WO2005095598A1 - Ｗｔ１由来の癌抗原ペプチド - Google Patents

Ｗｔ１由来の癌抗原ペプチド Download PDF

Info

Publication number
WO2005095598A1
WO2005095598A1 PCT/JP2005/006113 JP2005006113W WO2005095598A1 WO 2005095598 A1 WO2005095598 A1 WO 2005095598A1 JP 2005006113 W JP2005006113 W JP 2005006113W WO 2005095598 A1 WO2005095598 A1 WO 2005095598A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
seq
hla
antigen
cancer
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/006113
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Haruo Sugiyama
Original Assignee
International Institute Of Cancer Immunology, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by International Institute Of Cancer Immunology, Inc. filed Critical International Institute Of Cancer Immunology, Inc.
Priority to US10/594,507 priority Critical patent/US7622119B2/en
Priority to EP05727848A priority patent/EP1731605B1/en
Priority to DK05727848.3T priority patent/DK1731605T3/da
Priority to JP2006511744A priority patent/JP4886507B2/ja
Priority to AT05727848T priority patent/ATE462003T1/de
Priority to DE602005020121T priority patent/DE602005020121D1/de
Priority to SI200530954T priority patent/SI1731605T1/sl
Priority to PL05727848T priority patent/PL1731605T3/pl
Publication of WO2005095598A1 publication Critical patent/WO2005095598A1/ja
Priority to US12/554,151 priority patent/US8388975B2/en
Priority to US13/748,984 priority patent/US20130196427A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464452—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/464453—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a cancer antigen peptide derived from WT1 and use thereof.
  • the WT1 gene (Wilms' tumor gene 1) has been identified as one of the causative genes of Wilms tumor, a childhood renal tumor (Cell, 60: p509, 1990, Nature, 343: p774, 1990) ).
  • the WT1 gene encodes the transcription factor WT1, and WT1 plays an important role in cell growth, sorting, apoptosis and organ formation (Int. Rev. CytoL, 181: pl51, 1998).
  • the WT1 gene was positioned as a tumor suppressor gene. In subsequent studies, expression was observed in various solid cancers including leukemia, lung cancer and breast cancer, but rather, it acts as an oncogene that promotes cancer growth. It was shown that.
  • peptide-specific cytotoxic T cells can be stimulated in vitro by stimulating HLA-A * 0201-positive or HLA-A * 2402-positive peripheral blood mononuclear cells with specific peptides derived from WT1. These CTLs have been shown to injure leukemia and solid cancer cancer cells that endogenously express WT1. These results, WT1 it became bright et force a promising target molecule of cancer immunotherapy (cancer vaccine therapy) (Int J. HematoL, 76: . Pl27, 2002) 0 However, the WT1 is HLA It has not yet been clarified whether or not it has a cancer antigen peptide part capable of binding to the -A26 antigen, and no such peptide has been reported.
  • HLA-A * 0201 antigen which is one of HLA-A2 antigens
  • the binding sequence to the antigen has been estimated (WO 00/18795)
  • Very few cancer antigen peptides have been confirmed to be effective (WO 00/06602, WO 00/026249).
  • An object of the present invention is to provide a cancer antigen peptide derived from WT1, use of the peptide as a CTL inducer, and the like. Means for solving the problem
  • the present inventor has intensively investigated the identification of a novel cancer antigen peptide derived from WT1.
  • HLA-A26-restricted CTL was induced. That is, for the first time, it was found that WT1 has a cancer antigen peptide portion that binds to the HLA-A26 antigen and is recognized by CTL among the many HLA antigen subclasses. This finding has enabled a new cancer therapy that can induce WT1-specific CTL in HLA-A26 positive cancer patients.
  • the present inventor has the activity as a cancer antigen peptide in which the peptide described in SEQ ID NO: 3, which has not been known to have a conventional effect, binds to the HLA-A * 0201 antigen and is recognized by CTL. I found this for the first time.
  • the above-described cancer antigen peptide derived from WT1 of the present invention, a polynucleotide encoding the peptide, and the like can be used effectively as a CTL inducer, that is, a cancer vaccine.
  • the cancer antigen peptide of the present invention can also be used effectively as a component of a reagent for detecting WT1-specific CTL. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention relates to
  • HLA-A26-binding cancer antigen peptide derived from the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1, preferably (2) to (4) V, any of the peptides described above and HLA-A26 antigen CTL, which recognizes the complex of
  • HLA-A26-binding cancer antigen peptide derived from the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1, preferably the above-mentioned (2) to (4) V, any of the peptides described above and HLA-A26 antigen HLA monomer containing, HLA dimer, HLA tetramer or HLA pentamer,
  • a pharmaceutical composition comprising any one selected from the group consisting of: a pharmaceutically acceptable carrier;
  • a reagent for detecting CTL specific for HLA-A * 0201-binding cancer antigen peptide derived from WT1, comprising the HLA monomer, HLA dimer, HLA tetramer or HLA pentamer as described in (21) above , Regarding.
  • the present invention provides a cancer antigen peptide derived from WT1, a polynucleotide encoding the peptide, an inducer of CTL containing these peptides and polynucleotides, and the like.
  • the CTL inducer of the present invention is useful as a cancer vaccine.
  • the cancer vaccine of the present invention is applicable to many cancer patients who are HLA-A26 positive or HLA-A * 0201 positive.
  • the present invention provides a peptide having activity as an HLA-A26 binding cancer antigen peptide derived from the amino acid sequence of human WT1 set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1 is a known sequence described in Cell 60: 509, 1990, NCBI database Accession No. XP — 034418 and Accession No. P19544.
  • the amino acid sequence of the human WT1 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Known HLA-A26 antigens include HLA-A * 2601, HLA-A * 2602, and HLA-A * 2603.
  • the HLA-A26 antigen in the present invention is preferably HLA-A * 2601.
  • the HLA-A26 antigen is an HLA antigen possessed by about 20% of Japanese!
  • the present invention has been completed for the first time by finding that a cancer antigen peptide portion that binds to the HLA-A26 antigen and is recognized by CTL is present in the amino acid sequence of WT1.
  • “having activity as an HLA-A26 binding cancer antigen peptide” Means that it binds to HLA-A26 antigen and has an activity recognized by cytotoxic T cells (CTLs), and "induces CTL by binding to HLA-A26 antigen (has CTL-inducing activity)” , And “activate CTL by binding to HLA-A26 antigen (having CTL activation activity)”.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • the “peptide derived from the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1 and having activity as a HLA-A26-binding cancer antigen peptide” of the present invention is described in SEQ ID NO: 1.
  • CTL cytotoxic T cells
  • the cancer antigen peptide in the present invention is a peptide having a part of the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1 and having activity as an HLA-A26 (HLA-A26 antigen) -binding cancer antigen peptide. Any peptide may be used.
  • the length is preferably 8-11 amino acids, more preferably 9-10 amino acids.
  • the peptide having activity as a cancer antigen peptide of the present invention has a possibility of adding several to a plurality of amino acid residues at the N-terminus or C-terminus of this cancer antigen peptide,
  • the length of the whole peptide is usually 8 to 100 amino acids that are continuous, preferably 8 to 50 amino acids, and more preferably 8 to 30 amino acids.
  • the cancer antigen peptide of the present invention synthesizes a partial peptide (candidate peptide) having a strength of 8 to 11 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the peptide strength SHLA-A26 binding cancer antigen. It can be identified by assessing whether or not it has the activity as a peptide.
  • the synthesis of the peptide can be carried out according to a method used in ordinary peptide chemistry.
  • Examples of the synthesis method include literature (Peptide synthesis; Interscience, New York, 196; 1 ⁇ ⁇ Proynes, i, he Proteins;, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Drug Development Continued 14th Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) Can be mentioned.
  • the candidate peptide is an HLA-A26 binding cancer antigen peptide, for example, Tissue Antigen 61: 136. 2003, or the methods described in the examples below can be used for the examination. It can be similarly examined that the candidate peptide is a peptide having activity as an HLA-A26-binding cancer antigen peptide.
  • peripheral blood mononuclear cells PBMC
  • a candidate peptide is added (pulsed) and cultured.
  • repeat peptide stimulation several times every few days to increase peptide-specific CTL.
  • the peptide-specific CTL reaction by the CTL is detected by measuring the production of a cytodynamic force such as IFN- ⁇ by the CTL and the cytotoxic activity. Cytotoxic activity is measured by, for example, 51 Cr release assay (Int. J. Cancer, 58: p317, 1994).
  • Target cells used in Atsey include WT1-positive and HLA-A26-positive cells labeled with 51 Cr.
  • Specific examples include 51 Cr-labeled cells in which an HLA-A26 gene (for example, Genbank Accession No. D14350) is introduced into a leukemia cell line that is positive for WT1 and negative for HLA-A26.
  • the candidate peptide is “HLA-A26-binding cancer antigen peptide” or “HLA-A26-binding cancer” It is determined that the peptide has activity as an antigenic peptide.
  • Specific embodiments of the peptide having activity as an HLA-A26-binding cancer antigen peptide of the present invention include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, sequence.
  • Examples include peptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and having activity as HLA-A26 binding cancer antigen peptides.
  • the present invention provides a peptide containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • a peptide having a power of ⁇ 10 amino acids More preferred is a peptide having a power of ⁇ 10 amino acids. More preferably, described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • a cancer antigen peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 is most preferred.
  • the peptide of the present invention may be appropriately modified within a range that retains activity.
  • “modification” of an amino acid residue means substitution, deletion, and Z or addition of an amino acid residue (including addition of an amino acid at the N-terminal and C-terminal of a peptide), preferably the amino acid residue.
  • Group substitution In the case of modification involving amino acid residue substitution, the number and position of amino acid residues to be substituted are arbitrary as long as they have activity as a cancer antigen peptide. However, as described above, the peptide that normally binds to an HLA antigen is usually used. Since the length is about 8 to 11 amino acids, a range of several by one is preferable.
  • the present invention also provides a peptide containing a peptide of the present invention and a helper peptide or other cancer antigen peptide (so-called "epitope peptide").
  • a peptide (epitope peptide) force in which a plurality of CTL epitopes (antigen peptides) are linked has an efficient CTL-inducing activity.
  • the cancer antigen protein PSA-derived HLA-A2, -A3, -All, B53-restricted CTL epitopes linked to about 30mer peptide in vivo It is described that CTL specific to epitopes was induced.
  • helper epitope refers to a peptide having an action of activating CD4 positive T cells (Immunity., 1: 751, 1994).
  • CD4 positive T cells Immunity., 1: 751, 1994.
  • HBVcl28-140 derived from hepatitis B virus or ruptured Known to be TT947-967, etc., derived from pneumotoxin.
  • CD4-positive T cells activated by the helper epitope are important for anti-tumor immune responses because they induce and maintain CTL differentiation and effector activity such as macrophages. It is thought that.
  • Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925 includes HBV Origin HLA-A2-restricted antigen peptide 6 types, HLA-A11-restricted antigen peptide 3 types, and a DNA (minigene) force encoding a peptide composed of a helper epitope. It is described that this was effectively induced.
  • CTL epitope a cancer antigen peptide with 280 to 288 position of melanoma antigen gplOO
  • helper epitope T helper epitope derived from tetanus toxin
  • an epitope peptide having CTL-inducing activity in which a plurality of epitopes containing the peptide of the present invention are linked can also be exemplified as a specific example of the peptide of the present invention.
  • the epitope linked to the cancer antigen peptide of the present invention is a CTL epitope (cancer antigen peptide)
  • the CTL epitope used is HLA-A * 0201, -A * 0204, -A * 0205,- A * 0206,-A * 0207,-All, -A24,-A31,-A * 6801, -B7,-B8,-B * 2705, -B37, -Cw * 0401, -Cw * 0602
  • Examples include CTL epitopes (Int. J. Hematol 76: 127, 2002, Int. J. Hematol 78: 56, 2003, WO 00/06602, WO 00/18795).
  • a plurality of these CTL epitopes can be linked, and the length of one CTL epitope is determined by analyzing antigen peptides bound to various HLA molecules (Immunogenetics, 41: 178, 1995), 8 About 14 amino acids can be mentioned.
  • the helper epitope used includes HBVcl 28 140 derived from the hepatitis B virus as described above and TT947- derived from tetanus toxin. 967 or Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 5), which is a helper epitope derived from WT1.
  • the length of the helper epitope includes about 13 to 30 amino acids, preferably about 13 to 17 amino acids.
  • epitope peptide of the present invention include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: : A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and a helper epitope, preferably consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. And an epitope peptide containing a peptide and a helper epitope.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO:
  • amino group of the N-terminal amino acid or the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the peptide of the present invention may be modified. That is, the peptide in which the N-terminal amino acid residue and / or the C-terminal amino acid residue is modified is also included in the category of the peptide of the present invention.
  • alkylsulfol groups 1 to 6 alkylsulfol groups, phenolsulfol groups, alkoxycarbonyl groups having 2 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl groups substituted with phenol groups, 5 to 7 carbon atoms, cyclohexane Examples thereof include a carbonyl group substituted with alkoxy, a phenoxycarbol group and the like.
  • Examples of the peptide in which the carboxyl group of the C-terminal amino acid is modified include an ester form and an amide form.
  • Specific examples of the ester form are substituted with an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms and a phenol group.
  • Specific examples of amide compounds include one or two of an amide, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the like. Substituted amides, amides substituted with 1 or 2 carbon atoms substituted with a phenyl group, 5- to 7-membered azacyclos containing the nitrogen atom of the amide group Examples include amides that form alkanes.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, sequence SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, preferably SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9
  • a polynucleotide encoding an epitope peptide containing a peptide consisting of the amino acid sequence and a helper epitope.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15
  • a peptide comprising the amino acid sequence described above more preferably a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • a recombinant expression vector for expressing the peptide of the present invention can be prepared.
  • the expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, purpose, etc., and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
  • Examples of the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • E. coli include E. coli K-12 strains HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain, and the like.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and the like. Insect cells include s! 9.
  • a method for introducing an expression vector into a host cell a conventional method suitable for the host cell may be used. Specifically, the calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electo-poration method, lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin;
  • a transformed cell in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to the peptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or an monoclonal antibody using the peptide of the present invention as an immunogen without any particular limitation on its form!
  • the peptide of the present invention can be used as an immunogen to immunize a non-human animal such as a rabbit and obtain it from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • the peptide of the present invention can be obtained from hyperidoma cells prepared by immunizing a non-human animal such as a mouse and fusing the obtained spleen cells and myeloma cells.
  • e mon Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4: ⁇ 11.11).
  • Preparation of an antibody against the peptide of the present invention uses various adjuvants depending on the host. It can also be done by enhancing the immunological response.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pull-mouth polyol, polyone, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette Guerin) and Corynebaterum-Parvum.
  • an antibody that recognizes the peptide and an antibody that neutralizes the activity can be easily prepared.
  • Applications of antibodies include affinity chromatography, immunological diagnosis, and the like.
  • the immunological diagnosis can be appropriately selected from immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (E LISA), fluorescence or luminescence assay.
  • Such immunological diagnosis includes cancer with increased expression level of WT1 gene, such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, hematological cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, etc. It is effective in diagnosing solid cancers such as breast cancer, embryonic cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer and ovarian cancer.
  • the present invention provides an antigen-presenting cell in which a complex of the peptide of the present invention and an HLA-A26 antigen is presented.
  • CTL induction was observed by stimulation with the peptide of the present invention. This was because there was an antigen-presenting cell in which a complex of the peptide of the present invention and the HLA-A26 antigen was present. This indicates that CTLs that specifically recognize the presenting cells were induced.
  • Such an antigen-presenting cell in which a complex of the HLA-A26 antigen and the peptide of the present invention is presented is effectively used in cell therapy (DC therapy) described later.
  • the antigen-presenting cell of the present invention may be any antigen-presenting cell in which a complex of the cancer antigen peptide of the present invention and the HLA-A26 antigen is presented.
  • Antigen-presenting cells used in cell therapy are isolated from cancer patients and have the ability to pulse the peptide of the present invention in vitro. This is prepared by introducing a polynucleotide of HLA-A26 and the cancer antigen peptide of the present invention onto the cell surface by introducing the polynucleotide or an expression vector containing the polynucleotide into the cell.
  • the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it is a cell that expresses the HLA-A26 antigen capable of presenting the peptide of the present invention on the cell surface, but has antigen-presenting ability. Preferable is a high density of cells.
  • the peptide of the present invention may be pulsed to the cells having the antigen-presenting ability, and the polynucleotide encoding the peptide of the present invention or an expression vector containing the same may be used. There may be.
  • the antigen-presenting cell of the present invention is isolated from, for example, a cell having antigen-presenting ability from a cancer patient, and the peptide of the present invention (for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, sequence) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, or cancer antigen peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, preferably SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or a cancer antigen peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9) is obtained by pulsing in vitro and preparing a complex of the HLA-A26 antigen and the peptide of the present invention (Cancer Immunol.
  • lymphatic lymphocytes from peripheral blood of cancer patients can be obtained by the phycol method. Isolate spheres, then remove non-adherent cells and remove adherent cells with GM-CSF and IL-4 Induce ⁇ cells were cultured under, such as by pulse by culturing the ⁇ cell peptide co of the present invention, Ru can be prepared antigen-presenting cells of the present invention.
  • a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in cells having the antigen-presenting ability for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, sequence
  • antigen-presenting cell of the present invention When preparing the antigen-presenting cell of the present invention by introducing a polynucleotide encoding a pitope peptide) or an expression vector containing the same,
  • the polynucleotide is DNA
  • antigen-presenting cells can be prepared in the form of RNA as well as DNA.
  • the present invention also provides a CTL that recognizes a complex of the cancer antigen peptide of the present invention and an HLA-A26 antigen.
  • CTL-inducing activity was observed by stimulation with the peptide of the present invention. This indicates that there was an antigen-presenting cell in which a complex of the peptide of the present invention and the HLA-A26 antigen was present, and CTL specifically recognizing this antigen-presenting cell was induced. Such a CTL that specifically recognizes a complex of the HLA-A26 antigen and the peptide of the present invention is effectively used for adoptive immunotherapy described later.
  • CTL used in adoptive immunotherapy isolates a patient's peripheral blood lymphocytes from the peptide of the present invention (eg, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 amino acid sequence ability of the cancer antigenic peptide, preferably SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: : A cancer antigen peptide consisting of the amino acid sequence described in 9) or a polynucleotide encoding the peptide of the present invention (eg, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, sequence) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 amino acid sequence, preferably SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 Epitope
  • a cancer vaccine comprising the peptide of the present invention as an active ingredient
  • the peptide of the present invention has the ability to induce CTL, and the induced CTL can exert an anticancer effect through cytotoxicity or lymphokine production. Therefore, the peptide of the present invention can be used as an active ingredient of a cancer vaccine for treating or preventing cancer. That is, the present invention provides a cancer vaccine (pharmaceutical composition as a cancer vaccine) containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • a cancer vaccine pharmaceutical composition as a cancer vaccine
  • a peptide eg, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 amino acid sequence, preferably SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9
  • a cancer antigen peptide which specifically recognizes the presented HLA-A26 antigen complex, can proliferate and destroy cancer cells. Prevention is possible.
  • the cancer vaccine of the present invention is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, It can be used for the prevention or treatment of solid cancer such as breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer and the like.
  • hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, gastric cancer, colon cancer, lung cancer
  • solid cancer such as breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer and the like.
  • the present invention provides, as another aspect, a method for treating or preventing cancer by administering an effective amount of the cancer vaccine of the present invention to HLA-A26 positive and WT1 positive patients.
  • the cancer vaccine comprising the peptide of the present invention as an active ingredient is a single CTL epitope (for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: :
  • a cancer antigen comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, preferably the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • an epitope peptide force in which a plurality of CTL epitopes (antigen peptides) are linked in vivo has an efficient CTL inducing activity.
  • the cancer antigen protein PSA-derived HLA-A2, -A3, -All, B53-restricted CTL epitope (antigen peptide) is linked to about 30mer epitope peptide. It is described that CTL specific for each CTL epitope was induced in S, in vivo.
  • CTL is efficiently induced by an epitope peptide in which a CTL epitope and a helper epitope are linked.
  • an epitope peptide When administered in the form of such an epitope peptide, it is taken up into antigen-presenting cells, and then individual antigen peptides generated by intracellular degradation bind to HLA antigens to form complexes.
  • the complex is presented at a high density on the surface of the antigen-presenting cell, and CTL specific for the complex proliferates efficiently in the body to destroy cancer cells. In this way, treatment or prevention of cancer is achieved.
  • the cancer vaccine comprising the peptide of the present invention as an active ingredient can be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, or in a particulate form so that cellular immunity can be effectively established. It can be administered in dosage form.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or in a particulate form so that cellular immunity can be effectively established. It can be administered in dosage form.
  • adjuvants those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) and the like can be applied.
  • bacterial cell-derived components examples include bacterial cell-derived components, cytodynamic ingredients, plant-derived components
  • examples include marine organism-derived components, mineral gels such as hydroxyaluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pull mouth nick polyols, polyions, peptides, or oil emulsions (emulsion formulations).
  • a ribosome preparation, a particulate preparation bound to beads having a diameter of several meters, a preparation bound to a lipid, and the like are also conceivable.
  • Examples of the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.
  • the dosage of the peptide of the present invention in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably O.OOlmg to 1000 mg, more preferably O. 1 mg to 10 mg, preferably administered once every few days or months.
  • a DNA vaccine comprising an expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention as an effective component
  • the present invention provides a cancer vaccine (pharmaceutical composition as a cancer vaccine) containing an expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for treating or preventing cancer by administering an effective amount of the DNA vaccine of the present invention to HLA-A26-positive and WT1-positive patients.
  • an active ingredient of a cancer vaccine can be obtained by incorporating a polynucleotide encoding the epitope peptide of the present invention into an appropriate expression vector.
  • polynucleotide-containing expression vector of the present invention is applied as an effective component of a cancer vaccine (DNA vaccine)
  • the following method can be used.
  • a viral vector method and other methods can also be applied as a method for introducing the polynucleotide of the present invention into a cell. That is, as a method for introducing the polynucleotide of the present invention into a cell, a viral vector method and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1) , 23-48 (1994), Special Issue on Experimental Medicine, 12 (15), (1994), and references cited therein, etc.) can also be applied.
  • a retrovirus for example, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a poliovirus, a symbis virus, or a DNA virus or an RNA virus of the present invention. Assembling DNA The method of introducing it is included. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, etc. are particularly preferred.
  • Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA-cutting method), a ribosome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electoral position method, etc.
  • the ribosome method is preferred.
  • an in vivo method When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease or symptom to be treated. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intradermally, intramuscularly.
  • it When administered by the in vivo method, for example, it can be in the form of a pharmaceutical preparation such as a solution, but is generally an injection containing the polynucleotide-containing expression vector of the present invention, which is an active ingredient, and is necessary.
  • customary carriers may be added.
  • ribosome or membrane fusion ribosome containing the polynucleotide-containing expression vector of the present invention such as Sendai virus (HVJ) -ribosome
  • a ribosome preparation such as a suspension, a freezing agent, a centrifugal concentrated freezing agent, etc. can do.
  • the content of the polynucleotide-containing expression vector of the present invention in the preparation is a force that can be appropriately adjusted according to the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient. Usually, 0.0001 mg to 100 mg, preferably 0.001 mg to 10 mg of the present invention.
  • These polynucleotide-containing expression vectors are preferably administered once every few days or months.
  • a polypeptide corresponding to the polynucleotide is highly expressed in antigen-presenting cells.
  • individual cancer antigen peptides generated by intracellular degradation bind to HLA antigens to form complexes, which are displayed at high density on the surface of the antigen-presenting cells. Recognize CTL efficiently proliferate in the body and destroy cancer cells.
  • Cancer treatment or prevention is achieved.
  • a cancer vaccine comprising an expression vector containing the polynucleotide of the present invention as an active ingredient is a cancer associated with an increased expression level of the WT1 gene, such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, etc.
  • solid cancer such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc. Can be used.
  • Cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient
  • the present invention provides a cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient.
  • the antigen-presenting cell of the present invention can be used as an active ingredient of a cancer vaccine in cell therapy.
  • the cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, etc. Or for the prevention or treatment of solid cancers such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc. it can.
  • hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, etc.
  • solid cancers such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc. it can.
  • a cancer vaccine comprising the CTL of the present invention as an active ingredient
  • the present invention provides a cancer vaccine (pharmaceutical composition as a cancer vaccine) comprising the CTL of the present invention as an active ingredient.
  • the CTL of the present invention is effectively used in the following adoptive immunotherapy.
  • melanoma In melanoma, a therapeutic effect has been observed in adoptive immunotherapy in which a large amount of in vitro tumor-infiltrating T cells are cultured outside the body and returned to the patient (J. Natl. Cancer. Inst., 86: (1159, 1994) o
  • mouse melanoma splenocytes were stimulated in vitro with the cancer antigen peptide TRP-2 to proliferate CTL specific for the cancer antigen peptide, and the CTL was administered to melanoma-transplanted mice. By doing so, metastasis suppression is recognized (
  • the cancer vaccine containing the CTL of the present invention as an active ingredient preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium and the like in order to maintain CTL stably.
  • physiological saline physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium and the like in order to maintain CTL stably.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Examples of the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • Examples of the dosage include those described in the above literature.
  • the cancer vaccine comprising the CTL of the present invention as an active ingredient is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, hematological cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, gastric cancer, It can be used for prevention or treatment of solid cancers such as colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer and the like.
  • the present invention also provides an HLA monomer, HLA dimer, HLA tetramer or HLA pentamer containing the cancer antigen peptide of the present invention and an HLA-A26 antigen.
  • cancer immunotherapy the frequency and amount of CTL progenitor cells against cancer antigen (cancer antigen peptide) are examined in advance before treatment, and the frequency and amount of CTL in patients undergoing treatment with cancer antigen (cancer antigen peptide) are examined.
  • the response to the cancer antigen (cancer antigen peptide) It is an important indicator in selecting patients with high responsiveness, monitoring treatment effects, and determining suitability of treatment.
  • HLA monomers, HLA dimers, HLA tetramers, and HLA pentamers containing cancer antigen peptides and HLA antigens are useful as reagents for detecting antigen (antigen peptide) -specific CTL, that is, measuring the frequency and amount of the CTL. It is.
  • the HLA monomer refers to a monomer (monomer) used in the production of the above-mentioned HLA tetramer, which is an assembly of HLA antigen ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin, and antigen peptide.
  • Antigen peptide-specific CTL bound to the HLA dimer can be detected by binding a labeled anti-IgGl antibody to IgGl, for example). Can do.
  • HLA pentamer is a recently developed technology and refers to a pentamer in which five molecules of a complex of an HLA antigen and an antigen peptide are polymerized via a Coiled-Coil domain.
  • HLA antigen Since the antigen peptide complex can be labeled with a fluorescent dye etc., it can be analyzed with a flow cytometer, etc. (see http://www.proimmune.co.uk/). ) Any of the HLA monomers, dimers, tetramers and pentamers described above can be commissioned and synthesized, for example, by outsourcing to Prolmmune or BD Biosciences.
  • HLA tetramers containing various antigen peptides are also commercially available (Medical and Biological Laboratories, etc.).
  • HLA monomer, dimer, tetramer and pentamer of the present invention include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, preferably the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • HLA monomers, dimers, tetramers and pentamers containing peptides and HLA-A26 antigen Of these, it is preferred to use HLA tetramers or HLA pentamers for the detection of CTL, more preferably HLA tetramers.
  • the HLA monomer, HLA tetramer, and HLA pentamer are preferably fluorescently labeled so that CTLs bound by a known detection means such as flow cytometry or fluorescence microscope can be easily selected or detected.
  • a known detection means such as flow cytometry or fluorescence microscope can be easily selected or detected.
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PerCP beridin-chlorophyll protein
  • APC arophycocyanin
  • HLA-A26 antigen alpha chain of HLA-A26 antigen
  • Genbank Accession No. D 14350 Genbank Accession No. D 14350, and can be prepared by conventional methods such as PCR based on the information of known base sequences such as HLA-A26. It can be easily cloned.
  • HLA monomer, dimer, tetramer, and pentamer production method is as follows.
  • the force well known from the above-mentioned documents, specifically, the production method of the HLA tetramer is briefly described as follows.
  • the HLA-A26 a chain expression vector and the j82 microglobulin expression vector are introduced into E. coli or mammalian cells capable of expressing the protein and expressed.
  • E. coli eg BL21
  • the obtained monomer HLA-A26 complex and the peptide of the present invention are mixed to form a soluble HLA-peptide complex.
  • the sequence of the C-terminal part of the HLA-A26 a chain in the HLA-peptide complex is piotinylated with the BirA enzyme.
  • An HLA tetramer can be prepared by mixing the PIO-conjugated HLA-peptide complex and fluorescently labeled avidin at a molar ratio of 4: 1. Each of the above steps It is preferable to perform protein purification by gel filtration or the like.
  • the HLA monomer, dimer, tetramer and pentamer of the present invention are N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-(2-aminoethyl)-2-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoe
  • the frequency and amount of CTL precursor cells against the cancer antigen peptide of the present invention are examined. Thereby, the patient's responsiveness to the cancer antigen peptide can be determined.
  • a biological sample eg, PBMC
  • the HLA tetramer of the present invention is brought into contact with the biological sample, and the HLA tetramer or the like is contacted.
  • the frequency or amount of the CTL specific to the peptide of the present invention bound to the peptide is measured with a flow cytometer or the like.
  • the present invention is also a peptide strength HLA-A * 0201-binding cancer antigen peptide containing the amino acid sequence of Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 3 The peptide sequence described in SEQ ID NO: 3 is disclosed in WO 00/18795. However, it has activity as an HLA-A * 0201-binding cancer antigen peptide, and WT1 protein strength is also generated by intracellular processing, and a complex of the peptide and HLA-A * 0201 antigen is presented on the cell surface. It is the finding for the first time in the present invention that the peptide is recognized by CTL and that this peptide is a therapeutically effective cancer antigen peptide.
  • the present invention provides the following a) to f):
  • composition comprising any one selected from among the above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides the following a) 'to f)':
  • composition comprising any one selected from among the above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides an HLA monomer, an HLA da containing the peptide containing the amino acid sequence described in Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (SEQ ID NO: 3) and the HLA-A * 0201 antigen.
  • the present invention provides a reagent for detecting CTL specific to HLA-A * 0201-binding cancer antigen peptide derived from WT1, which contains ima, HLA tetramer or HLA pentamer, and these as components.
  • HLA monomers, HLA dimers, HLA tetramers, HLA pentamers, and CTL detection reagents containing these as components even in the case of peptides having activity as the HLA-A26 binding cancer antigen peptide, As described.
  • the peptide described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 instead of the peptide described in SEQ ID NO: 3 or 4, the HLA-A * 0201 antigen is used instead of the HLA-A26 antigen.
  • a peptide (SEQ ID NO: 3) having a sequence corresponding to positions 7 to 15 of the amino acid sequence of human WT1 (Cell 60: 509, 1990, SEQ ID NO: 1) was synthesized by solid phase synthesis.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • FicoU-Hypaque separation solution Endogenous peptide cannot be presented to HLA due to deficiency of TAP gene.
  • HLA-A * 0201-positive T2 cell line J. Immunol. 150: 1763, 1993
  • peptide of SEQ ID NO: 3 at 20 M concentration for 2 hours pulse Then, irradiation (7500 cGy) was performed, and mixed culture was performed at a ratio of PBMC and cell number of 1: 1.
  • the cytotoxic activity of CTL against target cells was measured by a chromium release test ( 51 Cr_release assay). That is, target cells labeled with 51 Cr (1 ⁇ 10 4 cells in a total volume of 100 L) were mixed and cultured with various numbers of effector cells (100 ⁇ L) in a round bottom 96-well plate. After culturing at 37 ° C for 3 to 5 hours, the plate was centrifuged, 100 L of the supernatant was collected, and ⁇ -rays were measured. Specific cytotoxic activity (% specific lysis) was calculated as follows:
  • % specific lysis (cpm experimental release ⁇ cpm spontaneous release) / (cpm maximal release ⁇ cpm spontaneous release) X 100.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the cytotoxic activity using T2 cells pulsed with the peptide used for stimulation and the T2 cells as target cells.
  • CTL induced by stimulation of ⁇ 2 cells pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 3 showed stronger cytotoxic activity against ⁇ 2 cells pulsed with peptide than ⁇ 2 cells not pulsed with peptide ( ⁇ ⁇ 0.05).
  • TF-1 cell line of CTL induced by the peptide of SEQ ID NO: 3 is positive for HLA-A * 0201 and expresses WT1 (J. Cell. Physiol. 140: 323, 1989) Or cytotoxicity against the HLA-A * 0201-positive JY cell line 0. Biol. Chem. 252, 1997) that does not express WT1.
  • WT1 J. Cell. Physiol. 140: 323, 1989
  • cytotoxicity against the HLA-A * 0201-positive JY cell line 0. Biol. Chem. 252, 1997) that does not express WT1.
  • the result is shown in figure 2. Induced by stimulation of peptide of SEQ ID NO: 3 CTL did not injure the force JY cells that injured TF-1 cells (p 0.05).
  • a peptide (SEQ ID NO: 2) having a sequence corresponding to positions 368 to 376 of the amino acid sequence of human WT1 (Cell 60: 509, 1990, SEQ ID NO: 1) was synthesized by solid phase synthesis.
  • PBMCs were prepared in the same manner as in Example 1 from HLA-A26 positive healthy individuals who obtained informed consent, and stimulated by adding the peptide of SEQ ID NO: 2.
  • PBMC was pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 2, and this was used as a stimulator cell to stimulate the stimulus. This stimulation was performed four times every other week.
  • B cells transformed with EB virus (B-LCL) were pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 2 and stimulated with this as a stimulating cell.
  • B-LCL pulsed with peptide of SEQ ID NO: 2 and peptide were pulsed, and B-LCL was used as a target cell by the chromium release test in the same manner as in Example 1. Cytotoxic activity was measured. The results are shown in Figure 3. CTL induced by stimulation of the peptide of SEQ ID NO: 2 has stronger cytotoxic activity against B-LCL pulsed with peptide than B-LCL not pulsed with peptide. Indicated. From this result, it became clear that CTL that specifically recognizes the peptide of SEQ ID NO: 2 derived from the WT1 protein also induces HLA-A26 positive human PBMC by stimulation of the peptide of SEQ ID NO: 2. It was.
  • HLA-A26 positive healthy individuals used here has been found to be HLA-A * 2601.
  • Peptide of the sequence corresponding to positions 152 to 160 (SEQ ID NO: 8) of the amino acid sequence of human WT1 (Cell 60: 509, 1990, SEQ ID NO: 1), peptide of the sequence corresponding to positions 185 to 193 (arrangement) Column number: 9) and peptide having the sequence corresponding to positions 368 to 376 (SEQ ID NO: 2) It was synthesized by the synthesis method.
  • PBMCs were prepared in the same manner as in Example 1 from HLA-A * 2601-positive healthy individuals who obtained informed consent, and stimulated by adding the peptide of SEQ ID NO: 8.
  • PBMC was pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 8, and this was used as a stimulator cell to stimulate the stimulus. This stimulation was performed three times every other week. After stimulation three times, CD8 positive cells were concentrated by the negative selection method. Further, stimulation with the peptide of SEQ ID NO: 8 was performed twice.
  • the present invention provides a cancer antigen peptide derived from WT1, a polynucleotide encoding the peptide, an inducer of CTL containing these peptides and polynucleotides, and the like.
  • the CTL inducer of the present invention is useful as a cancer vaccine.
  • the cancer vaccine of the present invention is applicable to many cancer patients positive for HLA-A26 or HLA-A * 0201.
  • FIG. 2 CTL induced by peptide stimulation of SEQ ID NO: 3, HLA-A * 0201-positive and WT1-expressing TF-1 cell line (black circle in the figure), or HLA-A * 0201-positive and WT1 Not expressed JY fine It is a graph which shows the result of having investigated the cytotoxic activity with respect to a cell line (white circle in a figure).
  • the vertical axis shows specific cytotoxic activity (% spedfic lysis), and the horizontal axis shows E / T ratio.
  • FIG. 3 Cells of peptide-stimulated CTL induced by peptide stimulation of SEQ ID NO: 2 against peptide-pulsed B-LCL target cells (black bars in the figure) or peptide non-pulsed B-LCL target cells (white bars in the figure) It is a graph which shows the result of having investigated injury activity. In the figure, the vertical axis represents specific cytotoxic activity (% specific lysis).
  • FIG. 4 CTL induced by peptide stimulation of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, peptide-pulsed B-LCL target cells (black bars in the figure) or peptide non-pulsed B-LCL standard It is a graph which shows the result of having investigated the cytotoxic activity with respect to a target cell (white bar in a figure). In the figure, the vertical axis represents specific cytotoxic activity (% specific lysis).
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is a synthetic peptide.
  • the second amino acid is leucine, methionine, palin, isoleucine or glutamine
  • the ninth amino acid is palin or oral isine.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is a synthetic peptide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 is a synthetic peptide.

Abstract

　新たな癌ワクチンを提供する。ＷＴ１由来のＨＬＡ－Ａ２６結合性癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むＣＴＬの誘導剤、および当該ペプチドやポリヌクレオチドを含む癌ワクチンに関する。

Description

明 細 書
WT1由来の癌抗原ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、 WT1由来の癌抗原ペプチドおよびその用途に関する。
背景技術
[0002] WT1遺伝子（Wilms' tumor gene 1)は、小児の腎腫瘍である Wilms腫瘍の原因遺 伝子の 1つとして同定された（Cell, 60: p509, 1990、 Nature, 343: p774, 1990)。 WT1 遺伝子は転写因子 WT1をコードしており、 WT1は細胞の増殖 ·分ィ匕 ·アポトーシス及 び臓器の形成などに関する重要な働きをする（Int. Rev. CytoL, 181: pl51, 1998)。 当初、 WT1遺伝子は、癌抑制遺伝子と位置付けられていた力 その後の研究により 白血病及び肺癌や乳癌を含む種々の固形癌で発現が認められ、むしろ癌の増殖を 促進する癌遺伝子としての作用を有することが示された。また、 WT1由来の特定のぺ プチドで HLA-A*0201陽性または HLA-A*2402陽性の末梢血単核球を in vitroで刺激 することにより、ペプチド特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)が誘導され、これらの CTLは、内因性に WT1を発現する白血病や固形癌の癌細胞を傷害することが示され た。これらの結果より、 WT1は癌免疫療法 (癌ワクチン療法)の有望な標的分子である ことが明ら力となった（Int. J. HematoL, 76: pl27, 2002) 0しかしながら、当該 WT1が HLA-A26抗原に結合性の癌抗原ペプチド部分を有しているカゝ否かは未だ明らかに されておらず、またそのようなペプチドの報告も無い。
また HLA-A2抗原の 1種である HLA-A*0201抗原に結合性の癌抗原ペプチドに関し ては、当該抗原への結合配列が推測されているものの (WO 00/18795号公報）、現 在までに効果が確認されている癌抗原ペプチドはごく僅かである（WO 00/06602号 公報、 WO 00/026249号公報）。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明の目的は、 WT1由来の癌抗原ペプチド、および当該ペプチドの CTL誘導剤 としての使用などを提供することにある。 課題を解決するための手段
[0004] 本発明者は、 WT1由来の新規な癌抗原ペプチドの同定につき鋭意検討を行った。
その結果、配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のペプチドが
HLA-A26拘束性の CTLを誘導することを明らかにした。すなわち WT1には、多数存 在する HLA抗原サブクラスのうち HLA-A26抗原に結合して CTLにより認識される癌 抗原ペプチド部分が存在していることを初めて見出した。そしてこの知見により、 HLA-A26陽性の癌患者に対して WT1特異的 CTLを誘導することのできる新たな癌ヮ クチン療法が可能となった。
また本発明者は、従来効果が知られていな力つた配列番号: 3に記載のペプチドが 、 HLA-A*0201抗原に結合して CTLにより認識されるという癌抗原ペプチドとしての活 性を有することを初めて見出した。
[0005] 以上に示された本発明の WT1由来の癌抗原ペプチドおよび当該ペプチドをコード するポリヌクレオチド等は、 CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンとして有効に用いるこ とができる。また本発明の癌抗原ペプチドは、 WT1特異的 CTLの検出用試薬の成分 としても有効に用いることができる。本発明はこのような知見に基づき完成するに至つ たものである。
[0006] すなわち本発明は、
(1) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する、 HLA— A26結合性 癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチド、
(2) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 8〜： L 1アミノ酸 を含有する、または該連続するアミノ酸力もなる、前記（1)記載のペプチド、
(3) 配列番号： 2、配列番号: 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列を含有する 、前記（1)または（2)記載のペプチド、
(4) 配列番号： 2、配列番号: 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列力 なる癌 抗原ペプチド、
(5) 前記（1)〜 (4) V、ずれか記載のペプチドを含有するェピトープペプチド、
(6) 前記（1)〜（5) V、ずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(7) 前記（6)記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、 (8) 前記（7)記載の発現ベクターを含有する細胞、
(9) 前記 (8)記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴と する、前記（1)〜（5) V、ずれか記載のペプチドの製造方法、
(10) 前記（1)〜 (4) V、ずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
(11) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA— A26結合性 癌抗原ペプチド、好ましくは前記（2)〜 (4) V、ずれか記載のペプチドと HLA— A26 抗原との複合体が提示されて!、る抗原提示細胞、
(12) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA— A26結合性 癌抗原ペプチド、好ましくは前記（2)〜 (4) V、ずれか記載のペプチドと HLA— A26 抗原との複合体を認識する CTL、
(13) 前記（1)〜（5)いずれか記載のペプチド、前記（7)記載の発現ベクター、前 記（8)記載の細胞、前記（11)記載の抗原提示細胞、または前記（12)記載の CTLと 、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(14) CTLの誘導剤として使用される、前記（13)記載の医薬組成物、
(15) 癌ワクチンとして使用される、前記（13)記載の医薬組成物、
(16) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA— A26結合性 癌抗原ペプチド、好ましくは前記（2)〜 (4) V、ずれか記載のペプチドと HLA— A26 抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタ マー、
(17) 前記（16)記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLA ペンタマ一を成分として含有する、 WT1由来の HLA— A26結合性癌抗原ペプチド 特異的な CTLの検出用試薬、
(18) 以下の a)〜； 0 :
a)配列番号： 3または配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含有するペプチド、 b)上記 a)のペプチドを含有するェピトープペプチド、
c)上記 a)または b)のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、 d)上記 c)の発現ベクターを含有する細胞、
e)上記 a)のペプチドと HLA— A*0201抗原との複合体が提示されている抗原提示 細胞、および
f)上記 a)のペプチドと HLA— A*0201抗原との複合体を認識する CTL、
のなかから選ばれるいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(19) CTLの誘導剤として使用される、前記（18)記載の医薬組成物、
(20) 癌ワクチンとして使用される、前記（18)記載の医薬組成物、
(21) 配列番号： 3または配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドと H LA— A*0201抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまた は HLAペンタマ一、ならびに
(22) 前記（21)記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLA ペンタマ一を成分として含有する、 WT1由来の HLA— A*0201結合性癌抗原ぺプ チド特異的な CTLの検出用試薬、に関する。
発明の効果
[0007] 本発明により、 WT1由来の癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオ チド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含む CTLの誘導剤などが提供される。本発 明の CTLの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、 HLA-A26 陽性または HLA-A*0201陽性の多くの癌患者に適用可能である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA-A26結合 性癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチドを提供する。
ここで配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列は、 Cell 60:509,1990、 NCBIデ ータベース Accession No.XP_034418および Accession No. P19544に記載された公知 の配列である。当該ヒト WT1のアミノ酸配列を配列番号： 1に示す。 HLA-A26抗原とし ては、 HLA-A*2601、 HLA-A*2602、 HLA-A*2603などが知られている。本発明におけ る HLA-A26抗原として好ましくは HLA-A*2601が挙げられる。当該 HLA-A26抗原は、 日本人の約 20%が保有して!/、る HLA抗原である。
[0009] 本発明は、 WT1のアミノ酸配列中に、 HLA-A26抗原に結合して CTLにより認識され る癌抗原ペプチド部分が存在していることを初めて見出し、完成された。
本発明にお 、て「HLA-A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有する」とは、 HLA-A26抗原に結合して細胞傷害性 T細胞 (CTL)により認識される活性を有すること を意味し、「HLA-A26抗原に結合して CTLを誘導する（CTL誘導活性を有する）」こと 、および「HLA- A26抗原に結合して CTLを活性ィ匕する（CTL活性化活性を有する）」 ことと同義語である。
[0010] 従って、本発明の「配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する、 HL A— A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチド」は配列番号： 1に記 載のヒト WT1のアミノ酸配列の一部力 なり、 HLA-A26抗原に結合して細胞傷害性 T 細胞 (CTL)により認識され得る癌抗原ペプチドを含むペプチドを意味し、当該癌抗原 ペプチド自体をも包含する。本発明における癌抗原ペプチドは配列番号： 1に記載の ヒト WT1のアミノ酸配列の一部からなり、 HLA-A26 (HLA-A26抗原）結合性癌抗原べ プチドとしての活性を有するペプチドである限り、如何なるペプチドであっても良ぐ その長さとしては好ましくは 8〜11アミノ酸、より好ましくは 9〜10アミノ酸力もなるぺプ チドが挙げられる。本発明の癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチドはこの癌 抗原ペプチドの N末端または C末端に数個〜複数個のアミノ酸残基が付加していて も良ぐ付カ卩がある場合、本発明のペプチド全体の長さとしては通常連続する 8〜100 アミノ酸、好ましくは連続する 8〜50アミノ酸、より好ましくは連続する 8〜30アミノ酸が 挙げられる。
前記本発明の癌抗原ペプチドは、例えば配列番号： 1に記載のアミノ酸配列におけ る連続する 8〜11アミノ酸力 なる部分ペプチド (候補ペプチド)を合成し、該ペプチド 力 SHLA-A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有する力否かをアツセィすることに より、同定することができる。
[0011] ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法 に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献 (ぺプタイド'シンセシス（ Peptide synthesis; , Interscience, New York, 196り；1τ ·プロアインズ、 i，he Proteins; , Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976 ;ペプチド合成，丸善（株）， 1975 ;ぺプ チド合成の基礎と実験、丸善 (株)， 1985 ;医薬品の開発 続 第 14卷'ペプチド合成, 広川書店， 1991)などに記載されている方法が挙げられる。
[0012] 候補ペプチドが HLA-A26結合性癌抗原ペプチドであることは、例えば Tissue Antigen 61: 136. 2003に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法などにより調べ ることができる。候補ペプチドが HLA-A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有す るペプチドであることも同様にして調べることができる。
[0013] すなわち、まず、 HLA- A26抗原陽性のヒトから末梢血単核球 (PBMC)を分離し、候 補ペプチドを添加 (パルス）して培養する。培養後、数日おきにペプチド添加による刺 激を数回繰り返してペプチド特異的な CTLを増やす。次に当該 CTLによるペプチド 特異的な CTLの反応を CTLによる IFN- γなどのサイト力イン産生や細胞傷害活性を 測定することにより検出する。細胞傷害活性は、例えば 51Crリリースアツセィ（ Int.J.Cancer,58:p317,1994)などにより測定する。アツセィにおいて使用する標的細 胞としては、 51Crでラベルした WT1陽性かつ HLA-A26陽性の細胞が挙げられる。具 体的には、例えば WT1陽性および HLA-A26陰性である白血病細胞株に HLA-A26 遺伝子（例えば Genbank Accession No.D14350)を導入した51 Crラベル化細胞などが 挙げられる。
以上のようなアツセィにより、 CTLが標的細胞を傷害したり、サイト力インを産生した 場合は、候補ペプチドが「HLA-A26結合性癌抗原ペプチドである」ある 、は「 HLA-A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチドである」と判断する。
[0014] 本発明の HLA-A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチドの具体的 な態様としては、例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列 番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載の アミノ酸配列を含有し HLA-A26結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有するぺプチ ドが例示される。好ましくは、本発明は、配列番号: 2、配列番号 : 8または配列番号 : 9 に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドを提供するものである。当該ペプチドは、 HLA-A26抗原に結合して CTLにより認識される活性を有する限り、その長さは特に 限定されない。しカゝしながら、 HLA抗原に結合性を有するペプチド (癌抗原ペプチド） は、一般的に 8〜11アミノ酸力もなることが知られている。従って配列番号: 2、配列番 号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列 番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列を含有する本発明のペプチドにお ける癌抗原ペプチド部分は、 9〜11アミノ酸力 なるペプチドであることが好ましぐ 9 〜10アミノ酸力もなるペプチドであることがより好ましい。より好ましくは、配列番号: 2、 配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド であり、最も好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のアミノ酸 配列からなる癌抗原ペプチドである。
[0015] 前記本発明のペプチドは、活性を保持する範囲内で、適宜改変されていても良い 。ここでアミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び Z又は付加（ぺ プチドの N末端、 C末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基 の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残 基の数および位置は、癌抗原ペプチドとしての活性を有する限り任意であるが、前記 したように通常、 HLA抗原に結合するペプチドの長さが 8〜11アミノ酸程度であること から、 1個力 数個の範囲が好ましい。
[0016] 本発明はまた、前記本発明のペプチドとヘルパーペプチド若しくは他の癌抗原べ プチドとを含有するペプチド ( 、わゆる「ェピトープペプチド」 )を提供する。
[0017] 近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド）を連結したペプチド (ェピトープぺプ チド）力 効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、癌抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A2, -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープを連結した約 30merのペプチド力 イン'ビボ でそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載されている。
[0018] また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたペプチド（ェピトープぺプ チド）により、効率的に CTLが誘導されることも示されている。ここでヘルパーェピトー プとは CD4陽性 T細胞を活性ィ匕させる作用を有するペプチドを指すものであり（ Immunity., 1:751, 1994)、例えば B型肝炎ウィルス由来の HBVcl28— 140や破傷 風毒素由来の TT947— 967などが知られている。当該ヘルパーェピトープにより活 性ィ匕された CD4陽性 T細胞は、 CTLの分化の誘導や維持、およびマクロファージな どのエフェクター活性ィ匕などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要である と考えられて 、る。このようなヘルパーェピトープと CTLェピトープとを連列したぺプ チドの具体例として、例えば Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、 HBV 由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原ペプチド 3種類、お よびヘルパーェピトープより構成されるペプチドをコードする DNA (ミニジーン）力 ィ ン'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に誘導したことが記載されて いる。また実際に、 CTLェピトープ (メラノーマ抗原 gplOOの第 280位〜 288位力もなる 癌抗原ペプチド）とヘルパーェピトープ (破傷風毒素由来 Tヘルパーェピトープ）とを 連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res.,
2001,7:3012-3024)。
[0019] 従って、前記本発明のペプチドを含む複数のェピトープを連結させた CTL誘導活 性を有するェピトープペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することが できる。
ここで、本発明の癌抗原ペプチドに連結させるェピトープが CTLェピトープ (癌抗原 ペプチド）の場合、用いる CTLェピトープとしては、 WT1由来の HLA-A*0201, -A* 0204, -A*0205, - A*0206, - A*0207，- All, -A24, - A31, - A*6801, -B7, - B8, - B* 2705, -B37, -Cw*0401, -Cw*0602に結合性の CTLェピトープ等が挙げられる（Int. J. Hematol 76: 127, 2002、 Int. J. Hematol 78: 56, 2003、 WO 00/06602号公報、 WO 00/18795号公報)。これら CTLェピトープは複数個連結することが可能であり、 1つの CTLェピトープの長さとしては、各種 HLA分子に結合して 、る抗原ペプチドの解析に より（Immunogenetics, 41:178, 1995)、 8〜14アミノ酸程度を挙げることができる。
[0020] また本発明の癌抗原ペプチドに連結させるェピトープがヘルパーェピトープの場合 、用いるヘルパーェピトープとしては、前述のような B型肝炎ウィルス由来の HBVcl 28 140や破傷風毒素由来の TT947— 967、または WT1由来のヘルパーェピトー プである Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His (配列 番号： 5)などが挙げられる。また当該ヘルパーェピトープの長さとしては、 13〜30アミ ノ酸程度、好ましくは 13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。
[0021] 本発明のェピトープペプチドとして、具体的には、例えば配列番号: 2、配列番号: 8 、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号 ： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとヘルパーェピトープ 、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のアミノ酸配列からな るペプチドとヘルパーェピトープとを含有するェピトープペプチドが挙げられる。
より具体的には、例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配 列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載 のアミノ酸配列よりなるペプチド、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番 号: 9に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと配列番号: 5に記載のアミノ酸配列よりな るペプチドとを含有するェピトープペプチド;配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9 、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配 列番号： 15に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド、好ましくは配列番号: 2、配列番号 ： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと破傷風毒素由来のへ ルパーペプチド（例えば Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;配列番号： 6)とを含有するェピトープペプチド；若しくは 配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12 、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列よりなるぺプ チド、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のアミノ酸配列よ りなるペプチドと Ala Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe He Gly He Thr Glu Leu ( 配列番号： 7、 Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024)とを含有するェピトープぺプ チドなどが挙げられる。
[0022] このような複数のェピトープを連結させたペプチド (ェピトープペプチド）は、前述の ように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のェピ トープを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基 づ 、て、通常の DNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。 すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発 現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より 目的の複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを回収することにより製造 することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法 (Molecular Cloning, T.Maniatis et al.'CSH Laboratory(1983)、 DNA Cloning, DM. Glover, IRL
PRESS(1985》や後述の方法などに準じて行うことができる。
[0023] 以上のようにして製造された複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを前 述の51 Crリリースアツセィ等に供すること等により、 CTL誘導活性を測定することができ る。
[0024] 以上に示した本発明のペプチド (ェピトープペプチドを含む）の N末端アミノ酸のアミ ノ基、または C末端アミノ酸のカルボキシル基は、修飾されていても良い。すなわち、 当該 N末端のアミノ酸残基及び/又は C末端のアミノ酸残基が修飾されたペプチドも、 本発明のペプチドの範疇に含まれる。
[0025] ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、例えば 1〜3個の炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、シクロアルキル基、ァシル基が挙げられ、ァシル基の具 体例としては炭素数 1から 6のアルカノィル基、フ -ル基で置換された炭素数 1から 6のアルカノィル基、炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換されたカルボ-ル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホ-ル基、フエ-ルスルホ-ル基、炭素数 2から 6のァ ルコキシカルボ-ル基、フエ-ル基で置換されたアルコキシカルボ-ル基、炭素数 5 力 7のシクロアルコキシで置換されたカルボ-ル基、フエノキシカルボ-ル基等が挙 げられる。
[0026] C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体お よびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数 1から 6のアルキルェ ステル、フエ-ル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル、炭素数 5から 7 のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数 1 力 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、フエ-ル基で置換された炭 素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子 を含んで 5から 7員環のァザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
[0027] 本発明はまた、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本 発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 DNAの形態であっても RNAの形態 であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配 列情報およびそれによりコードされる DNAの配列情報に基づき容易に製造することが できる。具体的には、通常の DNA合成や PCRによる増幅などによって、製造すること ができる。
[0028] 具体的には、例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列 番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載の アミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとヘルパーェピトープとを含有するェピトー プペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましくは、例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番 号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミ ノ酸配列よりなるペプチド、より好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと配列番号: 5に記載のアミノ酸配列よりなる ペプチドとを含有するェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号： 2、 配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド、より好 ましくは配列番号： 2、配列番号： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列よりなるぺ プチドと破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えば Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;配列番号： 6)とを含有す るェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド；若しくは配列番号： 2、配列番号： 8 、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号 ： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド、より好ましくは配列番 号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のアミノ酸配列よりなるペプチドと Ala Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe He Gly He Thr Glu Leu (配列番号： 7、 Clinical Cancer Res., 2001,7:3012- 3024)とを含有するェピトープペプチドをコードするポリヌ クレオチドなどを挙げることができる。
[0029] 前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、 本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。 ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択するこ とができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。
[0030] 例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pCR3等のプラスミドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 gtllなどのファージベクターが挙げられる 。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が 昆虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合に は、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミドベクタ 一や、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター などのウィルスベクターが挙げられる。
[0031] 前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。 また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST (ダルタ チオン S-トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されて いても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター (lac、 tac、 trc、 trp、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（ PGEX4Tなど）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisな ど）、さらにはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ pET32a)などを用いることができる。
[0032] 前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクタ 一を含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら れる。大腸菌としては、 E.coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 α株、 AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス'セルビジェなど が挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CHO細 胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては s!9などが挙 げられる。
[0033] 宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin;
Gibco-BRL社)を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常 の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質 転換細胞を選択することができる。
[0034] 以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な (ペプチドの発現可能な)条件下 で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたぺプ チドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離'精製することができる。ここ で精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァ フィ-ティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発 明のポリペプチドを、前述のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質とし て発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単 離'精製することができる。
[0035] 本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体 は、その形態に特に制限はなぐ本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗 体であっても、またモノクローナル抗体であっても良!、。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば 特に制限されないが、具体的には、配列番号: 2、配列番号 : 8、配列番号 :9、配列番 号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8また は配列番号: 9に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドに特異的に結合する抗体が挙 げられる。
[0036] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造すること; 0できる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、 Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989)。
[0037] 具体的には、本発明のペプチドを免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し 、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル 抗体の場合には、本発明のペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓 細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドーマ細胞の中から得ること 力 eさる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4：〜 11.11)。
[0038] 本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用い て免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、 フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン 、プル口-ックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットへモ シァニンおよびジニトロフエノールのような表面活性物質、 BCG (カルメット ゲラン 桿菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
[0039] 以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、 ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。 抗体の用途としては、ァフィユティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられ る。免疫学的診断は、ィムノブロット法、放射免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測定法 (E LISA)、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は 、 WT1遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多 発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細 胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の 診断において有効である。
[0040] 本発明は、本発明のペプチドと HLA-A26抗原との複合体の提示された抗原提示細 胞を提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により CTLの誘導が認められたが 、これは、本発明のペプチドと HLA-A26抗原との複合体の提示された抗原提示細胞 が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識する CTLが誘導されたことを示すもの である。このような、 HLA-A26抗原と本発明のペプチドとの複合体の提示された抗原 提示細胞は、後述する細胞療法 (DC療法）において有効に用いられる。
[0041] 本発明の抗原提示細胞は、本発明の癌抗原ペプチドと HLA-A26抗原との複合体 の提示された抗原提示細胞であれば良ぐ具体的には、例えば配列番号: 2、配列番 号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列 番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列 番号： 2、配列番号： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと HLA-A26抗原との複合体が榭状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙 げることができる。 [0042] 細胞療法 (DC療法）にお ヽて用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能 を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスする力、または 本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、 HLA-A26抗原と本発明の癌抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることに より作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可 能な HLA-A26抗原を細胞表面に発現して 、る細胞であれば特に限定されな 、が、 抗原提示能が高 、とされて 、る榭状細胞が好まし 、。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のぺプチ ドであっても良!、し、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含 有する発現ベクターであっても良い。
[0043] 本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、 該細胞に本発明のペプチド (例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番 号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、好ましくは配列番号: 2、配列番号 ： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド)を体外でパルス し、 HLA-A26抗原と本発明のペプチドとの複合体を作製することにより得られる (Cancer Immunol . Immunother . , 46： 82 , 1998 ^ J. Immunol. ,158:ρ1796, 1997、 Cancer Res.,59:pll84,1999)0榭状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコ ール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞を GM-CSFおよ び IL-4存在下で培養して榭状細胞を誘導し、当該榭状細胞を本発明のペプチドと共 に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができ る。
[0044] また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオ チド (例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、 配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配 列、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9に記載のアミノ酸配列を 含有するェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド）、あるいはそれを含有する 発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該 ポリヌクレオチドが DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607, 1998などを参考にして行うことができる。また、 DNAのみならず RNAの形態でも 同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、 J.Exp.Med., 184:
p465, 1996などを参考にすることができる。
[0045] 本発明はまた、本発明の癌抗原ペプチドと HLA-A26抗原との複合体を認識する CTLを提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により CTL誘導活性が認められた 。これは、本発明のペプチドと HLA-A26抗原との複合体の提示された抗原提示細胞 が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識する CTLが誘導されたことを示すもの である。このような、 HLA-A26抗原と本発明のペプチドとの複合体を特異的に認識す る CTLは、後述する養子免疫療法にぉ 、て有効に用いられる。
[0046] 本発明の CTLは、本発明のペプチドと HLA-A26抗原との複合体を特異的に認識 するものであれば良ぐ単一の CTLクローンであっても、様々な種類のクローンから なる CTL混合物 (集団）であってもよい。具体的には、例えば配列番号: 2、配列番号 : 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番 号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列番 号： 2、配列番号： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと HLA-A26抗原との複合体を特異的に認識する CTLを挙げることができる。
[0047] 養子免疫療法において用いられる CTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを 本発明のペプチド (例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配 列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載 のアミノ酸配列力 なる癌抗原ペプチド、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または 配列番号: 9に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）、あるいは本発明のぺプ チドをコードするポリヌクレオチド (例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配 列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番 号： 15に記載のアミノ酸配列、好ましくは配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9 に記載のアミノ酸配列を含有するェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド)や それを含有する発現ベクターでイン'ビトロで刺激する等により作製される (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669)。
[0048] 以上に記載した本発明のペプチド、本発明の発現ベクター、本発明の細胞、本発 明の抗原提示細胞、および本発明の CTLは、それぞれの物質に応じた適切な形態と することにより、 CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。 以下、具体的に説明する。
[0049] (1)本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、 CTLの誘導能を有するものであり、誘導された CTLは、細胞 傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って 本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすること ができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ヮクチ ン (癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンを HLA-A26陽 性かつ WT1陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞の HLA-A26抗原にペプチド（ 例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列 番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列、好 ましくは配列番号： 2、配列番号： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列力 なる 癌抗原ペプチド)が提示され、提示された HLA-A26抗原複合体を特異的に認識する CTLが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能と なる。本発明の癌ワクチンは、 WT1遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白 血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌 、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮 頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量を HLA-A26陽性 かつ WT1陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を 提供する。
[0050] 本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一の CTLェピトープ (例えば 配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12 、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列、好ましくは 配列番号： 2、配列番号： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原べ プチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLェピトープゃヘル パーェピトープ）と連結したェピトープペプチドを有効成分とするものであっても良 ヽ 。すなわち近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド）を連結したェピトープぺプチ ド力 イン'ビボで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、癌抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A2, -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結した約 30mer のェピトープペプチド力 S、イン.ビボでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを 誘導したことが記載されて 、る。また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結さ せたェピトープペプチドにより、効率的に CTLが誘導されることも示されている。この ようなェピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、そ の後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体 を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異 的な CTLが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療また は予防が達成される。
[0051] また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成 立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投 与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（ Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、具体 的には、菌体由来成分、サイト力イン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸ィ匕 アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性 剤、ポリア-オン、ペプチド、または油乳濁液 (ェマルジヨン製剤）などを挙げることが できる。また、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピ ッドを結合させた製剤なども考えられる。
[0052] 投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重 等により適宜調整することができる力 通常 0.0001mg〜1000mg、好ましくは O.OOlmg 〜1000mg、より好ましくは O.lmg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与す るのが好ましい。 [0053] (2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成 分とする DNAワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド を含有する発現ベクターもまた、癌の治療または予防のための DNAワクチンの有効 成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌク レオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン (癌ワクチンと しての医薬組成物）を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明の DNAワク チンの有効量を HLA-A26陽性かつ WT1陽性の患者に投与することにより、癌を治療 または予防するための方法を提供する。
[0054] 近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド）を連結したェピトープペプチドをコード するポリヌクレオチド、あるいは CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたェ ピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、 in vivoで効率的に CTL誘導活性を 有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には 、 HBV由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原ペプチド 3種 類、およびヘルパーェピトープを連結したェピトープペプチドをコードする DNA (ミニ ジーン）力 イン'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に誘導したこと が記載されている。
[0055] 従って、本発明のェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現べ クタ一に組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
[0056] 本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを癌ワクチン（DNAワクチン）の有効成 分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウィルスべ クタ一による方法およびその他の方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月 刊薬事， 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、およびこれらの引用文 献等）の 、ずれの方法も適用することができる。
[0057] ウィルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウィル ス、シンビスウィルス等の DNAウィルスまたは RNAウィルスに本発明の DNAを組み 込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好まし 、。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 (DNAヮクチ ン法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム 法、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リボソーム法が好 ましい。
[0058] 本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチ ドを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で DN Aを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス， 1994 年 4月号， 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、 およびこれらの引用文献等)。 in vivo法がより好ましい。
[0059] in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経 路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することが できる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一 般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有する注 射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレ ォチド含有発現ベクターを含有するリボソームまたは膜融合リボソーム (センダイウイ ルス (HVJ) -リボソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等の リボソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの含量は、治療目的の疾患、 患者の年齢、体重等により適宜調整することができる力 通常、 0.0001mg〜100mg、 好ましくは 0.001mg〜10mgの本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを、数日な いし数月に 1回投与するのが好ましい。
[0060] 以上のような本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの癌患者への投与により、 抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その 後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体 を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体を特異 的に認識する CTLが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、 癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現べクタ 一を有効成分とする癌ワクチンは、 WT1遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例え ば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、 胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、 子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
[0061] (3)本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から榭状細胞を誘導し、イン' ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に 戻す細胞療法 (DC療法）が報告されている（Cancer
Immunol. Immunother. ,46： 82 , 1998 , J.Immunol.,158:pl796,1997、 Cancer
Res.,59:pll84,1999、 Cancer Res.,56:p5672,1996、 J.Immunol.,161: p5607,1998、
J.Exp.Med., 184: p465,1996)。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法にお ける癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
[0062] 本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維 持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培地等を含むことが好ま しい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与 量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、 HLA-A26陽性かつ WT1陽性の患 者の体内で効率良く特異的な CTLが誘導され、癌を治療または予防することができ る。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、 WT1遺伝子の発現レべ ルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ 腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱 癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために 使用することができる。
[0063] (4)本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン (癌ワクチンとしての医薬組 成物）を提供する。本発明の CTLは、以下の養子免疫療法において有効に用いられ る。
[0064] メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養し、これを 患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159, 1994) oまたマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン'ビトロで癌抗原ペプチド TR P— 2で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的な CTLを増殖させ、該 CTLをメラノーマ移 植マウスに投与することにより、転移抑制が認められて 、る (
J.Exp.Med., 185:453,1997 )。これは、抗原提示細胞の HLA抗原と癌抗原ペプチドと の複合体を特異的に認識する CTLをイン'ビトロで増殖させた結果に基づくものであ る。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用 いて、イン'ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的 CTLを増やした後、この CTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明の CTLを、 養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
[0065] 本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチンは、 CTLを安定に維持するために、生理 食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法とし ては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文 献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、 HLA-A26陽性かつ WT1陽性の患 者の体内で CTLによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、 癌を治療することができる。本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチンは、 WT1遺伝 子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄 腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌 、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または 治療のために使用することができる。
[0066] 本発明はまた、本発明の癌抗原ペプチドと HLA— A26抗原とを含有する HLAモノマ 一、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を提供する。
癌免疫療法において、治療前に癌抗原 (癌抗原ペプチド）に対する CTL前駆細胞 の頻度や量を予め調べることや、癌抗原 (癌抗原ペプチド）による治療実施中の患者 における CTLの頻度や量を調べることは、当該癌抗原 (癌抗原ペプチド）に対する応 答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定などにお いて重要な指標となる。癌抗原ペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノマー、 HLA ダイマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、抗原 (抗原ペプチド)特異的 CTL の検出、すなわち当該 CTLの頻度や量を測定するための試薬として有用である。
[0067] ここで HLAテトラマーとは、 HLA抗原の α鎖と j8 2ミクログロブリンをペプチド（抗原べ プチド）と会合させた複合体 (HLAモノマー）をピオチン化し、アビジンに結合させるこ とにより 4量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、 Science 274: 94-96 (1996》。
HLAモノマーとは前記 HLAテトラマーの製造において用いられる、 HLA抗原 α鎖、 β 2ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をピオチンィ匕したもの（単量体)を指す。
[0068] HLAダイマーとは HLA抗原 α鎖と Ig (ィムノグロブリン、例えば IgGl)とを融合させ、こ れに j8 2ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6671-6675(1993》。 HLAダイマーに結合した抗原ぺプ チド特異的 CTLは、例えば標識抗 IgGl抗体を IgGlに結合させることなどにより、検出 することができる。
HLAペンタマ一とは近年開発された技術であり、 HLA抗原と抗原ペプチドとの複合 体 5分子が Coiled-Coilドメインを介して重合した 5量体を指す。 HLA抗原 抗原ぺプ チドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、 HLAテトラマー法と同様に フローサイトメーター等で解析することができる（http：〃 www.proimmune.co.uk/参照） 以上に述べた HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一はいずれも受 託合成可能であり、例えば Prolmmune社や BD Biosciences社などに委託することによ り合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有する HLAテトラマ 一なども市販されて ヽる ((株)医学生物学研究所等)。
[0069] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一として具体的には、 例えば配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列 番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のアミノ酸配列、好 ましくは配列番号： 2、配列番号： 8または配列番号： 9に記載のアミノ酸配列力 なる ペプチドと HLA-A26抗原とを含有する HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびべ ンタマーが挙げられる。このうち CTLの検出においては HLAテトラマーまたは HLAぺ ンタマーを用いることが好ましぐ HLAテトラマーを用いることがより好まし 、。
[0070] HLAモノマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、フローサイトメトリー、蛍光 顕微鏡等の公知の検出手段により結合した CTLを容易に選別または検出することが 出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン (PE)、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)、ベリジ-ンクロロフィルプロテイン（ PerCP)、ァロフィコシァニン (APC)などにより標識された HLAモノマー、 HLAテトラマ 一および HLAペンタマ一が挙げられる。
[0071] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である
HLA- A26抗原（HLA- A26抗原の α鎖）は、 Genbank Accession No.D 14350に開示さ れて 、る HLA-A26等の公知の塩基配列の情報に基づき、 PCR法等の常法により容 易にクロー-ングすることができる。
[0072] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である 13 2ミ クログロブリンは、ヒト由来の β 2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒト 13 2ミクログロブリ ンは GenBank Acc.No.AB021288に開示されているヒト j8 2ミクログロブリンの公知の 塩基配列情報に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローユングすることができる
[0073] HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一作製法にっ 、ては、前記各 文献により周知である力 具体的に HLAテトラマーの作製法につき簡単に述べると以 下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、 HLA-A26 a鎖発現べクタ 一および j8 2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例え ば BL21)を用いることが好まし 、。得られた単量体 HLA-A26複合体と本発明べプチ ドとを混合し、可溶性の HLA-ペプチド複合体を形成させる。次に HLA-ペプチド複合 体における HLA-A26 a鎖の C末端部位の配列を BirA酵素によりピオチンィ匕する。こ のピオチンィ匕された HLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを 4： 1のモル 比で混合することにより、 HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステツ プにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
[0074] 前記で本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一は、
HLA-A26結合性癌抗原ペプチド特異的な CTLの検出用試薬として有効に用いられ る。
本発明の CTL検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
1)本発明の癌抗原ペプチドによる治療開始前に、本発明の癌抗原ペプチドに対する CTL前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該癌抗原ペプチドに対する患者 の応答性を判断することができる。
2)本発明の癌抗原ペプチドによる治療実施中の患者における CTLの頻度や量を調 ベる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治療が順調に進ん で 、ることの確認などを行うことができる。
[0075] CTLの検出法としては、具体的には、被験患者より CTLを含む生体試料 (例えば PBMC)を単離し、本発明の HLAテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、 HLAテト ラマー等に結合した本発明ペプチド特異的な CTLの存在頻度または量を、フローサ イトメーター等で測定する。
[0076] 本発明にお 、てはまた、 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (配列番号： 3)のァ ミノ酸配列を含有するペプチド力 HLA-A*0201結合性癌抗原ペプチドであることを 初めて見出した。当該配列番号: 3に記載のペプチド配列は、 WO 00/18795号公報 において開示されている。し力しながら、 HLA-A*0201結合性癌抗原ペプチドとして の活性を有すること、そして細胞内プロセッシングにより WT1タンパク力も生じ、当該 ペプチドと HLA-A*0201抗原との複合体が細胞表面に提示され CTLにより認識される こと、そしてこのペプチドは治療上有効な癌抗原ペプチドであることは、本発明にお いて初めて見出された知見である。
[0077] 従って本発明は、以下の a)〜f )：
a)配列番号： 3に記載のアミノ酸配列を含有するペプチド、
b)上記 a)のペプチドを含有するェピトープペプチド、
c)上記 a)または b)のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、 d)上記 c)の発現ベクターを含有する細胞、 e)上記 a)のペプチドと HLA-A*0201抗原との複合体が提示されて ヽる抗原提示細胞 、および
f)上記 a)のペプチドと HLA-A*0201抗原との複合体を認識する CTL、
のなカゝから選ばれるいずれカゝと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を 提供する。
[0078] なお HLA-A*0201抗原の如き HLA-A2抗原においては、該 HLA抗原に結合して提 示される抗原ペプチドの配列の規則性 (モチーフ）が判明している。すなわち、 HLA-A2結合性ペプチドのモチーフとして、 8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの 第 2位のアミノ酸がロイシン、メチォニン、ノ リン、イソロイシンまたはグルタミンであり、 C末端のアミノ酸残基力パリンまたはロイシンであることが知られて 、る (
Immunogenetics ,41 ,ρ 178 , 1995 , J.Immunol.,155:p4749,1995)。よって前記配列番号 ： 3のペプチドの第 2位及び/または C末端のアミノ酸残基を、前記モチーフ上とり得る アミノ酸残基に置換することが可能である。従って、前記配列番号: 3のペプチドのみ ならず、前記モチーフ上の改変体である配列番号： 4のペプチド (ただし配列番号： 3 のペプチドは除く)も、癌抗原ペプチド活性を有する限り、同様の医薬組成物として 用!/、ることができる。
[0079] すなわち本発明は、以下の a) '〜； f) '：
a) '配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含有する癌抗原ペプチド、
b) '上記 a)'のペプチドを含有するェピトープペプチド、
c) '上記 a)'または b) 'のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現べクタ d) '上記 c) 'の発現ベクターを含有する細胞、
e) '上記 a)'のペプチドと HLA-A*0201抗原との複合体が提示されて ヽる抗原提示細 胞、および
f) '上記 a)'のペプチドと HLA-A*0201抗原との複合体を認識する CTL、
のなカゝから選ばれるいずれカゝと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を 提供する。
[0080] これら a)〜！)および a)'〜！) 'に記載の各物質の作製法、活性測定法、およびこれらの 物質の CTL誘導剤や癌ワクチンとしての用途については、全て本発明の HLA-A26 結合性癌抗原ペプチドとしての活性を有するペプチドのそれにおいて記載したとおり である。ただし配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11 、配列番号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のペプチド に替えて配列番号: 3または 4に記載のペプチドを用い、また HLA-A26抗原に替えて HLA- A*0201抗原を用いる。ここで HLA- A*0201抗原は Genbank Accession
No.M84379により公知である。
[0081] また本発明は、 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (配列番号： 3)に記載のアミ ノ酸配列を含有するペプチドと HLA-A*0201抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダ イマ一、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一、および、これらを成分として含有する WT1由来の HLA-A*0201結合性癌抗原ペプチド特異的な CTLの検出用試薬を提供 する。これら HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマー、 HLAペンタマ一、および これらを成分として含有する CTLの検出用試薬にっ 、ても、前記 HLA-A26結合性癌 抗原ペプチドとしての活性を有するペプチドのそれにおいて記載したとおりである。 ただし配列番号: 2、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号： 10、配列番号： 11、配列番 号： 12、配列番号： 13、配列番号： 14または配列番号： 15に記載のペプチドに替えて 配列番号： 3または 4に記載のペプチドを用い、また HLA-A26抗原に替えて HLA-A* 0201抗原を用いる。
[0082] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0083] HLA-A-0201に結合する抗原ペプチドの同定
ヒト WT1のアミノ酸配列（Cell 60:509, 1990、配列番号： 1)の第 7位から 15位に相当 する配列のペプチド (配列番号： 3)を固相合成法により合成した。
インフォームドコンセントを得た HLA-A*0201陽性の健常人より採血し、
FicoU- Hypaque分離液を用いて末梢血単核球 (PBMC)を分離した。 TAP遺伝子欠損 のため内因性のペプチドを HLAに提示できない HLA-A*0201陽性の T2細胞株（J. Immunol. 150: 1763, 1993)に、配列番号 3のペプチドを 20 Mの濃度で 2時間パルス した後、放射線照射（7500cGy)し、 PBMCと細胞数 1： 1の割合で混合培養を行った。 培養液には complete medium (45% AIM- V培地、 45% RPMI1640培地、 10%非働 化ヒト AB血清、 O.lmM MEM非必須アミノ酸、 100ng/mL streptomysin, 100IU/mL penicillin, 25ng/mL 2- mercaptoethanoはり成る）を用いた。 7日後、 2回目の刺激を同 様に行い、その翌日に 25IU/mLの IL-2 (塩野義製薬)を添加した。合計 5回の刺激を 行い、最後の刺激より 5日目に得られたエフェクター細胞を、細胞傷害活性の測定に 使用した。
[0084] 標的細胞に対する CTLの細胞傷害活性はクロミゥム遊離試験 (51Cr_release assay) にて測定した。すなわち、 51Crで標識した標的細胞 (全量 100 L中に 1 X 104個）を丸 底 96穴プレート内で様々な数のエフェクター細胞（100 μ L)と混合培養した。 37°Cに て 3〜5時間培養後、プレートを遠心し、上清 100 Lを回収し γ線を計測した。特異 的細胞傷害活性（％ specific lysis)は以下の通り計算した：
% specific lysis = (cpm experimental release― cpm spontaneous release)/(cpm maximal release― cpm spontaneous release) X 100。
[0085] 標的細胞の上清から自然遊離（spontaneous release)を、 1%トリトン X-100溶液で処 理した標的細胞の上清力も最大遊離 (maximal release)を、それぞれ測定した。有意 差検定は、 Student's t-testを用いて行った。刺激に用いたペプチドをパルスした T2 細胞、及びペプチドをパルスして 、な 、T2細胞を標的細胞として細胞傷害活性を測 定した結果を図 1に示す。配列番号： 3のペプチドをパルスした Τ2細胞の刺激で誘導 された CTLは、ペプチドをパルスしていない Τ2細胞に比して、ペプチドをパルスした Τ2細胞に対して、より強い細胞傷害活性を示した (ρ< 0.05)。この結果より、配列番 号: 3のペプチドの刺激により、 WT1タンパク質由来の配列番号: 3のペプチドを特異 的に認識する CTLが、 HLA- Α*0201陽性のヒト PBMC力も誘導されることが明ら力とな つた ο
[0086] 次に、配列番号： 3のペプチドで誘導された CTLの、 HLA-A*0201陽性で WT1を発 現している TF-1細胞株 (J. Cell. Physiol. 140: 323, 1989)、または HLA-A*0201陽性 であるが WT1を発現していない JY細胞株 0. Biol. Chem. 252, 1997)に対する細胞傷 害性を検討した。結果を図 2に示す。配列番号： 3のペプチドの刺激で誘導された CTLは TF-1細胞を傷害した力 JY細胞を傷害しなかった (pく 0.05)。この結果より、 配列番号： 3のペプチドは細胞内で内因性に発現する WT1タンパク質力 プロセシン グにより生じ、 HLA-A*0201分子とともに抗原提示され、 CTUこ認識されることが明ら カゝとなった。
実施例 2
[0087] HLA-A26に結合する杭原ペプチドの同定 (1)
ヒト WT1のアミノ酸配列（Cell 60:509, 1990、配列番号： 1)の第 368位から 376位に相 当する配列のペプチド (配列番号： 2)を固相合成法により合成した。
インフォームドコンセントを得た HLA-A26陽性の健常人より実施例 1と同様の方法 で PBMCを調製し、配列番号: 2のペプチドを添加して刺激を行った。 1週間後、 PBMCに配列番号: 2のペプチドをパルスし、これを刺激細胞として刺激をカ卩えた。こ の刺激を 1週間おきに合計 4回行った。さらに 1週間後に EBウィルスでトランスフォー ムした B細胞（B-LCL)に配列番号: 2のペプチドをパルスし、これを刺激細胞として刺 激を行った。最後の刺激の 5日後に配列番号: 2のペプチドをパルスした B-LCLとぺ プチドをパルスして ヽな 、B-LCLを標的細胞として、実施例 1と同様な方法でクロミゥ ム遊離試験により細胞傷害活性を測定した。結果を図 3に示す。配列番号 : 2のぺプ チドの刺激で誘導された CTLは、ペプチドをパルスしていない B-LCLに比して、ぺプ チドをパルスした B-LCLに対して、より強い細胞傷害活性を示した。この結果より、配 列番号： 2のペプチドの刺激により、 WT1タンパク質由来の配列番号： 2のペプチドを 特異的に認識する CTLが、 HLA-A26陽性のヒト PBMC力も誘導されることが明らかと なった。
なお、ここに用いた HLA-A26陽性健常人のジエノタイプは、 HLA-A*2601であること が判明している。
実施例 3
[0088] HLA-A26に結合する杭原ペプチドの同定 (2)
ヒト WT1のアミノ酸配列（Cell 60:509, 1990、配列番号： 1)の 152位から 160位に相当 する配列のペプチド（配列番号： 8)、 185位から 193位に相当する配列のペプチド（配 列番号： 9)及び 368位から 376位に相当する配列のペプチド (配列番号： 2)を固相合 成法により合成した。
インフォームドコンセントを得た HLA- A*2601陽性の健常人より実施例 1と同様の方 法で PBMCを調製し、配列番号: 8のペプチドを添加して刺激をかけた。 1週間後、 PBMCに配列番号: 8のペプチドをパルスし、これを刺激細胞として刺激をカ卩えた。こ の刺激を 1週間おきに合計 3回行った。 3回刺激後、ネガティブセレクション法で CD8 陽性の細胞を濃縮した。さらに配列番号: 8のペプチドによる刺激を 2回行った。最後 の刺激の 5日後に配列番号： 8のペプチドをパルスした B-LCLとペプチドをパルスして V、な 、B-LCLを標的細胞として、実施例 1と同様な方法でクロミゥム遊離試験により 細胞傷害活性を測定した。配列番号: 9のペプチド、および配列番号: 2のペプチドに ついても同様の実験を行った。結果を図 4に示す。配列番号: 8、配列番号: 9または 配列番号： 2のペプチドによる刺激で誘導された CTLは、ペプチドをパルスして ヽな ヽ B-LCLに比して、ペプチドをパルスした B-LCLに対して、より強い細胞傷害活性を示 した。この結果より、配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号: 2のペプチドの刺激により 、 WT1タンパク質由来の配列番号: 8、配列番号: 9、配列番号: 2のペプチドを特異的 に認識する CTLが、それぞれ、 HLA-A*2601陽性のヒト PBMCカゝら誘導されることが示 された。
産業上の利用可能性
[0089] 本発明により、 WT1由来の癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオ チド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含む CTLの誘導剤などが提供される。本発 明の CTLの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、 HLA-A26 または HLA-A*0201陽性の多くの癌患者に適用可能である。
図面の簡単な説明
[0090] [図 1]配列番号： 3のペプチド刺激で誘導された CTLの、ペプチドパルス T2標的細胞（ 図中黒丸）、またはペプチド非パルス T2標的細胞（図中白丸)に対する細胞傷害活性 を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は特異的細胞傷害活性 Specific lysis)を、また横軸はエフェクター細胞数 (E)と標的細胞数 (T)との比（E/T比)を示す。
[図 2]配列番号: 3に記載のペプチド刺激で誘導された CTLの、 HLA-A*0201陽性か つ WT1発現 TF-1細胞株（図中黒丸）、または HLA-A*0201陽性かつ WT1非発現 JY細 胞株（図中白丸）に対する細胞傷害活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦 軸は特異的細胞傷害活性 (％spedfic lysis)を、また横軸は E/T比を示す。
[図 3]配列番号： 2のペプチド刺激で誘導された CTLの、ペプチドパルス B-LCL標的 細胞（図中黒棒）、またはペプチド非パルス B-LCL標的細胞（図中白棒)に対する細 胞傷害活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は特異的細胞傷害活性（ %specific lysis)を す。
[図 4]配列番号: 2、配列番号: 8または配列番号: 9のペプチド刺激で誘導された CTL の、ペプチドパルス B-LCL標的細胞（図中黒棒）、またはペプチド非パルス B-LCL標 的細胞（図中白棒)に対する細胞傷害活性を調べた結果を示すグラフである。図中、 縦軸は特異的細胞傷害活性 (%specific lysis)を示す。
配列表フリーテキスト
配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 3に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号: 4に記載のアミノ酸配列において、第 2位のアミノ酸はロイシン、メチォ- ン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンであり、第 9位のアミノ酸はパリンまたは口イシ ンである。
配列番号： 5に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号: 6に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 7に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号: 8に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 9に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 10に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 11に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 12に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 13に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 14に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号： 15に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する、 HLA— A26結合性癌 抗原ペプチドとしての活性を有するペプチド。
[2] Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg (配列番号： 2)、 Val Thr Phe Asp Gly Thr
Pro Ser Tyr (配列番号： 8)、または Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr (配列番号: 9)に記載のアミノ酸配列を含有する、請求項 1記載のペプチド。
[3] ェピトープペプチドである請求項 1または 2記載のペプチド。
[4] 請求項 1〜3 、ずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[5] 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
[6] 請求項 5記載の発現ベクターを含有する細胞。
[7] 請求項 6記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする
、請求項 1〜3 、ずれか記載のペプチドの製造方法。
[8] 請求項 1または 2記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
[9] 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA— A26結合性癌抗 原ペプチド、好ましくは請求項 2記載のペプチドと HLA— A26抗原との複合体が提 示されて！/ゝる抗原提示細胞。
[10] 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA— A26結合性癌抗 原ペプチド、好ましくは請求項 2記載のペプチドと HLA— A26抗原との複合体を認 識する CTL。
[II] 請求項 1〜3いずれか記載のペプチド、請求項 5記載の発現ベクター、請求項 6記 載の細胞、請求項 9記載の抗原提示細胞、または請求項 10記載の CTLと、薬学的 に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[12] CTLの誘導剤として使用される、請求項 11記載の医薬組成物。
[13] 癌ワクチンとして使用される、請求項 11記載の医薬組成物。
[14] 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列に由来する HLA— A26結合性癌抗 原ペプチド、好ましくは請求項 2記載のペプチドと HLA— A26抗原とを含有する HL Aモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一。
[15] 請求項 14記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペン タマ一を成分として含有する、 WT1由来の HLA— A26結合性癌抗原ペプチド特異 的な CTLの検出用試薬。
[16] 以下の a)〜； 0 :
a) Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (配列番号： 3)に記載のアミノ酸配列を含有 するペプチド、
b)上記 a)のペプチドを含有するェピトープペプチド、
c)上記 a)または b)のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、 d)上記 c)の発現ベクターを含有する細胞、
e)上記 a)のペプチドと HLA— A*0201抗原との複合体が提示されている抗原提示 細胞、および
f)上記 a)のペプチドと HLA— A*0201抗原との複合体を認識する CTL、 のなかから選ばれるいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[17] CTLの誘導剤として使用される、請求項 16記載の医薬組成物。
[18] 癌ワクチンとして使用される、請求項 16記載の医薬組成物。
[19] Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (配列番号： 3)に記載のアミノ酸配列を含有 するペプチドと HLA—A*0201抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 H
LAテトラマーまたは HLAペンタマ一。
[20] 請求項 19記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペン タマ一を成分として含有する、 WT1由来の HLA— A*0201結合性癌抗原ペプチド 特異的な CTLの検出用試薬。
PCT/JP2005/006113 2004-03-31 2005-03-30 Ｗｔ１由来の癌抗原ペプチド WO2005095598A1 (ja)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/594,507 US7622119B2 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Cancer antigen peptides derived from WT1
EP05727848A EP1731605B1 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Cancer antigen peptides derived from wt1
DK05727848.3T DK1731605T3 (da) 2004-03-31 2005-03-30 Cancerantigenpeptider der er afledt af WT1
JP2006511744A JP4886507B2 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 Ｗｔ１由来の癌抗原ペプチド
AT05727848T ATE462003T1 (de) 2004-03-31 2005-03-30 Aus wt1 stammende krebsantigenpeptide
DE602005020121T DE602005020121D1 (de) 2004-03-31 2005-03-30 Aus wt1 stammende krebsantigenpeptide
SI200530954T SI1731605T1 (sl) 2004-03-31 2005-03-30 Peptidi antigena karcinoma izvedeni iz WT1
PL05727848T PL1731605T3 (pl) 2004-03-31 2005-03-30 Nowotworowe peptydy antygenowe pochodzące z WT1
US12/554,151 US8388975B2 (en) 2004-03-31 2009-09-04 Cancer antigen peptides derived from WT1
US13/748,984 US20130196427A1 (en) 2004-03-31 2013-01-24 Cancer antigen peptides derived from wt1

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-105219 2004-03-31
JP2004105219 2004-03-31

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/594,507 A-371-Of-International US7622119B2 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Cancer antigen peptides derived from WT1
US12/554,151 Continuation US8388975B2 (en) 2004-03-31 2009-09-04 Cancer antigen peptides derived from WT1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005095598A1 true WO2005095598A1 (ja) 2005-10-13

Family

ID=35063778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/006113 WO2005095598A1 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 Ｗｔ１由来の癌抗原ペプチド

Country Status (12)

Country Link
US (3) US7622119B2 (ja)
EP (2) EP1731605B1 (ja)
JP (1) JP4886507B2 (ja)
AT (1) ATE462003T1 (ja)
DE (1) DE602005020121D1 (ja)
DK (2) DK2186896T3 (ja)
ES (2) ES2341785T3 (ja)
HK (1) HK1144305A1 (ja)
PL (1) PL1731605T3 (ja)
PT (1) PT1731605E (ja)
SI (1) SI1731605T1 (ja)
WO (1) WO2005095598A1 (ja)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097358A1 (ja) 2006-02-22 2007-08-30 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Ｈｌａ－ａ＊３３０３拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物
WO2008081701A1 (ja) 2006-12-28 2008-07-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Ｈｌａ－ａ＊１１０１拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物
WO2008105462A1 (ja) 2007-02-27 2008-09-04 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. ヘルパーｔ細胞の活性化方法およびそのための組成物
EP2216041A1 (en) * 2007-11-20 2010-08-11 Nec Corporation Method for induction of cytotoxic t-cell, cytotoxic t-cell inducer, and pharmaceutical composition and vaccine each comprising the inducer
WO2012046730A1 (ja) 2010-10-05 2012-04-12 国立大学法人大阪大学 ヘルパーｔ細胞の活性化方法
WO2014042226A1 (ja) 2012-09-12 2014-03-20 株式会社癌免疫研究所 抗原特異的ヘルパーｔ細胞レセプター遺伝子
WO2014098012A1 (ja) 2012-12-17 2014-06-26 大塚製薬株式会社 ヘルパーt細胞の活性化方法
EP2762152A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation WT1 peptide cancer vaccine composition for transdermal administration
EP2762155A2 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine Composition
EP2762159A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation WT1 peptide cancer vaccine composition for transdermal administration
EP2762160A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Wt1 peptide cancer vaccine composition for mucosal administration
EP2762157A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine composition for transdermal or mucosal administration
EP2762156A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Tape preparation of WT1 peptide cancer vaccine for transdermal administration
EP2762154A2 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine composition for transdermal administration
EP2762153A2 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine composition for mucosal administration
WO2018088439A1 (ja) 2016-11-09 2018-05-17 国立大学法人大阪大学 Ｔ細胞集団の改変方法
US10124046B2 (en) 2003-11-05 2018-11-13 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. HLA-DR-binding antigen peptide derived from WT1
WO2019004415A1 (ja) * 2017-06-30 2019-01-03 国立大学法人大阪大学 末梢血ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を指標とする腫瘍免疫療法の効果予測方法
CN111978375A (zh) * 2020-08-28 2020-11-24 深圳市乐土生物医药有限公司 具有细胞毒性t细胞诱导能力的蛋白质或多肽
US10947503B2 (en) 2014-12-25 2021-03-16 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for modifying T cell population

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4422903B2 (ja) * 1998-07-31 2010-03-03 株式会社癌免疫研究所 癌抑制遺伝子ｗｔ１の産物に基づく癌抗原
WO2002079253A1 (fr) 2001-03-22 2002-10-10 Haruo Sugiyama Peptide modifie wt1
JP5230891B2 (ja) * 2001-09-28 2013-07-10 株式会社癌免疫研究所 抗原特異的ｔ細胞の新規な誘導方法
ES2538486T3 (es) * 2002-09-12 2015-06-22 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Preparación de péptidos antigénicos contra el cáncer
ES2332590T3 (es) 2003-01-15 2010-02-09 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Dimero peptidico.
KR101292971B1 (ko) * 2003-06-27 2013-08-12 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 Ｗｔ1 백신 적응 환자의 선택 방법
ATE462003T1 (de) * 2004-03-31 2010-04-15 Int Inst Cancer Immunology Inc Aus wt1 stammende krebsantigenpeptide
ES2542141T3 (es) 2005-10-17 2015-07-31 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Péptidos WT1 de unión a HLA de clase II, y composiciones y métodos que los comprenden
PT1961761E (pt) 2005-11-30 2010-12-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Novos compostos peptídicos do tumor de wilms
PL2010209T3 (pl) 2006-04-10 2017-04-28 Sloan Kettering Inst For Cancer Res Immunogeniczne peptydy WT-1 i sposoby ich użycia
WO2008108257A1 (ja) 2007-03-05 2008-09-12 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. 癌抗原特異的ｔ細胞のレセプター遺伝子およびそれによりコードされるペプチドならびにそれらの使用
KR20110053836A (ko) * 2009-11-16 2011-05-24 삼성에스디아이 주식회사 리튬 폴리머 이차 전지
CN105968191A (zh) 2011-06-28 2016-09-28 株式会社癌免疫研究所 肽癌抗原-特异性t细胞的受体基因
US9539299B2 (en) * 2011-10-27 2017-01-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Combination therapy with WT1 peptide vaccine and temozolomide
JP6368243B2 (ja) 2011-11-11 2018-08-08 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター がんのためのサイクリンａ１に標的化されたｔ細胞免疫療法
WO2013106834A2 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof
PL2945647T3 (pl) 2013-01-15 2021-03-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenne peptydy wt-1 i sposoby ich zastosowania
US10815273B2 (en) 2013-01-15 2020-10-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
US10023841B2 (en) * 2014-05-23 2018-07-17 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating breast cancer with dendritic cell vaccines
EP3177314B1 (en) 2014-08-04 2020-10-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center T cell immunotherapy specific for wt-1
CN106610423A (zh) * 2015-10-26 2017-05-03 复旦大学 评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒及其储存方法
CA3147717A1 (en) 2019-08-20 2021-02-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center T-cell immunotherapy specific for wt-1
CN112250752B (zh) * 2020-12-21 2021-03-26 中生康元生物科技(北京)有限公司 肿瘤新抗原表位肽及其应用
US20220227832A1 (en) 2020-12-21 2022-07-21 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
CA3204417A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Allogene Therapeutics, Inc. Knockdown or knockout of one or more of tap2, nlrc5, ?2m, trac, rfx5, rfxap and rfxank to mitigate t cell recognition of allogeneic cell products
US20240042030A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018795A2 (en) 1998-09-30 2000-04-06 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
JP4422903B2 (ja) * 1998-07-31 2010-03-03 株式会社癌免疫研究所 癌抑制遺伝子ｗｔ１の産物に基づく癌抗原
US20030235557A1 (en) * 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
GB9823897D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Imp College Innovations Ltd Immunotherapeutic methods and molecules
AU7859900A (en) 1999-10-04 2001-05-10 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
US20030082194A1 (en) * 2000-02-22 2003-05-01 Alexander Gaiger Compositions and methods for diagnosis and therapy of malignant mesothelioma
WO2002079253A1 (fr) * 2001-03-22 2002-10-10 Haruo Sugiyama Peptide modifie wt1
WO2003028758A1 (fr) * 2001-09-28 2003-04-10 Haruo Sugiyama Nouvelle methode d'induction de lymphocytes t specifiques d'un antigene
JP5230891B2 (ja) * 2001-09-28 2013-07-10 株式会社癌免疫研究所 抗原特異的ｔ細胞の新規な誘導方法
WO2003106682A1 (ja) * 2002-06-12 2003-12-24 中外製薬株式会社 Ｈｌａ−ａ２４拘束性癌抗原ペプチド
ES2538486T3 (es) * 2002-09-12 2015-06-22 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Preparación de péptidos antigénicos contra el cáncer
AU2003264514A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Wt1 substitution peptides
ES2332590T3 (es) * 2003-01-15 2010-02-09 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Dimero peptidico.
KR101292971B1 (ko) * 2003-06-27 2013-08-12 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 Ｗｔ1 백신 적응 환자의 선택 방법
US20080070835A1 (en) * 2003-11-05 2008-03-20 International Institute Of Cancer Immunology, Inc Hla-Dr-Binding Antigen Peptide Derived From Wt1
ATE462003T1 (de) * 2004-03-31 2010-04-15 Int Inst Cancer Immunology Inc Aus wt1 stammende krebsantigenpeptide

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018795A2 (en) 1998-09-30 2000-04-06 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
JP2002525099A (ja) * 1998-09-30 2002-08-13 コリクサ コーポレイション Ｗｔ１特異的免疫療法のための組成物および方法

Non-Patent Citations (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antibodies; A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBER LABORATORY PRESS
"Current protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY AND SONS
"Nen 3 Gatsu 1 Nichi", FUNAKOSHI NEWS, no. 2004, 1 March 2004 (2004-03-01), pages 1 - 13, XP002995886 *
"Peptide Synthesis", 1966, INTERSCIENCE
"Peptide Synthesis", 1975, MARUZEN, INC.
"Peptide Synthesis", vol. 14, 1991, HIROKAWA-SYOTEN
"Peptide Synthesis", vol. 14, 1991, HIROKAWA-SYOTEN, article "Iyakuhin no Kaihatsu"
"Peptide-Gosei no Kiso to Jikken", 1985, MARUZEN, INC.
"The Proteins", vol. 2, 1976, ACADEMIC PRESS INC.
BELLANTUONO I. ET AL: "Two distinct HLA-A0201-presented epitopes of the Wilms tumor antigen 1 can function as targets for leukemia-reactive CTL", BLOOD, vol. 100, no. 10, 2002, pages 3835 - 3837, XP002995885 *
CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER., vol. 46, 1998, pages 82
CANCER IMMUNOL.IMMUNOTHER., vol. 46, 1998, pages 82
CANCER RES., vol. 56, 1996, pages 5672
CANCER RES., vol. 59, 1999, pages 1184
CANCER RES., vol. 59, 1999, pages L184
CLIN. MICROBIOL. REV., vol. 7, 1994, pages 277 - 289
CLINICAL CANCER RES., vol. 7, 2001, pages 3012 - 3024
DAL PORTO J. ET AL: "A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6671 - 6675, XP002039180 *
DM. GLOVER: "DNA Cloning", 1985, IRL PRESS
GAO L. ET AL: "Selective elimination of leukemic CD34(+) progenitor cells by cytotoxic T lymphocytes specific for WT1", BLOOD, vol. 95, no. 7, 2000, pages 2198 - 2203, XP002337253 *
GEKKAN-YAKUJI, vol. 36, no. 1, 1994, pages 23 - 48
IMMUNITY., vol. 1, 1994, pages 751
IMMUNOGENETICS, vol. 41, 1995, pages 178
INT. J. HEMATOL, vol. 76, 2002, pages 127
INT. J. HEMATOL, vol. 78, 2003, pages 56
J. EXP. MED., vol. 184, 1996, pages 465
J. EXP. MED., vol. 185, 1997, pages 453
J. IMMUNOL., vol. 155, 1995, pages 4749
J. IMMUNOL., vol. 158, 1997, pages 1796
J. IMMUNOL., vol. 158, pages 1796
J. IMMUNOL., vol. 161, 1998, pages 5607
J. NATL. CANCER. INST., vol. 86, 1994, pages 1159
JIKKEN-IGAKU-ZOKAN, vol. 12, no. 15, 1994
JIKKENN-IGAKU-ZOKAN, vol. 12, no. 15, 1994
JOUMAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 190, 1999, pages 1669
JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 161, 1998, pages 3186 - 3194
JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 162, 1999, pages 3915 - 3925
NIKKEI-SCIENCE, April 1994 (1994-04-01), pages 20 - 45
T. MANIATIS ET AL.: "Molecular Cloning", 1983, CSH LABORATORY
TISSUE ANTIGEN, vol. 61, 2003, pages 136
ZINSZNER H. ET AL: "Nucleotide sequence of the HLA-A26 class I gene: identification of specific residues and molecular mapping of public HLA class I epitopes", HUM. IMMUNOL., vol. 27, 1990, pages 155 - 166, XP002995884 *

Cited By (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10124046B2 (en) 2003-11-05 2018-11-13 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. HLA-DR-binding antigen peptide derived from WT1
US11027003B2 (en) 2003-11-05 2021-06-08 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. HLA-DR-binding antigen peptide derived from WT1
EP2385117A1 (en) 2006-02-22 2011-11-09 International Institute of Cancer Immunology, Inc. HLA-A*3303-restricted WT1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
WO2007097358A1 (ja) 2006-02-22 2007-08-30 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Ｈｌａ－ａ＊３３０３拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物
EP2518149A1 (en) 2006-02-22 2012-10-31 International Institute of Cancer Immunology, Inc. HLA-A*3303-restricted WT1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
US9272026B2 (en) 2006-12-28 2016-03-01 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. HLA-A*1101-restricted WT1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
US8653038B2 (en) 2006-12-28 2014-02-18 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. HLA-A* 1101-restricted WT1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
EP2980219A1 (en) 2006-12-28 2016-02-03 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Hla-a*1101-restricted wt1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
EP2479276A1 (en) 2006-12-28 2012-07-25 International Institute of Cancer Immunology, Inc. HLA-A*1101-restricted WT1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
WO2008081701A1 (ja) 2006-12-28 2008-07-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Ｈｌａ－ａ＊１１０１拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物
EP3026115A1 (en) 2006-12-28 2016-06-01 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Hla-a*1101-restricted wt1 peptide and pharmaceutical composition comprising the same
EP2341142A2 (en) 2006-12-28 2011-07-06 International Institute of Cancer Immunology, Inc. HLA-A*1101-restricted WT1 peptide and pharmaceutical composition comprising same
CN103103246B (zh) * 2007-02-27 2018-05-01 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
CN103149366A (zh) * 2007-02-27 2013-06-12 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
JP2013139448A (ja) * 2007-02-27 2013-07-18 International Institute Of Cancer Immunology Inc ヘルパーｔ細胞の活性化方法およびそのための組成物
CN103103246A (zh) * 2007-02-27 2013-05-15 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
US11555814B2 (en) 2007-02-27 2023-01-17 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for activation of helper t cell and composition for use in the method
CN103088103A (zh) * 2007-02-27 2013-05-08 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
CN104774910A (zh) * 2007-02-27 2015-07-15 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
WO2008105462A1 (ja) 2007-02-27 2008-09-04 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. ヘルパーｔ細胞の活性化方法およびそのための組成物
US10139395B2 (en) 2007-02-27 2018-11-27 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for activation of helper T cell and composition for use in the method
EP2216041A1 (en) * 2007-11-20 2010-08-11 Nec Corporation Method for induction of cytotoxic t-cell, cytotoxic t-cell inducer, and pharmaceutical composition and vaccine each comprising the inducer
JPWO2009066462A1 (ja) * 2007-11-20 2011-04-07 日本電気株式会社 細胞傷害性ｔ細胞の誘導方法、細胞傷害性ｔ細胞の誘導剤、およびそれを用いた医薬組成物およびワクチン
EP2216041A4 (en) * 2007-11-20 2012-10-24 Nec Corp METHOD FOR INDUCING CYTOTOXIC LYMPHOCYTE T, CYTOTOXIC LYMPHOCYTE T INDUCER, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND VACCINE COMPRISING EACH INDUCER
WO2012046730A1 (ja) 2010-10-05 2012-04-12 国立大学法人大阪大学 ヘルパーｔ細胞の活性化方法
KR20190034359A (ko) 2010-10-05 2019-04-01 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 헬퍼 ｔ 세포의 활성화 방법
KR20200018738A (ko) 2010-10-05 2020-02-19 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 헬퍼 ｔ 세포의 활성화 방법
US10654892B2 (en) 2010-10-05 2020-05-19 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for activating helper T cell
EP3495483A1 (en) 2012-09-12 2019-06-12 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Antigen-specific helper t-cell receptor genes
WO2014042226A1 (ja) 2012-09-12 2014-03-20 株式会社癌免疫研究所 抗原特異的ヘルパーｔ細胞レセプター遺伝子
US11091531B2 (en) 2012-09-12 2021-08-17 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Antigen-specific helper T-cell receptor genes
US10815288B2 (en) 2012-09-12 2020-10-27 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Antigen-specific helper T-cell receptor genes
US20160009781A1 (en) 2012-09-12 2016-01-14 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Antigen-specific helper t-cell receptor genes
CN110195040A (zh) * 2012-12-17 2019-09-03 大塚制药株式会社 辅助性t细胞的活化方法
KR20150096697A (ko) 2012-12-17 2015-08-25 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 헬퍼 t세포의 활성화 방법
US9833493B2 (en) 2012-12-17 2017-12-05 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for activating helper T cell
WO2014098012A1 (ja) 2012-12-17 2014-06-26 大塚製薬株式会社 ヘルパーt細胞の活性化方法
EP2762155A2 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine Composition
EP3662927A2 (en) 2013-02-05 2020-06-10 Nitto Denko Corporation Vaccine composition
EP2762159A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation WT1 peptide cancer vaccine composition for transdermal administration
EP2762153A2 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine composition for mucosal administration
EP2762157A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine composition for transdermal or mucosal administration
EP2762154A2 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Vaccine composition for transdermal administration
EP2762152A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation WT1 peptide cancer vaccine composition for transdermal administration
EP2762160A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Wt1 peptide cancer vaccine composition for mucosal administration
EP2762156A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Nitto Denko Corporation Tape preparation of WT1 peptide cancer vaccine for transdermal administration
US10947503B2 (en) 2014-12-25 2021-03-16 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for modifying T cell population
US10899790B2 (en) 2016-11-09 2021-01-26 Osaka University Method for modifying T cell population
WO2018088439A1 (ja) 2016-11-09 2018-05-17 国立大学法人大阪大学 Ｔ細胞集団の改変方法
JPWO2019004415A1 (ja) * 2017-06-30 2020-03-19 国立大学法人大阪大学 末梢血ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を指標とする腫瘍免疫療法の効果予測方法
WO2019004415A1 (ja) * 2017-06-30 2019-01-03 国立大学法人大阪大学 末梢血ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を指標とする腫瘍免疫療法の効果予測方法
CN111978375A (zh) * 2020-08-28 2020-11-24 深圳市乐土生物医药有限公司 具有细胞毒性t细胞诱导能力的蛋白质或多肽
CN111978375B (zh) * 2020-08-28 2022-10-04 深圳市乐土生物医药有限公司 具有细胞毒性t细胞诱导能力的蛋白质或多肽

Also Published As

Publication number Publication date
ES2556232T3 (es) 2016-01-14
US8388975B2 (en) 2013-03-05
US20100062013A1 (en) 2010-03-11
JP4886507B2 (ja) 2012-02-29
ATE462003T1 (de) 2010-04-15
JPWO2005095598A1 (ja) 2008-02-21
DK2186896T3 (en) 2015-12-21
EP1731605B1 (en) 2010-03-24
PL1731605T3 (pl) 2010-08-31
DE602005020121D1 (de) 2010-05-06
EP1731605A4 (en) 2007-11-07
DK1731605T3 (da) 2010-05-25
SI1731605T1 (sl) 2010-07-30
US7622119B2 (en) 2009-11-24
PT1731605E (pt) 2010-04-14
US20130196427A1 (en) 2013-08-01
ES2341785T3 (es) 2010-06-28
EP2186896A1 (en) 2010-05-19
EP2186896B1 (en) 2015-11-04
US20080152631A1 (en) 2008-06-26
EP1731605A1 (en) 2006-12-13
HK1144305A1 (zh) 2011-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4886507B2 (ja) Ｗｔ１由来の癌抗原ペプチド
JP6145475B2 (ja) 癌抗原ヘルパーペプチド
KR101391561B1 (ko) Ｈｌａ-ａ*3303 구속성 ｗｔ1 펩티드, 및 그것을 포함하는 의약 조성물
JP4480580B2 (ja) Ｗｔ１置換型ペプチド
JP5281515B2 (ja) 腫瘍抗原タンパク質及びその利用
JP4516916B2 (ja) リビン由来のｈｌａ−ａ２４結合性癌抗原ペプチド
EP2363468B1 (en) Tumor antigen peptide and use thereof
JPWO2007066423A1 (ja) Ａｍａｃｒ由来の腫瘍抗原ペプチド
JP4414163B2 (ja) Ｐｓａ由来のｈｌａ−ａ２４結合性癌抗原ペプチド
US20160166666A1 (en) Tumor antigen peptide
JP4231284B2 (ja) Ｓｙｔ−ｓｓｘ改変ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511744

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10594507

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005727848

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005727848

Country of ref document: EP