KR101385805B1 - 신규 펩티드 화합물 - Google Patents
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Abstract
기재된 것은 하기 화학식 (1) 으로 표시되는 신규 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이다. 또한 기재되는 것은 암 면역치료에서의 이러한 화합물 또는 염의 용도이다.
[식 중 X 는 티로신 잔기 또는 메티오닌 잔기를 나타내고; Y 및 Z 는 각각 단일 결합 등을 나타내고;
R1 은 수소 원자 등을 나타내고;
R2 는 히드록실기 등을 나타내고;
R3 은 수소 원자, 알킬기, 아미노기 등을 나타내고;
R4 는 수소 원자, 알킬기, 카르복시기 등을 나타내고;
m 은 1 또는 2 를 나타내고;
n 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고, 이와 관련해서, n 이 0 인 경우, R3 은 수소 원자 또는 알킬기를 나타냄)].
Description
본 발명은 암 백신 요법, 특히 암 면역요법을 위한 의약으로 유용한 신규 펩티드 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체 내 CTL 유도 활성을 갖고 암 백신으로 유용한, WT1 유래의 암 항원 펩티드의 유도체에 관한 것이다.
세포 매개 면역성, 특히 세포독성 T 세포 (이하, "CTL" 로 언급됨) 는 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포의 생체 내 거부에서 중요한 역학을 한다. CTL 은 암 항원 단백질 유래의 항원 펩티드 ("암 항원 펩티드") 와 암 세포 상의, 인간의 경우 "HLA 항원" 으로 언급되는 MHC (주 조직적합적 복합체) 계열 I 항원 사이의 복합체를 인지하고, 세포를 공격 및 살해한다.
MHC 계열 I 분자에 결합하는 암 항원 펩티드는 일반적으로 단백질의 세포내 가공에 의해 생성된 8-12 개 아미노산 잔기의 펩티드인 것으로 알려져 있다. 그러므로, 일반적으로, 암 항원 단백질 유래의 8-12 개 아미노산 잔기의 펩티드는 암 항원 펩티드에 대한 후보자일 수 있다. 글루타민 잔기 또는 시스테인 잔기가 암 항원 펩티드에 존재하는 경우, 이들 아미노산 잔기는 일반적으로 공기 대기에서 자발적으로 산화한다. 이러한 자발적 산화는 MHC 계열 I 분자에 대한 펩티드의 결합 친화성 및 T 세포 수용체에 의한 펩티드에 대한 인식 반응을 감소시키 는 것으로 보고된다 (비특허 문헌 1 및 2 참조).
Wilms 종양 (WT1 유전자) 의 종양 억제 유전자 WT1 은 Wilms 종양의 합병증으로 발생하는 WAGR 증후군, 무홍채증, 비뇨생식기 이상, 정신지체 등의 분석에 근거한 Wilms 종양의 원인 유전자 중 하나로서 염색체 11p13 으로부터 단리되었고, WT1 아미노산 서열은 공개적으로 알려져 있다 (비특허 문헌 3 참조). WT1 유전자는 인간 백혈병에서 높은 빈도로 발현되고, 백혈병 세포가 WT1 안티센스 올리고머로 처리되는 경우, 세포 성장이 저해된다. 그러므로, WT1 유전자는 백혈병 세포의 성장을 촉진시키도록 작용하는 것으로 생각된다. 게다가, WT1 유전자는 또한 고형암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암 및 난소암에서 높게 발현되고, WT1 유전자는 백혈병 및 고형암 중의 신규 암 항원 단백질인 것으로 증명되었다 (비특허 문헌 4 및 5 참조). 또한, 야생형 암 항원 펩티드인 WT1 단백질의 일부 서열을 갖는 암 항원 펩티드가 확인되었다 (특허 문헌 1 및 2 참조).
특히, 암 항원 단백질 WT1 의 위치 235 내지 243 에 걸쳐있는 펩티드인, WT1235-243 (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO: 1) 은 HLA-A24-제한 방식으로 CTL 을 유도하는 활성을 갖는 암 항원 펩티드이다 (비특허 문헌 6 및 특허 문헌 1 참조). WT1235 - 243 의 위치 2 에서의 메티오닌 잔기가 티로신 잔기로 대체된 변형 펩티드 (Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO: 2, 이하 WT1235-243 (2M→Y) 로 언급될 수 있음) 는 야생형 펩티보다 HLA-A24 항원에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다 (특허 문헌 3 참조). 면역치료제로서 야생형 펩티드 WT1235 -243 및 변형 펩티드 WT1235 -243 (2M→Y) 모두의 개발이 약속된다.
또한, 상기 야생형 펩티드 및 상기 변형 펩티드 각각이 N-말단 부위에 시스테인 잔기를 갖는다는 것, 공기 대기 중의 이것의 산화가 디술피드 결합을 통해 결합된 이량체를 생성하는 것, 및 상기 이량체가 또한 암 항원 펩티드로서 작용할 수 있다는 것이 알려져 있다 (특허 문헌 4 참조).
특허 문헌 1: WO 00/06602
특허 문헌 2: WO 00/18795
특허 문헌 3: WO 02/079253
특허 문헌 4: WO 2004/063217
비특허 문헌 1: Immunity., 6:273, 1997
비특허 문헌 2: J.Immunol., 160:2099, 1998
비특허 문헌 3: Cell, 60:509, 1990
비특허 문헌 4: J. Immunol., 164:1873-80, 2000
비특허 문헌 5: J. Clin. Immunol., 20, 195-202, 2000
비특허 문헌 6: Clin. Cancer. Res. 8: 2626, 2002
발명에 의해 해결되는 과제
본 발명에 의해 해결되는 과제는 생체 내 CTL 유도 활성을 갖고 암 면역요법에서 암 백신으로 유용한 신규 펩티드 화합물을 제공하는 것이다.
과제를 해결하는 수단
본 출원인은 개선된 물리화학적 특성, 안정성 및 생물활성을 갖는 암 항원 펩티드를 제조하기 위해 WT1 단백질 유래의 암 항원 펩티드 WT1235 -243 및 WT1235 -243 (2M→Y) 의 변형에 대한 다양한 연구를 진지하게 수행하였다. 특히, 이들은 이러한 펩티드로부터 변형된 화합물을 제조하고, HLA-A2402/Kb 유전자변형 마우스 (WO 02/47474 참조, 이하 이들은 또한 HLA-A24 마우스로 언급될 수 있다) 를 사용하여 면역원성을 시험하였다.
그 결과, 이들은 WT1235 -243 또는 WT1235 -243 (2M→Y) 의 N-말단 부위에서 시스테인 잔기 (Cys) 를 변형하여, 특히 N-말단 부위에서 시스테인 잔기의 티올기를 변형하여 개선된 물리화학적 특성 및 안정성을 갖는 펩티드 화합물을 제조하는데 성공하였다. 본 발명의 펩티드 화합물은 개선된 면역원성 및 CTL 유도 활성을 갖는다. 본 발명의 펩티드 화합물에 의해 특이적으로 유도되는 T 세포는 본래 암 세포에 의해 제시되는 야생형 펩티드 WT1235 -243 과의 그들의 교차-반응으로 인해 암 면역요법을 위한 의약으로 유용하다.
지금까지, WT1 항원 펩티드로서 WT1235 -243 또는 WT1235 -243 (2M→Y) 의 시스테인 잔기가 변형된 펩티드 화합물은 암 항원으로 작용하기에 충분한 면역원성을 보이는 것으로 알려져 있지 않았다. 본 출원인은 처음으로 디술피드 결합을 형성하기 위해, N-말단에서의 시스테인 잔기의 티올기와 시스테인, 글루타티온 또는 티오글리콜산의 티올기를 축합하여 제조된 펩티드 유도체가 유효한 암 항원으로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은 상기 설명되는 발견에 근거해 완성되었다.
본 발명은 하기에 관한 것이다:
[1] 하기 화학식 (1) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
[식 중 X 는 티로신 잔기 또는 메티오닌 잔기이고; Y 및 Z 각각은 단일 결합 및 1-10 개 아미노산 잔기로 이루어진 2가 펩티드 기로부터 독립적으로 선택되고,
R1 은 수소 또는 알킬이고,
R2 는 히드록실, 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노이고,
R3 은 수소, 알킬, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 치환 또는 미치환 알킬카르보닐아미노이고,
R4 는 수소, 알킬, 카르복시, 카르바모일, 알킬카르바모일, 디알킬카르바모일 또는 하기 화학식 (2) 의 기이고:
(식 중 W 는 아미노산 잔기임),
m 은 1 또는 2 이고,
n 은 0 내지 2 의 정수이고, 단 n 이 0 인 경우, R3 은 수소 또는 알킬임];
[2] 상기 [1] 에 있어서, R3 으로 표시되는 상기 치환된 알킬카르보닐아미노가 카르복시, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2 개의 치환기로 치환된 알킬카르보닐아미노인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염;
[3] 상기 [1] 또는 [2] 에 있어서, R3 이 수소 또는 하기 화학식 (3) 의 기이고:
(식 중 r 은 1 내지 3 의 정수임),
R4 가 카르복시 또는 하기 화학식 (2') 의 기인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중 W' 는 글리신 잔기 또는 β-알라닌 잔기임);
[4] 상기 [3] 에 있어서, R3 이 하기 화학식 (3') 의 기이고:
R4 가 카르복시메틸카르바모일인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염;
[5] 상기 [3] 에 있어서, R3 이 수소이고, R4 가 카르복시인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염;
[6] 하기 화학식 (1') 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중 X' 는 티로신 잔기 또는 메티오닌 잔기이고,
R1' 는 수소 또는 알킬이고,
R2' 는 히드록실, 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노이고,
R3' 는 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 치환 또는 미치환 알킬카르보닐아미노이고,
R4' 는 카르복시, 카르바모일, 알킬카르바모일 또는 디알킬카르바모일임);
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 특이적으로 결합하는 항체;
[8] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 HLA-A24 항원의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포;
[9] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 의해 유도되는 CTL;
[10] 상기 [9] 에 있어서, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 HLA-A24 항원의 복합체를 인지하는 CTL;
[11] 상기 [9] 에 있어서, SEQ ID No:1 의 펩티드 및 HLA-A24 항원의 복합체를 인지하는 CTL;
[12] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 [8] 에 따른 항원-제시 세포 또는 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 하나에 따른 CTL 을, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물;
[13] 상기 [12] 에 있어서, 암 백신으로 사용되는 약학 조성물;
[14] 암 백신의 제조를 위한, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 [8] 에 따른 항원-제시 세포 또는 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 하나에 따른 CTL 의 용도;
[15] 활성 성분으로 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 [8] 에 따른 항원-제시 세포 또는 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 하나에 따른 CTL 을 포함하는 암 면역요법을 위한 의약; 또는
[16] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 [8] 에 따른 항원-제시 세포 또는 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 하나에 따른 CTL 의 치료적 또는 예방적 유효량을, 암의 치료 또는 예방이 필요한, HLA-A24 에 양성이고 WT1 에 양성인 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법.
발명의 효과
암 면역요법을 위한 의약으로 유용한 신규 펩티드 화합물, 예를 들어, 생체 내 CTL 유도 활성을 갖고 암 백신으로 유용한 WT1 유래의 암 항원이 본 발명에 의해 제공된다. 암 항원 펩티드로서의 활성을 유지하면서, WT1235 -243 또는 WT1235 -243 (2M→Y) 의 N-말단에 위치하는 시스테인 잔기의 메르캅토기의 변형에 의해 제조되는 본 발명의 펩티드는, 향상된 물리화학적 특성 및 안정성을 가지므로, 이것은 치료 또는 조사에 널리 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 신규 펩티드는 시험관 내 치료로 인한 활성의 감소, 안정적 치료 효과 발휘 등을 고려하지 않으면서, 취급의 편이성과 같은 장점을 갖는다.
도 1 은 3 마리 마우스를 개별적으로 사용한 실시예 1 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다 (도면 중의 검은색 막대). 본 도면에서, 흰색 막대는 임의의 펩티드가 펄스 (pulse) 되지 않은 세포를 사용하여 수득된 결과를 보여준다 (다음 도면에도 동일하게 적용된다).
도 2 는 3 마리 마우스를 개별적으로 사용한 실시예 2 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다.
도 3 은 3 마리 마우스를 개별적으로 사용한 실시예 3 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다.
도 4 는 3 마리 마우스를 개별적으로 사용한 실시예 4 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다.
도 5 는 3 마리 마우스를 개별적으로 사용한 실시예 5 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다.
도 6 은 3 마리 마우스를 개별적으로 사용한 실시예 6 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다.
도 7 은 실시예 1 의 펩티드 화합물에 의해 유도된 투여량-의존적 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여주는 그래프이다. X 축은 1 마리 개별 마우스 당 투여량을 보여주고 (600μg, 200μg, 60μg 및 20μg), Y 축은 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 보여준다. 각 투여량은 3 마리 마우스 각각에 투여되었고, 결과는 세포독성 활성의 평균 및 표준 편차 (S.D.) 로서 제시된다.
도 8 은 다양한 펩티드가 펄스된 세포에 대한 실시예 1 의 펩티드 화합물로 마우스의 면역화에 의해 제조된 펩티드-특이적 T 세포의 반응성을 나타내는 그래프이다. 본 도면에서, 빗금친 막대는 야생형 펩티드 (WT1235 -243) 가 펄스된 세포를 사용하여 수득된 결과를 보여주고, 검은색 막대는 실시예 1 의 펩티드 화합물이 펄스된 세포를 사용하여 수득된 결과를 보여주고, 흰색 막대는 인플루엔자 유래의 펩티드가 펄스된 세포를 사용하여 수득된 결과를 각각 보여준다. 또한, 본 도면에서, 수직축은 점을 보여준다.
도 9 는 다양한 펩티드가 펄스된 세포에 대한 실시예 1 의 펩티드로의 자극에 의한 인간 PBMC 유래의 펩티드-특이적 T 세포의 반응성을 보여주는 그래프이다. 본 도면에서, "야생형 펩티드" 는 야생형 펩티드 (WT1235 -243) 가 펄스된 세포를 사용하여 수득된 결과를 보여주고, "변형 펩티드" 는 변형 펩티드 (WT1235 -243 (2M→Y)) 가 펄스된 세포를 사용하여 수득된 결과를 보여주고, "실시예 1 의 펩티드" 는 실시예 1 의 펩티드 화합물이 펄스된 세포를 사용하여 수득된 결과를 보여주고, "펩티드 펄스 없음" 은 임의의 펩티드가 펄스되지 않은 세포를 사용하여 수득된 결과를 각각 보여준다. 또한, 본 도면에서, 수직 축은 생성된 인터페론-γ 의 양 을 나타낸다.
발명을 수행하기 위한 최선의 방식
본 출원의 명세서 및 도면에 사용된 바와 같이, 하기 약어가 각각의 아미노산 잔기에 대해 사용된다.
Ala: 알라닌 잔기
Arg: 아르기닌 잔기
Asn: 아스파라긴 잔기
Asp: 아스파르트산 잔기
Cys: 시스테인 잔기
Gln: 글루타민 잔기
Glu: 글루탐산 잔기
Gly: 글리신 잔기
His: 히스티딘 잔기
Ile: 이소류신 잔기
Leu: 류신 잔기
Lys: 리신 잔기
Met: 메티오닌 잔기
Phe: 페닐알라닌 잔기
Pro: 프롤린 잔기
Ser: 세린 잔기
Thr: 트레오닌 잔기
Trp: 트립토판 잔기
Tyr: 티로신 잔기
Val: 발린 잔기
명세서에서 사용되는 바와 같은, "아미노산 잔기" 에는 천연 또는 비천연 α-아미노산 잔기, β-아미노산 잔기, γ-아미노산 잔기 및 δ-아미노산 잔기가 포함된다. 예를 들어, "아미노산 잔기" 에는 중성 α-아미노산 (예를 들어, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val), 오르니틴 잔기, 호모세린 잔기, 호모시스테인 잔기, β-알라닌, γ-아미노부탄산 또는 δ-아미노펜탄산이 포함된다.
상기 기재된 아미노산은 광학 기성질체인 경우, L-거울상이성질체 또는 D-거울상이성질체일 수 있다. L-거울상이성질체가 더욱 바람직하다.
명세서에서, 펩티드 화합물의 아미노산 서열은 N-말단 아미노산 잔기가 좌측면에 위치하고, C-말단 아미노산 잔기가 우측면에 위치하는 통상적인 방식에 따라 기재된다.
(1) 펩티드 화합물
제 1 양상에서, 본 발명은 상기 기재된 화학식 (1) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.
화학식 (1) 에서, 바람직하게는, X 는 티로신 잔기 (Tyr) 를 나타낸다.
화학식 (1) 에서, Y 및 Z 에 의해 표시된 "1 내지 10 개 아미노산 잔기로 이 루어진 2가 펩티드 기" 에는 아미노산 서열의 임의의 제한 없이 1 내지 10 개 아미노산 잔기로 이루어진 동일 또는 상이한 2가 펩티드 기가 포함된다. 예를 들어, 1 내지 10 개 아미노산으로 이루어진 상기 2가 펩티드 기에는 인간 WT1 의 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 서열이 포함된다 (Cell,60:509,1990, GenBank Acc.No.A38080). 예를 들어, Y 는 Asn-Leu-Tyr-Gln-Met-Thr-Ser-Gln-Leu-Glu (SEQ ID No：3) 과 같이 기재되는 인간 WT1 의 225 내지 234 의 10 개 아미노산 잔기로 이루어진 2가 펩티드 기 또는, N-말단에서 1 내지 9 개 아미노산 잔기가 결실된 SEQ ID NO: 3 의 단편을 갖는 2가 펩티드 기를 나타낼 수 있다. 또한, 예를 들어, Z 는 Gly-Ala-Thr-Leu-Lys-Gly-Val-Ala-Ala-Gly（SEQ ID No：4）과 같이 기재되는 인간 WT1 의 244 내지 253 의 10 개 아미노산 잔기로 이루어진 2가 펩티드 기 또는, C-말단에서 1 내지 9 개 아미노산 잔기가 결실된 SEQ ID NO: 4 의 단편을 갖는 2가 펩티드 기를 나타낼 수 있다.
바람직하게는, Y 및 Z 중 각각은 단일 결합을 나타낼 수 있다.
명세서에서, 알킬기에는 예를 들어, 탄소수 1 내지 6 의 선형 또는 분지형 알킬기가 포함된다. 예를 들어, 알킬기에는 메틸, 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸, 펜틸 등이 포함된다.
명세서에서, 알킬아미노기에는 예를 들어, 탄소수 1 내지 6 의 선형 또는 분지형 알킬아미노기가 포함된다. 예를 들어, 알킬아미노기에는 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노, 1-메틸에틸아미노, 부틸아미노, 1-메틸프로필아미노, 2-메틸프로필아미노, 1,1-디메틸에틸아미노, 펜틸아미노 등이 포함된다.
명세서에서, 디알킬아미노기에는 예를 들어, 2 개의 동일 또는 상이하고, 탄소수 1 내지 6 의 선형 또는 분지형 알킬기로 치환된 아미노기가 포함된다. 예를 들어, 디알킬아미노기에는 디메틸아미노, 에틸메틸아미노, 디에틸아미노, 디프로필아미노, 메틸프로필아미노, 부틸메틸아미노, 메틸펜틸아미노 등이 포함된다.
명세서에서, 알킬카르보닐아미노기의 "알킬" 에는 상기 기재된 바와 같은 알킬기가 포함된다. 알킬카르바모일기의 "알킬" 에는 상기 기재된 바와 같은 알킬아미노기와 동일한 알킬이 포함된다. 디알킬카르바모일기의 "알킬" 에는 상기 기재된 바와 같은 디알킬아미노기와 동일한 알킬이 포함되고, 여기서 2 개 "알킬" 은 동일 또는 상이할 수 있다.
R1 및 R2 중 각각은 바람직하게는 수소 원자를 나타낸다.
R3 이 치환 알킬카르보닐아미노기를 나타내는 경우, 알킬카르보닐아미노기의 치환된 기에는 예를 들어, 카르복시, 히드록실, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노가 포함되고, 여기서 상기 알킬카르보닐아미노기는 동일 또는 상이한 1 내지 4 개, 바람직하게는 1 또는 2 개의 치환된 기로 치환될 수 있다.
화학식 (2) 에서 W 로 표시된 아미노산 잔기에는 글리신 잔기 (Gly) 가, 바람직하게는 포함될 수 있다.
본 발명의 펩티드 화합물에는 예를 들어, 하기 화학식 (4)-(9) 의 화합물이 포함된다:
본 발명의 펩티드 화합물은 명세서의 실시예에 기재된 방법 또는 펩티드 합성에서 통상 사용되는 방법에 따라 제조할 수 있다. 이러한 제조의 예는 "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; 및 "Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol. 14, Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991 을 포함하는 문헌에 기재된 바와 같은 것이다. 본 발명의 펩티드의 제조 방법의 예에는 고상 합성기에 의한 Fmoc 방법 또는 Boc 방법에 따른 펩티드의 제조 방법 또는 액상 합성법에 따른 Boc-아미노산 또는 Z-아미노산의 연속 축합에 의한 펩 티드의 제조 방법이 포함되고, 여기서 Fmoc 는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기를 나타내고, Boc 는 tert-부톡시카르보닐기를 나타내고, Z 는 벤질옥시카르보닐기를 각각 나타낸다.
본 발명의 화합물의 합성 중의 중간체 화합물의 아미노, 카르복실 및 메르캅토기와 같은 작용기는 적합한 보호기로 보호될 수 있고, 보호된 화합물은 필요한 경우 보호/탈보호의 통상적인 기술을 사용하여 탈보호될 수 있다. 적합한 보호기 및 보호 및 탈보호 방법은 예를 들어 [Protective Groups in Organic Synthesis 2nd Edition (John Wiley & Sons, Inc.；1990)] 에 상세히 기재되어 있다.
특히, 본 발명의 화합물의 제조 방법의 예는 하기 반응식에 기재된 방법이다:
[반응식 1]
(식 중 X, Y, Z, R1, R2, R3, R4, m 및 n 은 각각, 상기에 기재된 바와 동일하다. R 및 R' 각각은 독립적으로 수소 원자 또는 메르캅토기에 대한 보호기를 나타낸다.
메르캅토기에 대한 상기 보호기의 예에는 예를 들어, 아세토아미도메틸 또는 트리틸이 포함된다).
화학식 (1) 의 화합물은 화학식 (1-1) 의 화합물 및 화학식 (1-2) 의 화합물을 비활성 용매 중에서 산화시켜 제조할 수 있다.
디술피드 결합을 형성하기 위해 산화는 펩티드 합성에 보통 적용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 결합은 적합한 용매에 메르캅토기를 갖는 2 개의 중간체를 혼합하고, 이들을 산화시켜 형성할 수 있다. 산화에 대한 통상의 방법, 예컨대 공기 산화 및 요오드 산화가 사용될 수 있다. 용매는 물, 아세트산, 메탄올, 클로로포름, DMF 또는 DMSO 또는 그의 혼합물일 수 있다. 종종 산화 반응은 대칭 및 비대칭 디술피드 화합물의 혼합물을 산출한다. 바람직한 비대칭 디술피드 화합물은 예컨대, 다양한 종류의 크로마토그래피를 사용하는 정제, 재결정화 방법 등에 따른 정제와 같은 혼합물의 정제에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로는, 활성화 메르캅토기를 갖는 중간체를 메르캅토기를 갖는 또다른 중간체와 혼합하여, 선택적 디술피드 결합을 생성한다. 활성화 메르캅토기를 갖는 중간체의 예에는 예를 들어, Npys 기 (3-니트로-2-피리딘 술페닐기) 에 결 합된 메르캅토기를 갖는 화합물이 포함된다.
대안적으로는, 메르캅토기를 갖는 중간체 중 하나를 예를 들어, 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘) 과 혼합하여 메르캅토기를 활성화시킨 후, 다른 중간체를 결과 혼합물에 첨가하여, 선택적 디술피드 결합을 형성한다 (Tetrahedron Letters. Vol. 37. No. 9, pp. 1347-1350).
화학식 (1-1) 의 화합물은 당업자에게 잘 공지된 액상 또는 고상 펩티드 합성법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 화학식 (1-1) 의 화합물이 N 말단에 알킬화된 화합물인 경우, 필요하다면 보호기에 의해 보호될 수 있는 N-알킬 아미노산 또는 N,N-디알킬 아미노산이 N-말단 아미노산으로 사용될 수 있다. N-알킬 아미노산 또는 N,N-디알킬 아미노산은 시판되거나 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는데, 이것은 예를 들어, 출발 물질의 아미노산 또는 보호된 아미노산을 염기의 존재하에서 알킬할라이드와 반응시킨다. 예를 들어, N-말단 아미노기는 t-부톡시카르보닐기에 의해 보호된 아미노산을 하기 [반응식 2] 에 예증된 바와 같이, 예컨대 나트륨 히드리드와 같은 염기의 존재하에서, 알킬할라이드와 반응시켜 적합하게 알킬화할 수 있다.
[반응식 2]
(식 중 X, Z, R1, R2, m 및 R 각각은 상기 기재된 바와 동일하고, Hal 은 브롬 원자 또는 요오드 원자를 나타내고, Prot 은 보호기를 나타낸다).
또한, 화합물이 C 말단에 아미드화된 또는 알킬아미드화된 화합물인 경우, 아미드화된 또는 알킬아미드화된 아미노산은 출발 물질의 C-말단 아미노산 잔기로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 합성 중의 중간체는 당업자에게 잘 공지된 방법에 따라 정제될 수 있다. 예를 들어, 정제는 다양한 종류의 크로마토그래피 (예, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피) 또는 재결정화에 의해 수행될 수 있다. 재결정화를 위한 용매는 예를 들어, 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 2-프로판올, 에테르, 예컨대 디에틸에테르, 에스테르, 예컨대 에틸 아세테이트, 방향족 탄 화수소, 예컨대 벤젠 및 톨루엔, 케톤, 예컨대 아세톤, 탄화수소, 예컨대 헥산, 비양자성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 및 아세토니트릴, 물 또는 그의 혼합 용매일 수 있다. 정제를 위해 사용되는 다른 방법은 Jikkenkagakukoza 의 제 1 권 (Chemical Society of Japan, Maruzen 편집) 에 기재되는 방법일 수 있다.
본 발명의 화합물이 하나 이상의 비대칭 중심을 갖는 경우, 비대칭 중심을 갖는 물질 (아미노산) 이 통상의 방법에 따라 이를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물의 광학적 순도를 개선하기 위해 광학적 분리를 제조 방법의 적합한 단계에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 광학적 분리는 본 발명의 화합물 또는 중간체를 비활성 용매 (예, 알코올 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 2-프로판올, 에테르, 예컨대 디에틸에테르, 에스테르 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 탄화수소 용매, 예컨대 톨루엔, 비양자성 용매, 예컨대 아세토니트릴 또는 그의 혼합 용매) 중에서 광학적 활성 산 (예, 모노카르복실산, 예컨대 만델산, N-벤질옥시알라닌 및 락트산, 디카르복실산, 예컨대 타르타르산, o-디이소프로필리덴 타르타르산 및 말산 또는 술폰산, 예컨대 캄포르술폰산 및 브로모캄포르술폰산) 과 혼합시켜, 염 형태를 제조하는, 부분입체 이성질체 방법에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 중간체가 산 작용기, 예컨대 카르복시기를 갖는 경우, 광학적 분리는 광학적 활성 아민 (예, 유기 아민, 예컨대 α-페네틸아민, 퀴닌, 퀴니딘, 신코니딘, 신코닌 및 스트리키닌) 과 염을 형성하여 수행할 수 있다.
염을 형성하기 위한 반응은 실온에서 용매의 끓는점에 이르는 온도에서 수행될 수 있다. 광학적 순도를 개선하기 위해, 온도가 일단 약 용매의 끓는점까지 증가되는 것이 바람직하다. 침전된 염을 여과에 의해 회수하는 경우, 필요하다면 혼합물을 냉각시켜 수율을 증가시킬 수 있다.
광학적 활성 산 또는 아민은 기질에 대해 약 0.5 내지 약 2.0 당량으로, 바람직하게는 기질에 대해 약 1 당량의 양으로 적합하게 사용된다. 필요하다면, 결정을 비활성 용매 (예, 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 2-프로판올, 에테르, 예컨대 디에틸에테르, 에스테르, 예컨대 에틸 아세테이트, 탄화수소, 예컨대 톨루엔, 비양자성 용매, 예컨대 아세토니트릴 또는 그의 혼합 용매) 에 재결정화하여, 고도로 정제된 광학적 활성 염을 수득할 수 있다. 또한, 필요하다면, 광학적으로 분리된 염은 유리 형태의 화합물을 수득하기 위해, 통상의 방법에 따라 산 또는 염기로 처리될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염에는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 예를 들어, 산 부가염에는 무기산, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 술페이트, 히드로요오다이드, 니트레이트 및 포스페이트와의 염 및 유기산, 예컨대 시트레이트, 옥살레이트, 아세테이트, 포르메이트, 프로피오네이트, 벤조에이트, 트리플루오로아세테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 벤젠술포네이트 및 파라톨루엔술포네이트와의 염이 포함된다. 염기 부가염에는 무기 염기, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염 및 암모늄 염과의 염, 유기 염기, 예컨대 트리에틸암모늄 염, 트리에탄올 암모늄 염, 피리디늄 염 및 디이소프로필암모늄 염과의 염, 및 추가로 아미노산, 예컨대 아르기닌, 아스파라긴산 및 글루탐산을 포함하는 염기성 또는 산성 아미노산의 염이 포함된다.
또한, 본 발명은 수화물 또는 에탄올 용매화물을 포함하는 화학식 (1) 로 표시되는 펩티드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용매화물을 포함한다. 또한, 본 발명은 화학식 (1) 로 표시되는 화합물의 임의의 부분입체 이성질체 및 거울상이성질체를 포함하는 임의의 가능한 입체 이성질체, 및 임의의 그의 결정 형태를 포함한다.
광학적 활성 α-아미노산을 축합하고, 다양한 종류의 보호기를 제거하거나, 수지로부터 펩티드를 방출시키는 단계를 포함하는 펩티드 화합물의 제조 과정에서, 아미노산 결실을 갖는 펩티드, 가수분해, 산화 등에 의해 분해된 펩티드, 및 에피머화된 아미노산을 갖는 펩티드를 포함하는 부산물이 통상 제조된다. 실험실 규모에서, 다양한 크로마토그래피 (예, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 또는 역상 크로마토그래피) 의 조합을 고도로 정제된 펩티드 화합물을 수득하도록, 이들 불순물을 제거하기 위해 사용할 수 있다. 그러나, 의약으로 제공하기 위해 산업 규모에서 고도로 정제된 펩티드 화합물을 수득하는 것은 쉽지 않다.
본 발명의 펩티드 화합물은 벌크 제약의 대규모 제조를 가능하게 하는 물리화학적 특성을 갖는다. 특히, 본 발명의 펩티드 화합물은 고 가용성, 용액 중의 고 안정성 또는 고도로 정제된 펩티드 화합물이 심지어 역상 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 정제에 의해 대규모로 벌크 제약으로 쉽게 제조될 수 있도록 축합되는 경우 젤로 변하지 않는 경향을 포함하는 특성을 갖는다.
본 발명의 펩티드 화합물은 암 면역요법을 위한 CTL 유도자 또는 암 백신에 포함되는 활성 성분에 유용하다. 본 발명의 펩티드 화합물은 본 발명의 명세서의 실시예에 제시된 바와 같이 높은 면역원성 및 높은 CTL 유도 활성을 갖는다. 본 발명의 펩티드 화합물에 의해 유도되는 CTL 는 놀랍게도 암 세포에 의해 본래 가지고 있는 WT1 의 야생형 펩티드를 인지할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 펩티드 화합물은 WT1 유전자를 발현하는 암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암의 치료 또는 예방 (재발의 예방을 포함) 을 위한 의약에 유용하다.
(2) 본 발명의 항체
제 2 양상에서, 본 발명은 화학식 (1) 에 의해 표시되는 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 특이적으로 결합하는 항체 (이하 이들은 본 발명의 항체로 언급될 수 있음) 에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 특정 항체에 제한되는 것이 아니고, 본 발명의 펩티드를 면역원으로 사용하여 제조된 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드 화합물에 특이적으로 결합하는 한, 특정 항체에 제한되는 것은 아니며, 구체적인 예에는 상기 기재된 바와 같이 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 포함된다.
항체의 제조 방법은 이미 잘 공지되어 있으며, 본 발명의 항체는 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12 ~ 11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al. ed., Cold Spring Harber Laboratory Press Publisher, New York 1989).
구체적으로는, 본 발명의 펩티드 화합물 (예를 들어, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물) 을 면역원으로 사용하여 토끼와 같은 비-인간 동물을 면역화한 후, 통상의 방식으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 항체를 수득하여 항체를 제조할 수 있다. 반면, 단일클론 항제는 마우스와 같은 비-인간 동물을 본 발명의 화합물, 예를 들어, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물로 면역화하고, 동물로부터 수득된 비장세포 및 세포 융합에 의해 골수종 세포로부터 하이브리도마를 제조한 후, 하이브리도마로부터 항체를 수득하여 제조할 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 ~ 11.11).
본 발명의 펩티드 화합물에 대한 항체는 면역학적 반응이 숙주에 적합한 다양한 항원보강제를 사용하여 향상되는 방식으로 제조될 수 있다. 항원보강제의 예에는 프로인트 (Freund) 항원보강제, 미네랄 젤, 예컨대 알루미늄 히드록시드, 계면활성제, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 (Pluronic) 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole limpet Hemocyanin), 및 디니트로페놀, 및 인간 항원보강제, 예컨대 BCG (Bacille Calmette Guerin) 및 코리네박테리움-파르붐 (Corynebacterium-parvum) 이 포함된다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물을 인지하는 항체뿐 아니라, 화합 물의 활성을 중화시키는 항체는 동물을 통상의 방식으로 본 발명의 화합물로 적합하게 면역화하여 쉽게 제조할 수 있다. 이러한 항체는 친화성 크로마토그래피, 면역학적 진단, 등에 사용될 수 있다. 면역학적 진단은 적합하게는 면역블롯팅, 방사선면역검정법 (RIA), 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA), 형광 또는 발광 검정법, 등으로부터 선택될 수 있다. 면역학적 진단은 WT1 유전자를 발현하는 암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암을 진단하는데 유용하다.
(3) 본 발명의 항원-제시 세포
제 3 양상에서, 본 발명은 본 발명의 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포에 관한 것이다.
이하 기재되는 실시예는 본 발명의 화합물의 투여가 CTL 을 유도하는 것을 나타낸다. 즉, 본 발명의 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포가 말초혈액 단핵 세포에서 발생된 다음, 이러한 복합체를 제시하는 세포를 특이적으로 인지하는 CTL 이 유도된다. HLA-A24 항원과 본 발명의 화합물 사이의 복합체가 제시되는 이들 항원-제시 세포는 이하 기재되는 세포 요법 (DC 요법) 에 유용하다.
본 발명의 항원-제시 세포는 그 표면에 본 발명의 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체가 제시되는 한, 특정 세포에 제한되는 것은 아니다. 여기에는 구체적으로 예를 들어, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체가 제시되는 수지상 세포의 항원-제시 세포가 포함된 다.
세포 요법 (DC 요법) 에 사용되는 항원-제시 세포는 암 환자로부터 항원-제시 능력을 갖는 세포를 단리하고, 수득 세포에 생체 외에서 본 발명의 화합물을 펄스하여 본 발명의 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체가 그들의 세포 표면에서 제시되도록 제조할 수 있다. 본 문맥에서, "항원-제시 능력을 갖는 세포" 는 본 발명의 화합물을 제시하는 능력을 갖는 HLA-A24 항원을 표면에 발현하는 세포이기만 하면, 특정 세포에 제한되지 않으며, 특히 높은 항원-제시 능력을 갖는 것으로 여겨지는 수지상 세포가 바람직하게는 예시된다.
본 발명의 항원-제시 세포는 예를 들어, 암 환자로부터 항원-제시 능력을 갖는 세포를 단리하고, 세포를 본 발명의 화합물 (예, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나의 화합물) 로 생체 외 펄스하고, HLA-A24 항원과 본 발명의 화합물 사이의 복합체를 제조하여 제조할 수 있다 (Cancer Immunol.Immunother.,46: 82,1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res.,59: p 1184, 1999). 수지상 세포가 사용되는 경우, 본 발명의 항원-제시 세포는 예를 들어, 피콜 (Ficoll) 방법을 사용하여 암 환자의 말초 혈액으로부터 림프구를 단리하고, 비-부착 세포를 제거하고, 부착 세포를 GM-CSF 및 IL-4 의 존재하에서 인큐베이션하여 수지상 세포를 유도하고, 수득 수지상 세포를 본 발명의 화합물로 인큐베이션 및 펄스하여 제조할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 그렇게 제조된 항원-제시 세포는 이하 기재되는 바와 같은 세포 요법 (DC 요법) 을 위한 CTL 유도자 또는 암 백신에 포함되는 활성 성분 으로 유용하다.
(4) 본 발명의 CTL
본 발명의 펩티드 화합물은 인간 WT1 로부터 유래되고 HLA-A24-제한 방식으로 CTL 유도 활성 (면역원성) 을 갖는다. 제 4 양상에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 화합물에 의해 유도되는 CTL 에 관한 것이다.
이하 기재되는 실시예는 본 발명의 펩티드 화합물의 투여가 CTL 를 유도하는 것을 증명한다. 즉, 본 발명의 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체가 그들의 세포 표면에서 제시되는 항원-제시 세포가 말초 혈액 단핵 세포로부터 발생된 다음, 이러한 복합체를 제시하는 세포를 특이적으로 인지하는 CTL 이 유도된다. 본 발명의 펩티드 화합물에 의해 유도되는 이들 CTL 은 이하 기재되는 바와 같은 입양 면역요법에 유용하다.
본 발명의 CTL 는 이들이 본 발명의 펩티드 화합물에 의해 유도되기만 한다면, 특정 CTL 에 제한되는 것은 아니며, 여기에는 특히 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물과 HLA-A24 항원 사이의 복합체를 인지하는 CTL 및 야생형 펩티드 (WT1235 -243:SEQ ID No:1) 와 HLA-A24 항원 사이의 복합체를 인지하는 CTL 이 포함된다.
입양 면역요법에 사용되는 CTL 은 예를 들어, 환자로부터 말초 림프구를 단리하고, 산출 말초 림프구를 본 발명의 화합물 (예, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물) 로 시험관 내 자극시켜 제조할 수 있다 (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669).
상기 기재된 바와 같이 제조된 본 발명의 CTL 은 입양 면역요법을 위한 암 백신에 포함되는 활성 성분으로 유용하다.
암 백신으로 사용가능한 약학 조성물
상기 (1) 내지 (4) 에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물, 본 발명의 항원-제시 세포 및 본 발명의 CTL 은 각 성분에 적합한 형태로 제형화되는 경우, CTL 유도자에 포함되는 활성 성분, 즉 암 백신으로 사용될 수 있으며, 이는 하기에 예증된다.
1) 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적 염을 활성 성분으로 포함하는 암 백신
본 발명의 화합물은 CTL 유도 활성을 갖는다. 본 발명의 화합물에 의해 유도되는 CTL 은 그들의 세포독성 활성 및 림포카인 생성을 통해 암을 파괴할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 화합물은 암의 치료 또는 예방을 위한 암 백신에 포함된 활성 성분으로 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 발명은 유효 성분으로 본 발명의 화합물을 포함하는 암 백신 (암 백신으로 사용가능한 약학 조성물) 을 제공한다. 본 발명의 암 백신이 HLA-A24 에 양성이고 WT1 에 양성인 암 환자에게 투여되는 경우, 화합물 (예, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물) 은 항원-제시 세포의 HLA-A24 항원에 제시되고, 그 다음 HLA-A24 항원을 포함하는 제시된 복합체에 특이적인 CTL 이 효과적으로 증식하여, 암 세포를 파괴한다. 상기 방식으로, 암의 치료 또는 예방이 달성된다. 본 발명의 암 백 신은 혈액암, 예컨대 백혈병, 골수형성이상증후군, 다발성 골수종 및 악성 림프종, 및 고형암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암을 포함하는, WT1 유전자의 증가된 발현 수준에 관련되는 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련해서, 또다른 구현예로서, 본 발명은 HLA-A24 에 양성이고 WT1 에 양성인 암 환자에게 유효량의 본 발명의 암 백신을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
활성 성분으로 본 발명의 화합물을 포함하는 암 백신은 활성 성분으로 단일 암 항원 펩티드, 즉, CTL 에피토프 (예, 화학식 (4) 내지 (9) 중 임의의 하나로 표시되는 화합물), 또는 활성 성분으로 또다른 암 항원 펩티드 (CTL 에피토프) 또는 도움자 에피토프에 연결된 에피토프 펩티드를 포함할 수 있다. 최근, 다수의 CTL 에피토프 (항원 펩티드) 에 연결된 에피토프 펩티드가 생체 내 CTL를 효과적으로 유도하는 활성을 갖는다는 것이 증명되었다. 예를 들어, [Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194] 에는 암 항원 단백질 PSA 유래의 HLA-A2, -A3, -A11, B53-제한된 CTL 에피토프 (항원 펩티드) 가 선형으로 연결된 약 30량체 에피토프 펩티드가 관련 CTL 에피토프에 특이적인 CTL 를 생체 내에서 유도한다는 것이 기재되어 있다. 또한, CTL 에피토프 및 도움자 에피토프가 선형으로 연결된 에피토프 펩티드가 CTL 를 효과적으로 유도한다는 것이 증명되었다. 이러한 에피토프 펩티드 형태의 본 발명의 펩티드를 투여하는 경우, 펩티드는 항원-제시 세포 내에 도입된 다음, 세포내에서 분해되어 각각의 항원 펩티드를 발생하고, 이것은 HLA 항원에 결합하여 복합체를 형성한다. 복합체는 항원-제시 세포의 세포 표면에서 조밀하게 제시된 다음, 복합체에 특이적인 CTL 은 생체 내에서 효과적으로 증식하고, 암 세포를 파괴한다. 이러한 방식으로, 암의 치료 또는 예방이 달성된다.
활성 성분으로 본 발명의 펩티드를 포함하는 암 백신은 또한 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 적합한 항원보강제와 함께, 또는 세포 면역성을 효과적으로 달성하기 위해 미립자 투여 형태로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 문헌에 기재된 이들 항원보강제 (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994) 가 적용가능하고, 여기에는 구체적으로 박테리아-유래 성분, GM-CSF, 사이토카인, 예컨대 인터루킨-2, 인터루킨-7, 인터루킨-12 등, 식물-유래 성분, 해양 유기체-유래 성분, 미네랄 젤, 예컨대 알루미늄 히드록시드, 계면활성제, 예컨대 리소레시틴 및 플루로닉 (Pluronic) 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 및 오일 에멀젼 (에멀젼 제형) 이 포함된다. 박테리아-유래 성분에는 지질 A, 지질 A 의 유도체인 모노포스포릴 지질 A, 죽은 박테리아 (예, 마이코박테리아 (Mycobacterium), 예컨대 BCG), 박테리아 유래의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드, 프로인트 불완전 항원보강제 (Freund's Incomplete Adjuvant), 프로인트 완전 항원보강제 (Freund's Complete Adjuvant), 세포벽 성분 (예, BCG-CWS), 트레할로스-디마이콜레이트 (TDM) 등이 포함된다.
또한, 리포좀 제형, 성분이 직경 수 μm 의 비이드에 결합된 미립자 제형, 또는 성분이 지질에 부착된 제형이 또한 가능하다.
투여는 예를 들어, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥 주사에 의해 달성될 수 있다. 제형 내 본 발명의 화합물의 투여량이 치료되는 질환, 환자의 연령 및 체중 등에 따라 달라질 수는 있지만, 본 발명의 화합물의 0.0001 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.001 mg 내지 1000 mg, 더욱 바람직하게는 0.1 mg 내지 10 mg 를 매 수 일 내지 매 수 개월 투여하는 것이 전형적이다.
2) 활성 성분으로 본 발명의 항원-제시 세포를 포함하는 암 백신
본 발명은 활성 성분으로 본 발명의 항원-제시 세포를 포함하는 암 백신을 제공한다.
최근, 세포 요법 (DC 요법) 은 림프구를 암 환자의 말초 혈액으로부터 단리하고, 림프구로부터 유도된 수지상 세포를 항원 펩티드 등으로 시험관 내 펄스하여 항원-제시 세포를 제조한 다음, 이것을 환자에게 피하 주사 등을 통해 되돌려주는 것으로 보고되어 있다 (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999, Cancer Res., 56: p5672, 1996, J. Immunol., 161: p5607, 1998, J. Exp. Med., 184: p465, 1996). 그러므로, 본 발명의 항원-제시 세포는 세포 요법에서 암 백신 중의 활성 성분으로 사용될 수 있다.
활성 성분으로 본 발명의 항원-제시 세포를 포함하는 암 백신은 바람직하게는 항원-제시 세포를 안정하게 유지하기 위해 생리적 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 매질 등을 함유한다. 이것은 예를 들어, 정맥, 피하, 또는 피내로 투여될 수 있다. 투여량은 상기 언급된 문헌에 기재된 것들에 의해 예증된다.
환자의 체내에 암 백신을 재도입함으로써, 암의 치료 또는 예방을 달성하도록 HLA-A24 에 양성이고 WT1 에 양성인 환자에서 특이적 CTL 이 효과적으로 유도된다. 활성 성분으로 본 발명의 항원-제시 세포를 포함하는 암 백신은 혈액암, 예컨대 백혈병, 골수형성이상증후군, 다발성 골수종 및 악성 림프종, 및 고형암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암을 포함하는, WT1 유전자 발현의 수준이 상승된 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
3) 활성 성분으로 본 발명의 CTL 을 포함하는 암 백신
본 발명은 활성 성분으로 본 발명의 CTL 을 포함하는 암 백신 (암 백신으로 사용가능한 약학 조성물) 을 제공한다. 본 발명의 CTL 은 이하 기재되는 바와 같이 입양 면역요법에 유용하다.
흑색종에 있어서, 입양 면역요법이, 환자 자신으로부터 단리된 종양-침윤 T 세포를 대량으로 생체 외에서 배양한 다음, 환자 내로 되돌려 주는 치료 효과를 달성하는 것이 관찰되었다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994). 마찬가지로, 마우스 흑색종에서, 비장세포를 암 항원 펩티드 TRP-2 로 시험관 내 자극하여, 암 항원 펩티드에 특이적인 CTL 을 증식시키고, 상기 CTL 을 흑색종-이식 마우스에 투여하여 전이의 억제가 관찰되었다 (J. Exp. Med., 185:453, 1997). 이것은 항원-제시 세포 상에서 HLA 항원과 암 항원 펩티드 사이의 복합체를 특이적으로 인지하는 CTL 의 시험관 내 증식을 야기하였다. 따라서, 본 발명의 화합물을 사용하여 환자로부터의 말초 혈액 림프구를 시험관 내에서 자극시켜 종양-특이적 CTL 를 시험관 내에서 증식시키고, 이어서 환자에게 CTL 을 되돌려주는 것을 포함하는 암 치료 방법은 유용한 것으로 여겨진다. 그러므로, 본 발명의 CTL 은 입양 면역요법에 사용되는 암 백신에 포함되는 활성 성분으로 사용될 수 있다.
활성 성분으로 본 발명의 CTL 을 포함하는 암 백신은 바람직하게는 CTL 을 안정하게 유지하기 위해 생리적 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 매질 등을 함유한다. 이것은 예를 들어, 정맥, 피하, 또는 피내로 투여될 수 있다. 투여량은 상기 언급된 문헌에 기재된 것들에 의해 예증된다.
환자의 체내에 암 백신을 재도입함으로써, 암의 치료를 달성하도록 HLA-A24 에 양성이고 WT1 에 양성인 환자에서 암 세포에 대한 CTL 의 세포독성 효과가 향상되어, 암 세포를 파괴한다. 활성 성분으로 본 발명의 CTL 을 포함하는 암 백신은 WT1 유전자 발현의 상승된 수준과 관련된 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 암의 예에는 혈액암, 예컨대 백혈병, 골수형성이상증후군, 다발성 골수종 및 악성 림프종, 및 고형암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암이 포함된다.
본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 예증되나, 어떤 방식으로도 상기 실시예에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서, 실시예 2 의 화합물, 실시예 4 의 화합물 및 실시예 6 의 화합물은 WT1235 -243 (SEQ ID No:1) 의 유도체이고, 시스틴, 글루타티온 또는 티오글리콜산이, 각각 변형된 WT1235 - 243 의 유도체에 해당한다. 또한, 실시예 1 의 화 합물, 실시예 3 의 화합물 및 실시예 5 의 화합물은 WT1235 -243 (2M→Y) (SEQ ID No:2) 의 유도체이고, 시스틴, 글루타티온 또는 티오글리콜산이, 각각 변형된 WT1235 -243 (2M→Y) 의 유도체에 해당한다.
실시예에서 사용된 약어는 다음과 같다:
Boc: t-부톡시카르보닐
Npys: 3-니트로-2-피리딘 술페닐
t-Bu; t-부틸
Trt: 트리페닐메틸
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
DMF: 디메틸포름아미드
HOBT: N-히드록시벤조트리아졸
DIPCI: 디이소프로필카르보디이미드
실시예 1
하기 화학식 (4) 의 펩티드의 합성:
하기 기재되는 바와 같은 제조 1 에서 제조된 펩티드 (1.5g) 및 Boc-Cys(Npys)-OH (600mg) 를 디메틸술폭시드 (20ml) 에 혼합하고, 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반하였다. 아세토니트릴 (600ml) 을 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 교반하고, 수득 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 필터 상의 고체를 아세토니트릴 및 디에틸 에테르로 세정한 후, 감압하에 건조하여, Boc-Cys-OH 가 디술피드 결합에 결합된 펩티드 (1.65g) 를 제조하였다. 수득 펩티드 (0.53g) 를 트리플루오로아세트산 (5ml) 에 용해하고, 용액을 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 트리플루오로아세트산을 감암하에 증발시킨 후, 잔류물을 아세토니트릴-아세트산-물 (10/10/90) (110ml) 의 혼합 용액에 용해한 후 HPLC 를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 3cmΦX25cmL, 10μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2: CH3CN/0.1%TFA
유속: 20ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 5% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채웠다. 그 다음, 5% 의 용리액 2 로 10 분 동안 수행하고, 15% 의 용리액 2 로 15 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 0.1%/분으로 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하 는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드 (300mg) 를 제조하였다.
·질량 분광법: LC-ESI/MS m/z =1292 [M+1]+ (이론상 값＝1291.5)
실시예 2
하기 화학식 (5) 의 펩티드의 합성:
하기 기재되는 바와 같은 제조 2 에서 제조된 펩티드 (500mg) 와 Boc-Cys(Npys)-OH (200mg) 의 반응 후, 트리플루오로아세트산 중 Boc 기의 제거 및 실시예 1 와 유사한 방식으로 HPLC 에 의한 정제로 원하는 펩티드 (104mg) 를 제조하였다.
·질량 분광법: LC-ESI/MS m/z =1260 [M+1]+ (이론상 값＝1259.5)
실시예 3
하기 화학식 (8) 의 펩티드의 합성:
제조 1 에서 제조된 펩티드 (240mg) 와 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘) (60mg) 을 디메틸술폭시드 (6ml) 에서 혼합하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 환원된 글루타티온 (120mg) 을 반응 혼합물에 첨가한 후, 30 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 환원된 글루타티온 (60mg) 및 디메틸술폭시드 (4ml) 를 반응 혼합물에 추가로 첨가한 후, 30 분 동안 교반하고, 아세토니트릴 (200ml) 을 반응 혼합물에 첨가한 다음, 수득 침전물을 여과에 의해 수집하고, 감압하 건조하여, 미정제 펩티드 (440mg) 를 제조하였다. 수득 미정제 펩티드를 아세토니트릴-아세트산 및 물 (10/10/90) 의 혼합물 (110ml) 에 용해한 후, HPLC 를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 3cmφX25cmL, 10μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 20ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채웠다. 그 다음, 10% 의 용리액 2 로 10 분 동안 수행하고, 17% 의 용리액 2 로 15 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 0.05%/분으로 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드 (107mg) 를 제조하였다.
·질량 분광법: LC-ESI/MS m/z =1477 [M+1]+ (이론상 값＝1477.5)
실시예 4
하기 화학식 (9) 의 펩티드의 합성:
제조 2 에서 제조된 펩티드 (120mg) 및 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘) (30mg) 을 디메틸술폭시드 (3ml) 에서 혼합하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 환원된 글루타티온 (30mg) 을 반응 혼합물에 첨가한 후, 실온에서 30 분 동안 교반한 다음, 물 (1ml) 및 환원된 글루타티온 (30mg) 을 반응 혼합물에 추가로 첨가한 후, 20 분 동안 교반하였다. 아세토니트릴 (100ml) 을 반응 혼합물에 첨가한 후, 수득 침전물을 여과에 의해 수집하고, 감압하 건조하여, 미정제 펩티드 (160mg) 를 제조하였다. 수득 미정제 펩티드를 아세토니트릴-아세트산-물 (5/5/45) 의 혼합물 (55ml) 에 용해한 후, HPLC 를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-6A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 2cmφX25cmL, 10μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 10ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채웠다. 그 다음, 10% 의 용리액 2 로 10 분 동안 수행하고, 17% 의 용리액 2 로 15 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 0.05%/분으로 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드 (18mg) 를 제조하였다.
·질량 분광법: LC-ESI/MS m/z =1445 [M+1]+ (이론상 값＝1445.5)
실시예 5
하기 화학식 (6) 의 펩티드의 합성:
제조 1 에서 제조된 펩티드 (240mg) 및 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘) (60mg) 을 디메틸술폭시드 (6ml) 에 혼합하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 나트륨 티오글리콜레이트 (100mg) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 30 ℃ 에서 30 분 동안 교반한 다음, 나트륨 티오글리콜레이트 (50mg), 디메틸술폭시드 (4ml) 및 물 (2ml) 을 반응 혼합물에 추가로 첨가한 후, 30 분 동안 교반하였다. 아세토니트릴 (200ml) 을 반응 혼합물에 첨가한 후, 수득 침전물을 여과에 의해 수집하고, 감압하 건조하여, 미정제 펩티드 (305mg) 를 제조하였다. 수득 미정제 펩티드를 아세토니트릴-아세트산-물 (30/30/270) 의 혼합물 (330ml) 에 용해한 후, 여과한 다음, 수득 여과액을 HPLC 를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 3cmφX25cmL, 10μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 20ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채웠다. 그 다음, 10% 의 용리액 2 로 10 분 동안 수행하고, 20% 의 용리액 2 로 15 분 동안 수행하고, 23% 의 용리액 2 로 15 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 0.05%/분으로 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드 (15mg) 를 제조하였다.
·질량 분광법: LC-ESI/MS m/z =1263 [M+1]+ (이론상 값＝1262.5)
실시예 6
하기 화학식 (7) 의 펩티드의 합성:
제조 2 에서 제조된 펩티드 (240mg) 및 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘) (60mg) 을 디메틸술폭시드 (6ml) 에서 혼합하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 나트륨 티오글리콜레이트 (50mg) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 30 ℃ 에서 30 분 동안 교반하였다. 또한, 나트륨 티오글리콜레이트 (50mg) 를 반응에 추가로 첨가한 후, 30 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하고, 아세토니트릴 (200ml) 을 반응 혼합물에 첨가하였다. 수득 침전물을 여과에 의해 수집하고, 감압하 건조시켜, 미정제 펩티드 (194mg) 를 제조하였다. 수득 미정제 펩티드를 아세토니트릴-아세트산-물 (10/20/90) 의 혼합물 (120ml) 에 용해한 후, 여과한 다음, 수득 여과액을 HPLC 를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 3cmφX25cmL, 10μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 20ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채웠다. 그 다음, 10% 의 용리액 2 로 10 분 동안 수행하고, 18% 의 용리액 2 로 15 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 0.1%/분으로 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드 (30mg) 를 제조하였다.
·질량 분광법: LC-ESI/MS m/z =1230 [M+1]+ (이론상 값＝1230.4)
실시예 7
하기 화학식 (4) 의 펩티드의 합성:
1. 보호된 펩티드 수지 (Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) 의 합성
Fmoc-Leu-Alko-수지 (여기서 Alko 는 p-알콕시벤질 알코올임) (10 g) (0.74 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) 를 반응 용기 (500 ml, Type ACT90 고상 합성기, Advanced ChemTech) 에 채우고, DMF 등으로 1 회 세정하였다 (공정 1). 그 다음 수지에 25% 피페리딘 (3 분 x 1, 및 15 분 x 1) 을 처리하여 Fmoc 기를 분리하고 (공정 2), DMF 등으로 다시 세정하여 (공정 6), 피페리딘을 제거하였다. 반응 용기에 NMP (N-메틸피롤리디논) (200 ml) 중의 Fmoc-Asn(Trt)-OH (13.25 g) 및 HOBT (1-히드록시벤조트리아졸) (3.4 g) 의 용액을 첨가하였다. DIPCI (N,N'-디이소프로필카르보디이미드) (3.42 ml) 첨가 후, 혼합물을 실온에서 60 분 동안 교반하였다 (공정 3). 그 다음, 수지를 NMP 로 세정하고 (공정 4), 커플링 반응을 Fmoc-Asn(Trt)-OH (13.25 g), HOBT (3.4 g) 및 DIPCI (3.42 ml) 를 사용하여 다시 수행하였다 (공정 3). 수지를 세정한 후 (공정 6), 25% Ac2O (무수아세트산) 중에서 수지를 3 분 X 1, 15 분 X 2 로 교반하여, 미반응된 아미노기를 캡핑하였다 (공정 5). 수지를 세정한 후 (공정 6), 탈보호 (공정 2) 및 세정하여 (공정 6) H-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지를 제조하였다. 커플링 반응을 Fmoc-Met-OH (8.25g), Fmoc-Gln(Trt)-OH (13.56g), Fmoc-Asn(Trt)-OH (13.25g), Fmoc-Trp(Boc)-OH (11.69g), Fmoc-Thr(tBu)-OH (8.82g), Fmoc-Tyr(tBu)-OH (10.2g), 및 (Boc-Cys-OH)2 (19.56g) 을 사용하여, 유사한 방식으로 수행하였고, 단 커플링이 어려운 경우에는 커플링을 3 회 반복하였다. N-말단에 위치한 (Boc-Cys-OH)2 (N,N'-t-부톡시카르보닐시스틴) 이 축합된 후, 세정 (공정 6) 을 수행한 후, 디에틸에테르 (200ml) 로 2 회 세정하고, 감압하 건조시켜 Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지 (화학식 (10) 의 펩티드-수지) (22.87g) 를 제조하였다. 상기 합성 공정은 하기 표에 요약된다.
[표 1]
2. 보호된 펩티드 수지의 탈보호
트리플루오로아세트산/에탄디올/H2O/트리이소프로필실란 (94/2.5/2.5/1) 의 혼합물 (200ml) 을 상기 공정에 따라 수득된 보호된 펩티드 수지 (Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지 (22.87g) 에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 생성물을 여과한 후, 여과액을 빙냉하 디에틸에테르 (400ml) 에 첨가하였다. 수득 침전물을 유리 필터를 사용하여 여과에 의해 수집한 다음, 디에틸에테르로 세척하고, 감압하 건조시켜, 미정제 펩티드 (8.27g) 를 제조하였다.
3. 미정제 펩티드의 정제
수득 미정제 펩티드 (2.76g) 를 20% 아세트산 수용액 (1400ml) 과 아세토니트릴 (35ml) 의 혼합 용액에 용해하고, 수득 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였다. 수득 미정제 펩티드 용액을 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 5cmφX50cmL, 15-30μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 60ml/분
검출: UV280nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채웠다. 그 다음, 10% 의 용리액 2 로 30 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 120 분에 걸쳐 34% 로 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드: H-Cys(H-Cys-OH)-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (화학식 (4) 의 펩티드) (0.91g) 를 제조하였다.
시험예 1
(마우스의 면역화 (1))
실시예 1-6 에 의해 제조된 각 항원 펩티드의 면역원성을 HLA-A2402/Kb 유전자변형 마우스 (WO 02/47474 참조 및 이하, 마우스는 HLA-A24 마우스로 언급될 수 있음) 를 사용하여 평가하였다. 3 마리 유전자변형 마우스를 면역원성을 평가하기 위해 각 펩티드의 면역화에 사용하였다.
각각의 합성 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 하기와 같이 제조하였다. 실시예 1-3, 5, 6 의 각각의 합성 펩티드를 DMSO 중에서 40mg/ml 로 조정하였다. 그 다음, 용액 (32.5μl) 을 주사용수 (540μl) 와 혼합하였다. 추가로, 수득 용액 (550μl) 을 유리 주사기를 사용하여 프로인트 불완전 항원보강제 (700μl) (Montanide ISA51) 와 혼합하여 유중수 에멀젼을 제조하였다. 실시예 4 의 펩티드를 DMSO 중에서 50mg/ml 로 조정하고, 합성 도움자 펩티드 (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, SEQ ID No:5) 를 또한 DMSO 중에서 20mg/ml 로 조정하였다. 그 다음, 모든 펩티드 용액 30μl 을 주사용수 (540μl) 와 혼합한 후, 동 일 양의 프로인트 불완전 항원보강제 (IFA) 와 혼합하여, 유중수 에멀젼을 제조하였다.
면역화를 위해 수득 제제 (200μl) 를 HLA-A2402/Kb 유전자변형 마우스에게 꼬리의 기저에 피내로 주사하였다. 실험 시작 7-8 일 후에, 비장을 제거하고, 유리 슬라이드의 냉동된 부분 위에 갈고, 비장세포를 수집 및 준비하였다. ACK 완충액 (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2-7.4) 으로 용혈 처리한 비장세포의 일부를 면역화에서 사용된 항원 펩티드로 1 시간 동안 펄스하고 (100 μg/ml), 24-웰 플레이트 (7X106 세포/웰) 에 시딩하였다. 동시에, 임의의 펩티드가 펄스되지 않은 비장세포 (7x105 세포/웰) 를 함께 첨가하고, 시험관 내에서 자극시키고, 37 ℃ 에서 5-6 일 동안 배양하였다. 시험관 내 자극을 10% FCS, 10 mM HEPES, 20 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 1 mM MEM 비필수 아미노산, 1% MEM 비타민 및 55 μM 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지에서 수행하였다.
재자극 시작 5-6 일 후에, 세포독성 활성에 대한 시험을 통상의 방식에 따라 수행하였다. EL-4 세포 (DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD., Catalogue No. 06-039) 를 HLA-A2402/Kb 코딩 발현 벡터로 형질전환하여 수득된 EL4-A2402/Kb 세포, 및 항원 펩티드: WT1235 -243 또는 WT1235 -243 (2M→Y) 이 펄스된 EL4-A2402/Kb 세포 를 표적 세포 (T) 로 사용하였다. 구체적으로, WT1235 -243 (2M→Y) 이 펄스된 세포를 실시예 1, 3 및 5 의 펩티드의 평가를 위해 사용하였고, WT1235 -243 이 펄스된 세포를 실시예 2, 4 및 6 의 펩티드의 평가를 위해 사용하였다. 상기 세포를 51Cr (1.85 MBq/106 세포) 로 표지하고, 펩티드를 100μg/ml 로 1 시간 동안 펄스하였다 (표지화는 2 시간 동안 수행되었고, 표지화 시작 1 시간 후, 펩티드를 첨가하였다). 51Cr 방출 검정법 (J.Immunol., 159:4753, 1997) 을 수행하여 표적 세포 (T) 에 대한 시험관 내 배양된 비장세포 (E) 의 세포독성 활성을 결정하였다. 상기 검정법에서, E/T 비는 80 이었다.
결과는 도 1-7 에 제시된다. 도 1-6 은 실시예 1-6 의 펩티드 화합물 각각의 세포독성 활성에 해당한다. 도면에서, 수직축은 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 나타내고, 수평축은 3 마리 마우스 각각의 결과를 개별적으로 보여준다. 또한, 실시예 1 의 화합물의 투여량 의존적인 결과는 도 7 에 제시된다. 도면에서, 수직축은 세포독성 활성 (Specific Lysis) 을 나타내고, 수평축은 개별적으로 투여된 투여량 (600μg, 200μg, 60μg 및 20μg) 을 보여준다. 도면에서, 각 투여량 당 3 마리 마우스를 사용하였고, 세포독성 활성의 평균 및 표준 편차 (S.D.) 가 제시된다. 도면으로부터 명백하게 이해되는 바와 같이, 모든 합성 펩티드가 CTL 유도 활성, 즉, 면역원성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
시험예 2
(마우스의 면역화 (2))
실시예 1 의 펩티드를 DMSO 중에서 40mg/ml 로 조정하였다. 그 다음, 용액 (32.5μl) 을 주사용수 (540μl) 와 혼합하였다. 추가로, 수득 용액 (550μl) 을 유리 주사기를 사용하여 프로인트 불완전 항원보강제 (700μl) (Montanide ISA51 (등록 상표)) (SEPPIC, Inc, Paris, France) 와 혼합하여 유중수 에멀젼을 제조하였다.
면역화를 위해 수득 제제 (200μl) 를 HLA-A2402/Kb 유전자변형 마우스에게 꼬리의 기저에 피내로 주사하였다. 실험 시작 7 일 후에, 비장을 제거하고, 통상의 방식 (WO 02/47474) 으로, 비장세포를 준비하였다. 그 다음, 마우스 IFN 감마 ELISPOT 세트 (Enzyme - Linked Immunospot) (Fujisawa, catalog No. BD-551083) 를 사용하여 시험을 수행하였다. 세트에 첨부된 지시사항에 따라 시험을 수행하였다. 5x105 세포/웰의 비장세포를 플레이팅하고, 실시예 1 의 펩티드, 야생형 펩티드 (WT1235-243) 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 펩티드 (ASNENMETM, HLA-A24 에 결합하지 않는 음성 대조군 펩티드) 를 함유하는 배양 배지를 최종 농도 10-6M 로 첨가한 후, CO2 인큐베이터를 사용하여 37℃ 에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다.
첨부 지시사항에 따라, 플레이트를 세정하고, KS Elispot Research System (Carl Zeiss) 를 사용하여 점의 갯수를 검출하였다. Elispot 방법은 세포독성 활성 시험에 대한 대안이라고 알려져 있다 (J.Immunological Methods, 1995, 181, 45-54). 결과는 도 8 에 제시된다. 결과로서, 실시예 1 의 펩티드가 야생형 펩티드와 교차 반응하는 HLA-A24 특이적 세포-매개 면역성을 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
시험예 3
(인간 PBMC 를 사용한 시험)
HLA-A24 양성의 건강한 대상으로부터 헤파린화 진공 혈액 수집 튜브를 사용하여 말초 혈액 (50ml) 을 취하였다. PBS (-) 로 2 배 희석된 혈액을 Ficoll-Paque (Amersham Biosciences) 에 오버레이시킨 후 (그 양은 혈액의 양의 절반이었음), 20 분 동안 2000rpm 에서 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 함유하는 세포 층을 수집하고, 그 곳에 3-4 배 양의 PBS (-) 를 첨가한 후, 10 분 동안 1800rpm 에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 PBS (-) 로 2 회 세척하고, PMBC 를 수집하였다.
PMBC 를 림프구 (RPMI1640：AIM V=1:1, NEAA, 10％FCS) 배양을 위한 배지에 현탁시키고, 배양 플라스크에서 2 시간 동안 배양하고, 비부착 세포를 수집하였다. CD8+ T 세포 단리 키트 II (Miltenyi Biotec) 를 사용하여, 비부착 세포 중에서 CD8 양성 T 세포를 수집하였다. 부착 세포를 GM-CSF (1000U/ml) 및 IL-4 (1000U/ml) 를 함유하는 림프구 배양을 위한 배지에서 7 일 동안 배양하였다. 부유 세포를 수지상 세포 (DC) 를 함유하는 항원-제시 세포 분획으로 수집하였다. 수집된 세포를 실험에 사용할 때까지 보존을 위해 냉동시켰다.
상기와 같이 준비된 DC 분획을, 세포를 미토마이신 (50μg/ml) 함유 AIM-V 배지 중에서 펩티드와 1 시간 동안 인큐베이션시켜 실시예 1 의 펩티드 (50μg/ml) 로 펄스시켰다. 배지를 3 회 세정한 후, 실시예 1 의 펩티드를 1 시간 펄스 동안 추가 첨가하여 (50μg/ml), 항원-제시 세포를 제조하였다. 제 0 일에, 펩티드로 펄스된 항원-제시 세포를 첫 번째 자극을 수행하기 위해 CD8 양성 T 세포에 첨가하고, 24-웰 플레이트를 사용하여 IL-7 (10ng/ml) 함유 림프구를 배양하기 위해 배양중에서 세포 배양을 시작하였다. 제 7 일에, T 세포를 수집하고, 세정 후, 펩티드로 펄스된 항원-제시 세포를 사용하는 펩티드 자극을 첫 번째 자극과 유사한 방식으로 수행하였다. 다음 날 (제 8 일), 농도가 50U/ml 이 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 제 14 일에, T 세포를 수집하고, 첫 번째 또는 두 번째 자극과 유사한 방식으로 세번째 자극을 수행하였다. 다음 날 (제 15 일), 농도가 50U/ml 이 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 제 21 일에, T 세포를 수집하고 보존을 위해 냉동하였다.
제 21 일의 T 세포 1X105 세포를 펩티드 각각 (야생형 펩티드 (WT1235 -243), 변형 펩티드 (WT1235 -243(2M→Y)) 또는 실시예 1 의 펩티드) 이 없이 또는 이로 펄스한 HLA-A2402 발현 VA13/A2402 세포 2X104 세포에 첨가하고, 18 시간 후, 상청액을 수집하여, ELISA 를 사용하여 IFN-γ 의 양을 측정하였다.
실시예 1 의 합성 펩티드로 자극받은 T 세포의 펩티드 특이적 반응성의 결과는 도 9 에 제시된다. 실시예 1 의 합성 펩티드로 자극받은 T 세포는 펩티드가 없이 펄스된 세포와 반응하지 않았으나, 이들은 실시예 1 의 펩티드로 펄스받은 세포와 충분히 반응하였다. 그러므로, 펩티드에 특이적인 T 세포가 유도되었다는 것으로 밝혀졌다. 또한, 펩티드에 특이적인 유도된 T 세포는 야생형 펩티드 (WT1235 -243) 로 펄스된 세포 뿐 아니라 변형 펩티드 (WT1235 -243 (2M→Y)) 로 펄스된 세포와 반응하였다 .
제조 1
1. 보호된 펩티드 수지 (H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) 의 합성
Fmoc-Leu-Alko-수지 (여기서 Alko 는 p-알콕시벤질 알코올임) (10 g) (0.82 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) 를 반응 용기 (500 ml, Type ACT90 고상 합성기, Advanced ChemTech) 에 채우고, DMF 등으로 1 회 세정하였다 (공정 1). 그 다음 수지에 25% Pip (피페리딘) (3 분 x 1, 및 15 분 x 1) 을 처리하여 Fmoc 기를 분리하고 (공정 2), DMF 등으로 다시 세정하여 (공정 1), Pip 을 제거하였다. 반응 용기에 NMP (N-메틸피롤리디논) (200 ml) 중의 Fmoc-Asn(Trt)-OH (24.46 g) 및 HOBT (1-히드록시벤조트리아졸) (6.28 g) 의 용액을 첨가하였다. DIPCI (N,N'-디이소프로필카르보디이미드) (6.3 ml) 첨가 후, 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다 (공정 3). 30 분 후, 수지를 NMP 로 세정하고 (공정 4), 커플링 반응을 Fmoc-Asn(Trt)-OH (24.46 g), HOBT (6.28 g) 및 DIPCI (6.3 ml) 를 사용하여 다시 수행하여 (공정 5), Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko 수지를 합성하였다. 그 다음 수득 수지를 공정 2 의 탈보호에 의해 H-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지로 전환시켰다. 세정 후 (공정 1), Fmoc-Met-OH 15.23g, Fmoc-Gln(Trt)-OH 25.04g, Fmoc-Asn(Trt)-OH 24.46g, Fmoc-Trp(Boc)-OH 21.59g, Fmoc-Thr(tBu)-OH 16.3g, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 18.84g 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH 24.01g 을 연속으로 첨가하여 커플링 반응을 수행하였다 (공정 3). Fmoc-Thr(tBu)-OH 을 사용하는 커플링 반응에서, 반응을 3 회 반복하고, 수득 수지를 DMF 로 세정하고, 미반응된 아미노기의 캡핑을 위해 25 % Ac2O (무수아세트산) (15 분 x 2) 으로 처리하였다. N-말단 Fmoc-Cys(Trt)-OH 의 축합 후, 탈보호 (공정 2) 및 세정 (공정 6) 을 수행하여 H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지를 수득하였다. 상기 합성 공정은 하기 표에 요약된다.
[표 2]
2. 보호된 펩티드 수지의 탈보호
트리플루오로아세트산/에탄디올/H2O/트리이소프로필실란 (94/2.5/2.5/1) 의 혼합 용액 (100ml) 을 상기와 같이 제조된 보호된 펩티드 수지 (H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) (10.0g) 에 첨가하고, 수득 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉하 t-부틸메틸에테르 (625ml) 에 첨가하고, 수득 혼합물을 15 분 동안 교반한 후, 유리 필터를 사용하여 여과하여 불용성 물질을 수득하였다. 필터 상의 잔류물을 t-부틸메틸에테르 (약 100ml) 로 5 회 세정하고, 필터 상의 잔류물을 6M 구아니딘 히드로클로라이드 수용액 (1L) 으로 추출하여, 미정제 펩티드 용 액을 제조하였다.
3. 미정제 펩티드의 정제
수득 미정제 펩티드 용액을 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 5cmφX50cmL, 15-30μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 60ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채우고 50℃ 수조에서 유지하였다. 10% 의 용리액 2 로 30 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 40 분에 걸쳐 20% 로 증가시키고, 360 분에 걸쳐 40% 로 추가 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드: H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (SEQ ID No:2) (1.50g) 를 제조하였다.
·아미노산 분석
가수분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 10 시간
분석법: 닌히드린법
Asx:1.96(2) Thr:1.05(1) Glx:1.06(1) Met:1.05(1) *Leu:(1) Tyr:0.87(1)
*) Leu=표준 아미노산 이론상 값은 ( ) 안에 기재된다.
·질량 분석: LC-ESI/MS m/z =1173 [M+1]+ (이론상 값＝1172.5)
·아미노산 서열 분석: N-말단으로부터의 위치 2 에서 Tyr 에서 C-말단에서의 Leu 까지의 아미노산 잔기를 서열분석하여 확인하였다.
제조 2
1. 보호된 펩티드 수지 (H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) 의 합성
Fmoc-Leu-Alko-수지 (여기서 Alko 는 p-알콕시벤질 알코올임) (10 g) (0.81 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) 를 반응 용기 (500 ml, Type ACT90 고상 합성기, Advanced ChemTech) 에 채우고, DMF 등으로 1 회 세정하였다 (공정 1). 그 다음 수지에 25% Pip (피페리딘) (3 분 x 1, 및 15 분 x 1) 을 처리하여 Fmoc 기를 분할하고 (공정 2), DMF 등으로 다시 세정하여 (공정 1), Pip 을 제거하였다. 반응 용기에 NMP (N-메틸피롤리디논) (200 ml) 중의 Fmoc-Asn(Trt)-OH (24.17 g) 및 HOBT (1-히드록시벤조트리아졸) (6.2 g) 의 용액을 첨가하였다. DIPCI (N,N'-디이소프로필카르보디이미드) (6.2 ml) 첨가 후, 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다 (공정 3). 30 분 후, 수지를 NMP 로 세정하고 (공정 4), 커플링 반응을 Fmoc-Asn(Trt)-OH (24.17 g), HOBT (6.2 g) 및 DIPCI (6.2 ml) 를 사용하여 다시 수행하여 (공정 5), Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko 수지를 합성하였다. 그 다음 수득 수지를 공정 2 의 탈보호에 의해 H-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지로 전환시켰다. 세정 후 (공정 1), Fmoc-Met-OH 15.05g, Fmoc-Gln(Trt)-OH 24.73g, Fmoc-Asn(Trt)-OH 24.17g, Fmoc-Trp(Boc)-OH 21.33g, Fmoc-Thr(tBu)-OH 16.1g, Fmoc-Met-OH 15.05g 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH 23.72g 을 연속으로 첨가하여 커플링 반응을 수행하였다 (공정 3). Fmoc-Thr(tBu)-OH 을 사용하는 커플링 반응에서, 반응을 3 회 반복하고, 수득 수지를 DMF 로 세정하고, 미반응된 아미노기의 캡핑을 위해 25 % Ac2O (무수아세트산) (15 분 x 2) 으로 처리하였다. N-말단 Fmoc-Cys(Trt)-OH 의 축합 후, 탈보호 (공정 2) 및 세정 (공정 6) 을 수행하여 H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지를 수득하였다. 상기 합성 공정은 제조 1 의 표에 기재된 것과 동일하다.
2. 보호된 펩티드 수지의 탈보호
트리플루오로아세트산/에탄디올/H2O/트리이소프로필실란 (94/2.5/2.5/1) 의 혼합물 (130ml) 을 상기와 같이 제조된 보호된 펩티드 수지 (H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) (13.0g) 에 첨가하고, 수득 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉하 디에틸에테르 (800ml) 에 첨가하고, 수득 혼합물을 15 분 동안 교반한 후, 유리 필터를 사용하여 여과하여 불용성 물질을 수득하였다. 필터 상의 잔류물을 디에틸에테르 (약 100ml) 로 5 회 세정하고, 필터 상의 잔류물을 6M 구아니딘 히드로클로라이드 수용액 (1.3L) 으로 추출하여, 미정제 펩티드 용액을 제조하였다.
3. 미정제 펩티드의 정제
수득 미정제 펩티드 용액을 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
펌프: LC-8A 유형 (SHIMADZU CORPORATION)
컬럼: YMC ODS-A 5cmφX50cmL, 15-30μm
용리액 1: H2O/0.1%TFA
용리액 2:CH3CN/0.1%TFA
유속: 60ml/분
검출: UV220nm
미정제 펩티드 용액을 10% 의 용리액 2 로 평형된 컬럼에 채우고 50℃ 수조에서 유지하였다. 10% 의 용리액 2 로 30 분 동안 수행한 후, 용리액 2 의 농도를 40 분에 걸쳐 20% 로 증가시키고, 360 분에 걸쳐 40% 로 추가 증가시켰다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하 증발시킨 후, 동결건조하여, 원하는 펩티드: H-Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (SEQ ID No:1) (2.32g) 를 제조하였다.
·아미노산 분석
가수분해: 4N 메탄술폰산, 110℃, 17 시간
분석법: 닌히드린법
Asx:1.87(2) Thr:0.93(1) Glx:0.95(1) Met:1.72(2) *Leu:(1) Trp:0.80(1)
*) Leu=표준 아미노산 이론상 값은 ( ) 안에 기재된다.
·질량 분석: LC-ESI/MS m/z =1141 [M+1]+ (이론상 값＝1140.5)
·아미노산 서열 분석: N-말단으로부터의 위치 2 에서 Met 에서 C-말단에서의 Leu 까지의 아미노산 잔기를 서열분석하여 확인하였다.
본 발명의 펩티드 화합물은 암 면역요법을 위한 의약에 포함되는 활성 성분으로 유용하다.
서열 목록 프리 텍스트
SEQ ID No.1: 펩티드 유도체
SEQ ID No.2: 펩티드 유도체
SEQ ID No.3: 펩티드 유도체
SEQ ID No.4: 펩티드 유도체
SEQ ID No.5: 도움자 합성 펩티드
<110> International Institute of Cancer Immunology, Inc.
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Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu
1 5 10
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Peptide
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Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Peptide
<400> 5
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
20
Claims (18)
- 하기 화학식 (1) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
[식 중 X 는 티로신 잔기 또는 메티오닌 잔기이고; Y 및 Z 각각은 단일 결합 및 1-10 개 아미노산 잔기로 이루어진 2가 펩티드 기로부터 독립적으로 선택되고,R1 은 수소 또는 알킬이고,R2 는 히드록실, 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노이고,R3 은 수소, 알킬, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 치환 또는 미치환 알킬카르보닐아미노이고,R4 는 수소, 알킬, 카르복시, 카르바모일, 알킬카르바모일, 디알킬카르바모일 또는 하기 화학식 (2) 의 기이고:
(식 중 W 는 아미노산 잔기임),m 은 1 또는 2 이고,n 은 0 내지 2 의 정수이고, 단 n 이 0 인 경우, R3 은 수소 또는 알킬임]. - 제 1 항에 있어서, R3 으로 표시되는 상기 치환된 알킬카르보닐아미노가 카르복시, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2 개의 치환기로 치환된 알킬카르보닐아미노인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서, R3 이 수소 또는 하기 화학식 (3) 의 기이고:
(식 중 r 은 1 내지 3 의 정수임),R4 가 카르복시 또는 하기 화학식 (2') 의 기인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중 W' 는 글리신 잔기 또는 β-알라닌 잔기임). - 제 3 항에 있어서, R3 이 하기 화학식 (3') 의 기이고:
R4 가 카르복시메틸카르바모일인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염. - 제 3 항에 있어서, R3 이 수소이고, R4 가 카르복시인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
- 하기 화학식 (1') 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중 X' 는 티로신 잔기 또는 메티오닌 잔기이고,R1' 는 수소 또는 알킬이고,R2' 는 히드록실, 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노이고,R3' 는 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 치환 또는 미치환 알킬카르보닐아미노이고,R4' 는 카르복시, 카르바모일, 알킬카르바모일 또는 디알킬카르바모일임). - 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 (4) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
- 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 (5) 의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 HLA-A24 항원의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포.
- 환자로부터 단리된 말초 림프구를 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염으로 자극하는 것을 포함하는, 시험관 내에서 CTL을 제조하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, CTL 이 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 HLA-A24 항원의 복합체를 인지하는 것인 방법.
- 제 11 항에 있어서, CTL 이 SEQ ID No:1 의 펩티드 및 HLA-A24 항원의 복합체를 인지하는 것인 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 HLA-A24 항원의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 백혈병, 골수형성이상증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종, 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 암 백신으로 사용되는 약학 조성물.
- 삭제
- 활성 성분으로 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 HLA-A24 항원의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포를 포함하는 암 면역요법을 위한 의약.
- 삭제
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