CN105315347A - 新型肽化合物 - Google Patents

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CN105315347A CN201510909871.XA CN201510909871A CN105315347A CN 105315347 A CN105315347 A CN 105315347A CN 201510909871 A CN201510909871 A CN 201510909871A CN 105315347 A CN105315347 A CN 105315347A
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
International Institute of Cancer Immunology Inc
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Abstract

公开了下式(1)表示的新型化合物或其药学可接受盐。还公开了这种化合物或其盐在癌症免疫疗法中的用途。式（1）[式中X表示酪氨酸残基或甲硫氨酸残基；Y和Z各自表示单键等；R1表示氢原子等；R2表示羟基基团等；R3表示氢原子、烷基基团、氨基基团等；R4表示氢原子、烷基基团、羧基基团等；m表示1或2；n表示0-2的整数。在这一点上，当n为0时，R3表示氢原子或烷基基团]。

Description

新型肽化合物
本申请是2006年11月29日提交的题为“新型肽化合物”的国家申请号为200680051914.4(PCT/JP2006/323827)的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌症疫苗疗法，特别涉及可用作癌症免疫疗法的药物的新型肽化合物。具体的说，本发明涉及衍自WT1的癌抗原肽的衍生物，其具有体内CTL诱导活性，可用作癌症疫苗。
技术背景
细胞介导免疫特别是细胞毒性T细胞(下文称为“CTL”)在体内排斥癌细胞或病毒感染细胞中起到重要作用。CTL能识别癌细胞上的衍自癌抗原蛋白的抗原肽(“癌抗原肽”)和MHC(主要组织相容性复合体)I类抗原(在人类中称为“HLA”抗原)之间的复合物，并攻击和杀灭该细胞。
能结合MHCI类分子的癌抗原肽通常已知是由蛋白质的胞内加工产生的具有8-12个氨基酸残基的肽。因此，一般来说，衍自癌抗原蛋白的具有8-12个氨基酸残基的肽会是癌抗原肽的候选者。当癌抗原肽中存在谷氨酰胺残基或半胱氨酸残基时，这些氨基酸残基在空气气氛中一般会自发被氧化。据报道，这种自发氧化会降低该肽与MHCI类分子的结合亲和力和T细胞受体对该肽的认知应答(参见非专利文献1和2)。
已从染色体11p13分离出Wilms肿瘤的肿瘤抑制基因WT1(WT1基因)，该基因根据对作为Wilms肿瘤、无虹膜、泌尿生殖系统畸形、脑力发育迟缓等的并发症出现的WAGR综合征的分析鉴定为Wilms肿瘤的致病基因，且WT1的氨基酸序列是公知的(参见非专利文献3)。WT1基因在人白血病中以高频率表达，当白血病细胞用WT1反义寡聚物处理时，该细胞的生长受到抑制。因此，WT1基因据认为能起到促进白血病细胞的生长的作用。此外，WT1基因在实体癌症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌中也高度表达，且WT1基因已被证明是白血病和实体癌症中的新型癌抗原蛋白基因(参见非专利文献4和5)。另外，已鉴定了作为野生型癌抗原肽的具有WT1蛋白的部分序列的癌抗原肽(参见专利文献1和2)。
具体的说，WT1235-243(Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu；SEQIDNO：1)，即横跨癌抗原蛋白WT1的位置235-243的肽，是一种具有以HLA-A24限制方式诱导CTL的活性的癌抗原肽(参见非专利文献6和专利文献1)。WT1235-243的位置2处的甲硫氨酸残基被酪氨酸残基取代所成的修饰肽(Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu；SEQIDNO：2，下文可称为WT1235-243(2M→Y))，比野生型的肽具有更高的HLA-A24抗原结合亲和力(参见专利文献3)。将野生型肽WT1235-243和修饰肽WT1235-243(2M→Y)开发成免疫治疗剂是有前途的。
另外，已知所述野生型肽和所述修饰肽每一个在N末端位点都具有半胱氨酸残基，该残基在空气气氛中氧化会产生出通过二硫键结合的二聚体，而所述二聚体也可起到癌抗原肽的作用(参见专利文献4)。
专利文献1：WO00/06602
专利文献2：WO00/18795
专利文献3：WO02/079253
专利文献4：WO2004/063217
非专利文献1：Immunity.，6：273，1997
非专利文献2：J.Immunol.，160：2099，1998
非专利文献3：Cell，60：509，1990
非专利文献4：J.Immunol.，164：1873-80，2000
非专利文献5：J.Clin.Immunol.，20，195-202，2000
非专利文献6：Clin.Cancer.Res.8：2626，2002
发明内容
本发明要解决的问题
本发明要解决的问题是提供具有体内CTL诱导活性和可在癌症免疫疗法中用作癌症疫苗的新型肽化合物。
解决问题的手段
本发明人对衍自WT1蛋白的癌抗原肽WT1235-243和WT1235-243(2M→Y)的修饰认真地进行了各种研究，目的是要产生出具有改进的理化特性、稳定性和生物活性的癌抗原肽。具体的说，他们制备了从这些肽修饰而成的化合物，并用HLA-A2402/Kb转基因小鼠(参见WO02/47474，下文可称为HLA-A24小鼠)验证了免疫原性。
结果，他们通过修饰WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)的N末端位点处的半胱氨酸残基(Cys)，特别是修饰N末端位点处的该半胱氨酸残基的硫醇基团，成功地制备出具有改进的理化特性和稳定性的肽化合物。本发明的肽化合物具有改进的免疫原性和CTL诱导活性。被本发明肽化合物特异性诱导的T细胞由于能与癌细胞最初呈递的野生型肽WT1235-243发生交叉反应，因此可用作癌症免疫疗法的药物。
至今为止，其中作为WT1抗原肽的WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)的半胱氨酸残基得到修饰的肽化合物，未曾得知其能显示足够的免疫原性而起到癌症抗原的作用。本发明人首先发现，通过将N末端的半胱氨酸残基的硫醇基团与半胱氨酸、谷胱甘肽或硫代乙醇酸的硫醇基团进行缩合所制备的肽衍生物，可用作有效的癌症抗原。
本发明是基于上述发现得以完成的。
本发明涉及
[1]式(1)的化合物：
其中X为酪氨酸残基或甲硫氨酸残基；Y和Z各自独立选自单键和由1-10个氨基酸残基组成的二价肽基团，
R1为氢或烷基，
R2为羟基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基，
R3为氢、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或取代的或未取代的烷基羰基氨基，
R4为氢、烷基、羧基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基或式(2)的基团：
其中W为氨基酸残基，
m为1或2，和
n为0-2的整数，条件是当n为0时，R3为氢或烷基，
或其药物可接受的盐；
[2]根据以上[1]的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3所代表的所述取代的烷基羰基氨基是被一个或两个选自羧基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的取代基取代的烷基羰基氨基；
[3]根据以上[1]或[2]的化合物或其药物可接受的盐，
R3为氢或式(3)的基团：
其中r为1-3的整数，和
R4为羧基或式(2′)的基团：
其中W′为甘氨酸残基或β-丙氨酸残基；
[4]根据以上[3]的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为式(3′)的基团：
R4为羧基甲基氨基甲酰基；
[5]根据以上[3]的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为氢和R4为羧基；
[6]式(1′)的化合物：
其中X′为酪氨酸残基或甲硫氨酸残基，
R1′为氢或烷基，
R2′为羟基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基，
R3′为氨基、烷基氨基、二烷基氨基或取代的或未取代的烷基羰基氨基，和
R4′为羧基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基或二烷基氨基甲酰基，
或其药物可接受的盐；
[7]能特异性结合根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐的抗体；
[8]能呈递根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐和HLA-A24抗原的复合物的抗原呈递细胞。
[9]由根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐诱导的CTL；
[10]根据以上[9]的CTL，其能识别根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐和HLA-A24抗原的复合物；
[11]根据以上[9]的CTL，其能识别SEQIDNo：1的肽和HLA-A24抗原的复合物；
[12]一种包含根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐、根据以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL及药物可接受载体的药物组合物；
[13]根据以上[12]的药物组合物，其用作癌症疫苗；
[14]根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐、根据以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL用于制备癌症疫苗的用途；
[15]一种包含根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐、根据以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL作为活性成分的用于癌症免疫疗法的药物；或
[16]一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将治疗或预防有效量的根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐、根据以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL，给予需要进行癌症的治疗或预防的HLA-A24阳性和WT1阳性患者。
本发明所产生的效果
本发明提供了可用作癌症免疫疗法的药物的新型肽化合物，例如衍自WT1的具有体内CTL诱导活性和可用作癌症疫苗的癌症抗原。本发明的肽是通过对位于WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)N末端的半胱氨酸残基的巯基进行修饰、同时保持作为癌症抗原肽的活性而制备得到，它具有改进的理化特性和稳定性，因此能广泛用于治疗或研究。具体的说，本发明的新型肽具有诸如以下的优点：操作方便而无需担心因体外处理所造成的活性降低，显示出稳定的治疗效果等等。
附图简述
图1图示实施例1的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂解)，使用了三只小鼠(图中的黑色柱条)。图中的白色柱条显示的是用没有用任何肽脉冲的细胞获得的结果(以下各图同样适用)。
图2图示实施例2的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂解)，使用了三只小鼠。
图3图示实施例3的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂解)，使用了三只小鼠。
图4图示实施例4的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂解)，使用了三只小鼠。
图5图示实施例5的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂解)，使用了三只小鼠。
图6图示实施例6的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂解)，使用了三只小鼠。
图7图示实施例1的肽化合物所诱导的剂量依赖性细胞毒性活性(特异性裂解)。X轴显示每只小鼠的剂量(600μg、200μg、60μg和20μg)，Y轴显示细胞毒性活性(特异性裂解)。每个剂量分别给予三只小鼠，结果以细胞毒性活性平均值和标准偏差(S.D.)表示。
图8图示通过用实施例1的肽化合物免疫小鼠制备的肽特异性T细胞对用各种肽脉冲的细胞的反应性。图中分别地，阴影线柱条显示用野生型肽(WT1235-243)脉冲的细胞获得的结果，黑色柱条显示用实施例1的肽化合物脉冲的细胞获得的结果，白色柱条显示用衍自流感的肽脉冲的细胞获得的结果。另外在图中，纵轴显示斑点。
图9图示通过用实施例1的肽刺激而从人PBMC衍生的肽特异性T细胞对用各种肽脉冲的细胞的反应性。图中分别地，“野生型肽”显示用野生型肽(WT1235-243)脉冲的细胞获得的结果，“修饰肽”显示用修饰肽(WT1235-243(2M→Y))脉冲的细胞获得的结果，“实施例1的肽”显示用不用任何肽脉冲的细胞获得的结果。另外在图中，纵轴显示所产生的γ干扰素的量。
实施本发明的最佳方式
在本申请的说明书和附图中，每种氨基酸残基分别使用以下缩写。
Ala：丙氨酸残基
Arg：精氨酸残基
Asn：天冬酰胺残基
Asp：天冬氨酸残基
Cys：半胱氨酸残基
Gln：谷氨酰胺残基
Glu：谷氨酸残基
Gly：甘氨酸残基
His：组氨酸残基
Ile：异亮氨酸残基
Leu：亮氨酸残基
Lys：赖氨酸残基
Met：甲硫氨酸残基
Phe：苯丙氨酸残基
Pro：脯氨酸残基
Ser：丝氨酸残基
Thr：苏氨酸残基
Trp：色氨酸残基
Tyr：酪氨酸残基
Val：缬氨酸残基
本说明书中所用的“氨基酸残基”包括天然或非天然的α-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基和δ-氨基酸残基。例如，“氨基酸残基”包括天然α-氨基酸(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val)、鸟氨酸残基、高丝氨酸残基、高半胱氨酸残基、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸或δ-氨基戊酸。
上述氨基酸如为旋光异构体，则可以是L-对映异构体或D-对映异构体。L-对映异构体更为优选。
在本说明书中，肽化合物的氨基酸序列是按照常规方式描述，N末端氨基酸残基位于左侧，C末端氨基酸残基位于右侧。
(1)肽化合物
在第一个方面，本发明涉及上述式(1)化合物或其药物可接受的盐。
在式(1)中，优选地，X代表酪氨酸残基(Tyr)。
在式(1)中，Y和Z所代表的“由1-10个氨基酸残基组成的二价肽基团”包括由1-10个氨基酸残基组成的相同或不同的二价肽基团，对氨基酸序列没有任何限制。例如，所述由1-10个氨基酸组成的二价肽基团包括包含在人WT1(Cell，60：509，1990，GenBankAcc.No.A38080)的氨基酸序列中的氨基酸序列。例如，Y可代表由人WT1的225-234这十个氨基酸残基(如下所示：Asn-Leu-Tyr-Gln-Met-Thr-Ser-Gln-Leu-Glu(SEQIDNo：3))组成的二价肽基团，或者具有SEQIDNO：3的片段的二价肽基团，该片段中缺失SEQIDNO：3的N末端处的1-9个氨基酸残基。另外，例如，Z可代表由人WT1的244-253这十个氨基酸残基(如下所示：Gly-Ala-Thr-Leu-Lys-Gly-Val-Ala-Ala-Gly(SEQIDNo：4))组成的二价肽基团，或者具有SEQIDNO：4的片段的二价肽基团，该片段中缺失SEQIDNO：4的C末端处的1-9个氨基酸残基。优选地，Y和Z各自可代表单键。
在本说明书中，烷基基团包括例如具有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团。例如，烷基基团包括甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基等。
在本说明书中，烷基氨基基团包括例如具有1-6个碳原子的直链或支链烷基氨基基团。例如，烷基氨基基团包括甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、1-甲基乙基氨基、丁基氨基、1-甲基丙基氨基、2-甲基丙基氨基、1，1-二甲基乙基氨基、戊基氨基等。
在本说明书中，二烷基氨基基团包括例如被两个相同或不同的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团取代的氨基基团。例如，二烷基氨基基团包括二甲基氨基、乙基甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、甲基丙基氨基、丁基甲基氨基、甲基戊基氨基等。
在本说明书中，烷基羰基氨基基团中的“烷基”包括如上所述的烷基基团。烷基氨基甲酰基基团中的“烷基”包括与如上所述的烷基氨基基团中的烷基相同的烷基。二烷基氨基甲酰基基团中的“烷基，，包括与如上所述的二烷基氨基基团中的烷基相同的烷基，其中两个“烷基，，可相同或不同。
R1和R2各自优选代表氢原子。
如R3代表取代的烷基羰基氨基基团，则烷基羰基氨基基团的取代基包括例如羧基、羟基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基，其中所述烷基羰基氨基基团可被相同或不同的1-4个、优选1个或2个取代基取代。
式(2)中W代表的氨基酸残基可优选地包括甘氨酸残基(Gly)。
本发明的肽化合物包括例如以下式(4)-(9)的化合物：
本发明的肽化合物可按照本说明书实施例中描述的方法或者肽合成中常用的方法来制备。这种制备法的实例是包括以下文献在内的文献中描述的方法：″PeptideSynthesis(肽合成)″，Interscience，NewYork，1966；″TheProteins(蛋白质)″，Vol.2，AcademicPressInc.，NewYork，1976；″Pepuchido-Gosei″，MaruzenCo.Ltd.，1975；″Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn″，MaruzenCo.Ltd.，1985；和″Iyakuhin-no-Kaihatu，Zoku，vol.14，Peputido-Gosei″，HirokawaShoten，1991。制备本发明肽的方法的实例包括按照FmoC方法或Boc方法通过固相合成仪制备该肽的方法，或者按照液相合成方法通过Boc-氨基酸或Z-氨基酸的连续缩合制备该肽的方法，其中分别地，Fmoc代表9-芴甲氧基羰基基团，Boc代表叔丁氧基羰基基团，Z代表苄氧基羰基基团。
本发明化合物合成过程中的中间化合物的官能团如氨基、羧基和巯基基团可通过合适的保护基进行保护，被保护化合物如需要可用常规的保护/脱保护技术进行脱保护。合适的保护基及保护和脱保护方法详细描述于例如ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis2ndEdition(JohnWiley&Sons，Inc.；1990)。
具体的说，制备本发明化合物的方法的一个实例是以下反应式所示的方法：
[反应式1]
其中X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m和n分别如上所述。R和R′各自独立代表氢原子或巯基保护基。所述巯基保护基的实例包括例如乙酰胺基甲基或三苯甲基。
式(1)化合物可通过将式(1-1)化合物和式(1-2)化合物在惰性溶剂中进行氧化来制备。
该氧化可通过肽合成中常用来形成二硫键的常规方法来进行。例如，二硫键可通过将两种具有巯基基团的中间体在合适的溶剂中混合并将它们氧化来形成。可使用常规的氧化方法如空气氧化和碘氧化。溶剂可以是水、乙酸、甲醇、氯仿、DMF或DMSO或者它们的混合物。氧化反应有时候会产生出对称和不对称二硫化合物的混合物。所需的不对称二硫化合物可通过将该混合物进行纯化来制备，如用各种类型的色谱法进行纯化，按照重结晶法进行纯化等。
或者，将具有活化巯基基团的中间体与另一种具有巯基基团的中间体进行混合，以产生选择性二硫键。具有活化巯基基团的中间体的实例包括例如具有与Npys基团(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基基团)结合的巯基基团的化合物。
或者，在将具有巯基基团的中间体中的一个与例如2，2′-二硫代双(5-硝基吡啶)进行混合以使巯基基团活化后，将另一个中间体加入到所得的混合物以形成选择性二硫键(TetrahedronLetters.Vol.37.No.9，pp.1347-1350)。
式(1-1)化合物可按照本领域技术人员熟知的液相或固相肽合成方法来制备。
另外，在式(1-1)化合物为N末端烷基化化合物的情况中，可将如需要可通过保护基加以保护的N-烷基氨基酸或N，N-二烷基氨基酸用作N末端氨基酸。N-烷基氨基酸或N，N-二烷基氨基酸可市售获得，或者按照本领域技术人员熟知的方法制备，在该方法中例如使原料的氨基酸或被保护氨基酸与烷基卤在碱的存在下进行反应。例如，N-末端氨基基团可如以下[反应式2]所示，通过使被叔丁氧基羰基基团保护的氨基酸与烷基卤在碱如氢化钠的存在下进行反应，来进行适当烷基化。
[反应式2]
其中X、Z、R1、R2、m和R各自同上所述，Hal代表溴原子或碘原子，Prot代表保护基。
此外，在化合物是C末端酰胺化或烷基酰胺化化合物的情况中，可将酰胺化或烷基酰胺化氨基酸用作原料的C末端氨基酸残基。
本发明化合物或或其合成中的中间体可按照本领域技术人员熟知的方法进行纯化。例如，可通过各种类型的色谱法(例如硅胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤色谱或反相色谱)或者重结晶法进行纯化。重结晶用的溶剂可例如是醇类如甲醇、乙醇和2-丙醇，醚类如二乙醚，酯类如乙酸乙酯，芳烃类如苯和甲苯、酮类如丙酮，烃类如己烷，非质子溶剂如二甲基甲酰胺和乙腈，水或者以上溶剂的混合溶剂。其它纯化用的方法可以是《Jikkenkagakukoza(试验化学讲座)》(日本化学会编辑，Maruzen(丸善))的第1卷中所述的方法。
在本发明化合物具有一个或多个不对称中心的情况中，可用具有不对称中心的原料(氨基酸)按照常规方法来制备该化合物。此外，在生产过程中的适当步骤中可进行光学拆分，以改进本发明化合物的光学纯度。例如，可按照非对映异构体方法进行光学拆分，在该方法中将本发明化合物或其中间体与旋光活性酸(例如一元羧酸如扁桃酸、N-苄氧基丙氨酸和乳酸，二元羧酸如酒石酸、邻-二亚异亚丙基酒石酸和苹果酸或者磺酸如樟脑磺酸和溴樟脑磺酸)在非活性溶剂(例如醇类溶剂如甲醇、乙醇和2-丙醇，醚类如二乙醚，酯类溶剂如乙酸乙酯，烃类溶剂如甲苯，非质子溶剂如乙腈或者以上溶剂的混合溶剂)中进行混合，以制备盐形式。在本发明化合物或其中间体具有酸官能团如羧基基团的情况中，光学拆分可通过与旋光活性胺(例如有机胺如α-苯乙基、奎宁、奎尼定、辛可尼定、辛可宁和马钱子碱)形成盐来进行。
形成盐的反应可在室温到溶剂沸点的范围内的温度下进行。为了提高光学纯度起见，优选的是将温度一次性提高到大约溶剂沸点。如需要可通过将混合物冷却来提高收率，沉淀出的盐可通过过滤回收。
旋光活性酸或胺的适当用量为底物的约0.5至约2.0当量，优选为底物的约1当量。如需要，可将晶体在非活性溶剂(例如醇类如甲醇、乙醇和2-丙醇，醚类如二乙醚，酯类如乙酸乙酯，烃类如甲苯，非质子溶剂如乙腈或者以上溶剂的混合溶剂)中进行重结晶，以获得高度纯化的旋光活性盐。另外如需要，可按照常规方法将光学拆分的盐用酸或碱进行处理，以获得游离形式的化合物。
药物可接受盐包括酸加成盐或碱加成盐。例如，酸加成盐包括与无机酸所成的盐如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐和磷酸盐，和与有机酸所成的盐如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐包括与无机碱所成的盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铵盐，与有机碱所成的盐如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐和二异丙基铵盐，还有与氨基酸如碱性或酸性氨基酸(包括精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)所成的盐。
另外，本发明包括式(1)所代表的肽化合物或其药物可接受盐的溶剂合物，包括水合物或乙醇溶剂合物。此外，本发明包括式(1)所代表的化合物的任何可能立体异构体(包括任何非对映异构体和对映异构体)以及它们的任何晶形。
在包括将旋光活性α-氨基酸缩合、将各种类型的保护基除去或将肽从树脂释放的步骤的肽化合物制备过程中，通常会有副产物产生，包括带有氨基酸缺失的肽，被水解、氧化等降解的肽和具有差向异构化氨基酸的肽。在实验室规模，可组合使用各种色谱法(例如硅胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤或反相色谱)来除去这些杂质，以获得高度纯化的肽化合物。但是，在工业规模上获得高度纯化的肽化合物以将它作为药物提供，这是不容易的。
本发明的肽化合物所具有的理化特性能使得可以大规模生产原料药。具体的说，本发明的肽化合物具有诸如在溶液中溶解度高、稳定性高或者当被缩合时趋向于不会变成凝胶的特性，这使得高度纯化的肽化合物可容易地通过用柱色谱法如反向色谱进行纯化甚至大规模地制备成原料药。
本发明的肽化合物可用作活性成分包含在癌症免疫疗法用的CTL诱导剂或癌症疫苗中。本发明的肽化合物具有高免疫原性和高CTL诱导活性，这在本说明书的实施例中证实。被本发明的肽化合物诱导的CTL出人意料地能识别原先由癌细胞携带的WT1的野生型肽。因此，本发明的肽化合物可用作药物用于治疗或预防(包括预防复发)表达WT1基因的癌症，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
(2)本发明的抗体
在第二个方面，本发明涉及能特异性结合式(1)所代表的肽或其药物可接受盐的抗体(下文可称为“本发明的抗体”)。本发明的抗体并不限于具体的抗体，可以是用本发明的肽作为免疫原制备的多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明的抗体并不限于具体的抗体，只要它们能特异性结合本发明的肽化合物即可，具体的实例包括能特异性结合上述式(4)-(9)任一项所代表的肽的抗体。
制备抗体的方法已经是公知的，本发明的抗体可按照常规方法(CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit(精编现代分子生物学实验指南).Ausubeletal.(1987)Publish.JohnWileyandSons.Section11.12-11.13，Antibodies；ALaboratoryManual，Lane，H，D.etal.ed.，ColdSpringHarberLaboratoryPressPublisher，NewYork1989)来制备。
具体的说，可这样制备抗体：用本发明的肽化合物(例如式(4)-(9)任一项所代表的化合物)作为免疫原来免疫非人动物如兔，然后以常规方式从被免疫动物的血清获得抗体。另一方面，可这样制备单克隆抗体：用本发明化合物如式(4)-(9)任一项所代表的化合物免疫非人动物如小鼠，通过细胞融合从获自该动物的脾细胞和骨髓瘤细胞制备杂交瘤，然后从该杂交瘤获得抗体(CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit(精编现代分子生物学实验指南).Ausubeletal.(1987)Publish.JohnWileyandSons.Section11.4-11.11)。
抗本发明的肽化合物的抗体可以以用适合于宿主的多种佐剂使免疫反应得到增强的这样的方式来制备。佐剂的实例包括弗氏佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚以及人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium-parvum)。
如上所述，能识别本发明化合物的抗体以及能中和该化合物的活性的抗体，可容易地通过用本发明化合物以常规方式适当免疫动物来制备。这种抗体可用于亲和色谱、免疫学诊断等。免疫学诊断可适当地选自免疫印迹分析、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测定等。免疫学诊断可用于诊断表达WT1基因的癌症，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
(3)本发明的抗原呈递细胞
在第三个方面，本发明涉及其上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的抗原呈递细胞。
下文描述的实施例证明本发明化合物的给予能诱导CTL。也就是说，其上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的抗原呈递细胞在外周血单核细胞中产生，然后能特异性识别呈递这种复合物的细胞的CTL得到诱导。其上呈递HLA-A24抗原和本发明化合物之间的复合物的抗原呈递细胞可用于细胞疗法(DC疗法)中，这在下文中有描述。
本发明的抗原呈递细胞并不限于具体的细胞，只要它们能在其表面上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物即可。它们具体地包括例如其上呈递式(4)-(9)任一项所代表的化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的树突细胞的抗原呈递细胞。
用于细胞疗法(DC疗法)的抗原呈递细胞可这样制备：从癌症患者分离具有抗原呈递能力的细胞，用本发明化合物体外(exvivo)脉冲所得的细胞，使得该细胞在其细胞表面上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物。在这个情形中，“具有抗原呈递能力的细胞”并不限于具体的细胞，只要它是在其表面上表达具有呈递本发明化合物的能力的HLA-A24抗原的细胞即可，优选的实例是据认为具有特别高的抗原呈递能力的树突细胞。
本发明的抗原呈递细胞可例如这样制备：从癌症患者分离具有抗原呈递能力的细胞，用本发明化合物(例如式(4)-(9)任一项的化合物)体外(exvivo)脉冲该细胞，和制备HLA-A24抗原和本发明化合物之间的复合物(CancerImmunol.Immunother.，46：82，1998，J.Immunol.，158：p1796，1997，CancerRes.，59：p1184，1999)。如使用树突细胞，本发明的抗原呈递细胞可例如这样制备：用Ficoll方法从癌症患者的外周血分离淋巴细胞，除去非黏附细胞，将黏附细胞在GM-CSF和IL-4存在下进行温育以诱导树突细胞，并将所得的树突细胞温育并用本发明化合物脉冲该树突细胞。
如上所述这样制备得到的抗原呈递细胞可用作活性成分包含在下文所述的细胞疗法(DC疗法)用的CTL诱导剂或癌症疫苗中。
(4)本发明的CTL
本发明的肽化合物衍自人WT1，具有HLA-A24限制性方式的CTL诱导活性(免疫原性)。在第四个方面，本发明涉及由本发明的肽化合物诱导的CTL。
下文描述的实施例证明本发明的肽化合物的给予能诱导CTL。也就是说，其上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的抗原呈递细胞在外周血单核细胞中产生，然后能特异性识别呈递这种复合物的细胞的CTL得到诱导。由本发明的肽化合物诱导的CTL可用于过继免疫治疗，这在下文中有描述。
本发明的CTL并不限于具体的CTL，只要它们是由本发明的肽化合物诱导即可，特别包括能识别式(4)-(9)任一项所代表的化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL和能识别野生型肽(WT1235-243：SEQIDNo：1)和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL。
用于过继免疫治疗的CTL可例如这样制备：从患者分离外周淋巴细胞，用本发明化合物(例如式(4)-(9)任一项所代表的化合物)在体外(invitro)刺激所得的外周淋巴细胞(JoumalofExperimentalMedicine1999，190：1669)。
如上所述制备的本发明CTL可用作活性成分包含在过继免疫治疗用的癌症疫苗中。
可用作癌症疫苗的药物组合物
以上(1)-(4)所述的本发明化合物、本发明抗原呈递细胞和本发明CTL可用作活性成分包含在CTL诱导剂即癌症疫苗中，该疫苗配制成适应于这些各个物质的形式，这在下文中有说明。
1)包含有作为活性成分的本发明化合物或其药物盐的癌症疫苗
本发明化合物具有CTL诱导活性。由本发明化合物诱导的CTL能通过它们的细胞毒性活性和淋巴因子的产生来消灭癌症。因此，本发明化合物可用作活性成分包含在癌症疫苗中用于治疗或预防癌症。在一个实施方案中，本发明提供包含有本发明化合物作为有效成分的癌症疫苗(可用作癌症疫苗的药物组合物)。当将本发明的癌症疫苗给予HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者时，该化合物(例如式(4)-(9)任一项所代表的化合物)被呈递在抗原呈递细胞的HLA-A24抗原上，然后对包含HLA-A24抗原的被呈递复合物具有特异性的CTL得到有效增殖并消灭癌细胞。这样就实现癌症的治疗或预防。本发明的癌症疫苗可用来治疗或预防涉及到WT1基因表达水平升高的癌症，包括血液癌症如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤以及实体癌症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
在这点上，作为另一个实施方案，本发明提供治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的本发明癌症疫苗给予HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者。
包含有作为活性成分的本发明化合物的癌症疫苗，可包含单一癌抗原肽即CTL表位(例如式(4)-(9)任一项所代表的化合物)作为活性成分，或者包含与另一癌抗原肽(如CTL表位)或辅助表位连接的表位肽作为活性成分。最近证明，与多个CTL表位(抗原肽)连接的表位肽具有在体内有效诱导CTL的活性。例如，JournalofImmunology1998，161：3186-3194描述说，衍自癌抗原蛋白PSA的HLA-A2、-A3、-A11、B53限制性CTL表位(抗原肽)所线性连接的约30-mer表位肽，在体内诱导了对相关CTL表位有特异性的CTL。同时还证明，其中CTL表位和辅助表位线性连接在一起的表位肽有效地诱导了CTL。当给予这种表位肽形式的本发明肽时，该肽被引入到抗原呈递细胞，然后经历胞内降解产生出各个能结合HLA抗原而形成复合物的抗原肽。该复合物在抗原呈递细胞的细胞表面上密实地呈递，然后对该复合物具有特异性的CTL在体内得到有效增殖并消灭癌细胞。这样就实现癌症的治疗或预防。
包含有作为活性成分的本发明肽的癌症疫苗，还可与药物可接受载体如合适的佐剂一起给予，或者以颗粒剂型给予，以有效地引起细胞免疫。为此目的，文献(Clin.Microbiol.Rev.、7：277-289、1994)中描述的那些佐剂可适用，具体包括细菌衍生成分，GM-CSF，细胞因子如白细胞介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12等，植物衍生成分，海洋生物衍生成分，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂和复合多元醇，聚阴离子，肽和油乳液(乳液制剂)。细菌衍生成分包括脂质A、单磷酰脂质A(为脂质A的衍生物)、灭活细菌(例如分枝杆菌(Mycobacterium)如BCG)、衍自细菌的蛋白质或多核苷酸、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、细胞壁成分(例如BCG-CWS)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)等。
同样还可使用脂质体制剂、其中活性成分与直径几个微米的珠粒结合的颗粒状制剂或者其中活性成分与脂质连接的制剂。
给药可通过例如皮内、皮下、肌肉内或静脉内注射来实现。虽然本发明化合物在制剂中的剂量可根据待治疗疾病、患者的年龄和体重等因素而异，但通常是每隔几天或每隔几个月给予0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-1000mg、更优选0.1mg-10mg的本发明化合物。
2)包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫苗
本发明提供包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫苗。
最近，细胞疗法(DC疗法)已有报道，在该疗法中，从癌症患者的外周血分离淋巴细胞，将从淋巴细胞诱导而成的树突细胞体外用抗原肽等脉冲以制备抗原呈递细胞，后者然后通过皮下注射等送回患者体内(CancerImmunol.Immunother.，46：82，1998，J.Immunol.，158：p1796，1997，CancerRes.，59：p1184，1999，CancerRes.，56：p5672，1996，J.Immunol.，161：p5607，1998，J.Exp.Med.，184：p465，1996)。因此，本发明的抗原呈递细胞可在细胞疗法的癌症疫苗中用作活性成分。
包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫苗，优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、介质等，以使抗原呈递细胞得到稳定保持。它可例如进行静脉内、皮下或皮内给予。剂量的实例是上述文献中所述的剂量。
通过将癌症疫苗再引入到患者的身体，特异性CTL在HLA-A24阳性和WT1阳性患者中得到有效诱导，从而实现癌症的治疗或预防。包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫苗，可用来治疗或预防其中WT1基因表达水平升高的癌症，包括血液癌症如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤以及实体癌症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
3)包含有作为活性成分的本发明CTL的癌症疫苗
本发明提供包含有本发明CTL作为有效成分的癌症疫苗(可用作癌症疫苗的药物组合物)。本发明的CTL可用于过继免疫治疗中，这在下文有描述。
对于黑素瘤，已观察到过继免疫治疗能实现治疗作用，在该疗法中，将分离自患者本人的肿瘤浸润性T细胞在体外(exvivo)大量培养，然后送回患者体内(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。同样，在小鼠黑素瘤中，通过用癌抗原肽TRP-2体外刺激脾细胞，从而使对该癌抗原肽有特异性的CTL增殖，并将所述CTL给予到移植了黑素瘤的小鼠中，观察到肿瘤转移得到抑制(J.Exp.Med.，185：453，1997)。这是由能特异性识别抗原呈递细胞上HLA抗原和癌抗原肽之间的复合物的CTL的体外增殖所导致的。因此，用本发明化合物体外刺激来自患者的外周血淋巴细胞以使肿瘤特异性CTL在体外增殖、随后将CTL送回患者体内这样的治疗癌症的方法，被认为是有用的。因此，本发明的CTL可用作活性成分包含在用于过继免疫治疗的癌症疫苗中。
包含有作为活性成分的本发明CTL的癌症疫苗，优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、介质等，以使CTL得到稳定保持。它可例如进行静脉内、皮下或皮内给予。剂量的实例是上述文献中所述的剂量。
通过将癌症疫苗再引入到患者的身体，CTL对癌细胞的细胞毒性作用在HLA-A24阳性和WT1阳性患者中得到增强，并使癌细胞得到消灭，从而实现癌症的治疗。包含有作为活性成分的本发明CTL的癌症疫苗，可用于治疗或预防涉及到WT1基因表达水平升高的癌症。癌症的实例包括血液癌症如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤以及实体癌症症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
本发明将由以下实施例作进一步的说明，但在任何方面都不受这些实施例的限制。
在以下实施例中，实施例2的化合物、实施例4的化合物和实施例6的化合物是WT1235-243(SEQIDNo：1)的衍生物，分别对应于WT1235-243用胱氨酸、谷胱甘肽或硫代乙醇酸修饰而成的衍生物。例外，实施例1的化合物、实施例3的化合物和实施例5的化合物是WT1235-243(2M→Y)(SEQIDNo：2)的衍生物，分别对应于WT1235-243(2M→Y)用胱氨酸、谷胱甘肽或硫代乙醇酸修饰而成的衍生物。
实施例
实施例中所用的缩写如下：
Boc：叔丁氧基羰基
Npys：3-硝基-2-吡啶亚磺酰基
t-Bu：寂丁基
Trt：三苯基甲基
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
DMF：二甲基甲酰胺
HOBT：N-羟基苯并三氮唑
DIPCI：二异丙基碳二亚胺
实施例1
式(4)的肽的合成：
将下文所述的制备1中制备的肽(1.5g)和Boc-Cys(Npys)-OH(600mg)在二甲亚砜(20ml)中混合，将混合物在室温下搅拌20分钟。将乙腈(600ml)加到反应混合物中，将混合物在冰上搅拌，过滤收集所得沉淀物。将过滤器上的固体用乙腈和二乙醚洗涤，然后减压干燥，制备出其中Boc-Cys-OH通过二硫键结合的肽(1.65g)。将所得的肽(0.53g)溶于三氟乙酸(5ml)中，所得溶液在室温下搅拌10分钟。减压蒸发三氟乙酸后，将残余物溶于乙腈-乙酸-水(10/10/90)的混合溶液(110ml)中，然后用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL、10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用5％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将5％的洗脱液2运行10分钟，将15％的洗脱液2运行15分钟，之后以0.1％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(300mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1292[M+1]+(理论值＝1291.5)
实施例2
式(5)的肽的合成：
所需的肽(104mg)是这样制备：将下文所述的制备2中制备的肽(500mg)与Boc-Cys(Npys)-OH(200mg)反应，然后在三氟乙酸中除去Boc基因，按类似于实施例1的方式进行HPLC纯化。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1260[M+1]+(理论值＝1259.5)
实施例3
式(8)的肽的合成：
将制备1中制备的肽(240mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(60mg)在二甲亚砜(6ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应混合物加入还原型谷胱甘肽(120mg)，然后在30℃下搅拌1小时。再向反应混合物加入还原型谷胱甘肽(60mg)和二甲亚砜(4ml)并搅拌30分钟后，向反应混合物加入乙腈(200ml)，然后过滤收集所产生的沉淀物，减压干燥，制备出粗肽(440mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙酸-水(10/10/90)的混合物(110ml)中，然后用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL，10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％的洗脱液2运行10分钟，将17％的洗脱液2运行15分钟，之后以0.05％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(107mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1477[M+1]+(理论值＝1477.5)
实施例4
式(9)的肽的合成：
将制备2中制备的肽(120mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(30mg)在二甲亚砜(3ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应混合物加入还原型谷胱甘肽(30mg)，接着在室温下搅拌30分钟，然后再向反应混合物加入水(1ml)和还原型谷胱甘肽(30mg)，接着搅拌20分钟。向反应混合物加入乙腈(100ml)后，过滤收集所产生的沉淀物，减压干燥，制备出粗肽(160mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙酸-水(5/5/45)的混合物(55ml)中，然后用HPLC进行纯化。
泵：LC-6A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A2cmΦX25cmL，10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：10ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％的洗脱液2运行10分钟，将17％的洗脱液2运行15分钟，之后以0.05％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(18mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1445[M+1]+(理论值＝1445.5)
实施例5
式(6)的肽的合成：
将制备1中制备的肽(240mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(60mg)在二甲亚砜(6ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应混合物加入硫代乙醇酸钠(100mg)，接着在30℃下搅拌30分钟，然后再向反应混合物加入硫代乙醇酸钠(50mg)、二甲亚砜(4ml)和水(2ml)，接着搅拌30分钟。向反应混合物加入乙腈(200ml)后，过滤收集所产生的沉淀物，减压干燥，制备出粗肽(305mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙酸-水(30/30/270)的混合物(330ml)中，接着进行过滤，然后将所得的滤液用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL，10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％的洗脱液2运行10分钟，将20％的洗脱液2运行15分钟，将将23％的洗脱液2运行15分钟，之后以0.05％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(15mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1263[M+1]+(理论值＝1262.5)
实施例6
式(7)的肽的合成：
将制备2中制备的肽(240mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(60mg)在二甲亚砜(6ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应混合物加入硫代乙醇酸钠(50mg)，接着在30℃下搅拌30分钟。另外，在再向反应中加入硫代乙醇酸钠(50mg)并在30℃下搅拌1小时后，向反应混合物加入乙腈(200ml)。过滤收集所产生的沉淀物，减压干燥，制备出粗肽(194mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙酸-水(10/20/90)的混合物(120ml)中，接着进行过滤，然后将所得的滤液用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL、10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％的洗脱液2运行10分钟，将18％的洗脱液2运行15分钟，之后以0.1％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(30mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1230[M+1]+(理论值＝1230.4)
实施例7
式(4)的肽的合成：
1.被保护肽树脂(Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂)的合成
将Fmoc-Leu-Alko-树脂(其中Alko为对-烷氧基苄醇)(10g)(0.74mmol/g，WatanabeChemicalIndustries，Ltd.)装入反应容器(500ml、TypeACT90固相合成仪、AdvancedChemTech)中，用DMF或类似溶剂洗涤一次(过程1)。然后用25％哌啶处理树脂(3分钟x1和15分钟x1)以切割Fmoc基团(过程2)，再用DMF或类似溶剂洗涤(过程6)以除去哌啶。向反应容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(13.25g)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)(3.4g)于NMP(N-甲基吡咯烷酮)(200ml)中的溶液。加入DIPCI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)(3.42ml)后，所得混合物在室温下搅拌60分钟(过程3)。然后，用NMP洗涤树脂(过程4)，用Fmoc-Asn(Trt)-OH(13.25g)、HOBT(3.4g)和DIPCI(3.42ml)再进行偶联反应(过程3)。洗涤树脂(过程6)后，将树脂在25％Ac2O(乙酸酐)中进行3分钟X1和15分钟X2搅拌，以使未反应的氨基基团封闭(cap)(过程5)。将树脂洗涤(过程6)，然后脱保护(过程2)，洗涤(过程6)，以制备H-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。用Fmoc-Met-OH(8.25g)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(13.56g)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(13.25g)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(11.69g)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(8.82g)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH(10.2g)和(Boc-Cys-OH)2(19.56g)按类似方式进行偶联反应，但如果偶联有困难的话要重复进行偶联三次。在位于N末端的(Boc-Cys-OH)2(N，N′-叔丁氧基羰基胱氨酸)被缩合后，进行洗涤(过程6)，然后用二乙醚(200ml)洗涤两次，减压干燥，制备出Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂(式(10)的肽-树脂)(22.87g)。以上合成过程总结于下表中。
[表1]
2.被保护肽树脂的脱保护
将三氟乙酸/乙二醇/H2O/三异丙基甲硅烷(94/2.5/2.5/1)的混合物(200ml)加到按照上述过程获得的被保护肽树脂(Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂(22.87g)，所得混合物在室温下搅拌4小时。反应产物过滤后，将滤液加到二乙醚(400ml)，同时在冰上冷却。用玻璃过滤器过滤收集所产生的沉淀物，然后用二乙醚洗涤，减压干燥，制备出粗肽(8.27g)。
3.粗肽的纯化
将所得的粗肽(2.76g)溶于20％乙酸水溶液(1400ml)和乙腈(35ml)的混合溶液中，过滤除去所产生的不溶性物质。所得的粗肽溶液用反相液相色谱进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A5cmΦX50cmL，15-30μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：60ml/min
检测：UV280nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％的洗脱液2运行30分钟，之后在120分钟时间里将洗脱液2的浓度增加到34％。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽：H-Cys(H-Cys-OH)-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH((4)的肽)(0.91g)。
试验实施例1
(小鼠的免疫(1))
用HLA-A2402/Kb转基因小鼠(参见WO02/47474及下文，该小鼠可称为HLA-A24小鼠)对实施例1-6制备的每种抗原肽的免疫原性进行评估。用每种肽免疫三只转基因小鼠，以评估免疫原性。
包含每种合成肽的药物组合物如下制备。将实施例1-3、5、6的每种合成肽在DMSO中调至40mg/ml。然后，将所得溶液(32.5μl)与注射用水(540μl)进行混合。然后用玻璃注射器将所得的溶液(550μl)与弗氏不完全佐剂(700μl)(MontanideISA51)进行混合，制备出油包水型乳液。将实施例4的肽在DMSO中调至50mg/ml，同时将合成的辅助肽(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE，SEQIDNo：5)在DMSO中调至20mg/ml。然后，将30μl的两种肽溶液与注射用水(540μl)混合，然后与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合，制备出油包水型乳液。
将所得的制剂(200μl)在尾根处皮内注射到HLA-A2402/Kb转基因小鼠中进行免疫。实验开始后7-8天，取出脾脏，在载玻片磨砂区域上磨碎，收集和制备脾细胞。将一部分的用ACK缓冲液(0.15MNH4Cl、10mMKHCO3、0.1mMEDTA、pH7.2-7.4)进行过溶血处理的脾细胞用免疫中使用的抗原肽(100μg/ml)脉冲1小时并接种到24-孔板(7X106个细胞/孔)中。同时，将没有用任何肽脉冲的脾细胞加在一起(7x105个细胞/孔)，在体外进行刺激，37℃下培养5-6天。体外刺激是在补充有10％FCS、10mMHEPES、20mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mMMEM非必需氨基酸、1％MEM维生素和55μM2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中进行。
再刺激开始后5-6天，按照常规方式进行细胞毒性活性试验。将通过用编码HLA-A2402/Kb的表达载体转化EL-4细胞(DAINIPPONPHARMACEUTICALCO.、LTD.、目录号06-039)获得的EL4-A2402/Kb细胞和用抗原肽WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)脉冲的EL4-A2402/Kb细胞用作靶细胞(T)。具体的说，将用WT1235-243(2M→Y)脉冲的细胞用于对实施例1、3和5的肽的评估，用WT1235-243脉冲的细胞用于对实施例2、4和6的肽的评估。给这些细胞标记上51Cr(1.85MBq/106个细胞)，以100μg/ml的速度用肽脉冲1小时(标记进行2小时，在标记开始1小时后加入肽)。进行51Cr释放测定(J.Immunol.，159：4753，1997)，以测定体外培养的脾细胞(E)对靶细胞(T)的细胞毒性活性。在本测定中，E/T比为80。
结果在图1-7中显示。图1-6分别对应于实施例1-6的肽化合物的细胞毒性活性。在各图中，纵轴显示细胞毒性活性(特异性裂解)，横轴显示三只小鼠每一只的结果。另外，实施例1的化合物的剂量依赖关系的结果在图7中显示。在该图中，纵轴显示细胞毒性活性(特异性裂解)，横轴显示所给予的各个剂量(600μg、200μg、60μg和20μg)。在该图中，每个剂量使用三只小鼠，显示了细胞毒性活性的平均值和标准偏差(S.D.)。发现所有的合成肽都具有CTL诱导活性即免疫原性，这从各图中明显得知。
试验实施例2
(小鼠的免疫(2))
将实施例1的肽在DMSO中调至40mg/ml。然后，将所得溶液(32.5μl)与注射用水(540μl)进行混合。然后用玻璃注射器将所得的溶液(550μl)与弗氏不完全佐剂(700μl)(MontanideISA51(注射商标))(SEPPIC，Inc，法国巴黎)进行混合，制备出油包水型乳液。
将所得的制剂(200μl)在尾根处皮内注射到HLA-A2402/Kb转基因小鼠中进行免疫。实验开始后7天，去除脾脏，按常规方式(WO02/47474)制备脾细胞。然后，用小鼠IFNγELISPOT试剂盒(酶联免疫斑点)(Fujisawa、目录号BD-551083)进行试验。试验是按照试剂盒附带的说明书进行。将脾细胞以5x105个细胞/孔接种，将含有实施例1的肽、野生型肽(WT1235-243)或衍自流感病毒的肽(ASNENMETM，不结合HLA-A24的阴性对照肽)的培养基以10-6M的初始浓度加入，然后用CO2培养箱在37℃下温育18小时。
按照所附带的说明书，将板洗涤，用KSElispotResearchSystem(CarlZeiss)检测斑点的数量。已知Elispot方法是细胞毒性活性试验的另选方法(J.ImmunologicalMethods，1995，181，45-54)。结果在图8中显示。结果发现，实施例1的肽能诱导HLA-A24特异性细胞介导免疫，该免疫与野生型肽发生交叉反应。
试验实施例3
(用人PBMC进行试验)
用肝素化真空血液收集管从HLA-A24阳性健康受试者获取外周血(50ml)。将用PBS(-)稀释两倍的血液覆盖在Ficoll-Paque(AmershamBiosciences)上(其量为血液量的一半)，然后以2000rpm离心20分钟。收集含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，向其中加入3-4倍数量的PBS(-)，然后以1800rpm离心10分钟。将细胞沉淀用PBS(-)洗涤两次，收集PMBC。
将PMBC悬浮于培养淋巴细胞用的培养基(RPMI1640∶AIMV＝1∶1，NEAA，10％FCS)中，在培养瓶中培养两小时，收集非黏附细胞。使用CD8+T细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotec)，在非黏附细胞当中收集CD8阳性T细胞。将黏附细胞在含有GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)的培养淋巴细胞用的培养基中培养7天。收集漂浮的细胞，作为含有树突细胞(DC)的抗原呈递细胞级分。将收集的细胞冷冻保藏，以备实验使用。
通过将细胞与肽在含有丝裂霉素(50μg/ml)的AIM-V培养基中温育1小时，将如上制备的DC级分用实施例1的肽(50μg/ml)脉冲。在用培养基洗涤三次后，再加入实施例1的肽(50μg/ml)脉冲1小时，制备出抗原呈递细胞。在第0天，将用肽脉冲的抗原呈递细胞加到CD8阳性T细胞以进行第一次刺激，用24孔板在含有IL-7(10ng/ml)的淋巴细胞培养用的培养基中开始细胞培养。在第7天，收集T细胞，洗涤后，按与第一次刺激相似的方式用肽脉冲的抗原呈递细胞进行肽刺激。在下一天(第8天)，加入IL-2，使得浓度为50U/ml。在第14天，收集T细胞，按与第一次或第二次刺激相似的方式进行第三次刺激。在下一天(第15天)，加入IL-2，使得浓度为50U/ml。在第21天，收集T细胞，冷冻保藏。
将第21天的T细胞的1X105个细胞加到用或没用每种肽(野生型肽(WT1235-243)、修饰肽(WT1235-243(2M→Y))或实施例1的肽)脉冲的VA13/A2402细胞的表达HLA-A2402的2X104个细胞，18小时后，收集上清液，用ELISA测定IFN-γ的量。
用实施例1的合成肽刺激的T细胞的肽特异性反应性的结果在图9中显示。用实施例1的合成肽刺激的T细胞不与没有用肽脉冲的细胞反应，但它们与用实施例1的肽脉冲的细胞充分反应。因此发现，对肽有特异性的T细胞得到诱导。另外，被诱导的对肽有特异性的T细胞既与用野生型肽(WT1235-243)脉冲的细胞反应，也与用修饰肽(WT1235-243(2M→Y))脉冲的细胞反应。
制备1
1.被保护肽树脂(H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂)的合成
将Fmoc-Leu-Alko-树脂(其中Alko为对-烷氧基苄醇)(10g)(0.82mmol/g，WatanabeChemicalIndustries，Ltd.)装入反应容器(500ml，TypeACT90固相合成仪，AdvancedChemTech)中，用DMF或类似溶剂洗涤一次(过程1)。然后用25％哌啶处理树脂(3分钟x1和15分钟x1)以切割Fmoc基团(过程2)，再用DMF或类似溶剂洗涤(过程1)以除去哌啶。向反应容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.46g)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)(6.28g)于NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的溶液(200ml)。加入DIPCI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)(6.3ml)后，所得混合物在室温下搅拌30分钟(过程3)。30分钟后，用NMP洗涤树脂(过程4)，用Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.46g)、HOBT(6.28g)和DIPCI(6.3ml)再次进行偶联反应(过程5)，以合成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。然后将所得的树脂通过过程2的脱保护转化成H-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。洗涤(过程1)后，依次加入Fmoc-Met-OH15.23g、Fmoc-Gln(Trt)-OH25.04g、Fmoc-Asn(Trt)-OH24.46g、Fmoc-Trp(Boc)-OH21.59g、Fmoc-Thr(tBu)-OH16.3g、Fmoc-Tyr(tBu)-OH18.84g和Fmoc-Cys(Trt)-OH24.01g，进行偶联反应(过程3)。在使用Fmoc-Thr(tBu)-OH进行的偶联反应中，反应重复三次，所得的树脂用DMF洗涤，用25％AC2O(乙酸酐)处理(15分钟x2)，将未反应的氨基基团封闭。在N末端Fmoc-Cys(Trt)-OH缩合后，进行脱保护(过程2)和洗涤(过程6)，获得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。以上合成过程总结于下表中。
[表2]
2.被保护肽树脂的脱保护
将三氟乙酸/乙二醇/H2O/三异丙基甲硅烷(94/2.5/2.5/1)的混合溶液(100ml)加到如上制备的被保护肽树脂(H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂)(10.0g)，所得混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物加到叔-丁基甲基醚(625ml)，同时在冰上进行冷却，将所得的混合物搅拌15分钟，然后用玻璃过滤器过滤，获得不溶性物质。将过滤器上的残余物用叔-丁基甲基醚(约100ml)洗涤五次后，将过滤器上的残余物用6M盐酸胍水溶液(1L)萃取，制备出粗肽溶液。
3.粗肽的纯化
所得的粗肽溶液用反相液相色谱进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A5cmΦX50cmL，15-30μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：60ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上，在50℃水浴中保持。
在10％的洗脱液2运行了30分钟后，将洗脱液2的浓度在40分钟时间里增加到20％，然后在360分钟时间里再增加到40％。
收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(SEQIDNo：2)(1.50g)。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，10小时
分析方法：茚三酮方法
Asx：1.96(2)Thr：1.05(1)Glx：1.06(1)Met：1.05(1)*Leu：(1)Tyr：0.87(1)
*)Leu＝标准氨基酸理论值在()中显示。
·质谱分析：LC-ESI/MSm/z＝1173[M+1]+(理论值＝1172.5)
氨基酸序列分析：对从N末端位置2处的Tyr到C末端处Leu的氨基酸残基进行了序列上的确认。
制备2
1.被保护肽树脂(H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂)的合成
将Fmoc-Leu-Alko-树脂(其中Alko为对-烷氧基苄醇)(10g)(0.81mmol/g，WatanabeChemicalIndustries，Ltd.)装入反应容器(500ml，TypeACT90固相合成仪，AdvancedChemTech)中，用DMF或类似溶剂洗涤一次(过程1)。然后用25％哌啶处理树脂(3分钟x1和15分钟x1)以切割Fmoc基团(过程2)，再用DMF或类似溶剂洗涤(过程1)以除去哌啶。向反应容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.17g)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)(6.2g)于NMP(N-甲基吡咯烷酮)(200ml)中的溶液。加入DIPCI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)(6.2ml)后，所得混合物在室温下搅拌30分钟(过程3)。30分钟后，用NMP洗涤树脂(过程4)，用Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.17g)、HOBT(6.2g)和DIPCI(6.2ml)再次进行偶联反应(过程5)，以合成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。然后将所得的树脂通过过程2的脱保护转化成H-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。洗涤(过程1)后，依次加入Fmoc-Met-OH15.05g、Fmoc-Gln(Trt)-OH24.73g、Fmoc-Asn(Trt)-OH24.17g、Fmoc-Trp(Boc)-OH21.33g、Fmoc-Thr(tBu)-OH16.1g、Fmoc-Met-OH15.05g和Fmoc-Cys(Trt)-OH23.72g，进行偶联反应(过程3)。在使用Fmoc-Thr(tBu)-OH进行的偶联反应中，反应重复三次，所得的树脂用DMF洗涤，用25％AC2O(乙酸酐)处理(15分钟x2)，将未反应的氨基基团封闭。在N末端Fmoc-Cys(Trt)-OH缩合后，进行脱保护(过程2)和洗涤(过程6)，获得H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。以上合成过程与制备1的表中所述的相同。
2.被保护肽树脂的脱保护
将三氟乙酸/乙二醇/H2O/三异丙基甲硅烷(94/2.5/2.5/1)的混合物(130ml)加到如上制备的被保护肽树脂(H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂)(13.0g)，所得混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物加到二乙醚(800ml)，同时在冰上进行冷却，将所得的混合物搅拌15分钟，然后用玻璃过滤器过滤，获得不溶性物质。将过滤器上的残余物用二乙醚(约100ml)洗涤五次后，将过滤器上的残余物用6M盐酸胍水溶液(1.3L)萃取，制备出粗肽溶液。
3.粗肽的纯化
所得的粗肽溶液用反相液相色谱进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A5cmΦX50cmL，15-30μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：60ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上，在50℃水浴中保持。在10％的洗脱液2运行了30分钟后，将洗脱液2的浓度在40分钟时间里增加到20％，然后在360分钟时间里再增加到40％。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽H-Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(SEQIDNo：1)(2.32g)。
氨基酸分析
水解4N甲磺酸，110℃，17小时
分析方法：茚三酮方法
Asx：1.87(2)Thr：0.93(1)Glx：0.95(1)Met：1.72(2)*Leu：(1)Trp：0.80(1)
*)Leu＝标准氨基酸理论值在()中显示。
质谱分析：LC-ESI/MSm/z＝1141[M+1]+(理论值＝1140.5)
氨基酸序列分析：对从N末端位置2处的Met到C末端处Leu的氨基酸残基进行了序列上的确认。
产业适用性
本发明的肽化合物可用作活性成分包含在癌症免疫疗法用的药物中。
序列表自由正文
SEQIDNo.1：肽衍生物
SEQIDNo.2：肽衍生物
SEQIDNo.3：肽衍生物
SEQIDNo.4：肽衍生物
SEQIDNo.5：辅助合成肽。

Claims (23)

1.式(1)的化合物：
其中X为酪氨酸残基或甲硫氨酸残基；Y和Z各自为单键，
R1为氢，
R2为羟基，
R3为氢、氨基或取代或未取代的烷基羰基氨基，
R4为羧基或式(2)的基团：
其中W为甘氨酸残基，
m为1，和
n为0或1的整数，条件是当n为0时，R3为氢，
或其药物可接受的盐。
2.权利要求1的化合物或其药物可接受的盐，
其中X为酪氨酸残基。
3.权利要求1的化合物或其药物可接受的盐，
其中X为甲硫氨酸残基。
4.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为氢。
5.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为氨基。
6.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为式(3')的基团：
7.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R4为羧基。
8.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R4为羧基甲基氨基甲酰基。
9.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为氨基和R4为羧基。
10.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为氢和R4为羧基。
11.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为式(3')的基团：
R4为羧基甲基氨基甲酰基。
12.权利要求1-3中任一项的化合物或其药物可接受的盐，
其中m为1，和n为1。
13.式(4)化合物
或其药学上可接受的盐。
14.式(5)化合物
或其药学上可接受的盐。
15.一种抗体，其特异性结合权利要求1-14中任一项的化合物或其药物可接受的盐。
16.一种抗原呈递细胞，其呈递权利要求1-14中任一项的化合物或其药物可接受的盐和HLA-A24抗原的复合物。
17.一种CTL，其由权利要求1-14中任一项的化合物或其药物可接受的盐诱导。
18.权利要求17的CTL，其识别权利要求1-14中任一项的化合物或其药物可接受的盐和HLA-A24抗原的复合物。
19.权利要求17的CTL，其识别SEQIDNo:1的肽和HLA-A24抗原的复合物。
20.一种药物组合物，包含权利要求1-14的化合物或其药物可接受的盐、权利要求16的抗原呈递细胞、或权利要求17-19中任一项的CTL，及药物可接受载体。
21.权利要求20的药物组合物，所述药物组合物用作癌症疫苗。
22.权利要求1-14中任一项的化合物或其药物可接受的盐、权利要求16的抗原呈递细胞、或权利要求17-19中任一项的CTL用于制备癌症疫苗的用途。
23.一种用于癌症免疫疗法的药物，包含权利要求1-14中任一项的化合物或其药物可接受的盐、权利要求16的抗原呈递细胞、或权利要求17-19中任一项的CTL作为活性成分。
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