JP4498274B2

JP4498274B2 - 二量体化ペプチド

Info

Publication number: JP4498274B2
Application number: JP2005508011A
Authority: JP
Inventors: 治夫杉山; 秀夫高須; 文雄三溝
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd; International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; International Institute of Cancer Immunology Inc; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2010-07-07
Anticipated expiration: 2024-01-15
Also published as: AU2004204031B2; KR20050098863A; HK1081975A1; BRPI0406800A8; ATE444969T1; WO2004063217A1; CN1756763B; EP1584627A1; EP1584627B1; CN101851275A; EP2154145B1; JP4926231B2; BRPI0406800A; DE602004023476D1; CN1756763A; US8242084B2; KR101399678B1; HK1141539A1; KR20120054644A; EP2154145A2

Description

本発明は、癌ワクチン療法の分野に属し、詳細には細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせるペプチド二量体およびそれを含有する医薬組成物に関する。

生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣ（ＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡ抗原と称する）とにより形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃・破壊する。
癌抗原タンパク質は、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．１０：２８１，１９９９の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、およびチロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）などのメラノソーム抗原、ならびにメラノーマ以外の癌抗原タンパク質としてＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、およびＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）などの癌マーカーがある。
癌抗原ペプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成される約８から１１個のアミノ酸から成るペプチドである（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：７０９，１９９３；Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：７１９，１９９３；Ｃｅｌｌ，８２：１３，１９９５；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４６：１６７，１９９５）。前記のように、この生成された癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）との複合体が細胞表面に提示され、ＣＴＬにより認識される。従って、ＣＴＬによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、ＣＴＬを効率良く誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質から同定することが、非常に重要となる。

本発明の目的は、イン・ビボにて有用な癌抗原ペプチドから誘導される新たな癌抗原を提供することにある。
本発明者らは、癌抗原ペプチドとして証明されているペプチドの中にはシステイン残基が含まれているものがあり、意外にもこのようなペプチドを二量体化させて投与すると単量体と同等のＣＴＬの誘導活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体；
（２）ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、上記（１）記載のペプチド二量体；
（３）２つのペプチド単量体が１または２個のジスルフィド結合により結合している、上記（１）または（２）記載のペプチド二量体；
（４）ペプチド単量体が癌抑制遺伝子産物ＷＴ１に由来する、上記（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド二量体；
（５）ペプチド単量体がＣｙｓＸａａＴｈｒＴｒｐＡｓｎＧｌｎＭｅｔＡｓｎＸａａ（配列番号：７２）（第２位のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＭｅｔおよびＴｒｐからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐおよびＭｅｔからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）である、上記（１）〜（４）のいずれか記載のペプチド二量体：
（６）ペプチド単量体がＣｙｓＭｅｔＴｈｒＴｒｐＡｓｎＧｌｎＭｅｔＡｓｎＬｅｕ（配列番号：１１）、ＡｓｐＰｈｅＬｙｓＡｓｐＣｙｓＧｌｕＡｒｇＡｒｇＰｈｅ（配列番号：１８）、ＡｌａＴｙｒＰｒｏＧｌｙＣｙｓＡｓｎＬｙｓＡｒｇＴｙｒ（配列番号：１９）、ＡｓｎＡｌａＰｒｏＴｙｒＬｅｕＰｒｏＳｅｒＣｙｓＬｅｕ（配列番号：２０）、ＧｌｙＣｙｓＡｓｎＬｙｓＡｒｇＴｙｒＰｈｅＬｙｓＬｅｕ（配列番号：２１）、ＡｒｇＴｒｐＰｒｏＳｅｒＣｙｓＧｌｎＬｙｓＬｙｓＰｈｅ（配列番号：２２）、ＡｓｐＳｅｒＣｙｓＴｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｎＡｌａＬｅｕ（配列番号：２３）およびＣｙｓＴｙｒＴｈｒＴｒｐＡｓｎＧｌｎＭｅｔＡｓｎＬｅｕ（配列番号：４４）からなる群より選ばれる、上記（１）〜（４）のいずれか記載のペプチド二量体；
（７）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物；
（８）癌ワクチンとして使用される、上記（７）に記載の医薬組成物；
（９）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体における、癌ワクチンを製造するための使用；および
（１０）癌を治療または予防するための方法であって、上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としているＷＴ１陽性の患者に投与する方法：
に関する。

図１は、トランスジェニックマウスにおけるペプチド二量体（配列番号：４４）によるＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。

本発明のペプチド二量体は、２つのペプチド単量体間における少なくとも１対のシステイン残基のＳＨ基間でのジスルフィド結合によって２つの単量体が相互に結合して二量体化している。
本発明のペプチド二量体はＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明の二量体は、癌の治療または予防のための癌ワクチンに使用することができる。
本発明のペプチド二量体を構成するペプチド単量体は、少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなり、そしてＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる。「癌抗原ペプチドを生じさせる」とは、ペプチド単量体がＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される癌抗原ペプチドを生じさせる、という特性を有する意味である。ペプチド単量体は、それ自身ＣＴＬ誘導活性を有している限り特に制限されるものではないが、多くの癌種で高発現しているヒトＷｉｌｍｓ癌の癌抑制遺伝子ＷＴ１（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０、ＮＣＢＩデータベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＸＰ＿０３４４１８、配列番号：１）に由来しかつシステイン残基を少なくとも１つ含有するものが好ましい。ＷＴ１遺伝子は、Ｗｉｌｍｓ癌、無紅彩、泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ癌の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離され（Ｎａｔｕｒｅ，３４３：７７４，１９９０）、そのゲノムＤＮＡは約５０ｋｂであり１０のエキソンから成り、そしてそのｃＤＮＡは約３ｋｂである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０）。ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平９−１０４６２７号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特開平９−１０４６２７号公報および国際公開第００／０６６０２号パンフレット）、白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１８７３−８０，２０００およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，１９５−２０２，２０００）。癌免疫療法（癌ワクチン）は多くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、多くの癌種で高発現しているＷＴ１における癌抗原ペプチドの同定、および当該癌抗原ペプチドを利用した癌ワクチンの開発は重要である。これに関し、国際公開第００／０６６０２号パンフレットおよび国際公開第００／１８７９５号パンフレットには、ＷＴ１タンパク質の部分から成る幾つかの天然型の癌抗原ペプチドが記載されているが、イン・ビボでの効果は知られていない。
本発明に用いられる他のペプチド単量体としては、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．１０：２８１，１９９９の表中に記載の癌抗原タンパク質由来の癌抗原ペプチドでありかつシステイン残基を少なくとも１つ含有するものが挙げられる。
ＣＴＬ誘導活性は、ＨＬＡテトラマー法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２））または限界希釈法（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．：４，３２１−３２７（１９９８））によりＣＴＬの数を測定することにより確認することができる。あるいは、例えばＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性の場合、国際公開第０２／４７４７４号パンフレットおよびＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることなどにより調べることができる。
ペプチド単量体のアミノ酸残基の個数は７〜３０個であるが、８〜１２個が好ましく、９〜１１個がより好ましい。ペプチド単量体中のシステイン残基の数は、ＨＬＡとの結合モチーフとペプチドの長さとを考慮し、１または２個であることが好ましい。
ペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
得られたペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて分子間でジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合の形成方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
具体的には、ペプチド単量体に含まれるシステイン残基が１個の場合、システイン側鎖の保護基を含むすべての保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液をアルカリ条件下で空気酸化反応に付す方法、あるいは、アルカリ性または酸性条件下酸化剤を添加してジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。ここで、酸化剤としては、ヨウ素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、フェリシアン化カリウムなどが挙げられる。
システイン残基が２個以上の場合も、前記と同様の方法を用いることができる。この場合はジスルフィド結合様式が異なる異性体が得られる。システイン側鎖の保護基を特定の組み合わせにすることにより、目的のシステイン残基間でジスルフィド結合を形成した二量体を得ることができる。前記保護基の組み合わせとしては、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基とＡｃｍ（アセトアミドメチル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基とＡｃｍ基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルチオ）基とＡｃｍ基、Ｓ−Ｂｕ−ｔ（Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル）基とＡｃｍ基などが挙げられる。例えばＭｅＢｚｌ基とＡｃｍ基の組み合わせの場合、まずＭｅＢｚｌ基とシステイン側鎖以外のその他の保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液を空気酸化反応に付して脱保護されたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成し、次いでヨウ素による脱保護および酸化を行ってＡｃｍ基で保護されていたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。
得られたペプチド二量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて精製することができる。ペプチド二量体の精製方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されているが、ＨＰＬＣが好ましい。
このようにして得られた本発明のペプチド二量体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成していることにより、溶液中での酸化剤等に対する安定性に優れており、医薬品原料として一定の品質とＣＴＬの誘導活性を保持するものである。
本発明に用いられるペプチド単量体の好ましい具体例としてＷＴ１を例に以下に示す。なお、本明細書においてアミノ酸残基を略号で表示する場合、次の３文字表記または１文字表記を用いる：
Ａｌａ（Ａ）：アラニン残基、Ａｒｇ（Ｒ）：アルギニン残基、Ａｓｎ（Ｎ）：アスパラギン残基、Ａｓｐ（Ｄ）：アスパラギン酸残基、Ｃｙｓ（Ｃ）：システイン残基、Ｇｌｎ（Ｑ）：グルタミン残基、Ｇｌｕ（Ｅ）：グルタミン酸残基、Ｇｌｙ（Ｇ）：グリシン残基、Ｈｉｓ（Ｈ）：ヒスチジン残基、Ｉｌｅ（Ｉ）：イソロイシン残基、Ｌｅｕ（Ｌ）：ロイシン残基、Ｌｙｓ（Ｋ）：リジン残基、Ｍｅｔ（Ｍ）：メチオニン残基、Ｐｈｅ（Ｆ）：フェニルアラニン残基、Ｐｒｏ（Ｐ）：プロリン残基、Ｓｅｒ（Ｓ）：セリン残基、Ｔｈｒ（Ｔ）：トレオニン残基、Ｔｒｐ（Ｗ）：トリプトファン残基、Ｔｙｒ（Ｙ）：チロシン残基、Ｖａｌ（Ｖ）：バリン残基。
表中、「位置」とは配列番号１に記載のヒトＷＴ１におけるペプチドの位置を示す。

ＨＬＡ分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフとして、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）となることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，ｐ３９１３，１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，ｐ４３０７，１９９４）。従って、上記表４に示すペプチド単量体に加え、ペプチド単量体がＣｙｓＸａａＴｈｒＴｒｐＡｓｎＧｌｎＭｅｔＡｓｎＸａａ（配列番号：７２）（第２位のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＭｅｔおよびＴｒｐからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐおよびＭｅｔからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）であるペプチドも、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。
またＨＬＡ−Ａ０２０１の結合モチーフとして、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）またはロイシン（Ｌｅｕ）となることが知られている。ＨＬＡ−Ａ０２０５の結合モチーフとして、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）となることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：ｐ４７４９，１９９５）。従って、上記表２または３に示すペプチド単量体の第２位のアミノ酸またはＣ末端のアミノ酸を上記モチーフのいずれかに置換したペプチドもＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ０２０５拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。
上記表４に示すペプチド単量体が本発明においては特に好適に用いられる。表４中、配列番号：４４のペプチドは、配列番号：１１（２３５〜２４３位）のアミノ酸配列において２３６位のメチオニンをチロシンに改変した非天然の改変型ペプチドである。よって、本発明におけるペプチド単量体には、天然型ペプチド中のシステイン残基以外の残基を一部改変したペプチドであって、ＣＴＬの誘導活性を有するペプチドも含まれる。
本発明は別の態様として、本発明のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物中の有効成分であるペプチド二量体の量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜２０ｍｇである。
本発明医薬組成物には有効成分として、本発明ペプチド二量体だけでなく、ペプチド単量体を含むことができる。本発明医薬組成物中に含まれる「ペプチド二量体」の割合は、ＣＴＬの誘導活性をもたらす限り特に制限されるものではないが、全ペプチド中５０％以上であり、７０〜１００％が好ましく、８０〜１００％がより好ましい。ペプチド二量体の割合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認することができる。
製薬的に許容されうる担体は、細胞性免疫を増強する作用を有するものである。当該担体としては、例えばアジュバントが挙げられる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニウム如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などの製剤化に必要な成分も担体に含まれる。
本発明医薬組成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。ＣＴＬを効率よく誘導する皮内投与や皮下投与が好ましい。投与回数および投与間隔は、治療または予防目的の疾患、患者の個体差により適宜調整することができるが、通常複数回であり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
例えば、ＷＴＩ由来のペプチド単量体から構成されるペプチド二量体を含有する本発明医薬組成物をＷＴＩ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原にペプチドが提示され、提示されたＨＬＡ抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の医薬組成物は、ＷＴＩ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
本発明はさらに別の態様として、本発明の医薬組成物をＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
製造例１
１．保護ペプチド樹脂（Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−Ｒｅｓｉｎの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−樹脂（ここに、Ａｌｋｏはｐ−アルコキシベンジルアルコール）１２ｇ（渡辺化学製；０．８１ｍｍｏｌ／ｇ）をＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ社製ＡＣＴ９０型固相合成機の５００ｍｌ反応槽内に入れ、一旦この樹脂をＤＭＦ等で洗浄後（工程１）、２５％Ｐｉｐ（ピペリジン）で処理（３分×１回及び１５分×１回）してＦｍｏｃ基を切断後（工程２）、再びＤＭＦ等で樹脂を洗浄し（工程１）、Ｐｉｐを除去した。この反応槽内に、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ２９．３６ｇとＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）７．５ｇをＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）１５０ｍｌに溶解した溶液を加え、更にＤＩＰＣＩ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）７．６ｍｌを加えて３０分間室温撹拌を行った（工程３）。３０分後、ＮＭＰで樹脂を洗浄し（工程４）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ２９．３６ｇとＨＯＢＴ７．５ｇを用いて再度カップリング反応を行い（工程５）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ樹脂を合成した。その後、工程２の脱保護操作を行い、Ｈ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−樹脂とした。次いで、工程１の洗浄操作を行い、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ１８．２７ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ３０．０４ｇ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ２９．３６ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ２５．９１ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ１９．５６ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ２２．６０ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ２８．８２ｇを順次加え、工程３のカップリング反応を行った。但しＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨについてはカップリングを３回繰り返して行った後、得られた樹脂をＤＭＰで洗浄後、２５％ＡＣ_２Ｏ（無水酢酸）で１５分×２回で未反応のアミノ基をキャッピングした。Ｎ末端のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合後、工程２の脱保護操作を行い、工程６の洗浄操作を実施し、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−Ｒｅｓｉｎを得た。上記合成工程の概要を表３３に示す。

２．保護ペプチド樹脂の脱保護
上記操作によって得られた保護ペプチド樹脂（Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−Ｒｅｓｉｎ１４．０６ｇにＲｅａｇｅｎｔＫ（５％フェノール／５％チオアニソール／５％Ｈ_２Ｏ／２．５％エタンジチオール／ＴＦＡ溶液）１００ｍｌとトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）１５ｍｌを加え、室温で２．５時間攪拌した。その後、ジエチルエーテル約５００ｍｌを加え、グラスフィルターで濾過を行い、ＲｅａｇｅｎｔＫとジエチルエーテルを濾液として除いた。濾上物を約１００ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄し、洗浄後の濾上物に約１００ｍｌのＴＦＡを加える操作を３回繰り返して行い、目的物を含む濾液を約３００ｍｌ得た。この濾液を濃縮してＴＦＡを除き、アセトニトリル約５０ｍｌと２０％酢酸水約２５０ｍｌ加え凍結乾燥し、パウダー状の粗ペプチド（Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ、配列番号：４４）６．１２ｇを得た。
３．粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド７４９ｍｇをＴＦＡ１０ｍｌに溶解し、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ製；ＬＣ８ＡＤ型）１液＝Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡで平衡化しているＹＭＣ社製ＯＤＳＣ_１８５ｃｍΦ×５０ｃｍＬのカラムにＨＰＬＣのポンプでチャージした。その状態で約３０分間保ち、３０分後、２液＝ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡの濃度を３０分間で０％から１５％迄上昇した。その後、更に３３０分かけて２８％まで２液の濃度を上昇させ、目的とするペプチドの溶出液を２２０ｎｍのＵＶでモニターしながら、目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、ＹＭＣ社製ＯＤＳＣ_１８４．６ｍｍΦ×２５ｃｍＬカラムをセットしたＨＰＬＣ（日立製Ｌ−４０００型）で１液＝Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡと２液＝ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡの溶出液で、２液＝ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡの濃度を１７％で平衡化しているカラムに注入し、２２０ｎｍのＵＶでモニターしながら２液の濃度４７％まで３０分間で上昇させ、保持時間１４．７９分の目的ペプチド単量体の精製品２２７．５ｍｇを得た。
・アミノ酸分析
加水分解：１％フェノール／６Ｎ塩酸水、１１０℃ １０時間
分析法：ニンヒドリン法
Ａｓｘ：１．７１（２）Ｔｈｒ：０．７５（１）Ｇｌｘ：１．０７（１）Ｍｅｔ：０．９１（１）^＊Ｌｅｕ：（１）Ｔｙｒ：０．８２（１）
^＊）Ｌｅｕ＝基準アミノ酸（）内理論値
・質量分析：ＬＣ／ＭＳＭ^＋１＝１１７３．０（理論値＝１１７２．３６）
・アミノ酸配列分析：Ｎ末２残基目Ｔｙｒから、Ｃ末Ｌｅｕまで順次確認した。

次式で示される二量体の合成：

製造例１により得られたペプチド単量体２２７．５ｍｇ、Ｎ−メチルグルカミン（ＮＭＧ）２２７．５ｍｇ、水２３ｍｌを加え室温で約２日間攪拌することにより、空気酸化を行った。その後、反応液中に酢酸ナトリウム２ｇを水５ｍｌに溶解した水溶液を加え約２０分間室温攪拌を行い、更に水２００ｍｌとアセトニトリル約２００ｍｌを加えた後、桐山ロート（ろ紙Ｎｏ５Ｃ）で濾過し、濾上物を水（約５０ｍｌ×３回）で洗浄した。濾上物を濾取し、水約２００ｍｌを加えて凍結乾燥を行い、目的とする粗ペプチド二量体１５８ｍｇを得た。
粗ペプチド二量体の精製
粗ペプチド二量体１５８ｍｇをＤＭＳＯ９ｍｌに溶解し、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ製；ＬＣ８ＡＤ型）に１液＝Ｈ_２Ｏ／１％ＡｃＯＨで平衡化しているＹＭＣ社製ＯＤＳＣ_１８５ｃｍΦ×５０ｃｍＬのカラムにＨＰＬＣのポンプでチャージした。その状態で約３０分間保ち、３０分後、２液＝ＣＨ_３ＣＮ／１％ＡｃＯＨの濃度を３６０分間で０％から４０％迄上昇した。その後、目的とする二量体の溶出液を２２０ｎｍのＵＶでモニターしながら、自動分画装置により目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、ＹＭＣ社製ＯＤＳＣ_１８４．６ｍｍΦ×２５ｃｍＬカラムをセットしたＨＰＬＣ（日立製Ｌ−４０００型）で１液＝Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡと２液＝ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡの溶出液で、２液＝ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡの濃度を１７％で平衡化しているカラムに注入し、２２０ｎｍのＵＶでモニターしながら２液の濃度を０％から４７％まで３０分で上昇させ、保持時間２０．５１分の目的とするペプチド二量体精製品４６．６ｍｇを得た。
ＦＡＢ．ＭＳ２３６５．０（理論値２３４２．７０）Ｎａ^＋Ｆ＝０．２５％
試験例１
ペプチド二量体によるＣＴＬ誘導
実施例１にて調製したペプチド二量体のＣＴＬ誘導能をＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウス（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５，２００２）を用いて評価した。ペプチド二量体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、４０ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を作製した。このペプチド溶液３５μｌを５８１μｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加してペプチド懸濁液を調製した。このペプチド懸濁液５５０μｌとＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ５１（Ｓｅｐｐｉｃ社）７００μｌを連結したガラスシリンジを用いて混合し、エマルションを作製して投与液を調製した。
投与液２００μｌをＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは３匹用いた。投与７日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を１００μｇ／ｍｌのペプチド二量体で１時間パルスした。ペプチドをパルスしていない脾細胞を２４穴プレートに７×１０^６個／ｗｅｌｌで播種し、更に上記のペプチドをパルスした脾細胞を１×１０^６個／ｗｅｌｌ添加して培養した。培養液には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２０ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ２−メルカプトエタノールを含ませ、５日間培養した。
培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的なＣＴＬの活性を^５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：１５９，４７５３，１９９７）により測定した。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２４とＨ−２Ｋ^ｂのキメラのＭＨＣクラスＩ分子（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５，２００２）を安定的に発現するようにマウスリンパ腫由来細胞株ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ株番号ＴＩＢ−３９）に遺伝子導入して作製した細胞株ＥＬ−４−Ａ２４０２／Ｋ^ｂを用いた。標的細胞は３．７Ｍｂｑ／１０^６個で^５１Ｃｒラベル後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍｌになるように添加して更に１時間パルスした。またペプチド非パルスの標的細胞を２時間^５１Ｃｒラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を１：１２０の割合で混合して４時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合よりＣＴＬ活性を求めた。結果を図１に示した。前記ペプチドを投与したマウスより調製した脾細胞は、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。

本発明により、インビボにおいてＣＴＬ誘導活性を有するペプチド二量体およびそれを有効成分として含有する医薬組成物が提供される。本発明は、多くの癌患者の病態の改善に有効であると考えられる。

Claims

２つのCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：４４）が相互にジスルフィド結合により結合している、ペプチド二量体。