BRPI0619255B1 - Composto de peptídeo, composição farmacêutica, uso do composto e medicamento para imunoterapia de câncer - Google Patents
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Abstract
composto de peptídeo, composição farmacêutica, anticorpo, uso do composto e medicamento para imunoterapia de câncer. a presente invenção refere-se a um composto da fórmula (1) em que x é um resíduo de tirosina ou um resíduo de metionina; y e z são, cada, uma ligação simples ou similar; r1 é um átomo de hidrogênio ou similar; r2 é um grupo hidróxi ou similar; r3 é um átomo de hidrogênio, grupo alquila, grupo amino ou similar; r4 é um átomo de hidrogênio, grupo alquila, grupo carbóxi ou similar; m é 1 ou 2; e n é um número inteiro de 0 a 2, com a condição de que quando n é 0, r3 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e seu uso em imunoterapia de câncer.
Description
[001] A presente invenção refere-se a terapia de vacina do câncer, especialmente a um novo composto de peptídeo útil como um medicamento para imunoterapia do câncer. Em particular, a presente invenção refere-se a um derivado de um peptídeo antigênico de câncer derivado de WT1, que tem atividade de indução de CTL in vivo e é útil como vacina contra o câncer.
[002] A imunidade mediada pela célula, particularmente a célula T citotóxica (daqui por diante referida como "CTL") desempenha um papel significativo na rejeição in vivo de células cancerosas ou células infectadas por vírus. CTLs reconhecem um complexo entre um peptídeo antigênico ("peptídeo antigênico de câncer") derivado de uma proteína antigênica de câncer e um antígeno de MHC (complexo principal de histocompatibilidade) classe I, que é referido como "antígeno HLA" no caso de seres humanos, sobre uma célula cancerosa, e ataca e mata a célula.
[003] Um peptídeo antigênico de câncer que se liga a uma molécula de MHC classe I é geralmente conhecido por ser um peptídeo que tem 8-12 resíduos de aminoácidos produzidos pelo processamento intracelular da proteína. Assim, em geral, um peptídeo que tem 8-12 resíduos de aminoácidos derivado de uma proteína antigênica de câncer pode ser um candidato a um peptídeo antigênico de câncer. Quando um resíduo de glutamina ou um resíduo de cisteína está presente no peptídeo antigênico de câncer, esses resíduos de aminoácidos são espontaneamente oxidados no ar atmosférico em geral. É relatado que tal oxidação espontânea diminui a afinidade de ligação do peptídeo pela molécula de MHC classe I e a resposta cognitiva ao peptídeo pelo receptor de célula T (veja literaturas não-patentes 1 e 2).
[004] O gene supressor tumoral WT1 de tumor de Wilms (gene WT1) foi isolado do cromossomo 11p13 como um dos genes causadores de tumor de Wilms baseado na análise da síndrome WAGR que ocorre como complicação de tumor de Wilms, aniridia, anormalidades urogenitais, retardamento mental e etc., e a seqüência de aminoácidos de WT1 é conhecida publicamente (veja literatura de não-patente 3). O gene WT1 é expresso com alta freqüência na leucemia humana e quando as células leucêmicas são tratadas com oligômeros anti-senso de WT1, o crescimento das células é inibido. Assim, acredita-se que o gene WT1 aja na promoção do crescimento das células leucêmicas. Além disso, WT1 também é altamente expresso em cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer embrionário, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical e câncer de ovário e o gene WT1 tem sido demonstrado como uma nova proteína antigênica de câncer na leucemia e cânceres sólidos (veja literaturas de não-patentes 4 e 5). Além disso, um peptídeo antigênico de câncer que tem uma seqüência parcial de proteína WT1 que é um peptídeo antigênico de câncer selvagem foi identificado (veja literaturas de patentes 1 e 2).
[005] Particularmente, WT1235-243 (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met- Asn-Leu; SEQ ID N°: 1), que é um peptídeo que ocupa as posições 235 a 243 da proteína antigênica de câncer WT1 é um peptídeo antigênico de câncer que tem uma atividade de induzir CTLs de uma maneira restrita a HLA-A24 (veja literatura não-patente 6 e literatura de patente 1). O peptídeo modificado (Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn- Leu; SEQ ID N°: 2, daqui por diante pode ser referido como WTI235-243 (2M^Y)) no qual o resíduo de metionina na posição 2 de WTI235-243 é substituída por resíduo de tirosina, tem uma afinidade de ligação maior pelo antígeno HLA-A24 do que o peptídeo selvagem (veja literatura de patente 3). O desenvolvimento tanto do peptídeo WT1235-243 selvagem como do peptídeo modificado WTI235-243 (2M^Y), como um agente imunoterapêutico é promissor.
[006] Além disso, é conhecido que cada um do dito peptídeo selvagem e do dito peptídeo modificado tem um resíduo de cisteína no sítio N-terminal, cuja oxidação no ar atmosférico produz um dímero ligado através de uma ponte de dissulfeto e o dito dímero também pode funcionar como um peptídeo antigênico de câncer (veja literatura de patente 4).
[007] Literatura de patente 1: WO 00/06602
[008] Literatura de patente 2: WO 00/18795
[009] Literatura de patente 3: WO 02/079253
[0010] Literatura de patente 4: WO 2004/063217
[0011] Literatura não-patente 1: Immunity., 6:273, 1997
[0012] Literatura não-patente 2: J. Immunol., 160:2099, 1998
[0013] Literatura não-patente 3: Cell, 60:509, 1990
[0014] Literatura não-patente 4: J. Immunol., 164:1873-80, 2000
[0015] Literatura não-patente 5: J. Clin. Immunol., 20, 195-202, 2000
[0016] Literatura não-patente 6: Clin. Cancer. Res. 8: 2626, 2002
[0017] Um problema a ser resolvido pela presente invenção é fornecer um novo composto de peptídeo que tem indução de atividade de CTL in vivo e é útil como vacina contra câncer na imunoterapia do câncer.
[0018] Os inventores conduziram seriamente vários estudos sobre a modificação dos peptídeos antigênicos de câncer, WT1235-243 e WT1235-243 (2M^Y) derivados da proteína WT1, a fim de produzir um peptídeo antigênico de câncer que tem propriedade físico-química, estabilidade e bioatividade melhoradas. Em particular, eles prepararam os compostos modificados a partir desses peptídeos e examinaram a imunogenicidade usando camundongos transgênicos HLA-A2402/Kb (veja WO 02/47474, daqui por diante podem também ser referidos como camundongos HLA-A24).
[0019] Conseqüentemente, eles foram bem-sucedidos na preparação de um composto de peptídeo que tem propriedade físico- química e estabilidade melhoradas por meio de modificação no resíduo de cisteína (Cys) no sítio N-terminal de WT1235-243 ou WT1235- 243 (2M^Y), modificando especialmente o grupo tiol do resíduo de cisteína no sítio N-terminal. O composto de peptídeo da presente invenção tem uma imunogenicidade e atividade de indução de CTL melhoradas. As células T induzidas especificamente pelo presente composto de peptídeo são úteis como medicamentos para imunoterapia do câncer devido a sua reação cruzada com o peptídeo WT1235-243 selvagem que é originalmente apresentado por células cancerosas.
[0020] Até agora, o composto de peptídeo modificado no qual o resíduo de cisteína de WT1235-243 ou WT1235-243 (2M^Y) como o peptídeo de antígeno WT1 está modificado, não foi observado mostrando imunogenicidade suficiente para funcionar como um antígeno de câncer. Os presentes inventores primeiramente descobriram que um derivado de peptídeo preparado pela condensação do grupo tiol de um resíduo de cisteína na terminação N com o grupo tiol de cisteína, glutationa ou ácido tioglicólico para formar uma ponte de dissulfeto, pode ser usado como um antígeno de cancer eficaz.
[0021] A presente invenção foi completada com base no achado descrito acima.
[0022] A presente invenção refere-se a [1] um composto da fórmula (1):
[0023] em que X é um resíduo de tirosina ou um resíduo de metionina; cada um de Y e Z é independentemente selecionado a partir de uma ligação simples e um grupo de peptídeo divalente que consiste em 1-10 resíduos de aminoácidos,
[0024] R1 é hidrogênio ou alquila,
[0025] R2 é hidroxila, amino, alquilamino ou dialquilamino,
[0026] R3 é hidrogênio, alquila, amino, alquilamino, dialquilamino ou alquilcarbonilamino substituído ou não substituído,
[0027] R4 é hidrogênio, alquila, carboxila, carbamoíla, alquilcarbamoíla, dialquilcarbamoíla ou um grupo da fórmula (2):
[0028] em que W é um resíduo de aminoácido,
[0029] m é 1 ou 2, e
[0030] n é um número inteiro de 0-2, com a condição de que quando n é 0, R3 é hidrogênio ou alquila,
[0031] ou um sal farmaceuticamente desse; [2] o composto de acordo com [1] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desse,
[0032] em que o dito alquilcarbonilamino substituído representado por R3 é alquilcarbonilamino substituído por um ou dois grupos substituintes selecionados do grupo que consiste em carbóxi, amino, alquilamino ou dialquilamino; [3] o composto de acordo com [1] ou [2] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável disso,
[0033] R3 é hidrogênio ou um grupo da fórmula (3):
[0034] em que r é um número inteiro de 1-3, e
[0035] R4 é carbóxi ou um grupo da fórmula (2'):
[0036] em que W' é um resíduo de glicina ou um resíduo de β- alanina; [4] o composto de acordo com [3] acima um sal farmaceuticamente aceitável desse,
[0037] em que R3 é um grupo da fórmula (3’):
[0038] R4 é carboximetilcarbamoíla; [5] o composto de acordo com [3] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desse,
[0039] em que R3 é hidrogênio e R4 é carbóxi; [6] o composto da fórmula (1'): O
[0040] em que X' é um resíduo de tirosina ou um resíduo de metionina,
[0041] R1' é hidrogênio ou alquila,
[0042] R2' é hidroxila, amino, alquilamino ou dialquilamino,
[0043] R3' é amino, alquilamino, dialquilamino ou alquilcarbonilamino substituído ou não substituído, e
[0044] R4 é carbóxi, carbamoíla, alquilcarbamoíla ou dialquilcarbamoíla,
[0045] ou um sal farmaceuticamente aceitável desses; [7] um anticorpo que se liga especificamente ao composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses; [8] uma célula apresentadora de antígeno que apresenta um complexo do composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses e um antígeno HLA-A24; [9] uma CTL induzida pelo composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses; [10] a CTL de acordo com [9] acima que reconhece um complexo do composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses e um antígeno HLA-A24; [11] a CTL de acordo com [9] acima que reconhece um complexo do peptídeo de SEQ ID N°: 1 e o antígeno HLA-A24; [12] uma composição farmacêutica que compreende o composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses, a célula apresentadora de antígeno de acordo com [8] ou a CTL de acordo com qualquer um de [9]-[11] acima junto com um veículo farmaceuticamente aceitável; [13] a composição farmacêutica de acordo com [12] acima, que é usada como uma vacina de câncer; [14] um uso de um composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses, a célula apresentadora de antígeno de acordo com [8] ou a CTL de acordo com qualquer um de [9]-[11] acima para preparar uma vacina de câncer; [15] um medicamento para imunoterapia do câncer que compreende o composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses, a célula apresentadora de antígeno de acordo com [8] acima ou a CTL de acordo com qualquer um de [9]-[11] acima como ingrediente ativo; ou [16] um método para tratamento ou prevenção de câncer, que compreende administrar uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do composto de acordo com qualquer um de [1]-[6] acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desses, a célula apresentadora de antígeno de acordo com [8] ou a CTL de acordo com qualquer um de [9]-[11] acima a um paciente que é positivo para HLA- A24 e positivo para WT1 que necessite de tratamento ou prevenção do câncer.
[0046] Um novo composto de peptídeo útil como um medicamento para imunoterapia do câncer, por exemplo, um antígeno de câncer derivado de WT1 que tem indução de atividade de CTL in vivo e é útil como vacina de câncer é fornecido pela presente invenção. O peptídeo da presente invenção, que é preparado pela modificação de um grupo mercapto de um resíduo de cisteína localizado na terminação-N de WTI235-243 ou WT1 235-243 (2M^Y) com manutenção da atividade como um peptídeo antigênico de câncer, tem propriedade físico-química e estabilidade melhoradas e assim pode ser amplamente usado para tratamento ou pesquisa. Em particular, o novo peptídeo da presente invenção tem vantagens tais como conveniência no manuseio sem ter que tomar cuidado com a diminuição da atividade devido ao tratamento in vitro, exibição de efeito terapêutico estável e etc.
[0047] Figura 1 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 1 usando três camundongos individualmente (barra preta na figura). Na figura, a barra branca mostra os resultados obtidos usando células não pulsadas com nenhum peptídeo (o mesmo é aplicável às figuras seguintes).
[0048] Figura 2 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 2 usando três camundongos individualmente.
[0049] Figura 3 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 3 usando três camundongos individualmente.
[0050] Figura 4 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 4 usando três camundongos individualmente.
[0051] Figura 5 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 5 usando três camundongos individualmente.
[0052] Figura 6 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 6 usando três camundongos individualmente.
[0053] Figura 7 é um gráfico que mostra a atividade citotóxica (Lise Específica) dose-dependente induzida pelo composto de peptídeo do Exemplo 1. O eixo X mostra a dose para um camundongo individual (600 μg, 200 μg, 60 μg e 20 μg), e o eixo Y mostra a atividade citotóxica (Lise Específica). Cada dose foi administrada aos três camundongos respectivamente e os resultados são mostrados como a média das atividades citotóxicas e o desvio padrão (S.D.).
[0054] Figura 8 é um gráfico que mostra a reatividade da célula T peptídeo-específica preparada por imunização de camundongos com o composto de peptídeo do Exemplo 1 às células pulsadas com vários peptídeos. Na figura, as barras hachuradas mostram o resultado obtido usando células pulsadas com o peptídeo selvagem (WT1235-243), a barra preta mostra o resultado obtido usando células pulsadas com o composto de peptídeo do Exemplo 1 e a barra branca mostra o resultado obtido usando células pulsadas com um peptídeo derivado de Influenza, respectivamente. Além disso, na figura, o eixo vertical mostra pontos.
[0055] Figura 9 é um gráfico que mostra a reatividade da célula T peptídeo-específica derivada de PBMC humana por estimulação com o peptídeo do Exemplo 1 às células pulsadas com vários peptídeos. Na figura, "peptídeo selvagem" mostra o resultado obtido usando células pulsadas com o peptídeo selvagem (WT1235-243), o "peptídeo modificado" mostra o resultado obtido usando células pulsadas com o peptídeo modificado (WTI235-243 (2M^Y)), "peptídeo do Exemplo 1" mostra o resultado obtido usando células pulsadas com o composto de peptídeo do Exemplo 1 e "sem pulso de peptídeo" mostra o resultado obtido usando células não pulsadas com nenhum peptídeo, respectivamente. Além disso, na figura, o eixo vertical mostra a quantidade de interferon-Y produzida.
[0056] Como usado no relatório descritivo e nos desenhos do presente pedido de patente, as seguintes abreviações são usadas para cada resíduo de aminoácido: Ala: resíduo de alanina Arg: resíduo de arginina Asn: resíduo de asparagina Asp: resíduo de ácido aspártico Cys: resíduo de cisteína Gln: resíduo de glutamina Glu: resíduo de ácido glutâmico Gly: resíduo de glicina His: resíduo de histidina Ile: resíduo de isoleucina Leu: resíduo de leucina Lys: resíduo de lisina Met: resíduo de metionina Phe: resíduo de fenilalanina Pro: resíduo de prolina Ser: resíduo de serina Thr: resíduo de treonina Trp: resíduo de triptofano Tyr: resíduo de tirosina Val: resíduo de valina
[0057] Como usado no relatório descritivo, "resíduo de aminoácido" inclui resíduo de a-aminoácido, resíduo de e-aminoácido, resíduo de Y-amino-ácido, resíduo de δ-aminoácido natural ou não natural. Por exemplo, "resíduo de aminoácido" inclui um a-aminoácido natural (por exemplo, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val), resíduo de ornitina, resíduo de homosserina, resíduo de homocisteína, β-alanina, ácido Y- aminobutanóico ou ácido δ-aminopentan0ico.
[0058] O aminoácido descrito acima pode ser tanto L-enantiômero quanto D-enantiômero quando ele for um isômero óptico, L- enantiômero é mais preferível.
[0059] No relatório descritivo, a seqüência de aminoácido do composto de peptídeo é descrita de acordo com o estilo convencional onde o resíduo de aminoácido N-terminal está localizado no lado direito.
[0060] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se ao composto da fórmula (1) descrita acima ou um sal farmaceuticamente aceitável desse.
[0061] Na fórmula (1), preferivelmente, X representa um resíduo de tirosina (Tyr).
[0062] Na fórmula (1), "os grupos de peptídeos divalentes que consistem em 1-20 resíduos de aminoácidos" representados por Y e Z incluem os mesmos ou diferentes grupos de peptídeos divalentes consistindo em 1 a 10 resíduos de aminoácidos sem nenhuma limitação da seqüência de aminoácido. Por exemplo, o dito grupo de peptídeo divalente que consiste em 1-10 aminoácidos inclui uma seqüência de aminoácido compreendida na seqüência de aminoácido de WT1 humano (Cell, 60:509, 1990. GenBank Acc. óxi A38080). Por exemplo, Y pode representar um grupo de peptídeo divalente consistindo em dez resíduos de aminoácidos de 225 a 234 de WT1 humano que é descrito como segue: Asn-Leu-Tyr-Gln-Met-Thr-Ser- Gln-Leu-Glu (SEQ ID N°: 3) ou um grupo de peptídeo divalente que tem um fragmento de SEQ ID N°: 3, no qual na porção 1-9 resíduos de aminoácido em porção N-terminal são deletados. Além disso, por exemplo, Z pode representar um grupo de peptídeo divalente consistindo em dez resíduos de aminoácido de 244 a 253 de WT1 humano, que é descrito como segue: Gly-Ala-Thr-Leu-Lys-Gly-Val-Ala- Ala-Gly (SEQ ID N°: 4) ou um grupo de peptídeo divalente que tem um fragmento de SEQ ID N°: 4, no qual 1-9 resíduos de aminoácido em porção C-terminal são deletados. Preferivelmente, cada um de Y e Z podem uma única ligação.
[0063] No relatório descritivo, o grupo alquila inclui, por exemplo, um grupo alquila linear ou ramificado que tem 1-6 átomos de carbono. Por exemplo, o grupo alquila inclui metila, etila, propila, 1-metiletila, butila, 1-metilpropila, 2-metilpropila, 1,1-dimetiletila, pentila e similares.
[0064] No relatório descritivo, o grupo alquilamino inclui, por exemplo, um grupo alquilamino linear ou ramificado que tem 1-6 átomos de carbono. Por exemplo, o grupo alquilamino inclui metilamino, etilamino, propilamino, 1-metiletilamino, butilamino, 1- metilpropilamino, 2-metilpropilamino, 1,1-dimetiletilamino, pentilamino e similares.
[0065] No relatório descritivo o grupo dialquilamino inclui, por exemplo, um grupo amino substituído por dois grupos alquila iguais ou diferentes, lineares ou ramificados que têm 1-6 átomos decarbono. Por exemplo, o grupo dialquilamino inclui dimetilamino, etilmetilamino, dietilamino, dipropilamino, metilpropilamino, butilmetilamino, metilpentilamino e similares.
[0066] No relatório descritivo, a "alquila" do grupo alquilcarbonilamino inclui o grupo alquila como descrito acima. A "alquila" do grupo alquilcarbamoíla inclui a mesma alquila do grupo dialquilcarbamoíla como descrito acima. A "alquila" do grupo dialquilcarbamoíla inclui a mesma alquila do grupo dialquilamino como descrito acima, em que duas "alquilas" podem ser iguais ou diferentes.
[0067] Cada uma de R1 e R2 representa preferivelmente um átomo de hidrogênio.
[0068] Quando R3 representa um grupo alquilcarbonilamino substituído, o grupo substituído do grupo alquilcarbonilamino inclui, por exemplo, carbóxi, hidroxila, amino, alquilamino e dialquilamino, em que o dito grupo alquilcarbonilamino pode ser substituído por 1-4, preferivelmente, 1 ou 2 grupos substituídos iguais ou diferentes.
[0069] O resíduo de aminoácido representado por W na formula (2) pode incluir resíduo de glicina (Gly), preferivelmente.
[0070] O composto de peptídeo da presente invenção inclui, por exemplo, compostos das seguintes fórmulas (4)-(9).
[0071] Os compostos de peptídeos da presente invenção podem ser preparados de acordo com o método descrito nos Exemplos do relatório descritivo ou um método geralmente usado na síntese de peptídeos. Exemplos de tais preparações são aquelas descritas nas literaturas incluindo "Peptide Synthesis", Interscience, Nova Iorque, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., Nova Iorque, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no- Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; e "Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol. 14, Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991. Exemplo do método para preparar o peptídeo da presente invenção inclui um método para preparar um peptídeo de acordo com o método de Fmoc ou método de Boc por meio de sintetizadores em fase sólida ou um método para preparar o peptídeo por meio de condensação seqüencial de Boc-aminoácido ou Z-aminoácido de acordo com o método de síntese em fase líquida, em que Fmoc representa grupo 9- fluorenilmetiloxicarbonila, Boc representa grupo terc-butoxicarbonila e Z representa grupo benziloxicarbonila, respectivamente.
[0072] Um grupo funcional tal como grupo amino, carboxila e mercapto do composto intermediário na síntese do composto da presente invenção pode ser protegido por um grupo protetor adequado, e o composto protegido pode ser desprotegido usando uma técnica convencional de proteção/desproteção, se necessário. Um grupo protetor adequado e um método para a proteção e a desproteção são descritos, por exemplo, em Protective Groups in Organic Synthesis 2a edição (John Wiley & Sons, Inc.;1990), em detalhe.
[0073] Em particular, um exemplo do método para preparar o composto da presente invenção é um método conforme descrito nas seguintes fórmulas de reação: [fórmula de reação 1]
[0074] em que X, Y, Z, R1, R2, R3, R4, m e n são iguais ao descrito acima, respectivamente.; Cada um de R e R’ representam independentemente um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor para grupo mercapto.
[0075] O exemplo do dito grupo protetor para o grupo mercapto inclui, por exemplo, acetoamidometila ou tritila.
[0076] O composto da fórmula (1) pode ser preparado por oxidar o composto da fórmula (1-1) e o composto da fórmula (1-2) em um solvente inerte.
[0077] A oxidação pode ser conduzida por um método convencional normalmente aplicado na síntese de peptídeo para formar uma ligação de dissulfeto. Por exemplo, uma ligação de dissulfeto pode ser formada por misturar dois intermediários que têm grupo mercapto em um solvente adequado e oxidá-los. Um método convencional para oxidação tal como oxidação pelo ar e oxidação por iodo pode ser usado. O solvente pode ser água, ácido acético, metanol, clorofórmio, DMF ou DMSO ou uma mistura desses. A reação de oxidação algumas vezes dá uma mistura de compostos de dissulfeto simétricos e assimétricos. O composto de dissulfeto assimétrico desejado pode ser preparado por purificação da mistura tal como purificação usando vários tipos de cromatografia, purificação de acordo com o método de recristalização e similares.
[0078] Alternativamente, um intermediário que tem um grupo mercapto ativado é misturado com outro intermediário que tem um grupo mercapto ativado é misturado com outro intermediário que tem um grupo mercapto para produzir uma ligação de dissulfeto seletiva. Exemplos do intermediário que tem um grupo mercapto ativado incluem, por exemplo, um composto que tem um grupo mercapto ligado a um grupo Npys (grupo 3-nitro-2-piridina sulfenila).
[0079] Alternativamente, após um dos intermediários que tem um grupo mercapto ser misturado com, por exemplo, 2,2'-ditiobis(5- nitropiridina) para ativar o grupo mercapto, o outro intermediário é adicionado à mistura resultante para formar uma ligação de dissulfeto seletiva (Tetrahedron Letters. Vol. 37.óxi 9, pp. 1347-1350).
[0080] O composto da fórmula (1-1) pode ser preparado de acordo com um método de síntese de peptídeo em fase líquida ou fase sólida que é bem-conhecido por aqueles versados na técnica.
[0081] Além disso, no caso onde o composto da fórmula (1-1) é um composto alquilado na porção N-terminal, N-alquil aminoácido ou N,N-dialquil aminoácido que pode ser, se necessário, protegido por um grupo protetor pode ser usado como um aminoácido N-terminal. O N- alquil aminoácido ou N,N-dialquil aminoácido pode ser disponível comercialmente ou preparado de acordo com um método bem- conhecido daqueles versados na técnica, no qual, por exemplo, um aminoácido ou aminoácido protegido do material de partida é reagido com um haleto de alquila na presença de base. Por exemplo, grupo amino N-terminal pode ser apropriadamente alquilado por reagir aminoácido que é protegido por grupo t-butoxicarbonila com haleto de alquila na presença de base tal como hidreto de sódio como ilustrado a seguir [fórmula de reação 2]. [Fórmula de reação 2]
[0082] em que cada um de X, Z, R1, R2, m e R é igual ao descrito acima, Hal representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo, e Prot representa um grupo protetor.
[0083] Além disso, no caso onde o composto é um composto com terminação C amidada ou alquilamidada, um aminoácido amidado ou alquilamidado pode ser usado como um resíduo de aminoácido C- terminal do material de partida.
[0084] O composto da presente invenção ou intermediários na síntese desses podem ser purificados de acordo com o método bem- conhecido daqueles versados na técnica. Por exemplo, a purificação pode ser conduzida por meio de vários tipos de cromatografia (por exemplo, cromatografia em coluna de sílica-gel, cromatografia em coluna de troca de íon, cromatografia de filtração em gel, ou cromatografia de fase reversa) ou recristalização. O solvente para recristalização pode ser, por exemplo, álcoois tais como metanol, etanol e 2-propanol, éteres tais como dietiléter, ésteres tais como acetato de etila, hidrocarbonetos aromáticos tais como benzeno e tolueno, cetonas tais como acetona, hidrocarbonetos tais como hexano, solventes apróticos tais como dimetilformamida e acetonitrila, água ou solventes mistos desses. Outro método usado para a purificação pode ser o método descrito no volume 1 de Jikkenkagakukoza editado por Chemical Society of Japan, Maruzen).
[0085] No caso onde o composto da presente invenção tem um ou mais centros assimétricos, o material (aminoácido) que tem o centro assimétrico pode ser usado para prepará-lo de acordo com o método convencional. Além disso, a resolução óptica pode ser realizada na etapa apropriada do processo de produção para melhorar a pureza óptica do composto da presente invenção. Por exemplo, a resolução óptica pode ser realizada de acordo com o método de diastereômero no qual o composto ou intermediário da presente invenção é misturado com ácido opticamente ativo (por exemplo, ácido monocarboxílico tal como ácido mandélico, N-benziloxialanina e ácido lático, ácido dicarboxílico tal como ácido tartárico e ácido málico ou ácido sulfônico tal como ácido canforsulfônico e ácido bromocanforsulfônico) em um solvente inativo (por exemplo, solventes de álcool tal como metanol, etanol e 2-propanol, éteres, tais como dietiléter, solventes de ésteres tais como acetato de etila, solvente de hidrocarboneto tal como tolueno, solventes apróticos tais com acetonitrila ou solventes mistos desses) para preparar a forma de sal. No caso onde o composto ou intermediário da presente invenção tem um grupo funcional ácido tal como um grupo carbóxi, a resolução óptica pode ser realizada pela formação do sal com amina opticamente ativa (por exemplo amina orgânica tal como α-fenetilamina, quinina, quinidina, cinconidina, cinconina, e estriquinina).
[0086] A reação para formar o sal pode ser conduzida em uma temperatura que varia de uma temperatura ambiente até o ponto de ebulição do solvente. Com o objetivo de melhorar a pureza óptica, é preferível que a temperatura seja aumentada uma vez para até cerca do ponto de ebulição do solvente. O rendimento pode ser melhorado, se necessário por resfriar a mistura, quando o sal precipitado é recuperado por filtração.
[0087] O ácido ou amina opticamente ativa é usado apropriadamente na quantidade de cerca de 0,5 a cerca de 2,0 equivalentes do substrato, preferivelmente na quantidade de cerca de 1 equivalente do substrato. Se necessário, o cristal pode ser recristalizado em um solvente inerte (por exemplo, alcoóis, tais como metanol, etanol, e 2-propanol, éteres tais como dietiléter, ésteres tais como acetato de etila, hidrocarbonetos tais como tolueno, solventes apróticos tais como acetonitrila ou solventes mistos desses) para obter o sal opticamente ativo altamente purificado. Além disso, se necessário, o sal opticamente resolvido pode ser tratado com ácido ou base de acordo com o método convencional a fim de obter o composto de forma livre.
[0088] Um sal farmaceuticamente ativo inclui um sal de adição de ácido e um sal de adição de base. Por exemplo, o sal de adição de ácido inclui um sal com um ácido inorgânico tal como cloridrato, bromidrato, sulfato, iodidrato, nitrato e fosfato, e um sal com um ácido orgânico tal como citrato, oxalato, acetato, formiato, propionato, benzoato, trifluoroacetato, maleato, tartarato, metanossulfonato, benzenossulfonato e paratoluenossulfonato. O sal de adição de base inclui um sal com uma base inorgânica tal como um sal de sódio, sal de potássio, sal de cálcio, sal de magnésio, e sal de amônio, um sal com uma base orgânica tal como sal de trietilamônio, sal de trietanol amônio, sal de piridínio e sal de diisopropilamônio, e ainda um sal de um aminoácido tal como um aminoácido básico ou ácido incluindo arginina, asparagina e ácido glutâmico.
[0089] Além disso, a presente invenção compreende o solvato do composto de peptídeo representado pela fórmula (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável desse incluindo hidrato ou solvato de etanol. Além disso, a presente invenção compreende quaisquer possíveis estereoisômeros incluindo qualquer diastereoisômero e enantiômero do composto representado pela fórmula (1), e qualquer forma de cristal desse.
[0090] No curso de preparar um composto de peptídeo incluindo as etapas de condensar um a-aminoácido opticamente ativo, remover vários tipos de grupos protetores ou liberar o peptídeo de resina, subprodutos incluindo um peptídeo com anulação de aminoácido, um peptídeo degradado por hidrólise, oxidação ou similares, e um peptídeo que tem um aminoácido epimerizado são geralmente produzidos. Em escala laboratorial, uma combinação de várias cromatografias (por exemplo, cromatografia em coluna de sílica-gel, filtração em gel, cromatografia em coluna de troca de íon, cromatografia de fase reversa) podem ser usados para remover as impurezas a fim de obter um composto de peptídeo altamente purificado. Entretanto, não é fácil obter o composto de peptídeo altamente purificado em escala industrial com o objetivo de fornecê-lo como um medicamento.
[0091] O composto de peptídeo da presente invenção tem uma propriedade físico-química que permite a produção em larga escala dos fármacos a granel. Em particular, o composto de peptídeo da presente invenção tem uma propriedade que inclui alta solubilidade, alta estabilidade na solução ou uma tendência de não se tornar um gel quando ele é condensado a fim de que o composto de peptídeo altamente purificado possa ser facilmente preparado como um fármaco a granel mesmo em larga escala por meio de purificação usando cromatografia em coluna tal como cromatografia de fase reversa.
[0092] O composto de peptídeo da presente invenção é útil como um ingrediente ativo compreendido em indutor de CTL ou vacina de câncer para imunoterapia de câncer. O composto de peptídeo da presente invenção tem uma alta imunogenicidade e alta atividade de indução de CTL como mostrado nos Exemplos da presente especificação. As CTL induzidas pelo composto de peptídeo da presente invenção podem reconhecer surpreendentemente um peptídeo selvagem de WT1 originalmente transportado por células de câncer. Dessa forma, o composto de peptídeo da presente invenção é útil como um medicamento para o tratamento ou prevenção (incluindo prevenção de uma recorrência) de câncer que expressa o gene WT1 tal como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer embrionário, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, e câncer de ovário.
[0093] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a um peptídeo representado pela fórmula (1) ou sal farmaceuticamente aceitável desse (daqui em diante eles podem ser referidos como "anticorpos da invenção"). Os anticorpos da invenção não são limitados a um anticorpo específico, e podem ser anticorpo policlonal, ou anticorpo monoclonal preparado usando um peptídeo da presente invenção como um imunógeno.
[0094] Os anticorpos da presente invenção não são limitados a um anticorpo específico contanto que eles se liguem especificamente aos compostos de peptídeo da invenção, e exemplos específicos incluem um anticorpo que se liga especificamente a um peptídeo representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9) como descrito acima.
[0095] Um método para preparar os anticorpos já é bem- conhecido, e os anticorpos da presente invenção podem ser preparados de acordo com métodos convencionais (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Seção 11.12 a 11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press Publisher, Nova Iorque, 1989).
[0096] Especificamente, os anticorpos podem ser preparados usando os compostos de peptídeos da presente invenção (por exemplo, um composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9)) como um imunógeno para imunizar um animal não humano tal como um coelho, seguido por obter os anticorpos do soro do animal imunizado de uma forma convencional. Por outro lado, anticorpos monoclonais podem ser preparados por imunizar um animal não humano tal como um camundongo com o composto da presente invenção, por exemplo, um composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9), e preparar hibridoma dos esplenócitos obtidos do animal e células de mieloma por meio de fusão celular seguido por obter os anticorpos do hibridoma (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Seção 11.4 a 11.11).
[0097] Os anticorpos direcionados aos compostos de peptídeos da invenção da invenção podem ser preparados de uma maneira em que a reação imunológica é aumentada usando diversos adjuvantes adequados para o hospedeiro. Exemplos dos adjuvantes incluem adjuvante de Freund, géis minerais tal como hidróxido de alumínio, tensoativos tal como lisolecitina, poliol Plurônico, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, Hemocianina de Keyhole limpet, e dinitrofenol, e adjuvantes humanos tal como BCG (Bacilo de Calmette Guerin) e Corynebacterium-parvum.
[0098] Como descrito acima, os anticorpos que reconhecem o composto da presente invenção, assim como os anticorpos que neutralizam a atividade do composto podem ser facilmente preparados por imunizar apropriadamente um animal com os compostos da presente invenção de uma maneira convencional. Tais anticorpos podem ser usados em cromatografia de afinidade, diagnóstico imunológico, e similares. Diagnósticos imunológicos podem ser selecionados apropriadamente a partir de immunoblotting, radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um ensaio fluorescente ou luminescente, e similares. O diagnóstico imunológico é útil para diagnosticar cânceres que expressam o gene WT1, tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer embrionário, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, e câncer ovariano.
[0099] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a células apresentadoras de antígeno nas quais um complexo entre um composto da presente invenção e um antígeno HLA-A24 é apresentado.
[00100] Exemplos descritos posteriormente demonstram que a administração dos compostos da presente invenção induz CTLs. Isto é, células apresentadoras de antígeno nas quais um complexo entre o composto da presente invenção e um antígeno HLA-A24 é apresentado, são geradas nas células mononucleares de sangue periférico, e então CTLs que reconhecem especificamente as células que apresentam tal complexo são induzidas. Estas células apresentadoras de antígeno nas quais um completo entre um antígeno HLA-A24 e o composto da presente invenção é apresentado, são úteis em terapia celular (terapia de DC) como descrito posteriormente.
[00101] Células apresentadoras de antígeno da presente invenção não são limitadas a uma célula específica contanto que ela apresente sobre nas suas superfícies um complexo entre o composto da presente invenção e um antígeno HLA-A24. Eles incluem especificamente, por exemplo, células apresentadoras de antígeno de células dendríticas nas quais um complexo entre o composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9) e um antígeno HLA-A24 é apresentado.
[00102] Células apresentadoras de antígeno usadas em terapia celular (terapia de DC) podem ser preparadas por isolar as células que tem uma habilidade apresentadora de antígeno ex vivo com o composto da presente invenção para que as células apresentem um complexo entre um composto da presente invenção e um antígeno HLA-A24 na sua superfície celular. Nesse contexto, a célula que tem "habilidade de apresentar antígeno" não é limitada a uma célula específica contanto que ela seja uma célula expressando uma superfície em um antígeno HLA-A24 tendo uma habilidade de apresentar o composto da presente invenção, e células dendríticas, que acredita-se que tenham uma habilidade apresentadora de antígeno especialmente alta, são preferivelmente exemplificadas.
[00103] Células apresentadoras de antígeno da presente invenção podem ser preparadas, por exemplo, por isolar células que tem uma habilidade apresentadora de antígeno de um paciente com câncer, pulsar as células ex vivo com o composto da invenção (por exemplo, o composto que qualquer uma das fórmulas (4)-(9)), e preparar um complexo entre um antígeno HLA-A24 e o composto da presente invenção (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82,1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p 1184, 1999). Quando células dendríticas são usadas, células apresentadoras de antígeno da presente invenção podem ser preparadas, por exemplo, por isolar linfócitos de sangue periférico de um paciente com câncer usando o método de Ficoll, remover as células não aderentes, incubar as células aderentes na presença de GM-CSF e IL-4 para induzir células dendríticas, e incubar e pulsar as células dendríticas resultantes com o composto da presente invenção.
[00104] As células apresentadoras de antígeno preparadas como descrito acima são úteis como um ingrediente ativo compreendido de um indutor de CTL ou uma vacina de câncer para terapia celular (terapia de DC) como descrito posteriormente.
[00105] O composto de peptídeo da presente invenção são derivados de WT1 humano e tem atividade de indução de CTL (imunogenicidade) de uma maneira restrita a HLA-A24. Em um quarto aspecto a presente invenção refere-se à CTL induzida por um composto de peptídeo da presente invenção.
[00106] Exemplos descritos posteriormente demonstram que a administração dos compostos de peptídeos da presente invenção induz CTLs. Isto é, células apresentadoras de antígeno nas quais um complexo entre um composto da presente invenção e um antígeno HLA-A24 é apresentado, são gerados nas células mononucleares de sangue periférico, e então CTLs que reconhecem especificamente as células que apresentam tal complexo são induzidas. Essas CTLs induzidas pelo composto de peptídeo da presente invenção são úteis em imunoterapia adotiva como descrito posteriormente.
[00107] CTLs da presente invenção não são limitadas a uma CTL específica contanto que elas sejam induzidas pelo composto de peptídeo da presente invenção, e incluem particularmente CTLs que reconhecem um complexo entre o composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9) e um antígeno HLA-A24 e CTLs que reconhecem um complexo entre o peptídeo selvagem (WT1235-243; SEQ ID N°: 1) e um antígeno HLA-A24.
[00108] CTLs usadas na imunoterapia adotiva também podem ser preparadas, por exemplo, por isolar linfócitos periféricos de um paciente e estimular os linfócitos periféricos resultantes in vitro com o composto da presente invenção (por exemplo, o composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9)) (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669).
[00109] As CTLs da presente invenção preparadas como descrito acima são úteis como um ingrediente ativo compreendido em uma vacina de câncer para uma imunoterapia adotiva.
[00110] Composições farmacêuticas utilizáveis como vacinas de câncer.
[00111] Compostos da presente invenção, células apresentadoras de antígeno da presente invenção e CTLs da presente invenção como descrito acima (1)-(4) podem ser usadas como um ingrediente ativo compreendido em um indutor de CTL, isto quer dizer, uma vacina de câncer, quando formulada em uma forma apropriada para aquelas respectivas substâncias, que são ilustradas abaixo. 1) Vacinas de câncer que compreendem um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente ativo desse como ingrediente ativo.
[00112] O composto ativo da presente invenção tem atividade de indução de CTL. CTLs induzidas pelo composto da presente invenção podem destruir cânceres através da sua atividade citotóxica e produção de linfocina. Dessa forma, os compostos de peptídeos da presente invenção podem ser usados como um ingrediente ativo compreendido em uma vacina de câncer para o tratamento ou prevenção de cânceres. Na modalidade, a invenção fornece uma vacina de câncer que compreende como um ingrediente eficaz o composto de peptídeo da invenção (uma composição farmacêutica utilizável como vacina de câncer). Quando a vacina de câncer da invenção é administrada a um paciente com câncer positivo para HLA- A24 e positivo para WT1, o composto (por exemplo, o composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9)) é apresentado sobre um antígeno HLA-A24 de células apresentadoras de antígeno, e então CTL específicas para o complexo apresentado, que compreendem o antígeno HLA-A24, proliferam eficazmente e destroem células de câncer. Dessa forma, tratamento ou prevenção de cânceres é obtido. As vacinas de câncer da invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir cânceres que envolvem o nível de expressão elevado do gene WT1, incluindo cânceres do sangue, tais como leucemias, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo, e linfoma maligno, e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer embrionário, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, e câncer ovariano. Em relação a isso, como outra modalidade, a invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de câncer, que compreende administrar uma quantidade eficaz da vacina de câncer da presente invenção a um paciente com câncer da presente invenção que é positivo para HLA-A24, e positivo para WT1.
[00113] A vacina de câncer que compreende um composto da presente invenção como um ingrediente ativo pode compreender tanto um único peptídeo antigênico de câncer, isto quer dizer, epitopo de CTL (por exemplo, um composto representado por qualquer uma das fórmulas (4)-(9)) como um ingrediente ativo, ou um epitopo peptídico relacionado com outro peptídeo antigênico de câncer (um epitopo de CTL) ou um epitopo auxiliar como um ingrediente ativo. Recentemente, foi demonstrado que um peptídeo epitopo relacionado a uma pluralidade de epítopos de CTL (peptídeos antigênicos) tem uma atividade de induzir CTLs eficazmente in vivo. Por exemplo, Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194 descreve que um peptídeo epitopo de cerca de 30-mer no qual epítopos de CTL (peptídeos antigênicos) restritos a HLA-A2, -A3, -A11, B53- derivados da proteína antigênica de câncer PSA que são conectados linearmente induziram CTLs específicas para o epitopo de CTL relevante in vivo. Ainda, foi demonstrado que um peptídeo epitopo no qual um epitopo de CTL e um epitopo auxiliar são conectados linearmente induziu eficazmente CTLs. Quando um peptídeo da invenção na forma de tais peptídeos epítopos é administrado, o peptídeo é introduzido em células apresentadoras de antígeno, e então submetido à degradação intracelular para gerar os respectivos epítopos antigênicos, que se ligam a um antígeno de HLA para formar complexos. Os complexos são apresentados de forma compacta na superfície celular das células apresentadoras de antígeno, e então CTLs específicas para os complexos proliferam eficazmente in vivo, e destroem células de câncer. Dessa forma, o tratamento ou prevenção de cânceres é obtido.
[00114] Vacinas de câncer que compreendem o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo também podem ser administradas junto com um veículo farmaceuticamente aceitável tal como um adjuvante adequado, ou em uma forma de dosagem particulada a fim de estabelecer de forma eficaz a imunidade celular. Para tal propósito, esses adjuvantes descritos na literatura (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) são aplicáveis, e incluem especificamente componentes derivados de bactérias, GM-CSF, citocinas tais como interleucina-2, interleucina-7, interleucina-12 e similares, componentes derivados de plantas, componentes derivados de organismos marinhos, géis minerais, tal como hidróxido de alumínio, tensoativos tais como lisolecitina e poliol Plurônico, poliânions, peptídeos, e emulsões oleosas (formulações de emulsão). Os componentes derivados de bactérias incluem lipídio A, monofosforil lipídio A que é um derivado de lipídio A, bactéria morta (por exemplo, Mycobacterium tal como BCG), proteína ou polinucleotídeo derivado de bactérias, Adjuvante Incompleto de Freund, Adjuvante Completo de Freund, componente de parede celular (por exemplo, BCG, CWS), trealose-dimicolato (TDM) e similares. Além disso, formulações lipossomais, formulações particuladas nas quais o ingrediente é ligado a esferas que têm um diâmetro de vários μm, ou formulações nas quais o ingrediente é ligado a lipídios também são possíveis.
[00115] Administração pode ser obtida, por exemplo, por injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Embora a dose do composto da presente invenção nas formulações possa variar dependendo da doença a ser tratada, da idade e do peso do paciente, e similares, é típico administrar 0,0001 mg a 1000 mg, preferivelmente 0,001 mg a 1000 mg, mais preferivelmente 0,1 mg a 10 mg de um composto da invenção por vários dias a vários meses. 2) Vacinas de câncer que compreendem a célula apresentadora de antígeno da presente invenção como um ingrediente ativo.
[00116] A presente invenção fornece uma vacina de câncer que compreende a célula apresentadora de antígeno da presente invenção como um ingrediente ativo.
[00117] Recentemente, terapia celular (terapia de DC) foi relatada em que linfócitos são isolados do sangue periférico de um paciente com câncer, e as células dendríticas induzidas a partir dos linfócitos são pulsadas in vitro com um antígeno de peptídeo ou similar para preparar células apresentadoras de antígeno, que são então colocadas de volta no paciente através de uma injeção subcutânea ou similar (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999, Cancer Res., 56: p5672, 1996, J. Immunol., 161: p5607, 1998, J. Exp. Med., 184: p465, 1996). Dessa forma, a célula apresentadora de antígeno da presente invenção pode ser usada como um ingrediente ativo em uma vacina de câncer em terapia celular.
[00118] A vacina de câncer que compreende as células apresentadoras de antígeno da invenção como um ingrediente ativo contém preferivelmente solução salina fisiológica, solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio, ou similar para manter as células apresentadoras de antígeno estáveis. Ela pode ser administrada, por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intradermicamente. A dose é exemplificada pelas descritas nas literaturas mencionadas acima.
[00119] Por reintroduzir a vacina de câncer no corpo do paciente, CTLs específicas são induzidas eficazmente em pacientes positivos para HLA-A24, e positivos para WT1 a fim de obter o tratamento ou prevenção dos cânceres. A vacina de câncer que compreende as células apresentadoras de antígeno da invenção como um ingrediente ativo pode ser usada para tratar ou evitar cânceres em que o nível da expressão do gene WT1 é elevado, incluindo cânceres do sangue tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer embrionário, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, e câncer ovariano. 3) Vacinas de câncer que compreendem a CTL da presente invenção como um ingrediente ativo.
[00120] A presente invenção fornece uma vacina contra câncer que compreende como um ingrediente ativo a CTL da invenção (uma composição farmacêutica utilizável como vacinas de câncer). As CTLs da presente invenção são úteis em imunoterapia adotiva, como descrito posteriormente.
[00121] Para melanomas, foi observado que uma imunoterapia adotiva obtém um efeito terapêutico, em que as células T que infiltram tumor, isoladas do próprio paciente, são cultivadas ex vivo em grandes quantidades, e então colocadas de volta no paciente (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994). Da mesma forma, em melanoma de camundongo, a supressão de metástase foi observada por estimular in vitro esplenócitos com peptídeo antigênico de câncer TRP-2, por meio disso proliferando CTLs específicas para o peptídeo antigênico de câncer, e administrar as ditas CTLs em um camundongo enxertado com melanoma (J. Exp. Med., 185:453, 1997). Isso resultou da proliferação in vitro de CTLs que reconhecem especificamente o complexo entre um antígeno HLA e o peptídeo antigênico de câncer sobre células apresentadoras de antígeno. Conseqüentemente, acredita-se que um método para tratar cânceres, que compreende estimular in vitro linfócitos de sangue periférico de um paciente usando o composto da presente invenção para proliferar CTLs tumor- específicas in vitro, e subseqüentemente colocar as CTLs de volta no paciente, seja útil. Dessa forma, as CTLs da invenção podem ser usadas como um ingrediente ativo compreendido em vacina de câncer usada em imunoterapia adotiva.
[00122] Uma vacina de câncer que compreende as CTLs da presente invenção como um ingrediente ativo contém preferivelmente solução salina fisiológica, solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio, ou similares para manter estavelmente as CTLs. Isso deve ser administrado, por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intradermicamente. A dose é exemplificada pela dose descrita nas literaturas acima mencionadas.
[00123] Por reintroduzir a vacina de câncer no corpo do paciente, efeito citotóxico de CTLs sobre células de câncer é aumentado no paciente positivo para HLA-A24 e positivo para WT1, e destrói células de câncer, a fim de obter o tratamento dos cânceres. A vacina de câncer que compreende a CTL da presente invenção como um ingrediente ativo pode ser usada para tratar ou prevenir cânceres que envolvem o nível elevado de expressão do gene WT1. Exemplos de cânceres incluem cânceres do sangue tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer embrionário, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, e câncer ovariano.
[00124] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos, mas não é limitada a estes exemplos em nenhum aspecto.
[00125] Nos seguintes exemplos, o composto do Exemplo 2, o composto do Exemplo 4 e o composto do Exemplo 6 são derivados de WT1235-243 (SEQ ID N°: 1), e correspondem ao derivado de WTI235-243 modificado com cistina, glutationa, ou ácido tioglicólico, respectivamente. Além disso, o composto do Exemplo 1, o composto do Exemplo 3 e o composto do Exemplo 5 e o composto do Exemplo 5 são derivados de WTI235-243 (2M^Y) (SEQ ID N°: 2) e correspondem ao derivado de WTI235-243 (2M^Y) modificado com cistina, glutationa e ou ácido glicólico, respectivamente.
[00126] As abreviações usadas nos Exemplos são as seguintes: Boc: t-butoxicarbonila Npys: 3-nitro-2- piridina sulfenila t-Bu; t-butila Trt: trifenilmetila Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonila DMF: dimetilformamida HOBT: N-hidroxibenzotriazol DIPCI: diisopropilcarbodiimida Exemplo 1 Síntese de um peptídeo da fórmula (4):
[00127] Um peptídeo (1,5 g) preparado na Preparação 1 como descrito abaixo e Boc-Cys(Npys)-OH (600 mg) foram misturados em dimetilsulfóxido (20 ml) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 20 minutos. Acetonitrila (600 ml) foi adicionada à mistura de reação, e a mistura foi agitada sobre gelo e o precipitado resultante foi coletado por filtração. O sólido sobre o filtro foi lavado com acetonitrila e éter dietílico seguido por secagem sob pressão reduzida para preparar o peptídeo (1,65 g) ao qual Boc-Cys-OH foi ligado por uma ligação de dissulfeto. O peptídeo resultante (0,53 g) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (5 ml) e a solução foi agitada em temperatura ambiente por 10 minutos. Após o ácido trifluoroacético ter evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em uma solução mista de acetonitrila-ácido acético-água (10/10/90) (110 ml) seguido por purificação usando HPLC.
[00128] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00129] Coluna: YMC ODS-A 3cmα X25cmL, 10μm
[00130] Eluente 1: H2O/TFA 0,1%
[00131] Eluente 2: CH3CN/TFA 0,1%
[00132] Taxa de fluxo: 20 ml/min
[00133] Detecção: UV 220nm
[00134] A solução de peptídeo bruta foi aplicada em uma coluna equilibrada com 5% do eluente 2. Então, 5% de eluente 2 foram corridos por 10 minutos e 15% de eluente 2 foram corridos por 15 minutos e posteriormente a concentração de eluente 2 foi aumentada em 0,1%/min. As frações que compreendem o produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado (300 mg).
[00135] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1292 [M+1]+ (valor teórico = 1291,5) Exemplo 2 Síntese de um peptídeo de fórmula (5):
[00136] O peptídeo desejado (104 mg) foi preparado pela reação de um peptídeo (500 mg) preparado na Preparação 2 como descrito abaixo com Boc-Cys(Npys)-OH (200mg), seguido pela remoção do grupo Boc em ácido trifluoroacético e purificação por meio de HPLC de modo similar ao Exemplo 1.
[00137] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1260 [M+1]+ (valor teórico = 1259,5) Exemplo 3 Síntese de um peptídeo de fórmula (8):
[00138] Um peptídeo (240 mg) preparado na Preparação 1 e 2,2’- ditio-bis(5-nitropiridina) (60 mg) foram misturados em dimetilsulfóxido (6 ml) a mistura foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. Glutationa reduzida (120 mg) foi adicionada à mistura da reação seguido por agitação a 30°C por uma hora. Após glutationa reduzida (60 mg) e dimetilsulfóxido (4 ml) terem sido adicionados à reação seguido por agitação por 30 minutos, acetonitrila (200 ml) foi adicionada à mistura da reação e então, o precipitado resultante foi coletado por filtração e seco sob pressão reduzida para preparar um peptídeo bruto (440 mg). O peptídeo bruto resultante foi dissolvido na mistura (110 ml) de acetonitrila-ácido acético e água (10/10/90) seguido por purificação usando HPLC.
[00139] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00140] Coluna: YMC ODS-A 3cmd X25cmL, 10μm
[00141] Eluente 1: H2O/TFA 0,1%
[00142] Eluente 2: CH3CN/TFA 0,1%
[00143] Taxa de fluxo: 20 ml/min
[00144] Detecção: UV 220nm
[00145] A solução de peptídeo bruto foi aplicada sobre uma coluna equilibrada com 10% de eluente 2. Então, 10% de eluente 2 foram corridos por 10 minutos e 17% de eluente 2 foram corridos por 15 minutos e posteriormente a concentração de eluente 2 foi aumentada em 0,05%/min. Frações que compreendem o produto desejado foram coletadas e a acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado (107 mg).
[00146] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1477 [M+1]+ (valor teórico = 1477,5) Exemplo 4 Síntese de um peptídeo da fórmula (9):
[00147] Um peptídeo (120 mg) preparado na Preparação 2 e 2,2’- ditiobis(5-nitropiridina) (30 mg) foram misturados em dimetilsulfóxido (3 ml) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. Glutationa reduzida (30 mg) foi adicionada à mistura da reação seguido por agitação em temperatura ambiente por 30 minutos e então água (1 ml) e glutationa reduzida (30 mg) foram ainda adicionadas à mistura da reação seguido por agitação por 20 minutos. Após acetonitrila (100 ml) ter sido adicionada à mistura da reação, o precipitado resultante foi coletado por filtração e seco sob pressão reduzida para preparar um peptídeo bruto (160 mg). O peptídeo bruto resultante foi dissolvido na mistura (55 ml) de acetonitrila-ácido acético-água (5/5/45) seguido por purificação usando HPLC.
[00148] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00149] Coluna: YMC ODS-A 2cmΦX25cmL, 10μm
[00150] Eluente 1: H2O/TFA 0,1%
[00151] Eluente 2:CH3CN/TFA 0,1%
[00152] Taxa de fluxo: 10 ml/min
[00153] Detecção: UV 220nm
[00154] A solução de peptídeo bruto foi aplicada em uma coluna equilibrada com 10% de eluente 2. Então, 10% de eluente 2 foram corridos por 10 minutos e 17% de eluente 2 foram corridos por 15 minutos e, posteriormente, a concentração de eluente 2 foi aumentada por 0,05%/min. Frações que compreendem o produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado (18 mg).
[00155] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1445 [M+1]+ (valor teórico = 1445,5) Exemplo 5 Síntese de um peptídeo da fórmula (6):
[00156] Um peptídeo (240 mg) preparado na Preparação 1 e 2,2’- ditiobis(5-nitropiridina) (60 mg) foram misturados em dimetilsulfóxido (6 ml) a mistura foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. Tioglicolato de sódio (100 mg) foi adicionado à mistura da reação seguido por agitação a 30°C por 30 minutos e então, tioglicolato de sódio (50 mg), dimetilsulfóxido (4 ml) e água (2 ml) foram ainda adicionados à mistura da reação seguido por agitação por 30 minutos. Após acetonitrila (200 ml) ter sido adicionada à mistura de reação, o precipitado resultante foi coletado por filtração e seco sob pressão reduzida para preparar um peptídeo bruto (305 mg). O peptídeo bruto resultante foi dissolvido na mistura (330 ml) de acetonitrila-ácido acético-água (30/30/270) seguido por filtração e, então, o filtrado resultante foi purificado usando HPLC.
[00157] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00158] Coluna: YMC ODS-A 3cmΦX25cmL, 10μm
[00159] Eluente 1: H2O/TFA 0,1%
[00160] Eluente 2: CH3CN/TFA 0,1%
[00161] Taxa de fluxo: 20 ml/min
[00162] Detecção: UV 220nm
[00163] A solução de peptídeo bruto foi aplicada em uma coluna equilibrada com 10% de eluente 2. Então, 10% de eluente 2 foram corridos por 10 minutos e 20% de eluente 2 foram corridos por 15 minutos e 23% de eluente 2 foram corridos por 15 minutos e, posteriormente, a concentração de eluente 2 foi aumentada por 0,05%/min. Frações que compreendem o produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado (15 mg).
[00164] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1263 [M+1]+ (valor teórico = 1262,5). Exemplo 6 Síntese de um peptídeo de fórmula (7):
[00165] Um peptídeo (240 mg) preparado na Preparação 2 e 2,2’- ditiobis(5-nitropiridina) (60 mg) foram misturados em dimetilsulfóxido (6 ml) a mistura foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. Tioglicolato de sódio (50 mg) foi adicionado à mistura da reação seguido por agitação a 30°C por 30 minutos. Além disso, após o tioglicolato de sódio (50 mg) ter sido adicionado à reação seguido por agitação a 30°C por uma hora, acetonitrila (200 ml) foi adicionada à mistura de reação. O precipitado resultante foi coletado por filtração e seco sob pressão reduzida para preparar um peptídeo bruto (194 mg). O peptídeo bruto resultante foi dissolvido na mistura (120 ml) de acetonitrila-ácido acético-água (10/20/90) seguido por filtração e, então, o filtrado resultante foi purificado usando HPLC.
[00166] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00167] Coluna: YMC ODS-A 3cmd X25cmL, 10μm
[00168] Eluente 1: H2O/ TFA 0,1%
[00169] Eluente 2:CH3CN/TFA 0,1%
[00170] Taxa de fluxo: 20 ml/min
[00171] Detecção: UV 220nm
[00172] A solução de peptídeo bruto foi aplicada em uma coluna equilibrada com 10% de eluente 2. Então, 10% de eluente 2 foram corridos por 10 minutos e 18% de eluente 2 foram corridos por 15 minutos e após isso, a concentração de eluente 2 foi aumentada por 0,1%/min. Frações que compreendem o produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado (30 mg).
[00173] Espectrometria de massa: LC-ESI/MS m/z = 1230 [M+1]+ (valor teórico = 1230,4). Exemplo 7 Síntese de um peptídeo da fórmula (4): 1. Síntese de Resina de Peptídeo Protegida (Boc-Cys(Boc-Cys-OH)- Tyr(tBu)-Thr (tBu)-Trp (Boc)-Asn (Trt)-Gln (Trt)-Met-Asn (Trt)-Leu-Alko- Resina)
[00174] Fmoc-Leu-Alko-resina (em que Alko é álcool p- alcoxibenzílico) (10 g) (0,74 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) foi colocado em um recipiente de reação (500 ml, sintetizador de fase sólida Tipo ACT90, Advanced ChemTech) e lavado uma vez com DMF ou similar (Processo 1). A resina foi então tratada com piperidina 25% (3 minutos x 1 e 15 minutos x 1) para clivar o grupo Fmoc (Processo 2) e lavada novamente com DMF ou similar (Processo 6) para remover a piperidina. Ao recipiente de reação foi adicionada uma solução de Fmoc-Asn (Trt)-OH (13,25 g) e HOBT (1- hidroxibenzotriazol) (3,4 g) em NMP (N-metilpirrolidininona) (200 ml). Após adicionar DIPCI (N,N’-diisopropilcarbodiimida) (3,42 ml), a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 60 minutos (Processo 3). Então, a resina foi lavada com NMP (Processo 4) e a reação de acoplamento foi conduzida novamente usando Fmoc-Asn(Trt)-OH (13,25 g), HOBT (3,4 g) e DIPCI (3,42 ml) (Processo 3). Após a resina ter sido lavada (Processo 6), a resina foi agitada em Ac2O 25% (anidrido acético) por 3 minutos x 1 e por 15 minutos x 2 para proteger os grupos amino não reagidos (Processo 5). A resina foi lavada (Processo 6) seguido por desproteção (Processo 2) e lavagem (Processo 6) para preparar H-Asn(Trt)-Leu-Alko-resina. Uma reação de acoplamento foi conduzida usando Fmoc-Met-OH (8,25g), Fmoc- Gln(Trt)-OH (13,56g), Fmoc-Asn(Trt)-OH (13,25g), Fmoc-Trp(Boc)-OH (11,69g), Fmoc-Thr(tBu)-OH (8,82g), Fmoc-Tyr(tBu)-OH (10,2g), e (Boc-Cys-OH)2 (19,56g) de maneira similar, com a condição de que o acoplamento seria repetido três vezes no caso de dificuldade de acoplamento. Após (Boc-Cys-OH)2 (N,N'-t-butoxicarbonilcistina) localizada na terminação N ter sido condensada, a lavagem (Processo 6) foi conduzida seguido por lavagem com éter dietílico (200 ml) duas vezes e secagem sob pressão reduzida para preparar Boc-Cys(Boc- Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc) -Asn(Trt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)- Leu-Alko-Resina (a resina de peptídeo da fórmula (10)) (22,87 g). Os processos de síntese acima estão resumidos na Tabela a seguir. Tabela 1
[00175] A mistura (200 ml) de ácido trifluoroacético/etanodiol/H2O/- triisopropilsilano (94/2,5/2,5/1) foi adicionada à resina de peptídeo protegida (Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resina (22,87g) obtida de acordo com os processos acima e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 4 horas. Após o produto de reação ter sido filtrado, o filtrado foi adicionado a éter dietílico (400 ml) com resfriamento sobre gelo. O precipitado resultante foi coletado por filtração usando filtro de vidro e então lavado com éter dietílico e seco sob pressão reduzida para preparar o peptídeo bruto (8,27 g).
[00176] O peptídeo bruto resultante (2,76 g) foi dissolvido na solução aquosa de ácido acético 20% (1400 ml) e acetonitrila (35 ml) e as substâncias insolúveis resultantes foram removidas por filtração. A solução de peptídeo resultante bruta foi purificada usando cromatografia líquida de fase reversa.
[00177] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00178] Coluna: YMC ODS-A 5cmΦX50cmL, 15-30μm
[00179] Eluente 1: H2O/ TFA 0,1%
[00180] Eluente 2: CH3CN/ TFA 0,1%
[00181] Taxa de fluxo: 60 ml/min
[00182] Detecção: UV 280nm
[00183] A solução de peptídeo bruto foi aplicada em uma coluna equilibrada com 10% de eluente 2. Então, 10% de eluente 2 foram corridos por 30 minutos e, posteriormente, a concentração de eluente 2 foi aumentada para 34% durante 120 minutos. Frações compreendendo o produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado: H-Cys(H-Cys-OH)-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn- Leu-OH (o peptídeo da fórmula (4)) (0,91g).
[00184] A imunogenicidade de cada peptídeo antigênico preparado pelos Exemplos 1-6 foi avaliada usando camundongos transgênicos HLA-A2402/Kb (veja WO 02/47474 e daqui por diante os camundongos podem ser referidos como camundongos HLA-A24). Três camundongos transgênicos foram usados na imunização com cada peptídeo para avaliar a imunogenicidade.
[00185] Uma composição farmacêutica que compreende cada peptídeo sintético foi preparada como se segue. Cada um dos peptídeos sintéticos dos Exemplos 1-3, 5, 6 foi ajustado para 40 mg/ml em DMSO. Então, a solução (32,5 μl) foi misturada com água para injeção (540 μl). Adicionalmente, a solução resultante (550 μl) foi misturada com adjuvante incompleto de Freund (700 μl) (Montanide ISA51) usando uma seringa de vidro para preparar uma emulsão água-em-óleo. O peptídeo do Exemplo 4 foi ajustado para 50 mg/ml em DMSO e o peptídeo sintético auxiliar (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, SEQ ID N°: 5) também foi ajustado para 20 mg/ml em DMSO. Então, 30 μl de ambas as soluções de peptídeo foram misturadas em água para injeção (540 μl) seguido da mistura com igual quantidade de adjuvante incompleto de Freund (IFA) para preparar uma emulsão água-em-óleo.
[00186] A preparação resultante (200 μl) foi injetada em um camundongo transgênico HLA-A2402/Kb intradermicamente na base da cauda para imunização. 7-8 dias após o início do experimento, o baço foi removido e triturado sobre a parte fosca de uma lâmina de vidro e os esplenócitos foram coletados e preparados. Uma porção dos esplenócitos submetida a tratamento de hemólise com tampão ACK (NH4Cl 0,15 M, KHCO310 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7.2-7.4) foi pulsada com o peptídeo antigênico usado na imunização (100 μg/ml) por uma hora e semeada em uma placa de 24 cavidades (7x106 células /cavidade). Simultaneamente, esplenócitos não pulsados com nenhum peptídeo (7x105 células/cavidade) foram adicionados juntos e estimulados in vitro e cultivados a 37°C por 5-6 dias. A estimulação in vitro foi realizada com meio RPMI-1640 suplementado com FCS 10%, HEPES 10 mM, L-glutamina 20 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não-essenciais MEM 1 mM, vitamina MEM 1% e 2- mercaptoetanol 55 μM.
[00187] 5-6 Dias após o início da reestimulação, o teste para atividade citotóxica foi conduzido de acordo com a maneira convencional. Células EL4-A2402/Kb obtidas pela transformação de células EL-4 (DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD.,óxi de Catálogo. 06-039) com um vetor de expressão que codifica HLA- A2402/Kb e as células EL4-A2402/Kb pulsadas com peptídeo antigênico: WT1235-243 ou WT1235-243 (2M^Y) foram usadas como células-alvo (T). Especificamente, células pulsadas com WT1235-243 (2M^Y) foram usadas para avaliação de peptídeos dos Exemplos 1, 3 e 5 e as células pulsadas com WT1235-243 foram usadas para avaliação de peptídeos dos Exemplos 2, 4 e 6. Essas células foram marcadas com 51Cr (1,85 MBq/106 células) e pulsadas com o peptídeo em 100 μg/ml por uma hora (A marcação foi realizada por duas horas e uma hora após o início da marcação o peptídeo foi adicionado). O ensaio de liberação de 51Cr (J. Immunol., 159:4753, 1997) foi conduzido para determinar a atividade citotóxica de esplenócitos cultivados in vitro (E) a células-alvo (T). Nesse ensaio, a proporção E/T foi de 80.
[00188] Os resultados são mostrados nas figuras 1-7. As figuras 1-6 correspondem às atividades citotóxicas de compostos de peptídeos dos Exemplos 1-6, respectivamente. Nas figuras, o eixo vertical mostra a atividade específica (Lise Específica) e o eixo horizontal mostra os resultados de cada um dos três camundongos individualmente. Além disso, os resultados de dependência da dose do composto do Exemplo 1 são mostrados na figura 7. Na figura, o eixo vertical mostra a atividade específica (Lise Específica) e o eixo horizontal mostra a dose administrada individualmente (600 μg, 200 μg, 60 μg e 20 μg). Na figura, três camundongos foram usados para cada dose e a média e o desvio padrão (S.D.) das atividades citotóxicas são mostradas. Como claramente entendido a partir das figuras, foi descoberto que todos os peptídeos sintéticos têm atividade de indução de CTL, ou seja, imunogenicidade.
[00189] O peptídeo do Exemplo 1 foi ajustado para 40 mg/ml em DMSO. Então, a solução (32,5 μl) foi misturada com água para injeção (540 μl). Adicionalmente, a solução resultante (550 μl) foi misturada com adjuvante incompleto de Freund (700 μl) (Montanide ISA51 (marca registrada)) (SEPPIC, Inc, Paris, França) usando uma seringa de vidro para preparar uma emulsão água-em-óleo.
[00190] A preparação resultante (200 μl) foi injetada em um camundongo transgênico HLA-A2402/Kb intradermicamente na base da cauda para imunização. 7 dias após o início do experimento, baço foi removido e os esplenócitos foram preparados de maneira convencional (WO 02/47474). Então, os testes foram conduzidos usando o kit ELISPOT IFN gama de camundongo (Enzyme - Linked Immunospot) (Fujisawa, catalogóxi BD-551083). O teste foi conduzido de acordo com as instruções anexadas ao kit. 5x105 células/cavidade de esplenócitos foram plaqueadas e o meio de cultura contendo o peptídeo do Exemplo 1, o peptídeo selvagem (WT1235-243) ou um peptídeo derivado de vírus influenza (ASNENMETM, peptídeo de controle negativo que não se liga a HLA-A24) foi adicionado na concentração final de 10-6 M seguido pela incubação usando uma incubadora de CO2 a 37°C por 18 horas.
[00191] De acordo com as instruções anexas, a placa foi lavada e o número de spots foi detectado usando KS Elispot Research System (Carl Zeiss). O método Elispot é conhecido como uma alternativa ao teste de atividade citotóxica (J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54). Os resultados são mostrados na figura 8. Como um resultado, foi descoberto que o peptídeo do Exemplo 1 poderia induzir imunidade mediada por célula específica para HLA-A24 que teve reação cruzada com o peptídeo selvagem.
[00192] Sangue periférico (50 ml) foi retirado usando tubo coletor de sangue a vácuo heparinizado de indivíduos saudáveis positivos para HLA-A24. O sangue diluído duas vezes com PBS (-) foi superposto com Ficoll-Paque (Amersham Biosciences), cuja quantidade era a metade da quantidade do sangue, seguido pela centrifugação por 20 minutos a 2000 rpm. Uma camada celular contendo células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foi coletada e 3-4 vezes a quantidade de PBS (-) foi adicionada a ela, seguido por centrifugação por 10 minutos a 1800 rpm. O precipitado de célula foi lavado duas vezes com PBS (-) e PBMC foi coletada.
[00193] PBMC foi ressuspensa em meio para cultura de linfócito (RPMI 1640:AIM V=1:1 NEAA 10% FCS) e cultivada em um frasco de cultura por duas horas e as células não aderentes foram coletadas. Usando o kit II para isolamento de célula T CD8+ (Miltenyi Biotec), células T positivas para CD8 foram coletadas dentre as células não aderentes. As células aderentes foram cultivadas no meio para cultura de linfócito contendo GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml) por 7 dias. As células flutuantes foram coletadas como uma fração de célula apresentadora de antígeno contendo células dendríticas (DC). As células coletadas foram congeladas para preservação até serem usadas por experimentos.
[00194] A fração de DC preparada como acima foi pulsada com o peptídeo do Exemplo 1 (50 μg/ml) pela incubação das células com o peptídeo no meio AIM-V contendo mitomicina (50 μg/ml) por uma hora. Após lavar com o meio três vezes, o peptídeo do Exemplo 1 foi ainda adicionado (50 μg/ml) em um pulso de uma hora para preparar células apresentadoras de antígeno. No Dia 0, as células apresentadoras de antígeno pulsadas com o peptídeo foram adicionadas a células T positivas para CD8 para conduzir a primeira estimulação e a cultura celular foi iniciada em meio para cultura de linfócito contendo IL-7 (10 ng/ml) usando uma placa de 24 cavidades. No Dia 7, as células T foram coletadas e após lavá-las, a estimulação com peptídeo usando células apresentadoras de antígeno pulsadas com o peptídeo foi conduzida de maneira similar à primeira estimulação. No dia seguinte (Dia 8), IL-2 foi adicionada tal que a concentração era de 50 U/ml. No Dia 14, as células T foram coletadas e a terceira estimulação foi conduzida de maneira similar a primeira e segunda estimulações. No dia seguinte (Dia 15), IL-2 foi adicionada tal que a concentração era de 50 U/ml. No Dia 21, as células T foram coletadas e congeladas para preservação.
[00195] 1x105 células das células T do Dia 21 foram adicionadas a 2x104 células de HLA-A2402 que expressam VA13/A2402 pulsadas com ou sem cada um dos peptídeos (peptídeo selvagem (WT1235-243), peptídeo modificado (WT1235-243(2M^Y)) ou o peptídeo do Exemplo 1) e 18 horas mais tarde, o sobrenadante foi coletado para determinar a quantidade de IFN-Y usando ELISA.
[00196] Os resultados da reatividade específica ao peptídeo de células T estimuladas com o peptídeo sintético do Exemplo 1 foram mostrados na figura 9. As células T estimuladas com o peptídeo sintético do Exemplo 1 não reagiram com células pulsadas sem o peptídeo, mas elas reagiram suficientemente com células pulsadas com o peptídeo do Exemplo 1. Assim, foi descoberto que células T específicas para o peptídeo foram induzidas. Além disso, as células T induzidas específicas para o peptídeo reagiram com as células pulsadas com o peptídeo selvagem (WT1235-243), assim como as células pulsadas com o peptídeo modificado (WT1235-243(2M^Y)).
[00197] Fmoc-Leu-Alko-resina (em que Alko é álcool p- alcoxibenzílico) (10 g) (0,82 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) foi aplicado em um recipiente de reação (500 ml, sintetizador de fase sólida Tipo ACT90, Advanced ChemTech) e lavado uma vez com DMF ou similar (Processo 1). A resina foi então tratada com Pip 25% (piperidina) (3 minutos x 1 e 15 minutos x 1) para clivar o grupo Fmoc (Processo 2) e lavada novamente com DMF ou similar (Processo 1) para remover Pip. Ao recipiente de reação foi adicionada uma solução de Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,46 g) e HOBT (1-hidroxibenzotriazol) (6,28 g) em NMP (N-metilpirrolidininona) (200 ml). Após adicionar DIPCI (N,N’-diisopropilcarbodiimida) (6,3 ml), a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos (Processo 3). Trinta minutos depois, a resina foi lavada com NMP (Processo 4) e submetida à reação de acoplamento mais uma vez usando Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,46 g), HOBT (6,28 g) e DIPCI (6,3 ml) (Processo 5) para sintetizar a resina Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko. A resina resultante foi então convertida para resina de H-Asn(Trt)-Leu-Alko pela desproteção do Processo 2. Após a lavagem (Processo 1), Fmoc-Met-OH 15,23 g, Fmoc-Gln(Trt)-OH 25,04 g, Fmoc-Asn(Trt)-OH 24,46 g, Fmoc- Trp(Boc)-OH 21,59 g, Fmoc-Thr(tBu)-OH 16,3 g, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 18,84 g e Fmoc-Cys(Trt)-OH 24,01 g foram adicionados em série para conduzir a reação de acoplamento (Processo 3). Na reação de acoplamento usando Fmoc-Thr(tBu)-OH, a reação foi repetida três vezes e a resina resultante foi lavada com DMF e tratada com AC2O 25% (anidrido acético) (15 minutos x 2) para o capeamento de grupos amino não reagidos. Após a condensação de Fmoc-Cys(Trt)-OH da terminação N, a desproteção (Processo 2) e a lavagem (Processo 6) foram conduzidas para se obter H-Cys(Trt)- Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc) -Asn(Trt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resina. Os processos acima estão resumidos na seguinte Tabela: Tabela 2
[00198] A solução mista de ácido trifluoroacético/etanodiol/H2O/triisopro-pilsilano (94/2,5/2,5/1) (100 ml) foi adicionada à resina de peptídeo protegida (H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)- Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resina) (10,0) como preparada acima e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 4 horas. A solução de reação foi adicionada a t-butilmetiléter (625 ml) com resfriamento sobre gelo e a mistura resultante foi agitada por 15 minutos seguidos por filtração usando um filtro de vidro para se obter substâncias insolúveis. Após o resíduo do filtro ter sido lavado com t-butilmetiléter (cerca de 100 ml) cinco vezes, o resíduo sobre o filtro foi extraído com solução aquosa de cloridrato de guanidina 6M (1 L) para preparar a solução de peptídeo bruto.
[00199] A solução resultante de peptídeo bruto foi purificada usando cromatografia líquida da fase reversa.
[00200] Bomba: tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00201] Coluna: YMC ODS-A 5cmΦX50cmL, 15-30μm
[00202] Eluente 1: H2O / TFA 0,1%
[00203] Eluente 2: CH3CN/ TFA 0,1%
[00204] Taxa de fluxo: 60 ml/min
[00205] Detecção: UV 220nm
[00206] A solução de peptídeo bruto foi aplicada na coluna que foi equilibrada com 10% de eluente 2 e mantida em um banho-maria a 50°C. Após 10% do eluente 2 ter corrido por 30 minutos, a concentração de eluente 2 foi aumentada para 20% por 40 minutos e aumentada adicionalmente para 40% por 360 minutos. Frações que compreendem um produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado: H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (SEQ ID N°: 2) (1,50 g). • Análise de aminoácido Hidrólise: fenol 1% / ácido clorídrico aquoso 6N, 110°C, 10 horas Método de análise: Método de ninhidrina Asx: 1,96(2) Thr: 1,05(1) Glx: 1,06(1) Met: 1,05(1) *Leu:(1) Tyr: 0,87(1) • ) Leu = Valor Teórico do aminoácido padrão é descrito em ( ). • Análise de massa: LC-ESI/MS m/z =1173 [M+1]+ (valor teórico =1172,5) • Análise de seqüência de aminoácido: Os resíduos de aminoácido desde Tyr na posição 2 da terminação N até Leu na terminação C foram seqüencialmente confirmados.
[00207] Fmoc-Leu-Alko-resina (em que Alko é álcool p- alcoxibenzílico) (10 g) (0,81 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) foi aplicado em um recipiente de reação (500 ml, sintetizador de fase sólida Tipo ACT90, Advanced ChemTech) e lavado uma vez com DMF ou similar (Processo 1). A resina foi então tratada com 25% Pip (piperidina) (3 minutos x 1, e 15 minutos x 1) para clivar o grupo Fmoc (Processo 2), e lavada novamente com DMF ou similar (Processo 1) para remover Pip. Ao recipiente de reação foi adicionada uma solução de Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,17 g) e HOBT (1-hidroxibenzotriazol) (6,2 g) em NMP (N-metilpirrolidinona) (200 ml). Após adicionar DIPCI (N,N'- diisopropilcarbodiimida) (6,2 ml), a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos (Processo 3). Trinta minutos mais tarde, a resina foi lavada com NMP (Processo 4), e submetida à reação de acoplamento uma vez usando Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,17 g), HOBT (6,2 g) e DIPCI (6,2 ml) (Processo 5) para sintetizar Fmoc-Asn(Trt)-Leu- Alko resina. A resina resultante foi então convertida para H-Asn(Trt)- Leu-Alko-resina pela desproteção do Processo 2. Após a lavagem (Processo 1), Fmoc-Met-OH 15,05g, Fmoc-Gln(Trt)-OH 24,73g, Fmoc- Asn(Trt)-OH 24,17g, Fmoc-Trp(Boc)-OH 21,33g, Fmoc-Thr(tBu)-OH 16,1g, Fmoc-Met-OH 15,05g e Fmoc-Cys(Trt)-OH 23,72g foram adicionados em série para conduzir a reação de acoplamento (Processo 3). Na reação de acoplamento usando Fmoc-Thr(tBu)-OH, a reação foi repetida três vezes e a resina foi lavada com DMF e tratada com 25% AC2O (anidrido acético) (15 minutos x 2) para o capeamento de grupos amino não reagidos. Após condensação do Fmoc-Cys(Trt)- OH N-terminal, a desproteção (Processo 2) e lavagem (Processo 6) foram conduzidos para obter H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)- Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resina. O processo acima para síntese são os mesmos descritos na Tabela da Preparação 1.
[00208] A mistura de ácido trifluoroacético/etanodiol/H2O/triisopropil- silano (94/2,5/2,5/1) (130 ml) foi adicionada à resina de peptídeo protegida (H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met- Asn(Trt)-Leu-Alko-Resina) (13,0 g) com preparado acima e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 4 horas. A mistura da reação foi adicionada a éter dietílico (800 ml) com resfriamento em gelo e a mistura resultante foi agitada por 15 minutos seguidos por filtração usando um filtro de vidro para obter substâncias insolúveis. Após o resíduo no filtro ter sido lavado com éter dietílico (cerca de 100 mL) cinco vezes, o resíduo no filtro foi extraído com solução aquosa de cloridrato de guanidina 6M (1,3 L) para preparar a solução de peptídeo bruta.
[00209] A solução de peptídeo bruto resultante foi purificada usando cromatografia líquida de fase reversa
[00210] Bomba: Tipo LC-8A (SHIMADZU CORPORATION)
[00211] Coluna: YMC ODS-A 5cmΦX50cmL, 15-30μm
[00212] Eluente 1: H2O/ TFA 0,1%
[00213] Eluente 2: CH3CN/ TFA 0,1%
[00214] Taxa de fluxo: 60 ml/min
[00215] Detecção: UV 220nm
[00216] A solução de peptídeo bruto foi aplicada em uma coluna que foi equilibrada com 10% de eluente 2 e mantida em um banho- maria a 50°C. Após 10% do eluente 2 ter sido corrido por 30 minutos, a concentração de eluente 2 foi aumentada para 20% por 40 minutos e aumentada ainda mais para 40% por 360 minutos. Frações que compreendem um produto desejado foram coletadas e acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida seguido por liofilização para preparar o peptídeo desejado: H-Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (SEQ ID N°: 1) (2,32g). • Análise de aminoácido Hidrólise: ácido metanossulfônico 4N, 110°C, 17 horas Método de análise: Método de ninhidrina Asx: 1,87(2) Thr: 0,93(1) Glx: 0,95(1) Met: 1,72(2) *Leu: (1) Trp: 0,80,(1) • ) Leu = Valor Teórico do aminoácido padrão é descrito em ( ). • Análise de massa: LC-ESI/MS m/z =1141 [M+1]+ (valor teórico =1140,5) • Análise de seqüência de aminoácido: Os resíduos de aminoácido desde Met na posição 2 da terminação N até Leu na terminação C foram seqüencialmente confirmados.
[00217] Os compostos de peptídeo da presente invenção são úteis como um ingrediente ativo compreendido em um medicamento para imunoterapia de câncer.
[00218] Texto Livre de Listagem de Seqüência
[00219] SEQ ID Nº 1: derivado de peptídeo
[00220] SEQ ID Nº 2: derivado de peptídeo
[00221] SEQ ID Nº 3: derivado de peptídeo
[00222] SEQ ID Nº 4: derivado de peptídeo
[00223] SEQ ID Nº 5: peptídeo sintético auxiliar
Claims (14)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (1):
em que X é um resíduo de tirosina ou um resíduo de metionina; cada um de Y e Z é independentemente uma ligação simples, R1 é hidrogênio, R2 é hidroxila, R3 é hidrogênio, amino, ou um grupo de fórmula (3):
em que r é um número inteiro 2 R4 é carbóxi, ou um grupo de fórmula (2):
em que W é um resíduo glicina, m é 1, e n é um número inteiro de 0 a 1, com a condição de que quando n for 0, R3 é hidrogênio, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R3 é um grupo de fórmula (3'):
R4 é carboximetilcarbamoíla, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R3 é hidrogênio e R4 é carbóxi, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (6):
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (7):
Ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (8):
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
7. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (9):
8. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (1’):
R1' é hidrogênio, R2' é hidroxila, R3' é amino, e R4 é carbóxi, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (4):
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
10. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (5):
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é usada como uma vacina contra câncer.
13. Uso do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma vacina contra câncer.
14. Medicamento para imunoterapia de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende o composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como um ingrediente ativo.
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