PT1731605E - Péptidos antigénicos de cancro derivados de wt1 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS ANTIGÉNICOS DE CANCRO DERIVADOS DE WTl"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se à utilização de péptidos antigénicos de cancro derivados para WT1.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA 0 gene WT1 (gene 1 do tumor de Wilm) foi identificado como um dos genes causadores do tumor de Wilm que é um tumor renal infantil (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990). O gene WT1 codifica o factor de transcrição WT1 e o WT1 desempenha um papel importante em muitos processos, tais como proliferação, diferenciação e apoptose de células e desenvolvimento de tecidos (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998). O gene WT1 foi originalmente definido como um gene supressor de tumor. Contudo, estudos subsequentes revelaram que o gene WT1 é expresso na leucemia e vários cancros sólidos incluindo o cancro do pulmão e cancro da mama, indicando que o gene WTl exerce, por vezes, uma função oncogénica que promove o crescimento do cancro. Além disso, foi demonstrado in vitro que, quando as células mononucleares do sangue periférico positivas para HLA-A*0201 ou HLA-A*2402 são estimulados com péptidos derivados para WTl, são induzidos linfócitos T citotóxicos específicos para péptidos (CTL) que matam as células de leucemia ou de tumor sólido que expressa 1 endogenamente WT1. Estes resultados demonstraram que WT1 é uma molécula alvo promissora de imunoterapia do cancro (Int. J. Hematol 76: 127, 2002). Contudo, nunca foi elucidado se o referido WT1 contém um porção ou porções de péptido capazes de se ligarem ao antigénio HLA-A26 nem foi reportado que este é esse péptido(s).

Além disso, embora as sequências de ligação para um péptido antigénico de cancro capaz de ligação a HLA-A*0201 (um membro dos antigénios HLA-A2) tivessem sido deduzidas (documento WO 00/18795), apenas alguns péptidos antigénicos de cancro provaram ser eficazes até agora (documentos WO 00/06602 e WO 00/026249).

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

São divulgados péptidos antigénicos de cancro derivados para WT1, sua utilização como indutores de CTL, e semelhantes. O âmbito da protecção conferida é definido nas reivindicações. A presente requerente conduziu pesquisas intensivas que visavam a identificação de novos péptidos antigénicos de cancro derivados para WT1. Como resultado, foi divulgado que os péptidos mostrados nas SEQ ID N°: 2, 8 e 9 podem induzir CTL restritos a HLA-A26. Ou seja, a presente requerente verificou, pela primeira vez, que WT1 contém uma porção ou porções de péptido antigénico de cancro que se liga ao antigénio HLA-A26 entre várias subclasses de antigénio HLA e é reconhecido por CTL. Esta observação levou ao desenvolvimento de nova terapia de 2 vacina do cancro que pode induzir CTL específicos para WT1 em doentes com cancro positivos para HLA-A26. 0 péptido antigénico de cancro derivado para WT1 acima mencionado e um polinucleótido que codifica o mesmo e semelhantes, como aqui divulgado, podem ser utilizados eficazmente como um indutor de CTL, nomeadamente como vacina para o cancro. Além disso, os péptidos antigénicos de cancro como aqui divulgado podem ser utilizados eficazmente como um ingrediente de um agente de detecção para CTL específicos para WT1. A presente invenção foi estabelecida com base nestas observações.

Deste modo, a presente invenção refere-se a: (1) Utilização de um péptido de uma sequência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID N° 2, 8 e 9, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção do cancro num doente positivo para HLA-A26 . (2) Utilização de acordo com (1), em que a composição farmacêutica é uma vacina para o cancro. (3) Uma composição farmacêutica compreendendo um péptido de uma sequência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID N° 2, 8 e 9, para o tratamento ou prevenção de cancro num doente positivo para HLA-A26. 3 (4) Composição farmacêutica de acordo com (3), o qual é utilizado como um indutor de CTL. (5) Composição farmacêutica de acordo com (3), o qual é utilizado como uma vacina para o cancro. (6) Uma célula apresentadora de antigénio, a qual apresenta um complexo entre um péptido descrito em (1) e um antigénio de HLA-A26. (7) Um CTL que reconhece um complexo entre um péptido descrito em (1) e um antigénio de HLA-A26. (8) Um monómero, dimero, tetrâmero e pentâmero de HLA compreendendo um péptido descrito em (1), em conjunto com um antigénio HLA-A26. (9) Um reagente para a detecção de CTL específicos para um péptido antigénico do cancro de ligação a HLA-A26 derivado para WT1, em que o reagente compreende um monómero, dimero, tetrâmero e pentâmero de HLA descrito em (8) como um ingrediente.

Deste modo, é divulgada no contexto da presente invenção: (1) Um péptido derivado da sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N°: 1 e tendo actividade como um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26; (2) 0 péptido de (1) acima, compreendendo ou consiste em 8 - 11 aminoácidos contíguos na sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N°: 1; 4 (3) 0 péptido de (1) ou (2) acima, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 8 ou SEQ ID N°: 9; (4) Um péptido antigénico tumoral consistindo na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 8 ou SEQ ID N°: 9; (5) Um péptido epitopo compreendendo um péptido descrito em qualquer um de (1) a (4) acima; (6) Um polinucleótido que codifica um péptido descrito em qualquer um de (1) a (5) acima; (7) Um vector de expressão contendo o polinucleótido descrito em (6) acima; (8) Uma célula contendo o vector de expressão descrito em (7) acima; (9) Um processo para produzir um péptido descrito em qualquer um de (1) a (5) acima, compreendendo cultivar a célula descrita em (8) acima nas condições em que o péptido pode ser expresso; (10) Um anticorpo que se liga especif icamente a um péptido descrito em qualquer um de (1) a (4) acima; (11) Uma célula apresentadora de antigénio, na qual é apresentado um complexo entre um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26 derivado da sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N°: 1, cujo péptido é descrito em qualquer um de (2) a (4) acima, e um antigénio HLA-A26; (12) Um CTL que reconhece um complexo entre um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26 derivado da sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N°: 1, cujo péptido é descrito em qualquer um de (2) a (4) acima, e um antigénio HLA-A26; 5 (13) Uma composição farmacêutica compreendendo um péptido descrito em qualquer um de (1) a (5) acima, um vector de expressão descrito em (7) acima, uma célula descrita em (8) acima, uma célula apresentadora de antigénio, descrita em (11) acima, ou um CTL descrito em (12) acima, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável; (14) A composição farmacêutica de (13) acima, que é utilizada como um indutor de CTL; (15) A composição farmacêutica de (13) acima, que é utilizada como vacina para o cancro;

(16) Um monómero, dímero, tetrâmero ou pentâmero de HLA compreendendo um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26 derivado da sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N°: 1, cujo péptido é descrito em qualquer um de (2) a (4) acima, juntamente com um antigénio HLA-A26; (17) Um reagente para a detecção de CTL específico para um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26 derivado para WT1, cujo reagente compreende um monómero, dímero, tetrâmero ou pentâmero de HLA descrito em (16) acima, como um ingrediente. A presente invenção proporciona péptidos antigénicos de cancro derivados para WT1, polinucleótidos que os codificam, indutores de CTL que os compreendem, e semelhantes. 0 indutor de CTL da presente invenção é útil como vacina para o cancro. A vacina para o cancro da presente invenção é aplicável a muitos doentes de cancro que são positivos para HLA-A26. 6

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico que mostra os resultados das experiências, em que foi examinada a actividade citotóxica de CTL induzida por estimulação com um péptido de SEQ ID N° : 3 em células alvo T2 pulsadas (circulo a cheio) ou não pulsadas (círculo vazio) com o péptido. Na figura, o eixo vertical indica a actividade citotóxica especifica (% de lise específica) e o eixo das abcissas a proporção de E/T que é uma proporção do número de células efectoras (E) para o número de células alvo (T) . A Figura 2 é um gráfico que mostra os resultados de experiências em que foi examinada a actividade citotóxica de CTL induzidas por estimulação com um péptido de SEQ ID N°: 3 na linha celular TF-1 (círculos a cheio), que é positivo para HLA-A* 02 01 e expressa WT1 ou na linha celular JY (circulo vazio), que é positiva para HLA-A* 0201 e não expressa WT1. Na figura, o eixo vertical indica a actividade especifica citotóxica (% lise específica) e o eixo das abcissas a proporção E/T. A Figura 3 é um gráfico que mostra os resultados das experiências em que foi examinada a actividade citotóxica de CTL induzida pela estimulação com um péptido de SEQ ID N°: 2 em células alvo B-LCL pulsadas (barra sólida) ou não pulsada (barra vazia) com o péptido. Na figura, o eixo vertical indica a actividade citotóxica específica (% de lise específica). A Figura 4 é um gráfico que mostra os resultados das

experiências em que foi examinada a actividade citotóxica de CTL 7 induzida por estimulação com um péptido da SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 em células alvo B-LCL quer pulsadas (barras a cheio) ou não pulsadas (barra vazia) com o péptido. Na figura, o eixo vertical indica a actividade citotóxica especifica (% lise especifica).

MELHOR MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO É divulgado um péptido que é derivado da sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N° : 1 e tem actividade como um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26. A sequência de aminoácidos para WT1 humano apresentada em SEQ ID N°: 1 é uma sequência conhecida (Cell, 60: 509, 1990, NCBI N° Acesso da Base de dados XP_034418 e N° de Acesso. P19544) . A referida sequência de aminoácidos para WT1 humano é mostrada na SEQ ID N° : 1. Como antigénios HLA-A26, são

conhecidos HLA-A*2601, HLA-A*2602, HLA-A*2603 e semelhantes. A presente invenção refere-se ao antigénio HLA-A26, o qual é HLA-A* 2 6 01. No Japão, cerca de 20% da população partilha o antigénio HLA-A26 entre os antigénios HLA.

Foi verificado pela primeira vez que a sequência de aminoácidos para WT1 contém porções do péptido antigénico do cancro, capazes de ligação ao antigénio HLA-A26 e de serem reconhecidas por CTL, o que conduz ao estabelecimento da presente invenção.

No contexto da presente invenção, o termo "tendo (tem) actividade como um péptido antigénico de cancro de ligação a 8 HLA-A26" significa que um péptido tem uma actividade de ligação ao antigénio HLA-A26 é reconhecida por células T citotóxicas (CTL), e é sinónimo de "ligação ao antigénio de HLA-A26 e induzindo CTL (tendo uma actividade de indução de CTL)" ou "ligação ao antigénio HLA-A26 e activando CTL (tendo uma actividade de activação de CTL)". 0 péptido antigénico do cancro como reivindicado pode ser identificado sintetizando um péptido parcial (péptido candidato) consistindo em 8-11 aminoácidos contíguos na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 1 e ensaiando se o péptido tem ou não actividade como um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26. A síntese de péptidos pode ser realizada de acordo com um método geralmente utilizado no campo da química de péptidos. Um tal método pode ser encontrado na literatura incluindo Peptide Synthesis, Interscience, Nova Iorque, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., Nova Iorque, 1976; "Peptide Synthesis", Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; e Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991.

Pode ser examinado se um péptido candidato é ou não um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26 através de um método descrito em, por exemplo, Tissue Antigen 61: 136. 2003 ou um método descrito nos Exemplos de trabalho abaixo. Pode também ser examinado se um péptido candidato é ou não um péptido que tem actividade como um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26 de um modo semelhante. 9

Especificamente, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são, primeiro, isoladas de um indivíduo humano positivo para o antigénio HLA-A26 e cultivadas após adicionar (pulsar com) um péptido candidato. Após cultivo, a cultura é repetidamente estimulada várias vezes por adição de um péptido, a cada alguns dias, para amplificar CTL específicas para o péptido. Depois, a reacção específica para o péptido dos referidos CTL é detectada medindo citocinas, tais como IFN-γ produzido por CTL, ou a actividade citotóxica de CTL. A actividade citotóxica pode ser medida através de, por exemplo, ensaio de libertação de 51Cr (Int. J. Câncer, 58: p317, 1994) ou semelhantes. Exemplos de células alvo, utilizáveis no ensaio incluem células marcadas com 51Cr que são positivas para WT1 e positivas para HLA-A26. Exemplos específicos incluem células marcadas com 51Cr que são obtidas introduzindo um gene que codifica o gene de HLA-A26 (e. g., N° de Acesso do Genbank NO.D14350) numa linha celular de leucemia que é positiva para WT1 e negativa para HLA-A26.

Quando os resultados do ensaio acima demonstram que os CTL matam as células alvo ou produzem citocinas, o referido péptido candidato é identificado como sendo "um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26" ou "um péptido tendo actividade como um péptido antigénico de cancro de ligação a HLA-A26". A presente invenção divulga um péptido compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° : 2, 8 ou 9. Não existem limitações em relação ao comprimento desse péptido na condição de o referido péptido ter a actividade de ligação ao antigénio HLA-A26 e sendo reconhecido pelos CTL. Contudo, um péptido (péptido antigénico de cancro) tendo uma actividade de 10 ligação ao antigénio de HLA é conhecido por consistir geralmente em 8 a 11 aminoácidos. Consequentemente, a porção do péptido antigénico do cancro no péptido como divulgado no contexto da presente invenção, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° : 2, 8 ou 9 é um péptido, de um modo preferido, consistindo em 9 - 11 aminoácidos, de um modo mais preferido, 9-10 aminoácidos. De um modo ainda mais preferido, é um péptido antigénico de cancro consistindo na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° : 2, 8 ou 9 e de um modo muito preferido, um péptido antigénico de cancro consistindo na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 8 ou 9.

Os péptidos como divulgados no contexto da presente invenção podem ser alterados como apropriado dentro do intervalo no qual a actividade é mantida. Como aqui utilizado, a "alteração" de um resíduo de aminoácido significa substituição, deleção e/ou adição de um resíduo(s) de aminoácido(s) (a adição inclui a adição de aminoácido(s) no terminal N- e/ou C- do péptido). É preferida a substituição de um resíduo(s) de aminoácido(s). Quando a alteração envolve a substituição de um resíduo(s) de aminoácido(s) , qualquer número de resíduos de aminoácidos em qualquer posição pode ser substituído na condição de ser mantida a actividade como péptido antigénico de cancro. Contudo, uma vez que um péptido que se liga ao antigénio de HLA tem geralmente cerca de 8-11 aminoácidos de comprimento, a alteração, envolve, de um modo preferido, um até vários aminoácidos. A presente invenção também divulga um péptido (denominado um péptido epitopo) compreendendo um péptido da presente invenção juntamente com um péptido auxiliar ou outro péptido antigénico de cancro. 11

Recentemente, um péptido ("péptido epitopo") composto por múltiplos (vários) epitopos de CTL (péptidos antigénios) ligados em conjunto demonstrou ter uma actividade de induzir eficientemente CTL. Por exemplo, foi relatado que um péptido (cerca de 30-mero), em que os epitopos de CTL, cada um restrito a HLA-A2-, -A3, -All ou B53 originado da proteína PSA de antigénio de cancro são ligados em conjunto, induziu in vivo CTL específicos para os epitopos respectivos de CTL (Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194).

Além disso, um péptido (péptido epitopo), em que um epitopo (s) de CTL e um epitopo (s) auxiliar são ligados, demonstrou induzir eficientemente CTL. Neste contexto, "epitopo auxiliar" significa um péptido capaz de activar células T positivas para um CD4 (Immunity., 1:751, 1994) e exemplos deste incluem a origem do vírus de hepatite B HBVcl28-140, TT947-967 da origem da toxina do tétano, etc. Células T CD4+ activadas pelo referido epitopo auxiliar exercem várias actividades incluindo a indução e manutenção de CTL, diferenciação e activação de efectores, tais como macrófagos, etc., e consequentemente são considerado como sendo importantes na resposta anti-tumoral imunológica. Como um exemplo concreto de um péptido em que um epitopo auxiliar (s) e epitopo (s) CTL são ligados em conjunto, é relatado que um ADN (minigene) que codifica um péptido composto por péptidos antigénios restritos a HLA-A2 originado por HBV (6 péptidos), péptidos antigénios restritos a HLA-A11 (3 péptidos) e um epitopo auxiliar induziu in vivo CTL dirigidos aos respectivos epitopos eficientemente (Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925). Praticamente, um péptido em que um epitopo de CTL (péptido antigénico tumoral correspondendo à posição 280-288 de antigénio de melanoma gplOO) 12 e um epitopo auxiliar (epitopo auxiliar T originado da toxina do tétano) são ligados, foi submetido a teste clínicos (Clinicai Câncer Res., 2001, 7:3012-3024).

Consequentemente, os péptidos como reivindicados também incluem péptidos epitopo nos quais os epitopos múltiplos incluindo os péptidos acima mencionados da presente invenção são ligados e que possuem uma actividade de indução de CTL.

Quando o epitopo a ser ligado ao péptido antigénico de cancro como divulgado no contexto da presente invenção é um epitopo de CTL (péptido antigénico de cancro), exemplos de epitopos de CTL utilizáveis incluem epitopos de CTL derivados para WT1 capazes de se ligar a HLA-A*0201, -A*0204, -A*0205, -A*0206, -A*0207, -All, -A24, -A31, -A*6801, -B7, -B8, -B*2705, -B37, -Cw*0401 ou -Cw*0602 (Int. J. Hematol 76: 127, 2002; Int. J. Hematol 78: 56, 2003, documentos WO 00/06602, WO 00/18795). Números plurais destes epitopos de CTL podem ser ligados em conjunto e o comprimento de um epitopo de CTL pode ser cerca de 8-14 aminoácidos com base na análise de péptidos antigénio ligados a várias moléculas de HLA (Immunogenetics, 41: 178, 1995) .

Quando o epitopo a ser ligado ao péptido antigénico de cancro como divulgado no contexto da presente invenção é um epitopo auxiliar, exemplos de epitopos auxiliares utilizáveis incluem a acima mencionada origem HBVcl28-140 do vírus de hepatite B, origem TT947-967 da toxina do tétano, um epitopo auxiliar derivado para WT1 (Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His, SEQ ID N° : 5) e semelhantes. O 13 epitopo auxiliar pode ter cerca de 13-30 aminoácidos, de um modo preferido, cerca de 13-17 aminoácidos de comprimento.

Especificamente, os péptidos epitopo como divulgados no contexto da presente invenção são um péptido epitopo apresentado na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um péptido auxiliar.

Mais especificamente, os exemplos incluem um péptido epitopo compreendendo um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 5; um péptido epitopo que compreende um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 2, 8 ou 9 e um péptido auxiliar com origem na toxina do tétano (e. g., Phe Asn Asn Phe Thr Vai Ser Phe Trp Leu Arg Vai Pro Lys Vai Ser Ala Ser His Leu Glu, SEQ ID N°: 6); e um péptido epitopo compreendendo um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um péptido (Ala Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu, SEQ ID N°: 7; Clinicai Câncer Res., 2001,7:3012-3024). O péptido (péptido epitopo) em que epitopos múltiplos são ligados, pode ser preparada através de um método normal para a síntese de péptidos como descrito acima. Também se pode obter através de um método normal para a síntese de ADN e engenharia genética com base na informação de sequência de um polinucleótido que codifica um péptido epitopo em que epitopos múltiplos são ligados. Especificamente, um péptido epitopo em que epitopos múltiplos são ligados pode ser preparado através da inserção do referidos polinucleótido num vector de expressão conhecido, transformando uma célula hospedeira com o vector de 14 expressão recombinante resultante, cultivando as células transformadas resultantes, e recuperando o péptido epitopo objectivo, em que epitopos múltiplos são ligados a partir da cultura. Estes processos podem ser realizados de acordo com, por exemplo, um método descrito na literatura (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning; DM. Glover, IRL PRESS (1985)), ou o método aqui descrito adiante. A actividade de indução de CTL do péptido epitopo assim produzido em que os epitopos múltiplos são ligados pode ser examinada submetendo-o a, por exemplo, o ensaio de libertação de 51Cr acima mencionado.

Os péptidos acima descritos (incluindo péptidos epitopo) como divulgados no contexto da presente invenção podem ser modificados no grupo amino do aminoácido N-terminal e/ou no grupo carboxilo do aminoácido C-terminal. Assim, os péptidos em que o residuo de aminoácido N-terminal e/ou o C-terminal é modificado está dentro do âmbito do péptido como divulgado no contexto da presente invenção.

Exemplos de um grupo para a modificação do grupo amino do aminoácido N-terminal incluem 1 a 3 grupos seleccionados do grupo alquilo-Ci-6, grupo fenilo, grupo cicloalquilo e grupo acilo. Os grupos acilo incluem grupo alcanoílo-Ci_6, grupo alcanoílo-Ci_6 substituído pelo grupo fenilo, grupo carbonilo substituído pelo grupo cicloalquilo-C5-7, grupo alquil-sulf onilo-Ci_6, grupo f enilsulf onilo, grupo alcoxicarbonilo-C2-6f grupo alcoxicarbonilo substituído pelo grupo fenilo, grupo carbonilo substituído pelo grupo cicloalcoxilo C5_7, grupo fenoxicarbonilo, e semelhantes. 15

Exemplos de péptidos modificados no grupo carboxilo do aminoácido C-terminal incluem ésteres e amidas. Ésteres incluem ésteres de alquilo-Ci_6, ésteres de alquilo-Co-6 substituídos pelo grupo fenilo, ésteres de cicloalquilo-C5_7, e semelhantes. As amidas incluem especificamente amidas, amidas substituídas com um ou dois grupos alquilo-Ci-6, amidas substituídas com um ou dois grupos Co-6 que são substituídas pelo grupo fenilo, amidas formando azacicloalcano de 5- a 7- membros, inclusivamente de átomo de azoto de grupo amida, e semelhantes. A presente invenção também divulga um polinucleótido que codifica o péptido acima mencionado. 0 polinucleótido que codifica um péptido como divulgado no contexto da presente invenção pode estar na forma de ADN ou ARN. Os polinucleótidos como divulgados no contexto da presente invenção podem ser facilmente preparados com base na informação acerca da sequência de aminoácidos do presente péptido ou sequência do polinucleótido de ADN que o codifica. Especificamente, a síntese pode ser realizada utilizando o método normal de síntese de ADN ou amplificação por PCR. É também divulgado um polinucleótido que codifica um péptido epitopo compreendendo um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° : 2, 8 ou 9 e um epitopo auxiliar.

Um polinucleótido que codifica um péptido epitopo compreendendo um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 5; um polinucleótido que codifica um péptido epitopo compreendendo um 16 péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um péptido auxiliar com origem na toxina do tétano (e. g., Phe Asn Asn Phe Thr Vai Ser Phe Trp Leu Arg Vai Pro Lys Vai Ser Ala Ser His Leu Glu, SEQ ID N° : 6); e um polinucleótido que codifica um péptido epitopo compreendendo um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um péptido (Ala Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu, SEQ ID N°: 7; Clinicai Câncer Res., 2001, 7:3012-3024). O vector de expressão recombinante para expressar o péptido como divulgado no contexto da presente invenção pode ser construído incorporando um polinucleótido preparado acima num vector de expressão.

Um vector de expressão adequado pode ser seleccionado dependendo do hospedeiro a ser utilizado, objectivos, e semelhantes, e inclui plasmídeos, vectores fágicos, vectores virais, e semelhantes.

Quando o hospedeiro é Escherichia coli, os exemplos do vector incluem vectores plasmídicos, tais como pUC118, pUC119, pBR322, pCR3, e semelhantes; e vectores fágicos, tais como ΖΑΡΙI, gtll, e semelhantes. Quando o hospedeiro é levedura, exemplos de vector incluem pYES2, pYEUra3, e semelhantes. Quando o hospedeiro é células de insectos, exemplos de vector incluem pAcSGHisNT-A, e semelhantes. Quando o hospedeiro é células animais, exemplos de vector incluem vectores plasmídicos, tais como pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, pRc/CMV, e semelhantes; e vectores virais, tais como vector de retrovírus, vector adenovírus, vector vírus adeno-associados, e semelhantes. 17

Os vectores de expressão acima podem conter opcionalmente factor(es), tal como um promotor capaz de expressão de indução (promotor indutor de expressão), um gene que codifica uma sequência sinal, um gene marcador para a selecção, terminador e semelhantes.

Além disso, o vector de expressão pode conter uma sequência adicional para expressar o péptido como uma proteína de fusão com tiorredoxina, His tag, GST (glutationa S-transferase), ou semelhantes, de modo a facilitar o isolamento e purificação. Vectores utilizáveis nesse caso incluem vectores de proteína de fusão GST contendo um promotor apropriado (lac, tac, trc, trp, CMV, promotor precoce de SV40, etc.) que funciona em células hospedeiras, tal como pGEX4T; os vectores contendo a sequência Tag (Myc, His, etc.) tal como pcDNA3.1/Myc-His; e vectores capazes de expressar uma proteína de fusão com tiorredoxina e His tag, tais como pET32a.

As células transformadas contendo o vector como divulgado com contexto da presente invenção podem ser preparadas através da transformação de células hospedeiras com um vector de expressão obtido acima.

As células hospedeiras aqui utilizáveis incluem Escherichia coli, leveduras, células de insecto e células animais. Exemplos de Escherichia coli incluem estirpes de E. coli K-12, tais como HB101, C600, JM109, DH5 e AD494 (DE3). Exemplos de leveduras incluem Saccharomyces cerevisiae. Exemplos de células animais incluem células L929, BALB/c3T3, C127, CHO, COS, Vero e Hela.

Exemplos de células de insecto incluem sf9. 18 A introdução de um vector de expressão nas células hospedeiras pode ser realizada utilizando um método convencional adequado para as respectivas células hospedeiras acima. Especificamente, a introdução pode ser realizada utilizando o método de fosfato de cálcio, método de DEAE-dextrano, método de electroporação e um método utilizando lipidos para a transferência génica (Lipofectamina, Lipofectina; Gibco-BRL). As células transformadas contendo o vector de expressão podem ser seleccionadas cultivando as células hospedeiras após a introdução num meio convencional contendo um marcador de selecção. 0 péptido como divulgado no contexto da presente invenção pode ser produzido cultivando as células transformadas em condições apropriadas (condições sob as quais os péptidos podem ser expressos) . 0 péptido resultante pode ser ainda isolado e purificado de acordo com processos de purificação bioquímica convencionais. Os processos de purificação incluem precipitação salina, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de absorção, cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração em gel, e semelhantes. Quando o polipéptido da presente invenção foi expresso como um péptido de fusão com tiorredoxina, His tag, GST, ou semelhantes, como mencionado acima, o péptido pode ser isolado e purificado através de processos de purificação apropriado fazendo uso das características da proteína de fusão ou tags. A presente invenção revela um anticorpo que se liga especificamente a um péptido como divulgado no contexto da presente invenção. 0 anticorpo como divulgado no contexto da presente invenção não está restrito a qualquer forma e pode ser 19 anticorpo policlonal ou monoclonal criado contra um péptido como divulgado no contexto da presente invenção como um antigénio.

Como mencionado acima, não há limite em relação ao anticorpo como divulgado no contexto da presente invenção na condição de se ligar especificamente a um péptido como divulgado no contexto da presente invenção. Exemplos do anticorpo divulgam aqueles que se ligam especificamente a um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9. São bem conhecidos na técnica métodos de preparação de anticorpos e os anticorpos da presente invenção podem ser preparados através desses métodos convencionais (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et ai. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al., ed., Cold Spring Harber Laboratory Press, Nova Iorque 1989).

Especificamente, os anticorpos podem ser preparados através da imunização de um animal não humano, tal como coelho com um péptido como divulgado no contexto da presente invenção como um antigénio e recuperando os anticorpos a partir do soro do animal imunizado de um modo convencional. Por outro lado, podem ser obtidos anticorpos monoclonais através de imunização de um animal não humano, tal como murganho, com um péptido como divulgado no contexto da presente invenção, submetendo os esplenócitos resultantes a fusão celular com células de mieloma e recuperando os anticorpos das células de hibridoma resultantes (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11). 20

Os anticorpos contra o péptido como divulgado no contexto da presente invenção também podem ser produzidos enquanto se aumenta a resposta imunológica utilizando diferentes adjuvantes dependendo do hospedeiro. Exemplos de adjuvantes incluem adjuvantes de Freund; géis minerais, tal como hidróxido de alumínio; tensioactivos tais como lisolecitina, poliól Pluronic, polianião, péptido, emulsão de óleo, hemocianina de lapa e dinitrofenol; adjuvantes humanos, tais como BCG (Bacille de Calmette-Guerin) ou Corynebacterium, e semelhantes.

Como mencionado acima, os anticorpos que reconhecem um péptido como divulgado no contexto da presente invenção e os anticorpos que neutralizam a sua actividade podem ser facilmente preparados por imunização de um animal com um péptido da presente invenção, apropriadamente, de um modo convencional. Os anticorpos podem ser utilizados em cromatografia de afinidade, método de diagnóstico imunológico, e semelhantes. 0 método de diagnóstico imunológico pode ser seleccionado como apropriado de imunotransferência, radioimunoensaio (RIA), ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), um ensaio fluorescente ou luminescente, e semelhantes. 0 método de diagnóstico imunológico é eficaz no diagnóstico do cancro acompanhado por expressão elevada para WT1, por exemplo, cancros do sangue, tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cancros sólidos, tais como o cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro embrionário, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical e cancro dos ovários. 21 A presente invenção proporciona uma célula que apresenta antigénio que apresenta um complexo entre um péptido da presente invenção e um antigénio HLA-A26.

Como mostrado nos Exemplos abaixo, a estimulação com um péptido como reivindicado no contexto da presente invenção induziu CTL, que indica que existem células apresentadoras de antigénio apresentando um complexo entre um péptido como divulgado no contexto da presente invenção e um antigénio HLA-A26 e que CTL reconhecem especificamente as referidas células de apresentação de antigénio foram induzidas. Essas células que apresentam antigénio apresentam um complexo entre um péptido da presente invenção e um antigénio HLA-A26 são utilizadas eficazmente em terapia celular (terapia DC) como aqui descrito adiante.

As células que apresentam antigénio da presente invenção incluem quaisquer células que apresentam um complexo de um antigénio HLA-A26 e um péptido antigénico de cancro da presente invenção, em que é apresentado um complexo entre um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um antigénio HLA-A26, na superfície celular das células dendríticas.

As células que apresentam antigénios utilizadas na terapia celular (terapia DC) podem ser preparadas isolando células que possuem capacidade de apresentação de antigénio de um doente de cancro, pulsando as células in vitro com um péptido como reivindicado ou introduzindo nas células um polinucleótido ou um vector de expressão contendo o mesmo que é divulgado no contexto da presente invenção, e permitindo que as células apresentem um 22 complexo entre um antigénio HLA-A26 e um péptido antigénico de cancro como reivindicado, na superfície celular. As "células que possuem capacidade de apresentação de antigénio" não estão limitadas a células particulares e podem ser quaisquer células que expressam antigénio HLA-A26 capaz de apresentar um péptido da presente invenção na superfície celular; todavia, são preferidas as células dendríticas que possuem capacidade especialmente elevada de apresentação de antigénio.

Além disso, a substância com a qual as células que possuem capacidade de apresentação de antigénio acima são pulsadas pode ser um péptido da presente invenção ou um polinucleótido que codifica o péptido da presente invenção ou um vector de expressão que o contém.

As células que apresentam antigénio como reivindicado, podem ser preparadas por, por exemplo, isolando as células que possuem capacidade de apresentação de antigénio de um doente com cancro, pulsando as células in vitro com um péptido como divulgado no contexto da presente invenção (i. e., um péptido antigénico de cancro consistindo nas sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9), produzindo desse modo um complexo entre um antigénio HLA-A26 e o péptido da presente invenção (Câncer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158: pl796,1997, Câncer Res.r 59: pll84, 1999). Quando as células dendríticas são utilizadas, as células que apresentam o antigénio da presente invenção podem ser preparadas através de, por exemplo, isolamento dos linfócitos de sangue periférico de um doente com cancro através do método de Ficoll, removendo as células não aderentes, incubando as células aderentes na presença de GM-CSF e IL-4 para induzir células dendríticas e pulsando as células 23 dendríticas através de incubaçao com um péptido da presente invenção.

No caso em que as células que apresentam antigénio da presente invenção são preparadas através da introdução de um polinucleótido que codifica um péptido como reivindicado (i. e., um polinucleótido que codifica um péptido epitopo compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9,) ou um vector de expressão contendo o mesmo nas células acima mencionadas que possuem uma capacidade de apresentação de antigénio, a preparação pode ser realizada como referência a um método descrito em Câncer Res., 56:p5672, 1996 ou J. Immunol., 161:p5607, 1998 ou semelhantes, quando o polinucleótido é ADN. A preparação das células que apresentam antigénio pode ser realizada utilizando ARN, assim como ADN de um modo semelhante, em referência a J. Exp. Med., 184: p465, 1996, ou semelhantes. A presente invenção também proporciona CTL que reconhecem um complexo entre um péptido antigénico de cancro da presente invenção e um antigénio HLA-A26.

Como mostrado nos Exemplos abaixo, a estimulação com um péptido como reivindicado resultou na actividade de indução de CTL. Isto indica que existiram células que apresentam antigénio apresentando um complexo entre um péptido como divulgado no contexto da presente invenção e um antigénio HLA-A26 e que as CTL reconhecem especificamente as referidas células que apresentam antigénio foram induzidas. Esses CTL que reconhecem especificamente um complexo entre um antigénio HLA-A26 e um péptido como divulgado no contexto da presente invenção podem ser utilizados eficazmente na imunoterapia adoptiva, como aqui descrito adiante.

Os CTL da presente invenção podem estar em qualquer forma na condição de reconhecerem especificamente um complexo de um péptido reivindicado, com um antigénio HLA-A26 e incluem uma mistura monoclonal de CTL e mistura de CTL (população) compreendendo tipos de clones diferentes. Em particular, exemplos incluem CTL que reconhecem especificamente um complexo de um péptido consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 com um antigénio HLA-A26.

Os CTL utilizadas na imunoterapia adoptiva podem ser preparados através do isolamento de linfócitos do sangue periférico de um doente, estimulando as células in vitro com um péptido reivindicado (i. e., um péptido antigénico de cancro consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9) ou um polinucleótido que codifica um péptido como reivindicado (i. e., um polinucleótido que codifica um péptido epitopo compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 2, 8 ou 9) ou um vector de expressão que a contém (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669).

Os péptidos acima-descritos, os vectores de expressão, células, células que apresentam antigénio e CTL como divulgado no contexto da presente invenção podem ser utilizados como um ingrediente activo de um indutor de CTL, i. e., vacina para o cancro, formulando numa forma apropriada dependendo das respectivas substâncias, como aqui descrito adiante em maior detalhe. 25 (1) Vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo um péptido da presente invenção. 0 péptido como divulgado no contexto da presente invenção tem uma capacidade de indução de CTL e os CTL assim induzidos podem exercer a actividade anti-cancro através da acção citotóxica ou produção de linfocinas. 0 péptido como divulgado no contexto da presente invenção pode, por isso, ser utilizado como um ingrediente activo da vacina para o cancro para tratar ou prevenir o cancro. Assim, a presente invenção proporciona vacina para o cancro (composição farmacêutica como vacina para o cancro) compreendendo, como um ingrediente activo um péptido como reivindicado. Quando a vacina para o cancro da presente invenção é administrada a um doente positivo para HLA-A26 e positivo para WT1, o péptido (i. e., um péptido antigénico de cancro consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9) é apresentada ao antigénio HLA-A26 das células de apresentação de antigénio. Depois, os CTL que reconhecem especificamente o complexo de antigénio HLA-A26 apresentado podem proliferar e destruir as células de cancro, enquanto que o tratamento ou prevenção de cancro se torna possível. A vacina para o cancro da presente invenção pode ser utilizada na prevenção ou tratamento de cancro acompanhado por nível de expressão elevada do gene WTl, por exemplo, cancros do sangue, tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro embrionário, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro da cervical e cancro dos ovários. 26

Assim, noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de vacina para o cancro da presente invenção para utilização no tratamento ou prevenção de cancro num doente positivo para HLA-A26 e positivo para WT1. A vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo, um péptido da presente invenção, pode conter um único epitopo de CTL (i. e., um péptido antigénico tumoral consistindo na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2, 8 ou 9) ou um péptido epitopo em que um péptido é ligado com outro péptido (s) (epitopo de CTL, epitopo auxiliar, etc.) como um ingrediente activo. Recentemente, foi demonstrado que um péptido epitopo em que múltiplos epitopos de CTL (péptidos antigénios) são ligados, tem uma actividade de indução in vivo de CTL eficientemente. Por exemplo, foi relatado que péptido epitopo de cerca de 30-mero, em que os epitopos de CTL (péptidos antigénios) restritos a HLA-A2-, -A3, -All ou B53 com origem na proteína antigénio de cancro PSA estão ligados, induziu CTL in vivo específicos para os respectivos epitopos de CTL (Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194). Também foi relatado que um péptido epitopo, em que um epitopo (s) de CTL e um epitopo (s) auxiliar(es) estão ligados, pode induzir CTL eficientemente. Quando um péptido epitopo nestas formas é administrado, o referido péptido é incorporado em células que apresentam antigénio; os respectivos péptidos antigénios gerados por degradação intracelular ligam-se a antigénios HLA para formar complexos; os complexos são mostrados na superfície de células que apresentam antigénio em densidade elevada; e CTL específicos para os complexos proliferam eficientemente no corpo e destroem 27 as células cancerosas. Deste modo, o tratamento ou prevenção de cancro é alcançado. A vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo um péptido da presente invenção pode ser administrado juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um adjuvante apropriado ou na forma de partículas de modo a que a imunidade celular possa ser estabelecida eficazmente. Como um adjuvante, são aplicáveis aqueles descritos na literatura (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994), e semelhantes. Exemplos concretos incluem componentes derivados de microrganismos, citocinas, componentes derivados de plantas, componentes derivados de organismos marinhos, géis minerais, tal como hidróxido de alumínio, tensioactivos, tal como lisolecitina e polióis Pluronic, polianiões, péptidos, emulsão em óleo (preparações em emulsão), e semelhantes. Estão também contempladas preparações lipossomais, preparações particuladas nas quais o ingrediente está ligado a esferas que possuem um diâmetro de vários pm, preparações nas quais o ingrediente está ligado a lípidos, e semelhantes. A administração pode ser alcançada, por exemplo, intradermicamente, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. Embora a dosagem do péptido da presente invenção na formulação possa ser ajustada como apropriado, dependendo da doença a ser tratada, da idade e do peso corporal do doente, está normalmente no intervalo de 0,0001 mg - 1000 mg, de um modo preferido, 0,001 mg - 1000 mg, de um modo muito preferido, 0,1 mg - 10 mg, que podem ser administrados, de um modo preferido, uma vez em cada vários dias até a cada vários meses. 28 (2) Vacina de ADN compreendendo, como um ingrediente activo, um vector de expressão contendo um polinucleótido que codifica um péptido da presente invenção. Não apenas o péptido acima mencionado da presente invenção, mas também um vector de expressão contendo um polinucleótido que codifica um péptido da presente invenção pode ser um ingrediente activo da vacina de ADN para tratar ou prevenir o cancro. Assim, é divulgada uma vacina para o cancro (composição farmacêutica como vacina para o cancro) compreendendo como um ingrediente activo um vector de expressão contendo um polinucleótido que codifica um péptido da presente invenção.

Recentemente, um polinucleótido que codifica um péptido epitopo, em que múltiplos (vários) epitopos de CTL (péptidos antigénios) são ligado ou, em que um epitopo (s) de CTL e um epitopo auxiliar(es) são ligados, demonstrou ter uma actividade de indução de CTL in vivo eficientemente. Por exemplo, é relatado que um ADN (minigene) que codifica um péptido epitopo, em que péptidos antigénios restritos a HLA-A2 com origem em HBV (6 péptidos), péptidos antigénios restritos a HLA-A11 (3 péptidos) e um epitopo auxiliar são ligados, induziu in vivo CTL dirigidos aos respectivos epitopos eficientemente (Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925).

Consequentemente, um ingrediente activo da vacina para o cancro pode ser obtido através da incorporação de um polinucleótido que codifica um péptido epitopo como reivindicado, num vector de expressão apropriado. 29

Quando se administra um vector de expressão contendo um polinucleótido como divulgado no contexto da presente invenção como um ingrediente activo de vacina para o cancro (vacina de ADN), podem ser utilizados os seguintes métodos.

Como um método para introduzir um polinucleótido como divulgado no contexto da presente invenção nas células, são aplicáveis quaisquer meios incluindo aqueles que utilizam vectores virais ou outros métodos (Nikkei-Science, Abril, 1994, 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(15), 1994 e referências aí citadas).

Exemplos de um método que utiliza um vector virai incluem aqueles em que um ADN da presente invenção é incorporado no vírus de ADN ou ARN, tais como retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, vírus herpes, vírus vaccinia, poxvírus, poliovírus ou vírus Sindbis e depois introduzido nas células. Acima de tudo, um método que utiliza retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados ou vírus vaccinia, ou semelhantes, é particularmente preferido.

Exemplos de outros métodos incluem um método em que um plasmídeo de expressão é injectado directamente por via intramuscular (vacinação de ADN), método de lipossoma, método de Lipofectina, microinjecção, método do fosfato de cálcio e electroporação. São preferidos a vacinação com ADN e lipossoma.

Em relação a um método para permitir o polinucleótido como divulgado no contexto da presente invenção para actuar como um medicamento na prática, existe um método in vivo, em que o polinucleótido é introduzido directamente no corpo e um método 30 ex vivo, em que o ADN é introduzido extracorporeamente em certas células removidas de um humano e as células são reintroduzidas no corpo (Nikkei-Science, Abril, 1994, 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikkenn-Igaku-Zokan, 12(15), 1994; e referências aí citadas). O método in vivo é mais preferido.

No caso do método in vivo, a administração pode ser realizada através de quaisquer vias apropriadas dependendo da doença e dos sintomas a serem tratados. Por exemplo, pode ser administrada através de via intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intracutânea, intramuscular ou semelhantes. Quando a administração é realizada pelo método in vivo, a composição pode ser administrada em várias formas, tal como solução embora, seja tipicamente formulada, por exemplo, numa injecção contendo, como um ingrediente activo, um vector de expressão contendo um polinucleótido da presente invenção. A injecção pode conter um veículo convencional, se necessário. Os lipossomas ou lipossomas fusogénicos (tais como vírus Sendai (HVJ)-lipossomas), os quais contêm um vector de expressão contendo um polinucleótido como divulgado no contexto da presente invenção, podem estar na forma de formulação lipossomal, tais como suspensão, fármaco congelado, fármaco congelado concentrado por centrifugação, ou semelhantes.

Embora o conteúdo de um vector de expressão contendo um polinucleótido numa formulação possa ser ajustado como apropriado dependendo de, por exemplo, a doença a ser tratada, a idade e peso corporal de um doente, normalmente 0,0001 mg - 100 mg, de um modo preferido, 0,001 mg - 10 mg de um vector de expressão contendo um polinucleótido como divulgado no contexto 31 da presente invenção pode ser administrado uma vez em cada vários dias até cada vários meses.

Quando o vector de expressão acima mencionado contendo um polinucleótido como divulgado no contexto da presente invenção é administrado a um doente de cancro, um polipéptido correspondente ao referido polinucleótido é expresso em quantidade elevada em células apresentadoras de antigénio. Posteriormente, os péptidos antigénicos de cancro criados por degradação intracelular formam complexos com antigénios de HLA; os complexos são então mostrados na superfície de células que apresentam antigénio em densidade elevada; e os CTL que reconhecem especificamente os referidos complexos proliferam eficientemente no corpo e destroem as células cancerosas. Deste modo, o tratamento ou prevenção de cancro é alcançado. A vacina para o cancro compreendendo, como um ingrediente activo, um vector de expressão contendo um polinucleótido como divulgado no contexto da presente invenção pode ser utilizada na prevenção ou tratamento do cancro acompanhado pelo nível de expressão elevado do gene WT1, por exemplo, cancros do sangue, tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro embrionário, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro da cervical e cancro do ovário. (3) Vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo células que apresentam antigénio da presente invenção. 32 É divulgada uma vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo células que apresentam antigénio da presente invenção.

Recentemente, foi relatada uma terapia celular (terapia DC) compreendendo isolar linfócitos de sangue periférico de um doente com cancro, induzindo células dendriticas dos linfócitos, pulsando as células dendriticas com um péptido ou semelhante in vitro e reintroduzindo as células resultantes que apresentam antigénio, no doente, através de injecção subcutânea ou semelhante (Câncer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158: pl796, 1997, Câncer Res., 59: p 1184, 1999, Câncer Res., 56: p5672, 1996, J. Immunol., 161: p5607, 1998, J. Exp. Med., 184: p465, 1996). As células acima descritas que apresentam antigénio como divulgado no contexto da presente invenção podem, por isso, ser utilizadas como um ingrediente activo de vacina para o cancro a ser utilizado na terapia celular. A vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo células que apresentam antigénio como divulgado no contexto da presente invenção, contém, de um modo preferido, soro fisiológico, meio de solução salina tamponada com fosfato (PBS), ou semelhantes, para manter estavelmente as células que apresentam antigénio. Pode ser administrada, por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente ou intradermicamente. A dose é semelhante à descrita nas referências citadas acima.

Quando a vacina para o cancro acima é reintroduzida no corpo de um doente, os CTL específicos são induzidos eficientemente no corpo de um doente positivo para HLA-A26 e positivo para WT1, 33 através do qual o tratamento ou prevenção de cancro pode ser efectuado. A vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo células que apresentam antigénio como divulgado no contexto da presente invenção pode ser utilizada na prevenção ou tratamento de cancro acompanhada pelo nivel de expressão elevado do gene WT1, por exemplo, cancros do sangue tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro embrionário, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro da cervical, e cancro do ovário. (4) Vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo CTL da presente invenção. É divulgada uma vacina para o cancro (composição farmacêutica como vacina para o cancro) compreendendo como um ingrediente activo CTL da presente invenção, como definido nas reivindicações. Os CTL da presente invenção podem ser utilizados eficazmente na imunoterapia adoptiva como aqui descrito adiante.

Em melanomas, o foi observado o efeito terapêutico em imunoterapia adoptiva, em que as células T que se infiltram no tumor são removidas do doente e cultivadas ex vivo em grandes quantidades e regressadas para o mesmo doente (<J. Natl. Câncer. Inst., 86: 1159, 1994). Além disso, em melanoma de murganho, a supressão das metástases foi observada quando os esplenócitos foram estimulados com péptido antigénico de cancro TRP-2 in vitro para amplificar CTL específicos para o péptido antigénico 34 de cancro e os CTL são administrados a um murganho enxertado com melanoma (J. Exp. Med., 185:453, 1997). Isto resultou da proliferação in vitro de CTL que reconhecem especificamente um complexo entre um antigénio de HLA de células que apresentam antigénio e um péptido antigénico de cancro. Consequentemente, crê-se que seja eficaz um método terapêutico compreendendo a estimulação in vitro de linfócitos do sangue periférico de um doente com um péptido ou um polinucleótido ou um vector de expressão da presente invenção para proliferar CTL específicos para o cancro e regressando os CTL ao doente. Assim, os CTL como definidos nas reivindicações podem ser utilizados como um ingrediente activo de vacina para o cancro na imunoterapia adoptiva. A vacina para o cancro compreendendo, como um ingrediente activo, CTL como definido nas reivindicações, contém, de um modo preferido, soro fisiológico, meio de solução salina tamponada com fosfato (PBS), ou semelhantes, para manter, de uma forma estável os CTL. Pode ser administrada, por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente ou intradermicamente. A dose é semelhante à descrita nas referências citadas acima.

Quando a vacina para o cancro é regressada a um doente positivo para HLA-A26 e positivo para WT1, a acção citotóxica de CTL em células de cancro é aumentada no corpo de um doente, e as células do cancro são destruídas. Deste modo, o cancro pode ser tratado. A vacina para o cancro compreendendo como um ingrediente activo CTL como definido nas reivindicações pode ser utilizada na prevenção ou tratamento de cancro acompanhada por nível de expressão elevado do gene WT1 gene, por exemplo, cancros do sangue tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, 35 mieloma múltiplo e linfoma maligno, e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro embrionário, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro da cervical e cancro do ovário. A presente invenção também proporciona um monómero de HLA, um dimero de HLA, um tetrâmero de HLA ou um pentâmero de HLA compreendendo um péptido antigénico de cancro da presente invenção e antigénio HLA-A26.

Na imunoterapia do cancro, o exame da freguência ou quantidade de células precursoras de CTL dirigido a um antigénio do cancro (péptido antigénico de cancro) num doente antes do tratamento ou exame da frequência ou quantidade de CTL num doente durante o tratamento com um antigénio do cancro (péptido antigénico de cancro), pode proporcionar um indicador significativo na selecção de doentes com resposta elevada ao antigénio do cancro (péptido antigénico de cancro), a monitorização dos efeitos terapêuticos ou a avaliação da adequabilidade do tratamento. Um monómero de HLA, um dimero de HLA, um tetrâmero de HLA e um pentâmero de HLA, em que cada um deles compreende um péptido antigénico tumoral juntamente com um antigénio de HLA são úteis como um reagente na detecção de CTL específicos para o antigénio (péptido antigénico), especificamente, na medição da frequência ou quantidade de CTL.

Como aqui utilizado, o tetrâmero de HLA refere-se a um tetrâmero preparado através da biotinilação de um complexo (monómero de HLA) obtido por associação de uma cadeia α do antigénio de HLA e uma β2-microglobulina com um péptido (péptido 36 antigénico) e permitindo a ligação a avidina para tetramerização (Science 279: 2103- 2106 (1998); e Science 274: 94-96 (1996)). 0 monómero de HLA é um monómero que é utilizado na preparação do tetrâmero de HLA acima mencionado e é formado pela biotinilação de uma associação da cadeia α do antigénio de HLA, β2-microglobulina e péptido antigénico. 0 dímero de HLA é um dímero preparado através da fusão da cadeia α do antigénio de HLA e Ig (imunoglobulina, por exemplo, IgGl) e ligação da fusão resultante entre a p2-microglobulina e o péptido antigénico (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6671-6675 (1993)). Os CTL específicos para o péptido antigénico ligados ao dímero de HLA podem ser detectados através de, por exemplo, permitir que o anticorpo anti-IgG 1 se ligue a IgG 1. O pentâmero de HLA é uma técnica desenvolvida recentemente e refere-se a um pentâmero, em que cinco moléculas de um complexo compreendendo o antigénio de HLA e o péptido antigénico são polimerizadas através de um domínio "Coiled-Coil". Uma vez que o complexo antigénio de HLA-péptido antigénico pode ser marcado com fluorescência ou semelhantes, a análise pode ser realizada através de citometria de fluxo ou semelhante, de modo semelhante, semelhantes ao tetrâmero de HLA (ver, http://www.proimmune.co.uk/). 0 acima mencionado monómero, dímero, tetrâmero e pentâmero de HLA estão todos disponíveis através da produção sob pedido a um fabricante, tal como Prolmmune ou BD Biosciences. Presentemente, os tetrâmeros de HLA e semelhantes compreendendom 37 diferentes péptidos antigénios estão disponíveis comercialmente (Medicai & Biological Laboratories Co., Ltd., etc.)·

Exemplos do monómero, dímero, tetrâmero e pentâmero de HLA HLA da presente invenção, incluem, especificamente, monómeros, dímeros, tetrâmeros e pentâmeros de HLA cada compreendendo, um péptido com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 8 ou 9 e um antigénio de HLA-A26. De um modo preferido, um tetrâmero de HLA ou pentâmero de HLA e, de um modo mais preferido, um tetrâmero de HLA, é utilizado na detecção de CTL. 0 monómero de HLA, tetrâmero de HLA e pentâmero de HLA são, de um modo preferido, marcados com fluorescência de modo que os CTL ligados podem ser facilmente separados ou detectados através de uma medida de detecção conhecida, tal como citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, e semelhantes. Exemplos incluem monómeros, tetrâmeros e pentâmeros de HLA marcados com ficoeritrina(PE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína de peridinil clorofila (PerCP), aloficocianina (APC), ou semelhantes. 0 antigénio HLA-A26 (cadeia α de antigénio HLA-A26) que é um componente do monómero, dímero, tetrâmero e pentâmero de HLA da presente invenção pode ser clonado facilmente através de um método convencional, tal como PCR com base na informação sobre a sequência de bases conhecida de HLA-A26 e semelhantes, divulgada no N° de Acesso do Genbank D 14350. A 32-microglobulina, que é uma componente do monómero, dímero, tetrâmero e pentâmero de HLA da presente invenção é, de um modo preferido, de origem humana. A p2-microglobulina humana 38 pode ser clonada facilmente através de um método convencional, tal como PCR com base na informação sobre a sequência de bases conhecida da β2-microglobulina humana divulgada no N° de Acesso do Genbank AB021288. 0 processo para a preparação do monómero, dimero, tetrâmero e pentâmero de HLA é bem conhecido a partir das respectivas literaturas mencionadas acima; contudo, a preparação será aqui descrita em resumo mais adiante em relação ao tetrâmero de HLA.

Primeiro, uma célula hospedeira apropriada, tal como células de E. coli ou de mamíferos capazes de expressar uma proteína é transformada com um vector de expressão da cadeia α de HLA-A26 e um vector de expressão de β2-microglobulina e permitiu a expressão. De um modo preferido, é aqui utilizado E. coli (e. g., BL21) . 0 complexo de monómero de HLA-A26 resultante e um péptido da presente invenção são então misturados para formar um complexo HLA-péptido solúvel. A sequência C-terminal da cadeia cx de HLA-A26 do complexo HLA-péptido resultante é biotinilado com a enzima BirA. Quando um complexo HLA-péptido biotinilado e uma avidina marcada com fluorescência são misturados a uma proporção molar de 4:1, forma-se um tetrâmero de HLA. É preferido purificar a proteína resultante através de filtração em gel ou semelhante em cada passo acima. 0 monómero, dimero, tetrâmero e pentâmero de HLA descritos acima são utilizados eficazmente como um agente de detecção para CTL que são específicos para péptidos antigénios de cancro ligados a HLA-A26. 39 0 agente de detecçao de CTL da presente invenção pode ser utilizado para os seguintes objectivos, por exemplo. 1) Pode ser utilizado para examinar a frequência ou quantidade de precursores de CTL dirigidos a um péptido antigénico de cancro da presente invenção antes do tratamento com o péptido antigénico de cancro. Isto torna possível avaliar a capacidade de resposta de um doente ao péptido antigénico de cancro. 2) Pode ser utilizado para examinar a frequência ou quantidade de CTL num doente durante o tratamento com um péptido antigénico de cancro da presente invenção. Isto torna possível monitorizar os efeitos terapêuticos, avaliar a adequabilidade ao tratamento e confirmar que tratamento decorre favoravelmente, e semelhantes. A detecção de CTL pode ser realizada através de, especificamente, isolamento de uma amostra biológica (e. g., PBMC) contendo CTL de um indivíduo doente, levando um tetrâmero de HLA ou semelhantes, da presente invenção a entrar em contacto com a amostra biológica e medindo a frequência existente ou quantidade de CTL específicos para o péptido da presente invenção ligado ao tetrâmero de HLA, ou semelhante através de citometria de fluxo, ou semelhante. 40

EXEMPLOS A presente invenção é ainda ilustrada através dos exemplos seguintes, mas o âmbito de protecção conferido é definido nas reivindicações.

Exemplo 1

Identificação de Péptidos antigénicos que se Ligam a HLA-A* 0201

Um péptido tendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 3 que corresponde à da posição 7-15 da sequência de aminoácidos para WT1 humano (Cell 60: 509, 1990, SEQ ID N°: 1) foi sintetizada através de sintese em fase sólida.

Após obter consentimento informado, o sangue foi recolhido de indivíduos saudáveis positivos para HLA-A*0201 e foram isoladas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) utilizando solução de separação Ficoll-Hypaque. As linhas de células positivas para HLA-A*0201 incapazes de apresentação dos péptidos endógenos para HLA devido a deficiência no gene TAP (J. Immunol. 150: 1763, 1993) foram pulsadas com o péptido de SEQ ID N°: 3 a 20 μΜ durante 2 horas, depois irradiadas (7500 cGy) e co-cultivadas com PBMC até uma proporção de número de células de 1:1. Como solução de cultura, foi utilizado um meio completo composto de 45% de meio AIM-V, 45% de meio RPMI1640, 10% de soro humano inactivado, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais MEM, 100 ng/mL de estreptomicina, 100 IU/mL de penicilina e 25 ng/mL de 2-mercaptoetanol. Sete dias depois, a 41 segunda estimulação foi conduzida de um modo semelhante e, deste modo, foram adicionadas 25 IU/mL de IL-2 (Shionogi & Co., Ltd) no dia seguinte. A estimulação foi conduzida cinco vezes no total e as células efectoras obtidas após 5 dias da última estimulação, foram utilizadas na medição da citotoxicidade. A actividade citotóxica de CTL em células alvo foi medida através do ensaio de libertação de 51Cr. As células alvo marcadas com 51Cr (1 X 104 células/100 pL no total) foram co-cult ivadas com diferentes números de células efectoras (100 pL) numa placa de 96 poços de fundo redondo. Após cultura a 37 °C durante 3-5 horas, a placa foi centrifugada para separar o sobrenadante (100 pL) que foi submetido a medida do raio γ. A citotoxicidade pacifica (% de lise especifica) foi calculada como se segue:

% de lise especifica = (cpm de libertação experimental-cpm de libertação espontânea)/(cpm de libertação máxima- cpm de libertação espontânea)xlOO A "libertação espontânea" e a "libertação máxima" foram medidas no sobrenadante obtido da cultura de células alvo e pelo obtido da cultura de células alvo tratadas com solução de 1% de Triton X-100, respectivamente. O teste de diferença significativa foi conduzido pelo teste t de Student. A actividade citotóxica foi medida utilizando, como células alvo, as células T2 pulsadas com o mesmo péptido como utilizado na estimulação ou células T2 não pulsadas com o péptido. Os resultados são mostrados na Fig. 1. Os CTL induzidos por estimulação com células T2 pulsadas com o péptido de SEQ ID N°: 3 exerceu actividade citotóxica mais potente nas células T2 pulsadas com o péptido do que nas células T2 não pulsadas com o 42 péptido (p<0,05). Estes resultados demonstraram que os CTL que reconhecem especificamente o péptido derivado para WT1 de SEQ ID N° : 3 são induzidos de PBMC humanos positivos para HLA-A*0201 por estimulação com o péptido de SEQ ID N°: 3.

Depois, foi examinada a actividade citotóxica de CTL induzidos pelo péptido de SEQ ID N°: 3 em linhas de células TF-1 e JY, em que a linha de células TF-1 é positiva para HLA-A*0201 e expressa WT1 (J. Cell. Physiol. 140: 323, 1989), enquanto a linha de células JY é positiva para HLA-A*0201 mas não expressa WT1 (J. Biol. Chem. 252, 1997) . Os resultados são mostrados na Fig. 2. Os CTL induzidos através da estimulação com o péptido de SEQ ID N°: 3 matou as células TF-1 e não as células JY (p<0,05). Estes resultados demonstraram que um péptido de SEQ ID N°: 3 é produzido através do processamento da proteína WT1 endógena expressa intracelularmente, apresentado como um antigénio em conjunto com uma molécula HLA-A* 0201 e reconhecido por CTL.

Exemplo 2

Identificação dos Péptidos antigénicos que se Ligam a HLA-A26 (1)

Um péptido mostrado na SEQ ID N°: 2 que corresponde à posição 368-376 da sequência de aminoácidos para WT1 humano (Cell, 60:509, 1990, SEQ ID N° : 1) foi sintetizado por síntese em fase sólida.

Após ter sido obtido o consentimento informado, os PBMC foram preparados a partir de indivíduos saudáveis positivos para 43 HLA-A26 de uma forma semelhante à do Exemplo 1, e estimuladas pela adição do péptido de SEQ ID N° : 2. Uma semana depois, os PBMC foram pulsados com o péptido de SEQ ID N° : 2, e utilizados como estimuladores na estimulação. A estimulação foi conduzida todas as semanas 4 vezes no total. Uma semana depois, as células B (B-LCL) transformadas com o vírus EB foram pulsadas com o péptido de SEQ ID N°: 2, e utilizadas como estimuladores na estimulação. Após 5 dias a partir da estimulação final, A actividade citotóxica foi medida através do ensaio de libertação de 51Cr de uma forma semelhante à do Exemplo 1 utilizando, como células alvo, as células B-LCL pulsadas com o péptido de SEQ ID N° : 2 e as células B-LCL não pulsadas com o péptido. Os resultados são mostrados na Fig. 3. Os CTL induzidos por estimulação com o péptido de SEQ ID N° : 2 exerceram uma actividade citotóxica mais potente em células B-LCL pulsadas com o péptido do que em células B-LCL não pulsadas com o péptido. Estes resultados demonstraram que os CTL que reconhecem especif icamente o péptido derivado para WT1 de SEQ ID N°: 2 são induzidos de PBMC humanos positivos para HLA-A26 através da estimulação com o péptido de SEQ ID N°: 2. 0 genótipo de indivíduos saudáveis positivos para HLA-A26 aqui utilizados é conhecido por HLA-A*2601. 44

Exemplo 3

Identificação dos Péptidos antigénicos que se Ligam a HLA-A26 (2)

Os péptidos mostrados nas SEQ ID N°: 8, 9 e 2 que correspondem à posição 152-160, 185-193 e 368-376, respectivamente, da sequência de aminoácidos do WT1 humano (Cell, 60: 509, 1990, SEQ ID N°: 1) foram sintetizados pela síntese do estado sólido.

Após ter sido obtido o consentimento informado, os PBMC foram preparados a partir de indivíduos saudáveis positivos para HLA-A26 de uma forma semelhante à do Exemplo 1, e estimulados por adição de um péptido de SEQ ID N°: 8. Uma semana depois, os PBMC foram pulsados com o péptido de SEQ ID N°: 8 e utilizados como estimuladores na estimulação. A estimulação foi conduzida todas as semanas durante 3 vezes no total. Após 3 vezes de estimulação as células positivas para CD8 foram enriquecidas pelo método de selecção negativo. Além disso, a estimulação com o péptido de SEQ ID N°: 8 foi conduzido 2 vezes. Após 5 dias da estimulação final, a actividade citotóxica foi medida através do ensaio de libertação de 51Cr de uma forma semelhante ao Exemplo 1 utilizando, como células alvo, células B-LCL pulsadas com o péptido de SEQ ID N°: 8 e as células B-LCL não pulsada com o péptido. As experiências foram efectuadas do mesmo modo como acima utilizando um péptido de SEQ ID N°: 9 e um péptido de SEQ ID N°: 2. Os resultados são mostrados na Fig. 4. Os CTL induzidos pela estimulação com o péptido de SEQ ID N°: 8 , 0 péptido de SEQ ID N°: 9 ou o péptido de SEQ ID CM o exerceu uma actividade citotóxica mais potente em células B-LCL pulsadas com 45 o péptido do que me células B-LCL não pulsadas com o péptido. Estes resultados demonstraram que os CTL reconhecem especificamente o péptido derivado para WT1 de SEQ ID N°: 8, 9 e 2 são induzidos em PBMC humanos positivos para HLA-A26 por estimulação com o péptido de SEQ ID N°: 8, 9 e 2, respectivamente.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Os péptidos antigénicos de cancro derivados para WT1, polinucleótidos que codificam o mesmo, indutores de CTL compreendendo o mesmo, e semelhantes, são divulgados no contexto da presente invenção. 0 indutor de CTL como divulgado no contexto da presente invenção é útil como vacina para o cancro. A vacina para o cancro no contexto da presente invenção é aplicável a muitos doentes com cancro que são positivos para HLA-A26 ou HLA-A* 0201.

TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 2 é um péptido sintético. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 3 é um péptido sintético.

Na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 4, o segundo aminoácido é leucina, metionina, valina, isoleucina ou glutamina e o nono aminoácido é valina ou leucina. 46 A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 5 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 6 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 7 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 8 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 9 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 10 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 11 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 12 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 13 é um A sequência de péptido sintético. aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 14 é um 47 3 um A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 15 e péptido sintético. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Sugiyama, Haruo <120> Péptidos antigénicos de Cancro derivados para WT1 <13 0> 665070 <150> JP 2004-105219 <151> 2004-03-31 <160> 15 <1 7 0> Patentln versi <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens 48 <4 Ο 0> 1

Met Gly Ser Asp Vai Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Vai Pro 15 10 15

Ser Lau Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Vai Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gin Trp Ala Pro Vai Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe I l.e Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Aia Phe Thr Vai His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 1 io <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sitético 49 <4Ο0> 2

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile 130 135 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Vai Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Vai Pro Pro Pro Vai Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220

Asn Leu Tyr Gin Met Thr.Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Vai Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255

Ser Vai Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro I le Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg I le 27 5 280 285

His Thr His Gly Vai Phe Arg Gly I le Gin Asp Vai Arg Arg Vai Pro 290 295 300 50 <210> 3 <211> 9

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 3

Gly Vai Ala Pro Thr Leu Vai Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320

Arg Pro Phe Hat Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335

Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350

Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365

Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Vai Lys Pro Phe Gin 370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415

Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Vai 420 425 430

Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445

Leu 51 <210> 4 <211> 9

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <220> <221> característica_misc <222> (2) . . (2) <223> Xaa é Leu, Met, Vai, Ile ou Gin. <220> <221> característica_misc <222> (9) . . (9) <223> Xaa é Vai ou Leu. <400> 4 Asp Xaa Asn Ala Leu Leu Pro Ala Xaa 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> <22 0> Artificial <223> Péptido sintético 52 <4Ο0> 5

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His 15 10 15 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 6

Phe Asn Asn Phe Thr Vai Ser Phe Trp Leu Arg Vai Pro Lys Vai Ser 15 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 7

Ala Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly Ile Thr Glu Leu 15 10 15 53 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 8

Vai Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 9

Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético 54 <4 Ο 0> 10

Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 11

Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <40 0> 12

Gly Vai Phe Arg Gly lie Gin Asp Vai Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 55 <220> <223> Péptido sintético <400> 13 Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala lie Arg 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <40 0> 14 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 15

Ala Leu Leu Pro Ala Vai Pro Ser Leu 1 5

Lisboa, 7 de Abril de 2010 56

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um péptido de uma sequência como apresentado em qualquer uma das SEQ ID N° : 2, 8 e 9 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção do cancro num doente positivo para HLA-A26.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a composição farmacêutica é uma vacina para o cancro.
3. 3. Composição farmacêutica compreendendo ou péptidos de uma sequência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID N°: 2, 8 e 9, para utilização num método para o tratamento ou prevenção do cancro num doente positivo para HLA-A26.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a composição farmacêutica é utilizada como um indutor de CTL.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a composição farmacêutica é utilizada como uma vacina para o cancro.
6. 6. Célula apresentadora de antigénio, em que é apresentado um complexo entre um péptido descrito na reivindicação 1 e um antigénio HLA-A26.
7. 7. CTL que reconhece um complexo entre um péptido descrito na reivindicação 1 e um antigénio HLA-A26. 1
8. 8. Monómero, dímero, tetrâmero ou pentâmero de HLA compreendendo um péptido descrito na reivindicação 1, em conjunto com um antigénio HLA-A26.
9. 9. Reagente para a detecção de CTL específicos para um péptido antigénico de cancro que se liga a HLA-A26 derivado para WT1, em que o reagente compreende um monómero, dímero, tetrâmero ou pentâmero de HLA, descrito na reivindicação 8, como um ingrediente. Lisboa, 7 de Abril de 2010 2