BRPI0406800B1

BRPI0406800B1 - Dímero de peptídeo, composição farmacêutica contendo o mesmo e seu uso

Info

Publication number: BRPI0406800B1
Application number: BRPI0406800-9A
Authority: BR
Inventors: Haruo Sugiyama; Hideo Takasu; Fumio Samizo
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.; International Institute Of Cancer Immunology, Inc
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2020-08-11
Also published as: EP1584627B1; KR20120054644A; EP1584627A4; CN1756763B; JP4498274B2; EP2154145A2; US8242084B2; AU2004204031A1; WO2004063217A1; JPWO2004063217A1; KR101399678B1; BRPI0406800A8; US20060217297A1; ATE444969T1; EP2154145B1; EP1584627A1; BRPI0406800A; US20100292164A1; CA2513701C; JP4926231B2

Abstract

peptídio dimerizado, composição farmacêutica contendo o mesmo e seu uso a presente invenção refere-se a um novo peptídio antígeno de tumor e a vacina para câncer do mesmo, de modo específico um dímero de peptídio, no qual dois monômeros de peptídio que consistem em 7 a 30 aminoácidos que incluem, pelo menos um resíduo de cisteína e sendo capazes de produzir um peptídio antígeno de tumor estão ligados um com o outro através de uma ligação de dissulfeto.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se à terapia de vacina do câncer, de modo mais específico a um dímero de peptídeo que pode produzir um peptídeo antígeno de tumor tendo a atividade da indução das células T citotóxicas, e uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[0002] A imunização mediada por célula, de forma específica uma célula T citotóxica (a partir daqui denominada como "CTL") representa um papel significativo na rejeição in vivo de células de tumor ou de células infectadas por vírus. As CTL reconhecem um complexo entre um peptídeo de antígeno ("peptídeo de antígeno de tumor") derivado a partir de uma proteína antígeno de tumor e um antígeno de classe I do MHC (complexo principal de histocompatibilidade), que é referido como um "antígeno HLA" no caso de um ser humano, em uma célula de câncer, e ataca e mata a célula.

[0003] Os exemplos típicos de proteínas antígeno de tumor incluem aquelas relacionadas na Table of Immunity, Vol. 10: 281, 1999. Os exemplos específicos os antígenos de melanossomas tais como a proteína gp 100 específica de tecido de melanócito (J. Exp. Med. 179: 1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994) e a tirosinase (J. Exp. Med. 178: 489, 1993), e marcadores de tumores como outras proteínas antigênicas que não o melanoma tal como a HER2/neu (J. Exp. Med. 181: 2109, 1995), CEA (J. Natl. Câncer Inst. 87: 982, 1995) e PSA (J. Natl. Câncer Inst. 89: 293, 1997).

[0004] Um peptídeo antígeno de tumor é um peptídeo de e, torn de 8 a 11 aminoácidos, que pode ser produzido através deprocessamento intracelular de uma proteína antigênica de tumor por uma protease em células (Cur. Opin. Immunol., 5: 705, 1993; Cur. Opin. Immunol., 5: 719, 1993; Cell. 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995). Como descrito acima, o peptídeo antígeno de tumor produzido dessa forma, é apresentado na superfície de uma célula como um complexo com um antígeno MHC classe 1 (antígeno HLA) e reconhecido pelas CTL. Por consequência, para a finalidade de ser desenvolvido um agente imunoterapêutico para o câncer (vacina contra o câncer) que faz uso de destruição das células de tumor pelas CTL, é de elevada importância a identificação de um peptídeo antígeno de tumor em uma proteína antigênica de tumor, cujo peptídeo seja capaz de induzir as CTL de forma eficiente.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0005] Uma das finalidades da presente invenção é a de prover um novo antígeno de tumor derivado a partir de um peptídeo antígeno de tumor que possa ser utilizado in vivo.

[0006] Os presentes inventores descobriram que alguns peptídeos que tem sido demonstrados como sendo um peptídeo antígeno de tumor contém um resíduo ou resíduos de cisteína, e que um dímero, composto de tais peptídeos mostram de forma surpreendente uma atividade de indução das CTL ("atividade de indução das CTL") equivalente a do monômero, no evento da administração, e estabelecera, a presente invenção.

[0007] Dessa forma, a presente invenção engloba o que se segue. (1) Um dímero de peptídeo no qual dois monômeros de peptídeo, que consistem cada um em 7 a 30 aminoácidos, que incluem, pelo menos um resíduo de cisteína, e sendo capazes de produzir um peptídeo antígeno de tumor que tenha uma atividade de indução de CTL seja ligado um ao outro através de uma ligação ou de ligações de dissulfeto. (2) 0 dímero de peptídeo de acordo com (1) acima que pode produzir um peptídeo antígeno de tumor que tenha uma atividade de indução de CTL. (3) O dímero de peptídeo de acordo com (1) ou (2) acima, no qual os dois monômeros do peptídeo estejam ligados através de uma ou duas ligações de dissulfeto. (4) O dímero de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) até (3) acima, no qual os monômeros do peptídeo sejam derivados a partir de WT1 que é um produto da expressão de um gene supressor de tumor. (5) O dímero de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) até (4) acima, no qual os monômeros do peptídeo são como se segue: Cys Xaa Thr Trp Asn Gin Met Asn Xaa (SEQ ID NO: 72) em que Xaa na posição 2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir de Tyr, Phe, Met e Trp; e Xaa na posição 9 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir de Phe, Leu, He, Trp e Met. (6) O dímero de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) até (4) acima, no qual o monômero do peptídeo é selecionado a partir dos seguintes peptídeos: Cys Met Tht Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 11) Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe (SEQ ID NO: 18) Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr (SEQ ID NO: 19) Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu (SEQ ID NO: 20) Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (SEQ ID NO: 21) Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 22) Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu (SEQ ID NO: 23) Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 44) (7) Uma composição farmacêutica que compreende um dímero de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) até (6) acima, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. (8) A composição farmacêutica de acordo com (7) acima que é usada como uma vacina contra o câncer. (9) O uso de um dímero de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) até (6) acima na fabricação de uma vacina contra o câncer. (10) Um método para o tratamento ou para a prevenção de câncer, o qual compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dímero de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) até (6) acima a um paciente positivo para WT1 que esteja necessitando da mesma.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

[0008] A Figura 1 é um gráfico que demonstra que um dímero de peptídeo (SEQ ID NO: 44) induz as CTL em um camundongo transgênico.

MELHOR MANEIRA PARA A EXECUÇÃO DA INVENÇÃO

[0009] No dímero de peptídeo da presente invenção, dois monômeros do peptídeo são dimerizados através de uma ligação ou de ligações de dissulfeto entre grupos SH de pelo menos um par de resíduos de cisteína presentes nos monômeros do peptídeo.

[00010] O dímero de peptídeos da presente invenção tem uma atividade de indução das CTL e as CTL induzidas dessa forma podem exercer uma atividade antitumor através dos efeitos citotóxicos da produção de linfocinas. Por consequência, o dímero de peptídeos da presente invenção pode ser usado como uma vacina de câncer para o tratamento ou para a prevenção de cânceres (tumores).

[00011] O monômero de peptídeo que constitui o dímero de peptídeos da presente invenção consiste em 7 a 30 resíduos de aminoácidos que contem, pelo menos um resíduo de cisteína, e produz um peptídeo antígeno de tumor que tem uma atividade de indução das CTL. A frase "produz um peptídeo antígeno de tumor" significa que o monômero de peptídeo tem uma característica de tornar um peptídeo antígeno de tumor capaz de se ligar a um antígeno HLA e ser reconhecido pelas células T citotóxicas (CTL). Qualquer monômero de peptídeo pode ser usado na presente invenção sem limitação, contanto que ele tenha uma atividade de indução de CTL, no entanto, um monômero de peptídeo que seja derivado a partir do gene supressor de tumor WT1 do tumor de Wilms humano e que compreenda pelo menos um resíduo de cisteína é de preferência. O gene de supressão de tumor WT1 é expresso em diversos tipos de tumores (Cell, 60: 509, 1990; base de dados NCBI Número de Acesso XP_034418, SEQ ID NO: 1). O gene WT1 foi isolado a partir do cromossomo 11 p13 como um dos genes causadores dos tumores de Wilms com base na análise da síndrome de WAGR, da aniridia, anomalia urogenital, retardo mental, etc, que foi complicada pelos tumores de Wilms (Nature, 343: 774, 1990). O DNA genómico do WT1 é de cerca de 50 kb, e é composto por dez éxons, e dos quais o cDNA é de cerca de 3 kb. A sequência de aminoácidos deduzida a partir do cDNA como está mostrado na SEQ ID NO: 1 (Cell, 60: 509, 1990). O gene WT1 tem sido sugerido como o promotor do crescimento de células de leucemia a partir do fato de que o gene WT1 é altamente expresso na leucemia humana e que as células de leucemia são suprimidas no crescimento celular das mesmas através do tratamento com oligômeros antissenso de WT1 (JP-A- 104627/ 1997). Dessa forma o gene WT1 tem demonstrado ser uma nova proteína antigênica de tumor da leucemia e de cânceres sólidos (J. Immunol. 164: 1873 - 80, 2000 e J. Clin. Immunol. 20, 195 a 202, 2000) a partir dos fatos de que o gene WT1 também é expresso de forma elevada em cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer do cólon, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer embrionário, câncer da pele, câncer da bexiga urinária, câncer da próstata, câncer do útero, câncer cervical e câncer do ovário (JP-A- 104627/ 1997, WO 00/06602). Uma vez que a terapia de imunização do câncer (vacina do câncer) possa ser aplicada, de preferência, a tantos pacientes de câncer quanto possível, é de importância significativa a identificação dos peptídeos antígenos de tumor a partir do WT1 que são expressos de forma elevada em muitos tipos de cânceres, e desenvolver vacinas contra o câncer com a utilização dos peptídeos antígenos de tumor resultantes. Com relação a isso, diversos tipos de peptídeos antígenos de tumor naturais que consistem em fragmentos parciais de proteína WT1 estão descritos na WO 00/06602 e WO 00/ 18795; no entanto, nada é conhecido com relação aos efeitos in vivo dos mesmos.

[00012] Outros monômeros de peptídeo que podem ser usados na presente invenção incluem os peptídeos antígenos de tumor que contém pelo menos um resíduo de cisteína, que são derivados a partir de proteínas antigênicas de tumor relacionadas na Tabela de Imunização, vol. 10: 281, 1999.

[00013] A atividade de indução das CTL pode ser confirmada através da medição do número das CTL através do método de tratâmero HLA (Int. J. Cancer: 100, 565 a 570 (2002)) ou método de limitação de diluição (Nat. Med.: 4, 321 a 327 (1998)). De forma alternativa, por exemplo, no caso da indução de CTL restrita a HLA- A24, a atividade pode ser determinada com a utilização do modelo de camundongo HLA-A24 de acordo com o método descrito na WO 02/47474 ou no Int. J. Cancer: 100, 565 a 570 (2002).

[00014] O monômero de peptídeo consiste em 7 a 30, de preferência de 8 a 12, de mais preferência de 9 a 11 resíduos de aminoácidos. O monômero do peptídeo contém, de preferência 1 ou 2 resíduos de cisteína levando em conta ambos o motivo para a ligação com HLA e o comprimento do peptídeo.

[00015] O monômero do peptídeo pode ser sintetizado de acordo com um método usado de um modo geral no campo da química dos peptídeos. Esse método pode ser encontrado nas literaturas, incluindo Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966: The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985 e lakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa- soyoten, 1991.

[00016] Os monômeros de peptídeo resultantes podem ser permitidos formar uma ligação de dissulfeto intermolecular, de acordo com um método usado de forma geral na química dos peptídeos. O método para a formação de uma ligação de dissulfeto pode ser encontrado nas literaturas incluindo Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1976; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985 e lakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-soyoten, 1991.

[00017] De modo específico, um monômero de peptídeo que contém um resíduo de cisteína pode ser sintetizado através de, por exemplo, removendo todos os grupos de proteção incluindo aquele sobre a cadeia lateral da cisteína, e em seguida submetendo a solução de monômero resultante a oxidação pelo ar sob condições alcalinas, ou pela formação de uma ligação ou de ligações de dissulfeto através de um agente de oxidação com condições alcalinas ou ácidas. Os exemplos de agentes de oxidação incluem iodo, sulfóxido de dimetila (DMSO), ferrocianeto de potássio e os semelhantes.

[00018] Um peptídeo de monômero que contém dois ou mais resíduos de cisteína também pode ser sintetizado de acordo com o método descrito acima. Nesse caso, podem ser obtidos os isômeros que resultarem a partir das ligações de dissulfeto de maneiras de ligação diferentes. Um dímero de peptídeos no qual uma ligação de dissulfeto é formada entre os resíduos de cisteína pretendidos podemser preparados através da seleção de uma combinação específica de grupos de proteção para as cadeias laterais da cisteína. Os exemplos da combinação de grupos de proteção incluem os grupos de MeBz1 (metilbenzila) e de Acm (acetamidometila), TrT (tritila) e grupos Acm, Npis (3-nitro-2-piridiltio) e grupos Acm, C-Bu-t-(S-terc-butila) e grupos Acm e os semelhantes. Por exemplo, no caso de uma combinação de grupos MeBzl e Acm, a preparação pode ser executada através de um método que compreende a remoção de um grupo ou de grupos de proteção na cadeia lateral da cisteína, e submetendo a solução de monômero resultante a uma oxidação com ar para a formação de uma ligação ou de ligações de dissulfeto entre os resíduos de cisteína nãoprotegidos, seguida pela desproteção e da oxidação com iodo para a formação da ligação ou das ligações de dissulfeto entre os resíduos de cisteína protegidos por Acm.

[00019] O dímero de peptídeo resultante pode ser purificado de acordo com os processos usados de um modo geral no campo da química dos peptídeos. Esse método de purificação pode ser encontrado nas literaturas, incluindo a Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985 e Iakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-soyoten, 1991. Um método com a utilização de HPLC é o de preferência.

[00020] O dímero de peptídeo resultante da presente invenção exibe uma excelente estabilidade contra um agente de oxidação ou semelhante em solução e possui uma determinada qualidade e uma atividade de indução da CTL devido a ligação ou ligações de dissulfeto entre os resíduos de cisteína.

[00021] Os monômeros de peptídeo que podem ser usados na presente invenção estão ilustrados abaixo, tomando o WT1 como um exemplo. Na forma usada neste relatório, as abreviaturas de uma ou de três letras são usadas para encurtar os respectivos resíduos de aminoácidos. Ala(A): resíduo de alanina, Arg(R): resíduo de arginina, Asn(N): resíduo de asparagina, Asp(D): resíduos de ácido aspártico, Cys(C): resíduo de cisteína, Gln(Q): resíduo de glutsamina , Glu(E): resíduos de ácido glutãmico, Gly(G): resíduo de glicina, His(H): resíduo de histidina, lle(l) resíduo de interleucina, Leu(L): resíduo de leucina, Lys(K): resíduo de lisina, Met(M): resíduo de metionina, Phe(F): resíduo de fenilalanina, Pro(P): resíduo de prolina, Ser(S): resíduo de serina, Thr(T): resíduo de treonina, Trp(W): resíduo de triptofano. Tyr(Y): resíduo de tirosina, Val(V): resíduo de valina.

[00022] Nas Tabelas, o termo "posição" se refere a posição do peptídeo noWT1 humano. Tabela 1 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A1

Tabela 2 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A0201

Tabela 3 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A0205

Tabela 4 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A24

*: M na posição 236 na SEQ ID NO: 11 é alterado para Y Tabela 5 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A3

Tabela 6 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A68.1

Tabela 7 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A1101

Tabela 8 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A3101

Tabela 9 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-A3302

Tabela 10 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B14

Tabela 11 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B40

Tabela 12 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B60

Tabela 13 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B61

Tabela 14 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B62

Tabela 15 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B7

Tabela 16 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B8

Tabela 17 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B2702

Tabela 18 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B2705

Tabela 19 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B3501

Tabela 20 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B3701

Tabela 21 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B3801

Tabela 22 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B3901

Tabela 23 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B3902

Tabela 24 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B4403

Tabela 25 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B5101

Tabela 26 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B5102

Tabela 27 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B5201

Tabela 28 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-B5801

Tabela 29 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-CW0301

Tabela 30 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-CW0401

Tabela 31 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-CW0602

Tabela 32 Monômeros de peptídeo restritos a HLA-CW0702

[00023] É conhecido que existem muitos subtipos da molécula HLA e que a sequência de aminoácidos do peptídeo antígeno de tumor que se liga a esse subtipo obedece a uma regra determinada (motivo de ligação). O motivo de ligação para a HLA-A24 é sabido que em peptídeos que consistem em 8 a 11 resíduos de aminoácidos, o aminoácido na posição 2 é a tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), metionina (Met) ou triptofano (Trp), e o aminoácido no C-terminal é fenilalanina (Phe), leucina (Leu), isoleucina (lie), triptofano (Trp) ou metionina (Met) (J. Immunol., 152, p. 3913, 1994, Immunogenetics 41, pág. 178 (1995, J. Immunol., 155 pág. 4307, 1994). Por consequência, além dos monômeros de peptídeo na Tabela 4, um monômero de peptídeo da fórmula que se segue também pode ser usado de preferência como o monômero de peptídeo restrito a HLA-24. Cys Xaa Thr Trp Asn Gin Met Asn Xaa (SEQ ID NO: 72)

[00024] a qual Xaa na posição 2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir de Tyr, Phe, Met e Trp. e Xaa na posição 9 é umresíduo de aminoácido selecionado a partir de Phe, Leu, Ile, Trp e Met.

[00025] O motivo de ligação para HLA-A0201 é conhecido que, nos peptídeos que consistem em 8 a 11 resíduos de aminoácidos, o aminoácido na posição 2 é leucina (leu) ou metionina (Met) e o aminoácido no C-terminal é valina (Val) ou leucina (Leu). O motivo de ligação para HLA-A0201 é conhecido que, nos peptídeos que consistem em 8 a 11 resíduos de aminoácidos, o aminoácido na posição 2 é valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile) ou metionina (Met), e o aminoácido no C-terminal é leucina (Leu) (Immunogenetics 41, pág. 178 1995, J. Immunol., 155 pág. 4749, 1995). Por consequência, um peptídeo no qual o aminoácido na posição 2 ou no C-terminal de um monômero de peptídeo mostrado nas Tabelas 2 ou 3 acima é substituído por qualquer um motivo de aminoácido descritos acima, também pode ser usado de preferência como um monômero de peptídeo restrito a HLA-A0201- ou a HLA-A0205.

[00026] Os monômeros de peptídeo mostrado na Tabela 4 acima são de preferência especial para serem usados na presente invenção. Entre os peptídeos na Tabela 4 a SEQ ID NO: 44 é uma variante de peptídeo não-natural no qual a metionina na posição 236 da SEQ ID NO: 11 (posição 235 - 243) é alterada para tirosina. Por consequência, os monômeros de peptídeo da presente invenção incluem aqueles que tem uma sequência na qual um ou mais resíduos de aminoácido que não o resíduo de cisteína são alterados na sequência de peptídeos do tipo natural e que mostrem atividade de indução das CTL.

[00027] Como uma outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um dímero de peptídeo da presente invenção em conjunto com um veículo do mesmo aceitável de forma terapêutica. Embora a quantidade de um dímero de um peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo na composição farmacêutica possa variar dependendo da finalidade do tratamento, da idade, peso do paciente e semelhantes, ela é tipicamente de 0,0001 mg até 1000 mg, de preferência de 0,001 mg até 1000 mg, de mais preferência de 0,1 mg até 20 mg.

[00028] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender, como um ingrediente ativo um monômero de peptídeo em adição a um dímero de peptídeo da presente invenção. Não existe limitação a cerca do conteúdo de um "dímero de peptídeo" na composição farmacêutica da presente invenção sobre a condição de que a atividade de indução das CTL seja exercida; no entanto, ela pode ser de 50% ou mais, de preferência de 70 a 100%, e de mais preferência de 80 a 100% de todo o peptídeo. O teor de um dímero de peptídeo pode ser confirmado através de cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC).

[00029] Os veículos aceitáveis de forma farmacêutica são aqueles capazes de aumentar a imunização celular. Esses veículos incluem um adjuvante. Os exemplos de adjuvantes que podem ser aplicados na presente invenção incluem aqueles descritos em uma literatura (Clin. Microbiol. Ver., 7: 277 a 289, 1994), de forma específica, componentes derivados a partir de microrganismos, componentes de citocinas derivados a partir de vegetais, géis minerais, tais como o hidróxido de alumínio, liso lecitina, tensoativos tais como os polióis Pluronic ®, poliânion, peptídeo, emulsão de óleo (preparação de emulsão) e os semelhantes. Também o veículo inclui os componentes necessários para a preparação de preparações lisossômicas, preparações particuladas nas quais o ingrediente está ligado a contas que tenham um diâmetro de vários pm, preparações nas quais o ingrediente está fixado em lipídios e os semelhantes.

[00030] A administração pode ser conseguida, por exemplo, por via intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa. A via de preferência é a administração intradérmica ou subcutânea que induza as CTL de forma eficaz. A frequência ou o intervalo da administração pode ser ajustado de forma apropriada dependendo da doença a ser tratada ou prevenida, e da diferença individual; no entanto ela é executada de preferência mais do que uma vez em um intervalo de uma vez em vários dias até vários meses.

[00031] Por exemplo, quando a composição farmacêutica da presente invenção que compreende um dímero de peptídeo que consiste em monômeros de peptídeo derivados a partir de WT1 é administrada a um paciente positivo para WT1, o peptídeo é apresentado a um antígeno HLA de células de apresentação de antígeno para a formação de um complexo. As CTL específicas para o complexo de HLA apresentado são em seguida proliferadas e destroem as células de câncer, por meio do que o câncer podem ser tratado ou prevenido. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada para o tratamento ou para a prevenção de cânceres associados através no nível elevado de expressão do gene WT1 incluindo os cânceres do sangue tais como a leucemia, síndrome mieloplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cânceres sólidos tais como o câncer gástrico, câncer do cólon, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer embrionário, câncer hepático, câncer da pele, câncer da bexiga urinária, câncer da próstata, câncer do útero, câncer da cerviz, e câncer dos ovários.

[00032] Em outras modalidades, a presente invenção proporciona um método para o tratamento ou para a prevenção de cânceres através da administração da composição farmacêutica da presente invenção a um paciente WT1 positivo.

EXEMPLOS

[00033] A presente invenção é também ilustrada através dos exemplos que se seguem, porém não está limitada de qualquer maneira portais exemplos.

PREPARAÇÃO 1. 1. Síntese De resina de Peptídeo Protegida (H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)- Thr(tBu)- Trp(boc)- Asn(Trt)- Gln(Trt)- Met-Asn(Trt)- Leu- Alko- Resina).

[00034] A resina Fmoc-Leu-Alko (na qual Alko e o álcool de p- alcoxibenzilíco) (12 g) (0,81 mmol/ g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) foi carregada em um recipiente de reação (500 ml, Tipo ACT 90 sintetizador de fase sólida, Advanced Chem Tech) e lavado vez com DMF ou um semelhante (Processo I). A resina foi tratada em seguida com 25% Pip (piperidina) (3 minutos X 1, e 15 minutos X 1) para clivar o grupo Fmoc (Processo 2) e lavada de novo com DMF ou um semelhante (Processo 1) para a remoção do Pip. Foi adicionado ao recipiente de reação uma solução de Fmoc-Asn(Trt)-OH (29,36 g) e HOBT (1-hidroxibenzotriazol) (7,5 g) em NMP (N-metil pirrolidinona) (150 ml). Depois da adição de DIPCI (N,N'-diisopropilcarbodiimida) (7,6 ml), a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos (Processo 3). Trinta minutos mais tarde, a resina foi lavada com NMP (Processo 4) e submetida a reação de acoplamento uma vez com a utilização de Fmoc-Asn(Trt)-OH (29,36 g) e HOBT (7,5 g) (Processo 5) para sintetizar a resina Fmoc-Asn (Trt)-Leu-Alko. A resina resultante foi em seguida convertida para a resina H-Asn(Trt)-Leu- Alko, através da repetição da desproteção do Processo 2. Depois de lavagem (Processo 1) foram adicionados em série Fmoc-Met-H (18,27 g), Fmoc-GIn (Trt)-OH (30,04 g, Fmoc-Asn (Trt)-OH (20,36 g), Fmoc- Trp(Boc)-OH (25,91 g), Fmoc-Tht(tBu)-OH (19,56 g), Fmoc-Tyr(tBu)- OH (22,60 g) e Fmoc-Cys (TrT)-OH (28,82 g) para conduzir a reação de acoplamento (Processo 3), em que o acoplamento foi repetido três vezes com Fmoc-Thr(tBu)-OH. A resina resultante foi lavada com DMF e tratada com AC2O a 25% (anidrido acético) (15 minutos X 2) para 0 capeamento dos grupos amino não-tratados. Em seguida a condensação do Fmoc-Cys(Trt)-OH do N-terminal, foram realizadas a desproteção (processo 2) e a lavagem (Processo 6) para ser obtida a resina H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)- Thr(tBu)- Trp(boc)- Asn(Trt)- Gln(Trt)- Met- Asn(Trt)- Leu- Alko. O processo acima para a síntese está resumido na tabela 33. Tabela 33

2. Desproteção da Resina de Peptídeo Protegida

[00035] À resina de peptídeo protegida {H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)- Thr(tBu)- Trp(boc)- Asn(Trt)- Gln(Trt)- Met-Asn(Trt)- Leu- Alko} (14,06 g) obtida de acordo com os processos acima foram adicionados o Reagente K (5% de fenol/ 5% tioanisol/ 5% H2O/ 2,5% etanodiol/ solução de TFA 100 ml) e triisopropil silano (TIPS 15 ml) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2,5 horas. Depois da adição do éter de dietila (cerca de 500 ml), a mistura foi filtrada através de um filtro de vidro para a remoção do Reagente K e do éter de dietila como o filtrado. O resíduo no filtro foi lavado com éter de dietila (cerca de 100 ml, X 3) seguido pela adição de TFA (ca. 100 ml X 3) para ser obtido o filtrado (300 ml) que continha o produto objetivado. O filtrado foi concentrado para a remoção do TFA e liofilizado depois da adição de acetonitrila (cerca de 50 ml) e solução aquosa de ácido acético a 20% (cerca de 250 ml) para ser obtido um peptídeo em bruto (H-Cys - Tyr - Thr - Trp - Asn - Gin - Met - Asn - Leu- OH, SEQ ID NO: 44) (6,12 g) como um pó.

3. Purificação dom peptídeo em bruto.

[00036] O peptídeo em bruto resultante (749 mg) foi dissolvido em TFA (10 ml) e carregado sobre uma coluna ODS Cw ( 5 cm ψ x 50 cm comprimento, YMC, Co. Ltd.) de HPLC (Shimadzu; tipo LC8AD, equilibrada com solução 1 (= H2O/ 0,1% de TFA) com a utilização de uma bomba de HPLC. A coluna foi mantida durante cera de 30 minutos como estava, e em seguida a concentração da solução 2 (= CH3CN/ 0,1% TFA) foi aumentada a partir de 0% até 15% durante um período de tempo de 30 minutos. Em seguida, a concentração da solução 2 foi aumentada para até 28% durante um período de tempo de 330 minutos, enquanto 0 material decantado que continha 0 peptídeo objetivado era monitorado através de absorção de radiação UV a 220 nm para recolher as frações que continham 0 produto objetivado. As frações foram combinadas e injetadas dentro da coluna ODS C18 (4,6 mm ψ x 25 cm comprimento, YMC, Co. Ltd.) ligada a HPLC (Hitachi, tipo L-4000) e equilibrada com 17% de solução 2 (= CH3CN/ 0,1% TFA) em uma mistura de solução 1(= H2O/ 0,1% de TFA) e solução 2 (= CH3CN/ 0,1% TFA) e em seguida a concentração da solução 2 foi aumentada para até 47% durante um período de tempo de 30 minutos enquanto 0 material decantado era monitorado através de absorção de radiação UV a 220 nm para ser obtido o monômero do peptídeo objetivo purificado (227,5 mg) com um tempo de retenção de 14,79 minutos. Analise do aminoácido Hidrólise: 1% fenol/ 6N solução aquosa de ácido clorídrico 110° C, 10 horas Método analítico: método da ninhidrina Asx: 1,71(2) Thr:0,75 (1) Glx:1,07 (1) Met:0,91(1) *Leu:(1) Tyr: 0,82(1) * Leu = aminoácido de referência O valor entre parênteses (): valor teórico Espectrometria de massa: LC/MS N+ 1 = 1173,0 (valor teórico = 1172,36)

[00037] Sequenciamento do peptídeo: a sequência foi confirmada a partir do segundo resíduo (Tyr) a partir do N-terminal até o C-terminal, Leu, de forma sucessiva. EXEMPLO 1 Síntese de um Dímero da Fórmula:

[00038] A oxidação ao ar foi executada através da agitação e uma mistura de um monômero de peptídeo (227,5 mg) preparado na Preparação 1, N-metilglucamina (NMG) (227,5 mg) e água (23 ml) em temperatura ambiente durante cerca de 2 dias, A solução de reação foi adicionada uma solução aquosa de acetato de sódio (2 g) em água (5 ml), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos. Depois de adicionar água (200 ml) e acetonitrila (cerca de 200 ml), a mistura foi filtrada através de Kiriyama Roth (filtro de papel n° 5C) e o resíduo no filtro foi lavado com água (cerca de 50 ml X 3). O resíduo no filtro foi recolhido e liofilizado depois da adição de água (cerca de 200 ml) para ser obtido o produto em bruto do dímero de peptídeo objetivado (158 mg).

Purificação do Dímero de Peptídeo em Bruto.

[00039] O dímero de peptídeo em bruto (158 mg) foi dissolvido em DSMO (9 ml) e carregado sobre uma coluna ODS C18 ( 5 cm  x 50 cm comprimento, YMC, Co. Ltd.) de HPLC (Shimadzu; tipo LC8AD, equilibrada com solução 1 (= H2O/ 0,1% AcOH) com a utilização de uma bomba de HPLC. A coluna foi mantida durante cera de 30 minutos como estava, e em seguida a concentração da solução 2 (= CH3CN/ 1% AcOH) foi aumentada a partir de 0% até 40% durante um período de tempo de 360 minutos. Em seguida, as frações que continham o produto em objetivo foram coletadas por meio de um coletor de frações automático, enquanto o material decantado que continha o dímero de peptídeo objetivado era monitorado através de absorção de radiação UV a 220 nm. As frações foram combinadas e injetadas dentro da coluna ODS C1 8 (4,6 mm  x 25 cm comprimento, YMC, Co. Ltd.) ligada a HPLC (Hitachi, tipo L-4000) e equilibrada com 17% de solução 2 (= CH3CN/ 0,1% TFA) em uma mistura de solução 1(= H2O/ 0,1% de TFA) e solução 2 (= CH3CN/ 0,1% TFA). A concentração da solução 2 foi aumentada a partir de 0% até 47% durante um período de tempo de 30 minutos enquanto o material decantado era monitorado através de absorção de radiação UV a 220 nm durante o período de tempo de 30 minutos para ser obtido o dímero de peptídeo objetivo purificado (46,6 mg) com um tempo de retenção de 20,51 minutos. FAB. MS 2365,0 (valor teórico: 2342,70) Na+ F = 0,25%.

EXEMPLO DE TESTE 1 Indução das CTL com o Dímero de Peptídeo.

[00040] A atividade de indução das CTL do dímero de peptídeo preparado no Exemplo 1 foi avaliada com a utilização de camundongos transgênicos HLA-A24 (Int.J. Câncer: 100, 565, 2002).O dímero de peptídeo foi dissolvido em sulfóxido de dimetil (DMSO) para ser obtida uma solução de 40 mg/ ml de peptídeo. A solução de peptídeo, (35 pd) foi em seguida adicionada a 10 mM de solução compensadora de fosfato (pH 7,5) (581 pd) para ser obtida uma suspensão do peptídeo. A suspensão de peptídeo resultante (550 pl) e Montanide ISA51 (Seppic) (700 pl) foram misturadas com a utilização de uma seringa de vidro conectada para a preparação de uma emulsão como uma solução, para administração.

[00041] A solução, para administração (200 pl) foi injetada em um camundongo transgênico HLA-A24 por via subcutânea na base da cauda. Três camundongos foram usados. Sete dias depois da injeção, o baço foi removido e os esplenócitos foram preparados. Um a parte dos esplenócitos foi pulsada com o dímero de peptídeo (100 pg/ ml) durante uma hora. Os esplenócitos que não foram pulsados com o peptídeo foram semeados em uma placa de 24 cavidades a 7 X 106 células por cavidade e a elas foram adicionados os esplenócitos pulsados acima mencionados com o peptídeo (1 x 106 células por cavidade) e a placa foi incubada. A incubação foi conduzida em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FCS, 10 mM de HERPES, 20 ml de L-glutamina, 1 mM de piruvirato de sódio, 1 mM de aminoácidos não-essenciais MEM, 1% de vitamina MEN e 55 p M de 2-mercapto etanol durante 5 dias.

[00042] Os esplenócitos cultivados foram examinados com relação a atividade citotóxica específica com relação ao peptídeo usado na administração, através de análise de liberação de 51Cr (J. Immunol.; 159, 4753, 1997). As células EL4-A2402/Kb obtidas através da transformação das células EL-4 (ATCC N° TIB-39) de uma maneira tal que uma molécula quimera MHC classe I da HLA-A24 e H2Kb (Int. J. Câncer: 100, 565, 2002) que foram expressas de forma estável foram usadas como as células alvo. As células alvo foram marcadas com 51Cr (3,7 MBq/106 células) e pulsadas com o peptídeo a 100 pig por ml durante uma hora. Para o controle, as células alvo não-pulsadas com o peptídeo foram marcadas com 51Cr durante 2 horas. Aquelas células alvo marcadas e os esplenócitos preparados previamente foram misturados em uma proporção de 1:120, cultivadas durante 4 horas e a atividade CTL foi avaliada com base no percentual de células alvo danificadas. Os resultados estão mostrados na Figura 1. Os esplenócitos preparados a partir do camundongo injetado com o peptídeo danificaram fortemente as células alvo pulsadas com o peptídeo. No entanto, elas mostraram somente uma capacidade citotóxica fraca sobre as células alvo não-pulsadas com o peptídeo. Esses resultados mostram de forma clara que as CTL específicas com relação ao peptídeo foram induzidas.

APLICABIILIDADE INDUSTRIAL

[00043] De acordo com a presente invenção, são providos um dímero de peptídeo que tem uma atividade de indução das CTL in vivo, e composições farmacêuticas que compreendem o mesmo dímero de peptídeo como um ingrediente ativo. A presente invenção pode ser útil no melhoramento das condições de muitos pacientes de tumor.

Claims

1. Dímero de peptídeo, caracterizado pelo fato de que os dois monômeros de peptídeo são iguais e selecionados a partir dos seguintes peptídeos: Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 11) e Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 44).

2. Dímero de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dois monômeros de peptídeo são Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 11).

3. Dímero de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dois monômeros de peptídeo são Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 44).

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um dímero de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é usada como uma vacina contra o câncer.

6. Uso de um dímero de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma vacina contra o câncer.