilaxiaoutratamento da doença emquestão e a diferença empacientesindividuais, emgeral, elaé feitavárias vezes e aadministração umavezdurantevários dias a vários meses é preferível.

[00714] Através de administração de umacomposição farmacêutica contendotalcomposto da presenteinvenção como um ingredienteativo a pacientespositivos para WT1, pode ser proporcionado um método para profilaxiaoutratamento de câncer.

EXEMPLOS

[00715] A presente invenção é explicada especificamente a seguir por meio de referência aos Exemplos aos quais, no entanto, a invenção não está limitada.

Exemplo 1 Síntese do composto representado pela fórmula (5):

[00716]

[00717] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto.

[00718] Etapa 1. Síntese de H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala- Pro-Tyr-Leu-OH (síntese de C(Npys)RMFPNAPYL)

[00719] Usando resina de Fmoc-Leu-Alko (Alko é álcool p- alcoxibenzílico), 282 mg, (fabricada pela Watanabe Chemical; 0,71 mmol/g, 0,2 mmol) como material de iniciação, a cadeiapeptídica foimontadapormeio de síntese emfasesólida de acordo com o método de Fmoc/tBu. A síntese emfasesólida foirealizadausando um sinteti- zador de peptídeos CS336X fabricado pela Bio CS e desproteção do grupo Fmoc foirealizadaatravés de tratamento com umasolução em DMF de piperidina a 20% durante 5 minutos e durante 20 min. O acoplamento do aminoácido protegidofoirealizadopormeio de reação com umasolução de DMF de 1,05 mmol do aminoácido protegido, 1 mmol de HBTU e 2 mmol de DIPEA durante 1 h. A resina obtidafoilavada com DMF e éter e seca sob pressão reduzida para proporcionar a resina de Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)- Leu-Alko (630 mg). Aesta resina peptídica foiadicionadaumamistura de TFA/H2O/TIS=95/2,5/2,5 (10 ml) e amisturafoiagitadaemtemperaturaambientedurante 2 h. A resina foiremovidapormeio de filtração e a mistura de reação foiconcentrada sob pressão reduzida. A mistura de reação foiesfriada com gelo e dietiléter (50 ml) foiadicionado. O precipitadoresultantefoicoletadopormeio de filtração, lavado com éter e seco sob pressão reduzida para proporcionar o peptídeo bruto (217 mg). A solução de peptídeo brutoobtidafoidissolvidaemumamistura de ácido acético aquoso a 20% (7 ml) e acetonitrilo (1 ml) e purificadapormeio de HPLC de fasereversa.

[00720] Bomba: fabricada pela Shimadzu; LC-8A

[00721] Coluna: YMC ODS-A 3 cm^*25 µL, 10 µm

[00722] Eluato 1: H2O/TFA a 0,1%

[00723] Eluato 2: CH3CN/ TFA a 0,1%

[00724] Taxa de fluxo: 20 mL/min

[00725] Detecção: UV220 nm

[00726] A solução de peptídeo brutofoiinjetadaemumacolunaequilibrada com 15% de eluato 2. Após o que, a concentração doeluato 2 foi aumentada para 37% aolongo de 10 min e, após o que, elevadaemuma taxa de 0,24% porminuto. As frações contendo o produtoemquestão foramcoletadas e secaspormeio de congelamento para proporcionar H- Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (53 mg).

[00727] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1366,1 [M+1]+(Calculado = 1366,6).

[00728] Etapa 2. Síntese de ligação de dissulfureto (H-Cys-Tyr-Thr- Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr- Leu-OH) [Istoé, síntese de um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00729]

[00730] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto].

[00731] H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (50 mg) obtida no etapa 1 e H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (isto é, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)) (43 mg) sintetizada por meio de um método conhecido (por exemplo, documento WO07/063903) foram misturadas, DMSO (1 mL) foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 min. A mistura de reação foi diluída com TFA a 0,1% em água (5 mL) e purificada através de HPLC de fase reversa.

[00732] Bomba: fabricada pela Shimadzu; LC-8A

[00733] Coluna: YMC ODS-A 3 cm^*25 µL, 10 µm

[00734] Eluato 1: H2O/TFA a 0,1%

[00735] Eluato 2: CH3CN/ TFA a 0,1%

[00736] Taxa de fluxo: 20 mL/min

[00737] Detecção: UV220 nm

[00738] A solução de reação foiinjetadaemumacolunaequilibrada com 25% de eluato 2. Após o que, a concentração de eluato 2 foielevadaemuma taxa de 0,25% porminuto. As frações contendo o produtoemquestão foramcoletadas, secasporcongelamento e novamentepu- rificadasatravés de HPLC de fasereversa e secasporcongelamento para proporcionar a ligação de dissulfureto (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln- Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) (istoé, um compostorepresentado pela fórmula (5), 21 mg).

[00739] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z =1191,8 [M+2]2+ (Calculado = 1191,9).

Exemplo 2 Síntese do peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos a seguir:

[00740] CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13)

[00741] Etapa 1. Usando resina de Fmoc-Leu-Alko (Alko é álcool p- alcoxibenzílico) (338 mg, fabricado pela Watanabe Chemical; 0,74 mmol/g, 0,25 mmol) como material de iniciação e síntese em fase sólida conforme no método descrito no Exemplo 1 foi realizada duas vezes para proporcionar a resina H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)- Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko (1,54 g). A esta resina peptídica foi adicionada uma mistura de TFA/H2O/TIS=95/2,5/2,5 (15 ml) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. A resina foi removida por meio de filtração e a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. A mistura de reação foi esfriada com gelo e dietil éter (50 ml) foi adicionado. O precipitado resultante foi coletado por meio de filtração, lavado com éter e seco sob pressão reduzida para proporcionar o pep- tídeo bruto (637 mg).

[00742] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1211,9 [M+1]+ (Calculado = 1212,5)

[00743] Etapa 2. O peptídeo bruto (321 mg) obtido na etapa 1 foi dissolvido em TFA (10 ml) e carregada, através de uma bomba de HPLC, em uma coluna YMC-Pack ODS-A 3 cmFx 25 cm equilibrada para HPLC (fabricada pela Shimadzu; LC6AD) com eluato 1 = H2O/TFA a 0,1%. Este estado foi mantido durante cerca de 20 min e, após 20 mi- nutos, a concentração doeluato 2 = CH3CN/TFA a 0,1% foiaumentada para 27%. Após o que, enquanto se monitorava o eluato do peptídeo emquestão através de UV a 220 nm, a concentração doeluato 2 foielevadaemuma taxa de 0,25% porminuto e as frações contendo o produtoemquestão foramcoletadas. O peptídeo (100 mg) obtidoapós congelamento a seco foinovamentepurificadoatravés de faseinversa sob as mesmascondições e o acetonitrilofoievaporado sob pressão reduzida e o resíduo foiliofilizado para proporcionar o peptídeo emquestão (CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13), 37,2 mg).

[00744] Bomba: fabricada pela Shimadzu; LC-6A

[00745] Coluna: YMC ODS-A 3 cmF* 25 cm, 10 µm

[00746] Eluato 1: H2O/TFA a 0,1%

[00747] Eluato 2: CH3CN/TFA a 0,1%

[00748] Taxa de fluxo: 20 mL/min

[00749] Detecção: UV220 nm

[00750] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1212,0 [M+1]+(calculado = 1211,6).

Exemplos 3-5

[00751] Através de um método similar àquele no Exemplo 2, peptí- deos que consistem na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 18 ou 17 foram sintetizados. A Tabela 54 mostra a quantidade sintetizada e os resultados de espectrometria de massa. Tabela 54

Exemplo Experimental 1 Alterações de curso em tempo de corte de aminoácidos N-terminais por ERAP1

[00752] Os peptídeos de SEQ ID NOs: 13, 16, 18 e 17 sintetizados nos Exemplos 2 - 5 foram avaliados quanto ao corte do aminoácido N- terminal por ERAP1 (PLoS, 01 de Novembro de 2008, vol. 3, Edição 11, e3658).

[00753] 30 µl de ERAP1 (2,0 mg/ml) em solução tampão de PBS foram adicionados a 258 µlde tampão de Tris-HCl. Solução em DMSO (12,0 µl) de cada peptídeo a 10 mM foi adicionada à solução de ERAP1 supracitada e a mistura foi bem misturada e mantida em temperatura ambiente. 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 h depois, 50 µlde uma amostra foram adicionados a 150 µlde MeOH para terminar a reação, 25 µlforam injetados em UFLC (condições de análise mostradas abaixo) e a AUC do peptídeo em questão foi determinada. O peptídeo obtido por corte foi quimicamente sintetizado separadamente e analisado sob condições similares sem enzima. A proporção de formação de peptí- deo obtido por corte foi determinada com base na AUC obtida.

Condições de Análise

[00754] Bomba: UFLC fabricada pela Shimadzu

[00755] Coluna: Shim-pack XR-ODS d.i. de 3,0 mm x 75 mm

[00756] Solução: TFA a 0,1%/HaO (A) - TFA a 0,1 %/CHßCN (B)

[00757] Temperatura do forno: 40 °C

[00758] Taxa de fluxo: 1,0 mL/min

[00759] Comprimento de onda de detecção: À = 220 nm

Gradiente:

[00760] 1. Concentração de SOLUÇÃO B foi aumentada de 1,0% para 70% de 0,0 min para 5,0 min

[00761] 2. Concentração de SOLUÇÃO B foi aumentada de 1,0% para 50% de 0,0 min para 5,0 min Peptídeo em Questão:

[00762] Conforme para ospeptídeos sintetizadosnosExemplos 2 - 5, as sequências de aminoácidos dos peptídeos obtidospor corte de aminoácidos N-terminaispor ERAP1 são mostradasnaTabela 55. Tabela 55

[00763] Alterações de curso de tempo da taxa de formação dos peptídeos obtidos por corte são mostradas na Tabela 56 e a Figura 1. Tabela 56

[00764] Os resultados de corte sugerem fortemente que, em quaisquer peptídeos Cys-estendidos (SEQ ID NOS: 13, 16, 17 e 18), Cys no N-término estendido é clivada seletivamente por ERAP-1, ou seja, o peptídeo Cys-estendido sofre corte apropriado por ERAP-1 sem dependência acentuada da sequência do peptídeo e é, finalmente, convertido ao peptídeo antigênico de câncer em questão (SEQ ID NO: 2, 5, 6 ou 7).

Exemplo Experimental 2 Avaliação in vivo de capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402

[00765] O composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgê- nicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402. O composto representado pela fórmula (5):

[00766]

[00767] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto é, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer que A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e o peptídeo antigênico de câncer B é CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) é um peptídeo de WT1 I restrito a HLA-A0201 e CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 I restrito a HLA-A24.

[00768] Camundongos transgênicos para HLA-A0201 (C57BL/6CrHLA-A2.1DR1) são camundongos os quais são defectivos no MHC de camundongos e expressam quimeras de HLA humano MHC HLA-A0201 e MHC H-2Db e HLA-DRB1*0101 de camundongo. Usando estes camundongos, peptídeos positivos para HLA-A02 capazes de induzir a CTLs em seres humanos podem ser selecionados (Eur J Immunol. 2004; 34: 3060-9). Por outro lado, camundongos transgênicos para HLA-A2402 (C57BL/6CrHLA-A2402/Kb) são camundongos que expressam quimeras de HLA de MHC HLA-A2402 humano e MHC de H-2Kb de camundongo. Usando estes camundongos, peptídeos positivos para HLA-A24 capazes de indução de CTLs em seres humanos podem ser selecionados (Int J Cancer 2002; 100: 565-70).

[00769] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (5) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2, 4) foiavaliado com base namedição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4), de esplenócitos derivados a partir dos camundongos supracitado aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5).

[00770] Especificamente, um composto representado pela fórmula (5) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) a 40 mg/ml, adicionalmente diluído com água para injeção até 5 mg/ml e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de Adjuvante Incompleto de Freund (Incomplete Freund's Adjuvant - IFA). O composto emulsificado foi administrado por via intradérmica em 4 locais na base da cauda de um camundongo a 250 µg/local. Uma semana depois, o camundongo foi sacrificado com gás CO2, o baço foi isolado e os es- plenócitos foram preparados. O Kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior do preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,15 x 106 células/cavidade e os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 foram colocados em placas a 1 x 106 células/cavidade sobre a placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/ml e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% a 40 µg/mL.O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2) foi adicionado aos es- plenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 em uma concentração final de 10 µg/mL.Além disso, o peptídeo diluído (SEQ ID NO: 4) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 em uma concentração final de 10 µg/mL.Osesplenócitos com o peptídeo adicionado foram culti-vadosdurante 20 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitrofoirealizada. Após cultura, o sobrenadantefoiremovido e a placa para ELISPOT foideixadadesenvolver a cor de acordo com o protocoloanexo. O número de pontos que se desenvolveucorfoimedidopeloImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00771] Osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando camun-dongostransgênicos para HLA-A0201 são mostradosnaFigura 2 e osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongos trans- gênicos para HLA-A2402 são mostradosnaFigura 3.

[00772] Emcadafigura, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas. Na Figura 2, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de esplenóci- tosderivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 2 e, naFigura 3, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongostransgê- nicos para HLA-A2402 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 4, ouseja, a diferença nosvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs induzidoporcadapeptídeo emquestão específico noscamundongosin vivo pela administração de um compostorepresentado pela fórmula (5).

[00773] Emcadafigura, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongos trans- gênicos não reagiramemgeralnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultadodeste teste, a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 2 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA- A0201 e a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 4 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A2402.

[00774] A partir do acima, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (5) podeinduzir a CTLs específicos para o peptí- deo mostradopor SEQ ID NO: 2 e CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 4. Foi fortemente sugerido que ocompostorepresentado pela fórmula (5) sofreclivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriadopor ERAP-1 emcamundongosin vivo e é, naverdade,processadonospeptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.

[00775] Istoé, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (5), o qual é umamodalidade do composto da presenteinvenção, é um conjugadoem que doisdiferentestipos de peptídeos de WT1 formam um compósito pormeio da ligação de dissulfuretorepresentadanafórmula (1) e é umavacinaconjugada de peptídeo antigê- nico de câncer WT1 a qual, naverdade, podeinduziraosdoisdiferentestipos de CTL in vivo.

Exemplos de Referência 1-7

[00776] Através de um método similar àquele do Exemplo 2, respectivos peptídeos que consistem nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22, 24, 23, 2, 4, 6 e 5 foram sintetizados. A Tabela 57 mostra os resultados de espectrometria de massa. Uma vez que SEQ ID NOs: 22, 24, 23, 2, 4, 6 e 5 não são o composto da presente invenção, eles são descritos como Exemplos de Referência. Tabela 57

Exemplos 6 - 9

[00777] Através de um método similar àquele do Exemplo 1, respectivos compostos (conjugados) representados pelas fórmulas (3), (6), (7) e (8) foram sintetizados. A Tabela 58 mostra os resultados de espectrometria de massa. (Em cada fórmula, a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto). Tabela 58

Exemplo Experimental 3 Medição de solubilidade Etapa 1. Preparo de tampão isotônico

[00778] Foram misturados solução aquosa a 75% de hidrogenofos- fato dissódico e solução aquosa a 5,53% de ácido cítrico e os respectivos tampões (pH de 6,0 e 7,4) foram preparados.

Etapa 2. Preparo de solução de ensaio

[00779] Cerca de 1 mg de um produto de ensaio foi medido, um tampão isotônico (0,5 mL) foi adicionado e este foi usado como uma solução de ensaio. A solução de ensaio preparada foi agitada em temperatura ambiente durante 90 minutos (condições de agitação: RECIPRO SHAKER SR-1N fabricado pela TAITEC, velocidade = 8), centrifugada (15000 rpm, 5 min, temperatura ambiente) e o sobrenadante após centrifugação foi usado como uma solução de ensaio.

Etapa 3. Preparo de solução padrão

[00780] Cerca de 1 mg do produto de ensaio foi medido precisamente, dissolvido em TFA a 0,1% em água/acetonitrilo = 1/1, levado para a quantidade total de 10 mL e esta foi usada como uma solução padrão do produto de ensaio.

Etapa 4. Medição da concentração do produto de ensaio

[00781] A solução padrão do produto de ensaio e a solução de ensaio foram analisadas por HPLC (condições de análise descritas na Tabela 59) e a solubilidade do produto de ensaio foi calculada a partir da proporção da área de pico da solução padrão.

Condições de medição por HPLC

[00782] Coluna: ChemcoPack Quicksorb (4,6 mm0 x 150 mm, 5 µm) fabricada pela Chemco Scientific Co., Ltda.

[00783] Fasemóvel: SOLUÇÃO A; TFA a 0,1% emágua, SOLUÇÃO B; TFA a 0,1% emacetonitrilo

[00784] Temperatura da coluna: temperaturaambiente

[00785] Taxa de fluxo: 1 mL/min

[00786] Comprimento de onda de detecção: UV a 254 nm, 230 nm (2 comprimentos de onda de detecção)

[00787] Volume de injeção de amostra: 10 µL Tabela 59

[00788] OspeptídeossintetizadosnosExemplos de Referência 1 - 2 e 4 - 7 e os compostos (conjugados), sintetizados nos Exemplos 1, 7 e 9 foram submetidos à medição da solubilidade supracitada. Cada solubilidade é mostrada na Tabela 60. Tabela 60

Exemplo Experimental 4 Avaliação de capacidade de indução de CTLs in vivo usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00789] O composto representado pela fórmula (3) sintetizado no Exemplo 6 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgê- nicos para HLA-A0201. O composto representado pela fórmula (3):

[00790]

[00791] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto é, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e peptídeo antigênico de câncer B é SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) são peptídeos de WT1 restritos a HLA-A0201.

[00792] O camundongo transgênico para HLA-A0201 é conforme descrito no Exemplo 2 Experimental.

[00793] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (3) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2, 6) foiavaliado com base emmedição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 6), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (3).

[00794] Especificamente, um composto representado pela fórmula (3) foi dissolvido em água para injeção a 10 mg/ml e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsionado foi administrado por via in- tradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 500 µg/local. Uma semana depois, o camundongo foi sacrificado com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN- y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELIS- POT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA- A0201 preparados foram colocados em placas a 0,75 x io6 céiu- las/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 6) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% a 40 mg/mL. O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2, 6) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 em uma concentração final de 10 mg/mL. Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 20 h a 37 °C, 5% de CO2, em que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medidapeloImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00795] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando o ca-mundongotransgênico para HLA-A0201 são mostradosnaFigura 4.

[00796] Na Figura 4, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas. Na Figura 4, a barra preta e a barra sombreadamostramosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 enquantorecebiam um pulso com cadapeptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2, 6 e a barra brancamostraosresultados da culturasemreceber o pulso. Ouseja, a diferença entre osvalores da barra pretaousombreada e da barra brancamostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que aadministração de um compostorepresentado pela fórmula(3) resultounaindução de CTLs específicos para cadapeptídeo mostradopor SEQ ID NOs: 2, 6 in vivonoscamundongos. Na Figura 4, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos de camundongostransgênicos para HLA-A0201 não reagiramemgeralnaausência de pulsos com o peptídeo emquestão. Como um resultadodesteensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2, 6 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201.

[00797] A partir do acima, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (3) podeinduzir a CTLs específicos para o peptí- deo mostradopor SEQ ID NO: 2, 6. Foisugerido fortemente que ocompostorepresentado pela fórmula (3) sofreclivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriadopor ERAP-1 noscamundongosin vivo e, naverdade, é processadonospeptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2 e 6. Istoé, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (3), o qual é umamodalidade do composto da presenteinvenção, é um conjugadoem que doisdiferentestipos de peptídeos formam um compósito pormeio da ligação de dissulfuretorepresentada nafórmula (1) e é umavacinaconjugada de peptídeo antigênico de câncer WT1 que, naverdade, podeinduzir a doisdiferentestipos de CTLs in vivo. Exemplo Experimental 5 Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00798] O composto representado pela fórmula (6) sintetizado no Exemplo 7 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgê- nicos para HLA-A0201. O composto representado pela fórmula (6):

[00799]

[00800] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto é, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e o peptídeo antigênico de câncer C é CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) é um peptídeo de WT1 I restrito a HLA-A0201 e CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, pep- tídeo auxiliar).

[00801] O camundongo transgênico para HLA-A0201 é conforme descrito no Exemplo Experimental 2. Usando estes camundongos, peptídeos positivos para HLA-A02 capazes de induzir a CTLs em seres humanos podem ser selecionados, bem como a atividade de aumentou a indução de CTLs do peptídeo auxiliar capaz de induzir a células T auxiliares através da ligação a HLA-DRB1*0101 podem ser avaliadas.

[00802] Se a administração de um composto representado pela fórmula (6) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2): e células reativas ao peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 24) foi avaliado com base na medição da produção de IFN-y porre-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 24), de esplenóci- tosderivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (6). Além disso, os es- plenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (6) e osesple- nócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentadopor SEQ ID NO: 2, foram re- estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2) e osnúmeros de células produtoras de IFN-y foram comparados.

[00803] Especificamente, um peptídeo representado por SEQ ID NO: 2 foi dissolvido em água para injeção com 6 mg/ml e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O peptídeo emulsificado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Um composto representado pela fórmula (6) foi dissolvido em água para injeção (19,8 mg/mL) e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsionado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 495 mg/local. O número molar do peptídeo de SEQ ID NO: 2 contido na dose do composto representado pela fórmula (6) por um camundongo foi ajustado para ser igual àquele do peptídeo de SEQ ID NO: 2 contido na dose por camundongo. Uma semana depois, o camundongo foi sacrificado com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA- A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 106 célu- las/cavidade ou 0,5 x io6células/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 24) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 mg/mL. O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2, 24) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA- A0201 em uma concentração final de 10 mg/mL. Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 20 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00804] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados nas Figuras 5 e 6.

[00805] Nas Figuras 5 e 6, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas e o eixo horizontal mostra o composto ou peptídeo administrado aos camundongos. Na Figura 5, a barra preta mostra os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 enquanto recebiam um pulso com o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 e a barra branca mostra os resultados da cultura sem pulsos. Ou seja, a diferença entre os valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que a administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 ou um composto representado pela fórmula (6) resultou na indução de CTLs específicos para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 in vivo nos camundongos. Na Figura 5, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esple- nócitos de camundongos transgênicos para HLA-A0201 não reagiram em geral na ausência de pulsos com o peptídeo em questão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o pep- tídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectado nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201. Além disso, na Figura 5, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (6), foi mais elevado do que as células produtoras de IFN-y específicas para peptí- deo induzidas pela administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2.

[00806] Na Figura 6, além disso, a barra preta mostra os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 enquanto recebiam um pulso com peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 e a barra branca mostra os resultados da cultura sem pulsos. Ou seja, a diferença entre os valores da barra preta e da barra branca mostra o número de células reativas ao peptídeo e que a administração de um composto representado pela fórmula (6) resultou na indução de células que reagem com o peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 24 in vivo nos camundongos e a administração de um composto representado por SEQ ID NO: 2 não induziu a células reativas com o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 in vivo nos camundongos. Na Figura 6, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esplenócitos de camundongos transgênicos para HLA- A0201 não reagiram em geral na ausência de pulsos com o peptídeo em questão.

[00807] A partir do acima, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (6) pode induzir a CTLs específicos para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 e células reativas com o peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 24. É sugerido fortemente que o composto representado pela fórmula (6) sofre clivagem da ligação de dis- sulfureto e corte apropriado por ERAP-1 nos camundongos in vivo e, naverdade,é processadonospeptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2 e 24. Foiassumido que aindução de células reativas com o peptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 24produzidas a partir de um com-postorepresentado pela fórmula (6) aumentou a indução de CTLs es-pecíficos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foramencontradascomparado com a administração do peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2.

[00808] Istoé,foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (6), o qual é umamodalidade do composto da presenteinvenção, é um conjugadoem que doistiposdiferentes de peptídeos formam um compósito pormeio da ligação de dissulfuretorepresentadanafórmula (1) e é umavacinaconjugada de peptídeo antigênico de câncer WT1 a qual, naverdade, podeinduzir a CTLs e células reativasaopeptídeo auxiliar in vivo.

Exemplo Experimental 6

[00809] Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00810] O composto representado pela fórmula (8) sintetizado no Exemplo 9 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgê- nicos para HLA-A0201. O composto representado pela fórmula (8):

[00811]

[00812] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto é, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e o peptídeo antigênico de câncer C é CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201 e CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00813] O camundongotransgênico para HLA-A0201 é conformedescritonosExemplosexperimentais 2 e 5.

[00814] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (8) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2) e células reativasaopeptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 22) foi avaliado com base em medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 22), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (8). Além disso, os esplenóci- tos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (8) e os esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado por SEQ ID NO: 2, foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2) e os números de células produtoras de IFN-y foram comparados.

[00815] Especificamente, um peptídeo representado por SEQ ID NO: 2 foi dissolvido em água para injeção com 6 mg/ml e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O peptídeo emulsificado foi administrado por via intradér- mica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Um compostorepresentado pela fórmula (8) foidissolvidoemágua para injeção (18 mg/mL) e emulsificadopormeio de mistura com umaquantidadeigual de adjuvanteincompleto de Freund (IFA). O compostoemulsionadofoiadministradopor via intradérmica em 2 locaisna base da cauda de um camundongo a 450 µg/local. O número molar do peptí- deo de SEQ ID NO: 2 contidona dose do compostorepresentado pela fórmula (8) por um camundongofoiajustado para ser igualàquele do peptídeo de SEQ ID NO: 2 contidona dose porcamundongo. Uma se-manadepois, o camundongofoisacrificado com gás CO2, o baço foiisolado e osesplenócitos forampreparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 106 células/cavidade ou 0,5 x io6 células/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 22) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 mg/mL. O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2, 22) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 em uma concentração final de 10 mg/mL. Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 20 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00816] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados nas Figuras 7 e 8.

[00817] Nas Figuras 7 e 8, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas e o eixo horizontal mostra o composto ou peptídeo administrado aos camundongos. Na Figura 7, a barra preta mostra os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 enquanto recebiam um pulso com o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 e a barra branca mostra os resultados da cultura sem pulsos. Ou seja, a diferença entre os valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que a administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 ou um composto representado pela fórmula (8) resultounaindução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 in vivonoscamundongos. Na Figura 7, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos de camun-dongostransgênicos para HLA-A0201 não reagiramemgeralnaausência de pulsos com o peptídeo emquestão. Como um resultadodesteensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201. Além disso, na Figura 7, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (8), foi mais elevado do que as células produtoras de IFN-y específicas para peptídeo induzidas pela administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2.

[00818] Na Figura 8, além disso, a barra preta mostra os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 enquanto recebiam um pulso com peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 22 e a barra branca mostra os resultados da cultura sem pulsos. Ou seja, a diferença entre os valores da barra preta e da barra branca mostra o número de células reativas ao peptídeo e que a administração de um composto representado pela fórmula (8) resultou na indução de células que reagem com o peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 22 in vivo nos camundongos e a administração de um pep- tídeo representado por SEQ ID NO: 2 não induziu a células reativas ao peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 22 in vivo nos camundongos. Na Figura 8, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esplenócitos de camundongos transgênicos para HLA-A0201 não reagiram em geral na ausência de pulsos com o peptídeo em questão.

[00819] A partir do acima, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (8) pode induzir a CTLs específicos para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 e células reativas ao peptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 22. É sugerido fortemente que ocompostorepresentado pela fórmula (8) sofreclivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriadopor ERAP-1 noscamundongosin vivo e, naverdade, é processadonospeptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2 e 22. Foiassumido que aindução de células reativasaopeptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 22 produzidas a partir de um compostorepresentado pela fórmula (8) aumentou aindução de CTLs específicos para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 e muitas células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foram encontradas comparado com a administração do composto representado por SEQ ID NO: 2.

[00820] Isto é, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (8), o qual é uma modalidade do composto da presente invenção, é um conjugado em que dois tipos diferentes de peptídeos formam um compósito por meio da ligação de dissulfureto representada na fórmula (1) e é uma vacina conjugada de peptídeo antigênico de câncer WT1 a qual, na verdade, pode induzir a CTLs e células reativas ao pep- tídeo auxiliar in vivo.

Exemplo 10

[00821] Através de um método similar àquele do Exemplo 1, respectivos compostos (conjugados) representados pela fórmula (9) foram sin-tetizados. A Tabela 61 mostram os resultados de espectrometria de massa. (Em cada fórmula, a ligação entre C e C é uma ligação de dis- sulfureto). Tabela 61

Exemplo de Referência 8 - 9

[00822] Através de um método similar àquele do Exemplo 2, peptí- deos que consistem nas sequências de aminoácidos mostradas por SEQ ID NOs: 238 - 239 foram sintetizados. Os resultados de espec- trometria de massa são mostrados na Tabela 62. Uma vez que os pep- tídeos descritos na tabela não são o composto da presente invenção, eles são indicados como exemplos de referência. Tabela 62

Exemplos de Referência 10 - 11

[00823] Através de um método similar àquele do Exemplo 2, peptí- deos que consistem nas sequências de aminoácidos mostradas por SEQ ID NOs: 240 - 241 foram sintetizados. Os resultados de espec- trometria de massa são mostrados na Tabela 63. Uma vez que os pep- tídeos descritos na tabela não são o composto da presente invenção, eles são indicados como exemplos de referência. Tabela 63

[00824] OspeptídeosapresentadosnaTabela 63 foramsintetizadosporreferência aodocumentonão patente, Cancer Science, Janeiro de 2012, Vol. 103, N° 1, 150-153.

Exemplo Experimental 7 Ensaio de estabilidade de vacina conjugada e coquetel Etapa 1

[00825] Conjugado (fórmula N°: (6)) (2,4 mg) foi dissolvido em 120 mL de água para injeção e preservado sob sombra em temperatura ambiente.

Etapa 2

[00826] Como uma vacina em coquetel, o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 (1,1 mg) foi dissolvido em 180 mL de água para injeção, 123 µLdo mesmo foram usados para dissolver o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 (1,3 mg) e a solução foi preservada sob sombra em temperatura ambiente.

Etapa 3

[00827] As soluções (2,5 µl) obtidas na etapa 1 e etapa 2 foram diluídas com água para injeção (50 mL) e submetidas à análise por HPLC (condições de análise são mostradas a seguir) e a percentagem do teor de conjugado e peptídeo na solução aquosa foram medidos com o valor da área imediatamente após o início de preservação como 100%. A percentagem de teor de conjugado é apresentada na Tabela 64 e aquela de cada peptídeo na vacina em coquetel é mostrada na Tabela 65.

Condições de Análise

[00828] Bomba: UFLC fabricada pela Shimadzu

[00829] Coluna: C18 100 Kinetex 2,6 µ, d.i. 3,0 mm x 75 mm

[00830] Fase móvel: SOLUÇÃO A; TFA a 0,1% em água; SOLU ÇÃO B; TFA a 0,1% em acetonitrilo

[00831] Temperatura da coluna: 40 °C

[00832] Taxa de fluxo: 1 mL/min

[00833] Comprimento de onda de detecção: UV 220, 254 nm (2 comprimentos de onda de detecção)

[00834] Volume de injeção de amostra: 10 µL Tabela 64

[00835] No Exemplo Experimental 7, o conjugado representado pela fórmula N° (6) continha 96% do composto representado pela fórmula (6) no ponto de tempo de 2 semanas desde preparo da solução. Em contraste, em uma solução mista de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 24, a qual é uma vacina em coquetel, a percentagem de teor de SEQ ID NO: 24 diminuiu para 65% no ponto de tempo de 1 dia decorrido e para 6% 2 semanas depois. Estes resultados mostram que o conjugado preservado na forma de uma solução aquosa era mais estável do que uma vacina em coquetel preservada sob as mesmas condições.

Exemplo Experimental 8 Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00836] O composto representado pela fórmula (7) sintetizado no Exemplo 8 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgê- nicos para HLA-A0201. O composto representado pela fórmula (7):

[00837]

[00838] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto é, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e o peptídeo antigênico de câncer C é CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201 e CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00839] O camundongo transgênico para HLA-A0201 é conforme descrito nos Exemplos experimentais 2 e 5.

[00840] Se a administração de um composto representado pela fórmula (7) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2): e células reativas ao peptídeo auxiliar (23 a SEQ ID NO) foi avaliado com base na medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 23), de esplenóci- tos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (7). Além disso, os es- plenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (7) e os esple- nócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado por SEQ ID NO: 2 foram re- estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2) e os números de células produtoras de IFN-y foram comparados.

[00841] Especificamente, um peptídeo representado por SEQ ID NO: 2 foi dissolvido em água para injeção com 6 mg/ml e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O peptídeo emulsificado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Um composto representado pela fórmula (7) foi dissolvido em água para injeção (19 mg/mL) e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsionado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 475 mg/local. O número molar do peptídeo de SEQ ID NO: 2 contido na dose do composto representado pela fórmula (7) por camundongo foi ajustada para ser igual àquele do peptídeo de SEQ ID NO: 2 contido na dose por camundongo. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 106 célu- las/cavidade ou 0,5 x io6 células/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 23) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 mg/mL. O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2, 23) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA- A0201 em uma concentração final de 10 mg/mL. Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 17 horas a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadantefoiremovido e a placa para ELISPOT foideixadadesenvolver a cor de acordo com o protocoloanexo. O número de pontos que desenvolveucorfoimedidopeloImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00842] Os resultados do ensaioELISPOT de IFN-y usando osca-mundongostransgênicos para HLA-A0201 são mostradosnasFiguras 9 e 10. NasFiguras 9 e 10, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas e o eixo horizontal mostra o compostooupeptídeo administradoaoscamundongos. Na Figura 9, a barra pretamostraosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 enquantorecebiam um pulso com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e a barra brancamostraosresultados da culturasempulsos. Ouseja, a diferença entre osvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que aadministração do peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 ou um compostorepresentado pela fórmula (7) resultounaindução de CTLs específicos para o peptí- deo mostradopor SEQ ID NO: 2 in vivonoscamundongos. Na Figura 9, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesple- nócitos de camundongostransgênicos para HLA-A0201 não reagiramemgeralnaausência de pulsos com o peptídeo emquestão. Como um resultadodesteensaio, a produção de IFN-y específico para o pep- tídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201. Além disso, naFigura 9, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2, as quaisforaminduzidas pela administração de um compostorepresentado pela fórmula (7), foimaiselevado do que as células produtoras de IFN-y específicas para peptí- deo induzidas pela administração do peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2.

[00843] Na Figura 10, além disso, a barra pretamostraosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongostransgêni- cos para HLA-A0201 enquantorecebiam um pulso com peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 23 e a barra brancamostraosresultados da culturasempulsos. Ouseja, a diferença entre osvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de células reativasaopeptídeo e que aadministração de um compostorepresentado pela fórmula (7) resultounaindução de células que reagem com o peptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 23 in vivonoscamundongos e a administração de um peptídeo representadopor SEQ ID NO: 2 não induziu a células reativasaopeptídeo mostradopor SEQ ID NO: 23 in vivonoscamundongos. Na Figura 10, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos de camundongostransgênicos para HLA-A0201 não reagiramemgeralnaausência de pulsos com o pep- tídeo emquestão.

[00844] A partir do acima, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (7) podeinduzir a CTLs específicos para o peptí- deo mostradopor SEQ ID NO: 2 e células reativasaopeptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 23. É sugerido fortemente que ocompostorepresentado pelafórmula (7) sofreclivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriadopor ERAP-1 noscamundongosin vivo e, naverdade,é processadonospeptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2 e 23. Foiassumido que aindução de células reativasaopeptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 23 produzidas a partir de um compostore-presentado pela fórmula (7) aumentada a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foramencontradascomparado com a administração docompostore-presentadopor SEQ ID NO: 2.

[00845] Istoé, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (7), o qual é umamodalidade do composto da presenteinvenção, é um conjugadoem que doistiposdiferentes de peptídeos formam um compósito pormeio da ligação de dissulfuretorepresentadanafórmula (1) e é umavacinaconjugada de peptídeo antigênico de câncer WT1 a qual, naverdade, podeinduzir a CTLs ecélulas reativasaopeptídeo auxiliar in vivo.

Exemplo Experimental 9

[00846] Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00847] O composto representado pela fórmula (9) sintetizado no Exemplo 10 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgê- nicos para HLA-A0201. O composto representado pela fórmula (9):

[00848]

[00849] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto é, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5) e o peptídeo antigênico de câncer C é CNKRYFKLSHLQMHSRKHG (SEQ ID NO: 24). ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201 e HLA-A2402 e CNKRYFKLSHLQMHSRKHG (SEQ ID NO: 24) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00850] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 são conforme descrito nos Exemplos experimentais 2 e 5.

[00851] Se a administração de um composto representado pela fórmula (9) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 5): e células reativas ao peptídeo auxiliar (24 a SEQ ID NO) foi avaliado com base na medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 5, 24), de esplenóci- tos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi adminis- trado um compostorepresentado pela fórmula (9). Além disso, os es- plenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (9) e osesple- nócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentadopor SEQ ID NO: 5 foram re- estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 5) e osnúmeros de células produtoras de IFN-y foram comparados.

[00852] Especificamente, um peptídeo representado por SEQ ID NO: 5 foi dissolvido em água para injeção com 6 mg/ml e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O peptídeo emulsificado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Um composto representado pela fórmula (9) foi dissolvido em água para injeção (23,6 mg/mL) e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsionado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 590 mg/local. O número molar do peptídeo de SEQ ID NO: 5 contido na dose do composto representado pela fórmula (9) por camundongo foi ajustado para ser igual àquele do peptídeo de SEQ ID NO: 5 contido na dose por camundongo. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 106 célu- las/cavidade ou 0,75 x io6 células/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 5, 24) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 mg/mL. O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 5, 24) foiadicionadoaosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA- A0201 emumaconcentração final de 10 mg/mL.Osesplenócitos com o peptídeo adicionadoforamcultivadosdurante 17 horas a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitrofoirealizada. Após cultura, o sobrenadantefoiremovido e a placa para ELISPOT foideixadadesenvolver a cor de acordo com o protocoloanexo. O número de pontos que desenvolveucorfoimedidopeloImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00853] Os resultados do ensaioELISPOT de IFN-y usando osca-mundongostransgênicos para HLA-A0201 são mostradosnasFiguras 11 e 12. NasFiguras 11 e 12, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas e o eixo horizontal mostra o peptídeo oucompostoadministradoaoscamundongos. Na Figura 11, a barra pretamostraosresultados da cultura de esplenóci- tosderivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 enquantorecebiam um pulso com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 5 e a barra brancamostraosresultados da culturasempulsos. Ouseja, a diferença entre osvalores de a preto e a barra brancamostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que aadministração do pep- tídeo mostradopor SEQ ID NO: 5 ou um compostorepresentado pela fórmula (9) resultounaindução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 5 in vivonoscamundongos. Na Figura 11, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenóci- tos de camundongostransgênicos para HLA-A0201 não reagemnaausência de pulsos com o peptídeo emquestão. Como um resultadodesteensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 5 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201. Na Figura 11, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 5, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (9), foi mais elevado do que as células produtoras de IFN-y específicas para peptídeo induzidas pela administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 5.

[00854] Na Figura 12, além disso, a barra preta mostra os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos transgêni- cos para HLA-A0201 enquanto recebiam um pulso com peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 e a barra branca mostra os resultados da cultura sem pulsos. Ou seja, a diferença entre os valores da barra preta e da barra branca mostra o número de células reativas ao peptídeo e que a administração de um composto representado pela fórmula (9) resultou na indução de células que reagem com o peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 24 in vivo nos camundongos e a administração do peptídeo representado por SEQ ID NO: 5 não induziu a células reativas ao peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 in vivo nos camundongos. Na Figura 12, o valor da barra branca dificilmente é detectado. Isto significa que os esplenócitos de camundongos transgêni- cos para HLA-A0201 não reagem na ausência de pulsos com o peptí- deo em questão.

[00855] A partir do acima, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (9) pode induzir a CTLs específicos para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 5 e CTL reativos com o peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 24. Foi sugerido fortemente que o composto representado pela fórmula (9) sofre clivagem de ligação de dis- sulfureto e corte apropriado por ERAP-1 nos camundongos in vivo e, na verdade, é processado nos peptídeos mostrados por SEQ ID Nos: 5 e 24. Foi assumido que a indução de células reativas ao peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 24 produzidas a partir de um composto representado pela fórmula (9) aumentou a indução de CTLs es- pecíficos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 5 e muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 5 foramencontradascomparado com a administração do compos-torepresentadopor SEQ ID NO: 5.

[00856] Istoé, foiesclarecido que umcompostorepresentado pela fórmula (9), o qual é umamodalidade do composto da presenteinvenção, é um conjugadoem que doistiposdiferentes de peptídeos formam um compósito pormeio da ligação de dissulfuretorepresentadanafórmula (1) e é umavacinaconjugada de peptídeo antigênico de câncer WT1 a qual, naverdade, podeinduzir a CTLs e células reativasaopeptídeo auxiliar in vivo.

Exemplo Comparativo 1

[00857] Avaliação in vivo de capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402

[00858] O composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 238 e 239 sintetizado no Exemplo de Referência 8 e 9 foram avaliados quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402. O composto representado pela fórmula (5):

[00859]

[00860] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é conforme descrito no Exemplo Experimental 2. O peptídeo mostrado por SEQ ID NOs: 238 e 239 é um peptídeo de cadeia longa em que RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), o qual é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201 e CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4), o qual é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402, estão ligados por uma ligação de amida.

[00861] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camun- dongostransgênicos para HLA-A2402 são conformedescrito no Exemplo Experimental 2.

[00862] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 238, 239 resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2, 4) foi julgado com base em medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4), do esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 238, 239.

[00863] Especificamente, um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NOs: 238, 239 foram, cada um, dissolvidos em sulfóxido de dimetila (DMSO) a 40 mg/ml, adicionalmente diluídos com água para injeção para 5 mg/ml e emulsificados por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsificado foi administrado por via intradérmica em 4 locais na base da cauda de um camundongo a 250 µg/local. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 106 célu- las/cavidade e os esplenócitos derivados de camundongos transgêni- cos para HLA-A2402 foram colocados em placas a 1 x 106 célu- las/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4) foi dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 µg/mL.O peptídeo dilu- ído (SEQ ID NO: 2) foiadicionadoaosesplenócitos derivados de ca-mundongostransgênicos para HLA-A0201 emumaconcentração final de 10 µg/mL.Além disso, o peptídeo diluído (SEQ ID NO: 4) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 em uma concentração final de 10 µg/mL.Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 18 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00864] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 13 e os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A2402 são mostrados na Figura 14.

[00865] Em cada Figura, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas. Na Figura 13, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 2 e, na Figura 14, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos trans- gênicos para HLA-A2402 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 4, ou seja, a diferença nos valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos em questão induzidos nos camundongosin vivo pela administração de um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 238, 239.

[00866] Em cada Figura, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esplenócitos dos respectivos camundongos trans- gênicos não reagiramemgeralnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA- A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) e a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 4 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A02402 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5). Por outro lado, embora a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 tenha sido detectada nos esple- nócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 238, no entanto, quando comparado com os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5), seu número foi muito pe-queno. A produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 4 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 aos quais foi administrado o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 238. Embora a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 tenha sido detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 239, no entanto, quando comparado com os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5), seu número foi pequeno. A produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 4 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 aos quais foi administrado o peptídeo SEQ ID NO: 239.

[00867] A partir do acima, foiesclarecido que ocompostorepresentado pela fórmula (5) da presenteinvenção é capaz de induzireficientemente a CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO : 4. Por outro lado, o peptídeo de cadeia longa mostradopor SEQ ID NOs: 238, 239 não pôde induzireficientemente tanto a CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 quanto CTLs específico para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 4.

Exemplo Comparativo 2 Avaliação da capacidade de indução de CTLs in vivo usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402

[00868] O composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e peptídeos mostrados por SEQ ID NOs: 240 e 241 sintetizados nos Exemplos de Referência 10 e 11 foram avaliados quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA -A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402. O composto representado pela fórmula (5):

[00869]

[00870] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é conforme descrito no Exemplo Experimental 2. O peptídeo mostrado por SEQ ID NOs: 240 e 241 é um peptídeo de cadeia longa em que RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), o qual é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201 e CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4), o qual é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402, estão ligados por uma ligação de amida através de 6 glicinas como um espaçador peptídico.

[00871] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402 são conforme indicado no Exemplo Experimental 2.

[00872] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (5) e um peptídeo de SEQ ID NO: 240, 241 mostradoresultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2, 4) foi avaliado com base na medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 240, 241.

[00873] Especificamente, um composto representado pela fórmula (5) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmente diluído com água para injeção para 10 mg/mL e emulsificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsificado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 500 µg/local. Além disso, os peptídeos mostrados por SEQ ID NOs: 240, 241 foram dissolvidos em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmente diluídos com água para injeção para 11 mg/mL e emulsificados por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O com-posto emulsificado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 550 µg/local. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 a 0,25 x 106 células/cavidade e esplenócitos derivados de camundongos transgê- nicos para HLA-A2402 a 1,5 x 106 células/cavidade preparados foram cultivadosemumaplaca para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4) foidissolvidoem DMSO para 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 mg/mL. O peptí- deo diluído (SEQ ID NO: 2) foiadicionadoaosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 emumaconcentração final de 10 mg/mL.Além disso, o peptídeo diluído (SEQ ID NO: 4) foiadicionadoaosesplenócitos derivados de camundongostransgê- nicos para HLA-A2402 em uma concentração final de 10 µg/mL.Osesplenócitos com o peptídeo adicionadoforamcultivadosdurante 17 horas a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitrofoirealizada. Após cultura, o sobrenadantefoiremovido e a placa para ELISPOT foideixadadesenvolver a cor de acordo com o protocoloanexo. O número de pontos que desenvolveucorfoimedidopeloImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00874] Osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando ca-mundongostransgênicos para HLA-A0201 são mostradosnaFigura 15 e osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundon-gostransgênicos para HLA-A2402 são mostradosnaFigura 16.

[00875] EmcadaFigura, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas. Na Figura 15, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de es- plenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 2 e, naFigura 16, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A2402 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 4, ouseja, a diferença nosvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos emquestão induzidosnoscamundongosin vivo pela administração de um composto representado pela fórmula (5) e ospeptídeos mostradospor SEQ ID NOs: 240, 241.

[00876] EmcadaFigura, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongostransgênicos não reagiunaausência do peptídeo emquestão. Como um resultadodesteensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 2 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicospara HLA- A0201 aosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (5) e a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 4 foidetectadanosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A2402 aosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (5). Por outrolado, a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 2 era extremamentemenosnosesplenóci- tosderivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 aosquaisfoiadministrado o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 240; No entanto, a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 4 foidetectadanosesplenócitos derivados de HLA-A02402 camundongotransgênico aosquaisfoiadministrado um compostorepresentadopor SEQ ID NO: 240. Além disso, a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 2 era extremamentemenosnosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 aosquaisfoiadministrado o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 241. Embora a produção de IFN-y específico para o peptídeo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 4 foidetectadaemosesplenócitos derivadosde camundongostransgênicos para HLA-A0201 aosquaisfoiadministrado o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 241; No entanto, quandocomparado com osesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A2402 aosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (5), seunúmero foimuitopequeno.

[00877] A partir de cima, foiesclarecido que ocompostorepresentado pela fórmula (5) da presenteinvenção é capaz de induzireficientemente a CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 4. Por outro lado, o peptídeo de cadeia longa contendo o peptídeo espaçador mostradopor SEQ ID NO: 240, 241 não podeinduzir de forma eficiente tanto a CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 quanto a CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 4.

Exemplo Experimental 10

[00878] O peptídeo sintetizado no Exemplo de Referência 3 e os compostos (conjugados) sintetizados nos Exemplos 6 e 9 foram sub-metidos à medição de solubilidade através de um método similar àquele do Exemplo Experimental 3. Cada solubilidade é mostrada na Tabela 66. Tabela 66

Exemplos 11 - 12

[00879] Através de um método similar àquele do Exemplo 2, peptí- deos que consistemnassequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 242 - 243 foramsintetizados. Osresultados de espectrometria de massasão mostradosnaTabela 67. Ospeptídeos descritosnaTabela 67 são oscompostos da presenteinvenção. Tabela 67

Exemplo 13

[00880] Através de um método similar àquele do Exemplo 1, cada um dos compostos (conjugados) representados pela fórmula 10 foi sintetizado. Os resultados de espectrometria de massa são mostrados na Tabela 68, em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto. Tabela 68

Exemplo de Referência 12

[00881] Através de um método similar àquele do Exemplo 1, cada um dos compostos (conjugados) representados pela fórmula 11 foi sintetizado. Os resultados de espectrometria de massa são mostrados na Tabela 69, em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto. O peptídeo descrito na tabela não é o composto da presente invenção e, portanto, ele é descrito como Exemplo de Referência. Tabela 69 Exemplo 14 Síntese do composto representado pela fórmula (12):

[00882]

[00883] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto.

[00884] Etapa 1. Síntese de Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn (Mmt é 4- Metoxitritila) (Síntese de Fmoc-C(Mmt)A-SBn)

[00885] Uma solução de Fmoc-Cys(Mmt)-OH (4,80 g), N,N-di- isopropiletilamina (2,56 mL), ácido hexafluorofosfórico (benzotriazol-1- ilóxi)tripirrolidinofosfônio (4,50 g) e H-Ala-SBn sintetizado através de um método conhecido (por exemplo, Journal of Organic Chemistry, Vol. 64, N° 24 8761-8769) em clorofórmio (20 ml) foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. A mistura de reação foi purificada por meio de cromatografia em coluna (solvente de eluição, hexano/acetato de etila) para se obter o composto em questão, Fmoc-C(Mmt)A-SBn (2,80 g).

[00886] RMN: 1H RMN (CDCl3) d 7,72 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,38-7,34 (m, 7H), 7,29-7,25 (m, 6H), 7,23-7,15 (m, 7H), 6,76 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,95 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,57 (quin, J = 7,6 Hz, 1H), 4,35 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,19-4,17 (m, 1H), 4,04 (s, 2H), 3,73 (s, 3H), 2,72 (dd, J = 13,2, 8,4 Hz, 1H), 2,61 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

[00887] Etapa 2. Síntese de H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn- Gln-Met-Asn-Leu-OH (Síntese de C(Mmt)ACYTWNQMNL)

[00888] Uma solução de Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn (11 mg) obtida no etapa 1, H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (21 mg) sin-tetizadaatravés de um método conhecido (porexemplo, documento WO07/063903), N,N-di-isopropiletilamina (200 µL), cloridrato de ácido 3,3',3''-fosfanotritil tripropanoico (1 mg), ácido 4-mercaptofenilacético (1 mg) e tampão de fosfato de sódio a 0,1 M (pH de 7,5, 200 µl) em DMF (400 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4 h. À mistura de reação foi adicionada dietilamina (200 mL) e a mistura foi ainda agitada durante 15 min. A mistura de reação foi purificada por meio de HPLC de fase inversa para se obter o composto em questão, C(Mmt)ACYTWNQMNL (7 mg).

[00889] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 810,2 [M+2H]2+ (Calculado = 810,5)

[00890] Etapa 3. Síntese de ligação de dissulfureto (H-Cys(Mmt)- Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe- Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) [isto é, síntese de um composto repre-sentado pela fórmula (13):

[00891]

[00892] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto.

[00893] Uma solução de H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln- Met-Asn-Leu-OH (51 mg) obtida no Etapa 2 e (H-Cys(Npys)-Arg-Met- Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (43 mg), obtida no Exemplo 1, etapa 1, em DMF (4 mL) foiagitadaemtemperaturaambientedurante 2 h. A mistura de reação foipurificadapormeio de HPLC de faseinvertida para proporcionar 39 mg do compostoemquestão, ligação de dissulfu- reto (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H- Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) [istoé, um compostorepresentado pela fórmula (13)].

[00894] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1414,4 [M+2H]2+ (Calculado = 1415,2)

[00895] Etapa 4. Síntese de H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys- Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (Síntese de C(SPy)NKRYFKLSHLQMHSRK)

[00896] Uma solução a 20% peso/peso de H-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr- Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (182 mg), obtida no Exemplo de Referência 1, e bissulfeto de 2,2'-dipiridila (solução a 0,2 M em isopropanol, 544 µL) em ácido acético/água (4 mL) foi agi-tadaemtemperaturaambientedurante 17 horas. A mistura de reação foipurificadapormeio de HPLC de faseinversa para proporcionar o compostoemquestão, H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser- His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (177 mg).

[00897] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1143,5 [M+2H]2+ (Calculado = 1142,9)

[00898] Etapa 5. Síntese de um compostorepresentado pela fórmula (12):

[00899]

[00900] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto.

[00901] Uma solução de ligação de dissulfureto(H-Cys(Mmt)-Ala- Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro- Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) btida no etapa 3 [istoé, um compostorepre-sentado pela fórmula (13)] (9 mg), H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe- Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (24 mg), obtida no etapa 4, e tri-isopropil-silano (10 mL) emácido trifluoroacético (190 mL) foiagitadaemtemperaturaambientedurante 1 h. A mistura de reação foipurificadapormeio de HPLC de faseinversa para proporcionar o compostoemquestão, um compostorepresentado pela fórmula 12 (5 mg).

[00902] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1577,2 [M+3H]3+ (Calculado = 1577,9).

Exemplos 15 - 16

[00903] Através de um método similar àquele do Exemplo 14, cada um dos compostos (conjugados) representados pela fórmula 14 ou 15 foi sintetizado. Os resultados de espectrometria de massa são mostrados na Tabela 70, em que a ligação entre C e C é uma ligação de dis- sulfureto. Tabela 70

Exemplo de Referência 13

[00904] Através de um método similar àquele do Exemplo 2, peptí- deos constituídos pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244 foram sintetizados. A Tabela 71 mostram os resultados de espectro- metria de massa. O peptídeo descrito na tabela não é o composto da presente invenção e, portanto, ele é descrito como Exemplo de Referência. Tabela 71

Exemplo Experimental 11 Avaliação da capacidade de indução de CTLs in vivousando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00905] O compostorepresentado pela fórmula (10) sintetizado no Exemplo 13 foiavaliadoquantoà capacidade de indução de CTLs por um ensaioin vivo de indução de CTLs usandocamundongostransgê- nicospara HLA-A0201. O compostorepresentado pela fórmula (10):

[00906]

[00907] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfuretoé, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e peptídeo antigênico de câncer B é WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) é um peptídeo de WT1 restritoa HLA-A0201 e WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (istoé, peptídeo auxiliar).

[00908] Oscamundongostransgênicos para HLA-A0201 são con-formedescritonosExemplosExperimentais 2 e 5.

[00909] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (10) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2) foijulgado com base emmedição da produçãode IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2), de esplenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (10). Se o peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 244) funcionaounão no corpo vivo foiavaliadocomparando-se o número de células produtoras de IFN-y quandoosesplenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (10) e osesplenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 foram re- estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00910] Especificamente, um compostorepresentadopor SEQ ID NO: 2 foidissolvidoemsulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmentediluído com água para injeção para 3 mg/mL e emulsi- ficadopormeio de mistura com umaquantidadeigual de adjuvanteincompleto de Freund (IFA). O compostoemulsificadofoiadministradopor via intradérmica em 2 locaisna base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Além disso, um composto representado pela fórmula (10) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmente diluído com água para injeção para 8,5 mg/mL e emul- sificado por meio de mistura com uma quantidade igual de adjuvante incompleto de Freund (IFA). O composto emulsificado foi administrado por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 425 µg/local. O número molar do peptídeo da SEQ ID NO: 2 contido na dose de um composto representado pela fórmula (10) por camundongo foi controlado para ser igual ao número molar contido na dose do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 por camundongo. Além disso, a concentração de DMSO contida em cada emulsão foi também ajustada para o mesmo nível. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenó- citos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,125 x 106 células/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4) foi dissolvido em DMSO para 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 µg/mL.O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2) foi adicionado aos esplenó- citos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 em uma concentração final de 10 µg/mL.Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 19 horas a 37 °C, 5% de CO2, pelo que re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desen-volver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00911] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 17. Na Figura 17, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas e o eixo horizontal mostra o composto ou peptídeo administrado aos camundongos. Na Figura 17, a barra preta mostra os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 enquanto recebiam um pulso com o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 e a barra branca mostra os resultados da cultura sem pulsos. Ou seja, a diferença entre os valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que a administração do peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 ou um composto representado pela fórmula (10) resultou na indução de CTLs específicos para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 in vivo nos camundongos. Na Figura 17, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esplenóci- tos de camundongos transgênicos para HLA-A0201 não reagiram em geral na ausência de pulsos com o peptídeo em questão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201. Além disso, na Figura 17, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (10), foi mais elevado do que as células produtoras de IFN-y específicas para peptídeo induzidas pela administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2.

[00912] A partir do acima, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (10) pode induzir a CTLs específicos para o pep- tídeo mostrado por SEQ ID NO: 2. Quando um composto representado pela fórmula (10) foi administrado, muitas células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foram observadas como comparado com a administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2. Foi assumido que a indução de células reativas ao peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 244 produzido a partir de um composto representado pela fórmula (10) aumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2. Portanto, foi sugerido fortemente que o composto representado pela fórmula (10) sofre clivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriado por ERAP-1 nos camundongos in vivo e, na verdade, é processado nos peptídeos mostrados por SEQ ID NOs: 2 e 244.

[00913] Isto é, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (10), o qual é uma modalidade do composto da presente invenção, é um conjugado em que dois tipos diferentes de peptídeos formam um compósito por meio da ligação de dissulfureto representada na fórmula (1) e é uma vacina conjugada de peptídeo antigênico de câncer WT1 a qual, na verdade, pode induzir a CTLs e células reativas ao peptídeo auxiliar in vivo.

Exemplo Comparativo 3 Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00914] O composto representado pela fórmula (11) sintetizado no Exemplo de Referência 12 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando ca- mundongostransgênicos para HLA-A0201. O compostorepresentado pela fórmula (11):

[00915]

[00916] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfuretoé, em particular, um composto da fórmula geral (1) supracitada, em que o peptídeo antigênico de câncer A é RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) e o peptídeo antigênico de câncer C é WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) é um peptídeo de WT1 restritoa HLA-A0201 e WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (istoé, peptí- deo auxiliar).

[00917] Oscamundongostransgênicos para HLA-A0201 são con-formedescritonosExemplosExperimentais 2 e 5.

[00918] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (11) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2) foijulgado com base emmedição da produção de IFN-y por re-estimulação, com um peptídeo (SEQ ID NO: 2), osesplenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (11). Se o peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 244) funcionaounão no corpo vivo foiavaliadocomparando-se o número de células produtoras de IFN-y quandoosesplenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado um compostorepresentado pela fórmula (11) e osesplenócitos derivados dos camundongossupracitadosaosquaisfoiadministrado o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 foram re- estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00919] Através de um método similar àquele doExemplo Experimental 11, foirealizado o ensaio de indução de CTL.

[00920] Osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usandoos ca- mundongostransgênicos para HLA-A0201são mostradosnaFigura 18. Na Figura 18, o eixo vertical mostra o número de células que reagi-ramnascélulas colocadasemplacas e o eixo horizontal mostra o compostooupeptídeo administradoaoscamundongos. Na Figura 18, a barra pretamostraosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 enquantorecebiam um pulso com o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e a barra brancamostraosresultados da culturasempulsos. Ouseja, a diferença entre osvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs específicos para o peptídeo e que aadministração do peptí- deo mostradopor SEQ ID NO: 2 ou um compostorepresentado pela fórmula (11) resultounaindução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 in vivo noscamundongos. Na Figura 18, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenóci- tos de camundongostransgênicos para HLA-A0201 não reagiramemgeralnaausência de pulsos com o peptídeo emquestão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201. Por outro lado, na Figura 18, um aumento de células produtoras de IFN-y específico para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração do peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, não pôde ser detectado através da administração de um composto representado pela fórmula (11).

[00921] Os resultados do Exemplo Experimental 11 e Exemplo Comparativo 3 sugerem que, quando WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) é usado como um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II, WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) como o peptídeo antigênico de câncer B na fórmula geral (1) supracitada é uma modalidade mais preferida da invenção do que WAPVLDFAP- PGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243) como o peptídeo antigênico de câncer C.

Exemplo Experimental 12 Avaliação in vivo de capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402

[00922] A capacidade de indução de CTLs do composto representado pela fórmula 12 sintetizado no Exemplo 14 foi avaliada por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contido no composto representado pela fórmula (12):

[00923]

[00924] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402 e CNKRYF- KLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22) é peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00925] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402 são conforme descrito nos Exemplos Experimentais 2 e 5.

[00926] Se a administração de um composto representado pela fórmula (12) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2, 4) foi avaliado com base em medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (12). Se o peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 22) funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN-y quando os esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (12) e os esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) foram re- estimulados com o peptídeo (SEQ ID NOs: 2, 4).

[00927] Especificamente, um composto representado pela fórmula (5) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmente diluído com água para injeção para 3 mg/mL e emulsifica- do por meio de mistura com uma quantidade igual de Montanide ISA51VG. O composto emulsificado foi administrado por via intradér- mica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Além disso, um compostorepresentado pela fórmula (12) foidissolvidoemsulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmentediluído com água para injeção para 6 mg/mL e emulsificadopormeio de mistura com umaquantidadeigual de Montanide ISA51VG. O compos-toemulsificadofoiadministradopor via intradérmica em 2 locaisna base da cauda de um camundongo a 300 µg/local. O número molar do compostorepresentado pela fórmula (5) contidana dose do compostorepresentado pela fórmula (12) porcamundongofoicontrolado para ser igualaonúmero molar contidona dose do compostorepresentado pela fórmula (5) porcamundongo. Além disso, a concentração de DMSO contidaemcadaemulsão foitambém ajustada para o mesmonível. Uma semanadepois, oscamundongosforamsacrificados com gás CO2, o baço foiisolado e osesplenócitos forampreparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foiusado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, umaplaca para ELISPOT foitratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no diaseguinte. Osesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA- A0201 preparadosforamcolocadosemplacas e esplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A2402 foramcolocadosem placas, cada um a 0,25 x 106 células/cavidade, na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4) foi dissolvido em DMSO para 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 µg/mL.O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 em uma concentração final de 10 µg/mL.Além disso, o peptídeo diluído (SEQ ID NO: 4) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 em uma concentração final de 10 µg/mL.Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 17 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re- estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrena- dante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00928] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 19 e os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando camundongos transgênicos para HLA-A2402 são mostrados na Figura 20.

[00929] Em cada Figura, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas. Na Figura 19, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 2 e, na Figura 20, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos trans- gênicos para HLA-A2402 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 4, ou seja, a diferença nos va- lores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs es-pecíficos para cada um dos peptídeos emquestão induzidosnosca-mundongosin vivo pela administração de compostosrepresentados pela fórmula (5) e fórmula (12).

[00930] EmcadaFigura, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongos trans- gênicos não reagiramnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptí- deo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada em esple- nócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foram administrados compostos representados pela fórmula (5) e fórmula (12) e a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 4 foi detectada nos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A2402 aos quais foram administrados compostos representados pela fórmula (5) e fórmula (12). Na Figura 19, o número das células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (12), foi mais elevado do que o número das células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (5). Por outro lado, na Figura 20, o número das células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 4, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (12), não difere muito do número de células produtoras de IFN-y células específicas para o peptídeo, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (5).

[00931] A partir do acima, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (12) pode induzir a CTLs específicos para o pep- tídeo mostrado por SEQ ID NOs: 2, 4. Quando um composto represen- tado pela fórmula (12) foiadministrado, muitascélulas produtoras de IFN-y específico para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foram observadas quando comparado com a administração do composto representado pela fórmula (5). Foi assumido que a indução de células reativas ao peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 22 produzidas a partir de um composto representado pela fórmula (12) aumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2. A ausência de uma grande diferença na quantidade células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 4 entre a administração de um composto representado pela fórmula 12 e a administração de um composto representado pela fórmula (5) foi assumida como sendo atribuível à ausência da indução de células que reagem com o peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 22, uma vez que os camundongos transgênicos para HLA-A2402 não expressam moléculas do MHC de classe II humanas. Portanto, foi sugerido fortemente que o composto representado pela fórmula (12) sofre clivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriado por ERAP-1 nos camundongos in vivo e é, na verdade, processado nos peptídeos mostrados por SEQ ID NOs: 2, 4 e 22.

[00932] Isto é, foi esclarecido que um composto representado pela fórmula (12), o qual é uma modalidade do composto da presente invenção, é um conjugado em que três tipos diferentes de peptídeos formam um compósito por meio da ligação de dissulfureto e é uma vacina conjugada de peptídeo antigênico WT1 de câncer que pode, na verdade, induzir a CTLs e células reativas ao peptídeo auxiliar in vivo. Exemplo Experimental 13

[00933] Avaliação in vivo de capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402

[00934] A capacidade de indução de CTLs do composto represen- tado pela fórmula (14) sintetizado no Exemplo 15 foiavaliadapor um ensaioin vivo de indução de CTLs usando um camundongostransgê- nicospara HLA-A0201 e um camundongostransgênicos para HLA- A2402. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contidoem um compostorepresentado pela fórmula (14):

[00935]

[00936] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402, WAPVLDFAP- PGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00937] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 e camundongos transgênicos para HLA-A2402 são conforme descrito nos Exemplos Experimentais 2 e 5.

[00938] Se a administração de um composto representado pela fórmula (14) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2, 4) foi avaliado com base em medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2, 4), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (14). Se o peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 244) funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN- y quando os esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (14) e os esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00939] Através de um método similar àquele do Exemplo Experimental 12, foi realizado um ensaio de indução de CTLs. O composto representado pela fórmula (14) foidissolvidoemsulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, diluído com água para injeção para 5,6 mg/ml e misturado com umaquantidadeigual de Montanide ISA51VG para proporcionarumaemulsão. O compostoemulsificadofoiadministradopor via intradérmica em 2 locaisna base da cauda de um camundongo a 280 µg/local.

[00940] Osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando camun-dongostransgênicos para HLA-A0201 são mostradosnaFigura 21 e osresultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usandocamundongostransgênicos para HLA-A2402 são mostradosnaFigura 22.

[00941] EmcadaFigura, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas. Na Figura 21, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de esplenóci- tosderivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 2 e, naFigura 22, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de esplenócitos derivados de camundongos trans-gênicos para HLA-A2402 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 4, ouseja, a diferença nosvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos emquestão induzidosnoscamundongosin vivo pela administração de compostosrepresentadospelasfórmulas (5) e (14).

[00942] EmcadaFigura, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongos trans- gênicos não reagiramnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultadodesteensaio, a produção de IFN-y específico para o peptí- deo emquestão mostradopor SEQ ID NO: 2 foidetectadanosesple- nócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 administrados com compostosrepresentadospelasfórmulas (5) e (14) e a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostradopor SEQ ID NO: 4 foidetectadanosesplenócitos derivados de ca-mundongostransgênicos para HLA-A2402 administrados com com-postosrepresentadospelasfórmulas (5) e (14). NasFiguras 21 e 22, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2, 4, as quaisforaminduzidas pela administração de um compostorepresentado pela fórmula (14), foimaiselevado do que o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo, as quaisforaminduzidas pela administração de um compostorepresentado pela fórmula (5).

[00943] A partir do acima, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (14) podeinduzir a CTLs específicos para peptí- deosmostradospor SEQ ID NOS: 2 e 4. Foiassumido que a indução de células reativasaopeptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 244 produzido a partir de um compostorepresentado pela fórmula (14) aumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 e muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2 foramencontradasquando um compostorepresentado pela fórmula (14) foiadministradocomparado com a administração de um compostorepresentado pela fórmula (5). Por outro lado, muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 4 foramencontradasquando um compostorepresentado pela fórmula (14) foiadministradocomparado com aadministração de um compostorepresentado pela fórmula (5). Foisugerido que o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 244 se ligouao MHC de classe II de camundongoexpressanoscamundongostransgênicos para HLA-A2402 para induzir a células reativasaopeptídeo auxiliar o que, porsuavez, aumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 4. Portanto,foisugerido fortemente que ocompostorepresentado pela fórmula (14) sofreclivagem da ligação de dissulfureto e corte apropriadopor ERAP-1 noscamundongosin vivo e, naverdade, é processadonospeptídeos mostradospor SEQ ID NOs: 2, 4 e 244.

[00944] Istoé, foiesclarecido que um compostorepresentado pela fórmula (14), o qual é umamodalidade do composto da presenteinvenção, é um conjugadoem que três tiposdiferentes de peptídeos formam um compósito pormeio da ligação de dissulfureto e é umavacinaconjugada de peptídeo WT1 antigênico de câncer que pode, naverdade, induzir a CTLs e células reativasaopeptídeo auxiliar in vivo. Exemplo Experimental 14

Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00945] Uma vacina em coquetel que é uma mistura do composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 22 sintetizado no Exemplo de Referência 1 foi avaliado quanto à capacidade de indução de CTLs por um ensaio de indução de CTLs in vivo usando camundongos transgênicos para HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contido no composto representado pela fórmula (5):

[00946]

[00947] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402 e CNKRYF- KLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00948] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 são conforme descrito nos Exemplos Experimentais 2 e 5.

[00949] Se a administração de um composto representado pela fórmula (5) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2) foi julgado com base em medição da produ- ção de IFN-y por re-estimulação, com um peptídeo (SEQ ID NO: 2), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5). Se o peptí- deo auxiliar (SEQ ID NO: 22) misturado com a fórmula (5) funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN-y quando os esplenócitos derivados a partir do rato acima mencionada administrada com um composto representado pela fórmula (5) sozinho e os esplenócitos derivados a partir do rato acima mencionada administrada com uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 22 foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00950] Especificamente, um composto representado pela fórmula (5) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmente diluído com água para injeção para 3 mg/mL e emulsifica- do por meio de mistura com uma quantidade igual de Montanide ISA51VG. O composto emulsificado foi administrado por via intradér- mica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Além disso, um compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 22 foramdissolvidosemsulfóxido de dimeti- la (DMSO) para 80 mg/ml, diluído com água para injeção e misturados de modo que a concentração após diluição fosse de 3 mg/mL para o compostorepresentado pela fórmula (5) e 2,7 mg/ml para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 22. A solução misturadafoidiluída com umaquantidadeigual de Montanide ISA51VG para proporcionarumaemulsão. A vacinaemcoquetelcontendo um compostorepresentado pela fórmula (5) a 150 µg/sftioe o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 22 a 137 µg/sftiofoi administrada por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo. A concentração de DMSO de cada uma das emulsões foi ajustada para o mesmo nível. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 106 células/cavidade na placa para ELIS- POT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2) foi dissolvido em DMSO para 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 µg/mL.O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA- A0201 em uma concentração final de 10 µg/mL.Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 17 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00951] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 23.

[00952] Na Figura 23, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas. Na Figura 23, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 2. Isto é, a diferença nos valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos em questão induzidos nos camundongos in vivo pela administração de uma vacina em coquetel contendo um composto representado pela fórmula (5) e um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 22).

[00953] Na Figura 23, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongostransgêni- cos não reagiramnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 22). Na Figura 23, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 22) foi mais elevado do que o número de células produtoras de IFN-y específicas do peptídeo, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (5) apenas.

[00954] A partir do acima, foi esclarecido que uma vacina contendo um coquetel de composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 22 pode induzir a CTLs específicos para peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 2. Além disso, muitas células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foram encontradas quando a vacina foi administrada em coquetel comparado com a administração única de um composto representado pela fórmula (5). Foi assumido que a indução de células reativas ao peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 22 contido na vacina em coquetel aumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2. Assim, foi esclarecido que uma vacina em coquetel contendo um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo auxiliar pode induzir a CTLs fortemente no corpo de camundongos comparado com a administração única de um composto repre- sentado pela fórmula (5).

Exemplo Experimental 15 Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs HLA-A0201 usando camundongo transgênico

[00955] A capacidade de indução de CTLs de uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 244, sintetizado no Exemplo de Referência 13 foi avaliada por um ensaio in vivo deindução de CTLs usando um camundongo transgênico para HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contido em um composto representado pela fórmula (5):

[00956]

[00957] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402 e WAPVLDFAP- PGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00958] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 são conforme descrito nos Exemplos experimentais 2 e 5.

[00959] Se a administração de um composto representado pela fórmula (5) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2) foi julgado com base em medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5). Se o peptí- deo auxiliar (SEQ ID NO: 244) misturado com a fórmula (5) que funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN-y quando os esplenócitos derivados de camundongos mencionados acima aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e os esplenócitos deriva- dos de camundongosmencionadosacimaaosquaisfoiadministradaumavacinaemcoquetel de um compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 244 foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00960] Através de um método similar àquele doExemplo Experimental 14, foirealizado um ensaio de indução de CTLs. Para proporcio-narumavacinaemcoquetel, um compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 244 foramdissolvidosemsulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, diluídos com água para injeção e misturados de modo que a concentração após a diluição fosse de 3 mg/mL para o compostorepresentado pela fórmula (5) e 2,3 mg/ml para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 244. A solução diluída foimisturada com umaquantidadeigual de Montanide ISA51VG para proporcionarumaemulsão . Uma vacinaemcoquetelcontendo o composto representado pela fórmula (5) a 150 µg/sftioe o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 244 a 115 µg/sitio foi administrada por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo.

[00961] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 24.

[00962] Na Figura 24, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas. Na Figura 24, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 2. Isto é, a diferença nos valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos em questão induzidos nos camundongos in vivo pela administração de uma vacina em coquetel contendo um composto representado pela fórmula (5) e um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 244).

[00963] Na Figura 24, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongostransgêni- cos não reagiramnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 244). Na Figura 24, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 244), foi mais elevado do que o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptí- deo, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (5) apenas.

[00964] A partir do acima, foi esclarecido que uma vacina contendo um coquetel de composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 244 pode induzir a CTLs específicos para peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 2. Além disso, muitas células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foram encontradas quando a vacina foi administrada em coquetel comparado com a administração única de um composto representado pela fórmula (5). Foi assumido que a indução de células reativas ao peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 244 contido na vacina em coquetel aumentada a indução de CTLs específicos para o peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 2. Assim, foi esclarecido que uma vacina em coquetel contendo um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo auxiliar pode induzir a CTLs fortemente no corpo de camundongos comparado com a administração única de um composto representado pela fórmula (5).

[00965] Como umamodalidade para produzirumavacinacontendodoispeptídeos antigênicos WT1, umavacinaemcoquetelcontendodoispeptídeos diferentescomo um preparadoúnico pode ser mencionada.Quando de produção de umavacinaemcoquetel, as propriedades dos peptídeos antigênicos de câncer a seremmisturadosimpõem um problema. ConformemostradonaTabela 60 e Tabela 66, a produção de um coquetel de doispeptídeos antigênicos WT1 significaprocessamento de doispeptídeos tendodiferentessolubilidades, ouseja, propriedades, em um preparado. Emcontraste, o conjugado da presenteinvenção é um compostoem que doispeptídeos antigênicos WT1 são ligadosatravés de umaligação de dissulfureto e mostraumasolubilidadeúnica, istoé, propriedades. Istosignifica que oconjugado da presenteinvenção tem a propriedadeúnica e também tem a propriedadecorrespondente para osdoispeptídeos antigênicos WT1, conformemostrado no Exemplo Experimental 2. Neste aspecto, foimostrado que oconjugado da presenteinvenção é um compostocapaz de induzir a umarespostaaosdoispeptídeos antigênicos WT1 sem a necessidade de considerarumainteração entre osdoispeptídeos anti- gênicos WT1 e assimpordiante, aocontrário de vacinasemcoquetel. Exemplo Experimental 16

[00966] Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00967] A capacidade de indução de CTLs de uma vacina em quetel de um composto representado pela fórmula (5) sintetizado Exemplo 1 e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 sintetizado Exemplo de Referência 2 foi avaliada por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contido em um composto representado pela fórmula (5):

[00968]

[00969] em que a ligação entre C e C é umaligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restritoa HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402 e CNKRYF- KLSHLQMHSRKTG (SEQ ID NO: 24) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II d (istoé, peptídeo auxiliar).

[00970] Oscamundongostransgênicos para HLA-A0201 são con-formedescritonosExemplosExperimentais 2 e 5.

[00971] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (5) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2) foijulgado com base emmedição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5). Se o peptí- deo auxiliar (SEQ ID NO: 24) misturado com a fórmula (5) funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN-y quando os esplenócitos derivados dos camundongos mencionados acima aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e os esplenócitos derivados dos camundongos mencionados acima aos quais foi administrada uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00972] Especificamente, um composto representado pela fórmula (5) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, adicionalmente diluído com água para injeção para 3 mg/mL e emulsifica- do por meio de mistura com uma quantidade igual de Montanide ISA51VG. O composto emulsificado foi administrado por via intradér- mica em 2 locais na base da cauda de um camundongo a 150 µg/local. Além disso, um compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 24 foramdissolvidosemsulfóxido de dimeti- la (DMSO) para 80 mg/ml e diluídos com água para injeção. Elesfo-rammisturados de modo que a concentração após diluição fosse de 3 mg/mL para o compostorepresentado pela fórmula (5) e 3,11 mg/ml para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 24. A solução diluída foimisturada com umaquantidadeigual de Montanide ISA51VG para proporcionarumaemulsão. A vacinaemcoquetelcontendo um composto representado pela fórmula (5) a 150 µg/local e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 a 156 µg/local foi administrada por via intra- dérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo. A concentração de DMSO de cada uma das emulsões foi ajustada para o mesmo nível. Uma semana depois, os camundongos foram sacrificados com gás CO2, o baço foi isolado e os esplenócitos foram preparados. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y foi usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior de preparo de esplenócitos, uma placa para ELISPOT foi tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. Os esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 preparados foram colocados em placas a 0,25 x 1O6 célu- las/cavidade na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 2) foi dissolvido em DMSO para 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 µg/mL.O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 2) foi adicionado aos esplenócitos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 para uma concentração final de 10 µg/mL.Os esplenócitos com o peptídeo adicionado foram cultivados durante 19 h a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitro foi realizada. Após cultura, o sobrenadante foi removido e a placa para ELISPOT foi deixada desenvolver a cor de acordo com o protocolo anexo. O número de pontos que desenvolveu cor foi medido pelo ImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

[00973] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca- mundongostransgênicos para HLA-A0201 são mostradosnaFigura 25.

[00974] Na Figura 25, o eixo vertical mostra o número de células que reagiramnascélulas colocadasemplacas. Na Figura 25, a barra preta e a barra brancamostramosresultados da cultura de esplenóci- tosderivados de camundongostransgênicos para HLA-A0201 napresença ouausência do peptídeo emquestão representadopor SEQ ID NO: 2. Istoé, a diferença nosvalores da barra preta e da barra brancamostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos emquestão induzidosnoscamundongosin vivo pela administração de umavacinaemcoquetelcontendo um compostorepresentado pela fórmula (5) e um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 24).

[00975] Na Figura 25, o valor da barra brancanão é detectado. Istosignifica que osesplenócitos dos respectivoscamundongostransgêni- cos não reagiramnaausência do peptídeo emquestão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 24). Na Figura 25, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 24), foi mais elevado do que o número de células produtoras de IFN-y específicas do peptídeo, as quais foram induzidas pela administração única de um composto representado pela fórmula (5) apenas.

[00976] A partir do acima, foi esclarecido que uma vacina contendo um coquetel de composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 24 pode induzir a CTLs específicos para peptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2. Além disso, muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foramencontradasquando a vacinafoiadministradaemcoquetelcomparado com a administração única de um compostorepresentado pela fórmula (5). Foiassumido que aindução de células reativasaopeptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 24 contidonavacinaemcoquetelaumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2. Assim, foiesclarecido que umavacinaemcoquetelcontendo um compostorepresentado pela fórmula (5) e opeptídeo auxiliar podeinduzir a CTLs fortemente no corpo dos camundongoscomparado com a administração única de um compostorepresentado pela fórmula (5).

Exemplo Experimental 17

[00977] Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00978] SEQ ID NO: 242, sintetizado no Exemplo 11, é o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 244 tendo uma cisteína estendida na ex-tremidade N-terminal. SEQ ID NO: 244 na vacina em coquetel no Exemplo Experimental 15 mostra uma atividade aprimorada de indução de CTLs. Neste ensaio, portanto, a capacidade de indução de CTLs de uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 242 foi avaliada por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contido em um composto representado pela fórmula (5):

[00979]

[00980] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402 e WAPVLDFAP- PGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) contidoem CWAPVLDFAP- PGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) é um peptídeo de WT1 restritoa MHC de classe II (istoé, peptídeo auxiliar).

[00981] Oscamundongostransgênicos para HLA-A0201 são con-formedescritonosExemplosExperimentais 2 e 5.

[00982] Se a administração de um compostorepresentado pela fórmula (5) resultanaindução de CTLs específicos para o peptídeo emquestão (SEQ ID NO: 2) foijulgado com base emmedição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5). Se o peptí- deo auxiliar (SEQ ID NO: 242) misturado com a fórmula (5) funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN-y quando os esplenócitos derivados dos camundongos mencionados acima aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e os esplenócitos derivados dos camundongos mencionados acima aos quais foi administrada uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 242 foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00983] Através de um método similar àquele do Exemplo Experimental 16, foi realizado um ensaio de indução de CTLs. Para proporcionar uma vacina em coquetel, um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 242 foram dissolvidos em sulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, diluídos com água para injeção e misturados de modo que a concentração após diluição fosse de 3 mg/mL para o composto representado pela fórmula (5) e 2,42 mg/ml para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 242. A solução diluída foi misturada com uma quantidade igual de Montanide ISA51VG para proporcionar uma emulsão. Uma vacina em coquetel contendo o composto representado pela fórmula (5) a 150 µg/local e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 242 a 121 µg/local foi administrada por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo.

[00984] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 26.

[00985] Na Figura 26, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas. Na Figura 26, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 2. Isto é, a diferença nos valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos em questão induzidos nos camundongos in vivo pela administração de uma vacina em coquetel contendo um composto representado pela fórmula (5) e um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 242).

[00986] Na Figura 26, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esplenócitos dos respectivos camundongos transgêni- cos não reagiram na ausência do peptídeo em questão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 242). Na Figura 26, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 242), foi mais elevado do que o número de células produtoras de IFN-y específicas do peptídeo, as quaisforaminduzidas pela administração de um compostorepresentado pela fórmula (5) apenas.

[00987] A partir do acima, foiesclarecido que umavacinacontendo um coquetel de compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 242 podeinduzir a CTLs específicos para peptídeos mostradospor SEQ ID NO: 2. Além disso, muitascélulas produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foramencontradasquando a vacinafoiadministradaemcoquetelcomparado com aadministração única de um compostorepresentado pela fórmula (5). Foiassumido que a indução de células reativasaopeptídeo auxiliar mostradopor SEQ ID NO: 244 contido no peptí- deo mostradopor SEQ ID NO: 242 contidonavacinaemcoquetelaumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 2. Portanto, foiesclarecido que umavacinacontendo um coquetel de compostorepresentado pela fórmula (5) e o peptídeo auxiliarpodeinduzir a CTLs fortemente no corpo dos camundongoscomparado com a administração única de um compostorepresentado pela fórmula (5).

Exemplo Experimental 18 Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201

[00988] SEQ ID NO: 243, sintetizado no Exemplo 12, é o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 244 tendo uma cisteína estendida na ex-tremidade N-terminal. SEQ ID NO: 244 na vacina em coquetel no Exemplo Experimental 15 mostra uma atividade aprimorada de indução de CTLs. Neste ensaio, portanto, a capacidade de indução de CTLs de uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) sintetizado no Exemplo 1 e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 243 foi avaliada por um ensaio in vivo de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) contidoem um compostorepresentado pela fórmula (5):

[00989]

[00990] em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfureto, é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A0201, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) é um peptídeo de WT1 restrito a HLA-A2402 e WAPVLDFAP- PGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) contido em WAPVLDFAP- PGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243) é um peptídeo de WT1 restrito a MHC de classe II (isto é, peptídeo auxiliar).

[00991] Os camundongos transgênicos para HLA-A0201 são conforme descrito nos Exemplos Experimentais 2 e 5.

[00992] Se a administração de um composto representado pela fórmula (5) resulta na indução de CTLs específicos para o peptídeo em questão (SEQ ID NO: 2) foi julgado com base em medição da produção de IFN-y por re-estimulação, com o peptídeo (SEQ ID NO: 2), de esplenócitos derivados dos camundongos supracitados aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5). Se o peptí- deo auxiliar (SEQ ID NO: 243) misturado com a fórmula (5) funciona ou não no corpo vivo foi avaliado comparando-se o número de células produtoras de IFN-y quando os esplenócitos derivados dos camundongos mencionados acima aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e os esplenócitos derivados dos camundongos mencionados acima aos quais foi administrada uma vacina em coquetel de um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 243 foram re-estimulados com o peptídeo (SEQ ID NO: 2).

[00993] Através de um método similar àquele do Exemplo Experimental 16, foi realizado um ensaio de indução de CTLs. Para proporcionaruma vacina em coquetel, um composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 243 foram dissolvidos emsulfóxido de dimetila (DMSO) para 80 mg/ml, diluídos com água para injeção e misturados de modo que a concentração após diluição fosse de 3 mg/mL para o compostorepresentado pela fórmula (5) e 2,42 mg/ml para o peptídeo mostradopor SEQ ID NO: 243. A solução diluída foimisturada com umaquantidadeigual de Montanide ISA51VG para proporcionarumaemulsão. Uma vacinaemcoquetelcontendo o composto representado pela fórmula (5) a 150 µg/local e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 243 a 121 µg/local foi administrada por via intradérmica em 2 locais na base da cauda de um camundongo.

[00994] Os resultados do ensaio ELISPOT de IFN-y usando os ca-mundongos transgênicos para HLA-A0201 são mostrados na Figura 27.

[00995] Na Figura 27, o eixo vertical mostra o número de células que reagiram nas células colocadas em placas. Na Figura 27, a barra preta e a barra branca mostram os resultados da cultura de esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 na presença ou ausência do peptídeo em questão representado por SEQ ID NO: 2. Isto é, a diferença nos valores da barra preta e da barra branca mostra o número de CTLs específicos para cada um dos peptídeos em questão induzidos nos camundongos in vivo pela administração de uma vacina em coquetel contendo um composto representado pela fórmula (5) e um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 243).

[00996] Na Figura 27, o valor da barra branca não é detectado. Isto significa que os esplenócitos dos respectivos camundongos transgêni- cos não reagiram na ausência do peptídeo em questão. Como um resultado deste ensaio, a produção de IFN-y específico para o peptídeo em questão mostrado por SEQ ID NO: 2 foi detectada nos esplenóci- tos derivados de camundongos transgênicos para HLA-A0201 aos quais foi administrado um composto representado pela fórmula (5) apenas e umavacinaemcoquetelcontendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 243). Na Figura 27, o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2, as quais foram induzidas pela administração de uma vacina em coquetel contendo um peptídeo auxiliar (SEQ ID NO: 243), foi mais elevado do que o número de células produtoras de IFN-y específicas para o peptí- deo, as quais foram induzidas pela administração de um composto representado pela fórmula (5) apenas.

[00997] A partir do acima, foi esclarecido que uma vacina contendo um coquetel de composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 243 pode induzir a CTLs específicos para peptídeos mostrados por SEQ ID NO: 2. Além disso, muitas células produtoras de IFN-y específicas para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2 foram encontradas quando a vacina foi administrada em coquetel comparado com a administração única de um composto representado pela fórmula (5). Foi assumido que a indução de células reativas ao peptídeo auxiliar mostrado por SEQ ID NO: 244 contido no peptí- deo mostrado por SEQ ID NO: 243 contido na vacina em coquetel aumentou a indução de CTLs específicos para o peptídeo mostrado por SEQ ID NO: 2. Portanto, foi esclarecido que uma vacina contendo um coquetel de composto representado pela fórmula (5) e o peptídeo auxiliar pode induzir a CTLs fortemente no corpo dos camundongos comparado com a administração única de um composto representado pela fórmula (5).

[00998] Como uma modalidade para produzir uma vacina contendo dois peptídeos antigênicos WT1, uma vacina em coquetel contendo dois peptídeos diferentes como um preparado único pode ser mencionada. Quando de produção de uma vacina em coquetel, as propriedades dos peptídeos antigênicos de câncer a serem misturados impõem um problema. Conforme mostrado na Tabela 60 e Tabela 66, a produ- ção de um coquetel de doispeptídeos antigênicos WT1 significapro-cessamento de doispeptídeos tendodiferentessolubilidades, ouseja, propriedades, em um preparado. Emcontraste, o conjugado da pre-senteinvenção é um compostoem que doispeptídeos antigênicos WT1 são ligadosatravés de umaligação de dissulfureto e mostraumasolubilidadeúnica, istoé, propriedade. Istosignifica que oconjugado da presenteinvenção tem a propriedadeúnica e também tem a propriedadecorrespondente para osdoispeptídeos antigênicos WT1, con-formemostrado no Exemplo Experimental 2. Neste aspecto, foimostrado que oconjugado da presenteinvenção é um compostocapaz de induzir a umarespostaaosdoispeptídeos antigênicos WT1 sem a necessidade de considerarumainteração entre osdoispeptídeos anti- gênicos WT1 e assimpordiante, aocontrário de vacinasemcoquetel. Exemplo

Experimental 19 Avaliação in vivo da capacidade de indução de CTLs usando camundongos transgênicos para HLA-A2402 após filtração em filtro

[00999] O homodímero mostrado por SEQ ID NO: 4 formado por meio de uma ligação de dissulfureto e um composto representado pela fórmula (5) são dissolvidos em água para injeção para 3-10 mg/mL. A atividade farmacológica de cada composto é avaliada usando camundongos transgênicos para HLA-A2402 (C57BL/6CrHLA-A2402/Kb) com atividade de indução de CTLs como um índice. Para administração aos camundongos transgênicos para HLA-A2402, o composto é dissolvido em água para injeção, esterilizado por meio de filtração usando um filtro de baixa ligação de proteína (filtro de membrana de grau que visa o tratamento de esterilização de injeção) e misturado com adjuvante incompleto de Freund para proporcionar uma emulsão.

[001000] O composto emulsificado é administrado por via intradérmi- ca na base da cauda de camundongos transgênicos para HLA-A2402. Uma semana depois, os camundongos são sacrificados com gás CO2, o baço ounódulo linfático inguinal é isolado e osesplenócitos oucélulas de nódulos linfáticos são preparadas. O kit de ensaio ELISPOT de IFN-y é usado para medição da produção de IFN-y. No dia anterior ao preparo de células, uma placa para ELISPOT é tratada com um anticorpo anti-IFN-y de camundongo e bloqueada com meio RPMI1640 contendo FBS a 10% no dia seguinte. As células preparadas derivadas de camundongo são cultivadas na placa para ELISPOT bloqueada. O peptídeo (SEQ ID NO: 4) é dissolvido em DMSO para 40 mg/mL e, então, diluído com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% para 40 µg/mL. O peptídeo diluído (SEQ ID NO: 4) é adicionadoaosesplenócitos derivados de camundongostransgênicos para HLA-A2402 oucélulas de nódulos linfáticos emumaconcentração final de 10 µg/mL. As células adicionadas com o peptídeo são cultivadasdurante 16-20 horas a 37 °C, 5% de CO2, pelo que a re-estimulação de peptídeo in vitroé realizada.Após cultura, o sobrenadanteé removido e a placa para ELIS- POT é deixada a desenvolver a cor de acordo com o protocoloanexo. O número de pontos que desenvolveucoré medidopeloImmunoSpot Analyzer (fabricado pela C.T.L.).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[001001] O composto da presente invenção é útil como um ingrediente ativo de uma vacina contra o câncer que induz a CTLs eficientemente e é fácil de produzir. O presente pedido se baseia nos Pedidos de Patente Nos 2013-072173 (data de depósito: 29 de Março de 2013) e 2013-158383 depositados no Japão (data de depósito: 31 Julho de 2013), todo o conteúdo dos quais são incorporados ao presente relatório descritivo.

Claims (15)

1. Composto, caracterizadopelofato de que é representado pela fórmula (1): em que Xa e Yasão, cada um, umaligação simples, o peptídeo antigênico de câncer A é um peptídeo que con-sisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir: RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5), SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) e RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), um grupo amino de um aminoácido N-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se liga a Yanafórmula (1) e um grupocarbonila de um aminoácido C-terminal do peptídeo antigênico de câncer A se ligaa um grupohidroxilanafórmula (1), R1é a o peptídeo antigênico de câncer C, o peptídeo antigênico de câncer C temumasequência dife-rentedaquela do peptídeo antigênico de câncer A,, o qual é um peptí- deo que consisteemqualquersequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos a seguir: CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) e CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4), e um grupotioéter do resíduo de cisteína do peptídeo anti- gênico de câncer C é ligadoaogrupotioéter nafórmula (1), ou um salfarmaceuticamenteaceitável domesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-dopelofato de que ocompostorepresentado pela fórmula (1) é um compostorepresentado pela fórmula (4): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto representado pela fórmula (1) é um composto representado pela fórmula (5): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto selecionado do grupo que consiste em um composto representado pela fórmula (4): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, e um composto representado pela fórmula (5): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e pelo menos um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoáci- dos a seguir: CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22), CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23), CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244), CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zadapelofato de que a composição compreende o compostorepresentado pela fórmula (4): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zada pelo fato de que a composição compreende o composto representado pela fórmula (5): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zada pelo fato de que a composição compreende pelo menos um pep- tídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos a seguir: WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244), CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) e WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).

8. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zada pelo fato de que a composição compreende um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos: WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244).

9. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende um composto representado pela fórmula (4): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um peptídeo que consistenasequência de aminoácidos: WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244).

10. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracte-rizadapelofato de que compreende um compostorepresentado pela fórmula (5): em que a ligação entre C e C é uma ligação de dissulfeto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos: WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244).

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no tratamento de câncer que expressa o gene de WT1 ou câncer associado a um aumento no nível de expressão do gene de WT1.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso como um agente de indução de CTLs para imunoterapia celular de câncer.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso como uma vacina contra o câncer.

15. Uso do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo fato de que é para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer.