CN106610423A - 评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒及其储存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒及其储存方法，所述试剂盒包括MHC限制性抗原肽。本发明评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒，能够利用处于临床试验阶段的治疗性疫苗研究数据库与标本，并应用流式细胞技术，对免疫细胞及其分泌的细胞因子进行全面检测，从而建立细胞免疫学疗效评价体系。并且所述评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒稳定性好，储存一年以上时稳定性仍能保持90％以上。

Description

评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒及其储存方法
技术领域
本发明涉及一种用于评价疫苗疗效的试剂盒、以及所属试剂盒的储存方法，尤其涉及一种通过细胞免疫学检测进行疫苗疗效评价的试剂盒、以及所述试剂盒的储存方法。
背景技术
目前，预防性疫苗的评价手段相对简单，主要以跟踪随访队列为主，评价抗体水平及人群保护效力，如流感疫苗、乙肝预防性疫苗、天花疫苗等等。在对预防性疫苗作用进行综合评价中，常常以疫苗所产生的抗体滴度作为一个核心指标，而近十年来随着检测手段的加强，特别是新型细胞免疫评价技术的发展，预防性疫苗的评价也开始触及适应性免疫的重要细胞——T细胞，如预防性的流感、天花等疫苗的效果研究中，除了检测了IgG之外，也对T细胞所表达的少数细胞因子IFN-γ、IL-2等进行了检测，由此来推测疫苗的长期影响和保护效果。
治疗性疫苗的研制已覆盖了多种类型的慢性感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和神经退行性疾病等。在治疗性疫苗近二三十年的发展过程中，遭遇了诸多瓶颈，以致于目前仅有4种治疗性疫苗获得成功上市。瓶颈之一就是尚未找到一种在临床研究的早期，可以用来预测疫苗临床疗效的普适的免疫学替代终点，如预防性疫苗评价的替代终点——中和抗体。由于缺乏这一普适的替代终点，使得目前治疗性疫苗的评价不得不依赖于临床治疗后最终的疗效，而临床疗效的获得要求大样本，以及长时间、耗力、耗经费的IIb或III期临床试验，一旦所选择的剂量、用法或策略存在不足，即便治疗性疫苗本身确实有效，亦无法获得满意的疗效评价，从而大大地延迟此类产品的上市，甚至扼杀了这类技术和产品。
如今，治疗性疫苗的研发和各种关键技术手段日新月异，但对于治疗替代终点与最终临床效果平行评价方法学的研究，国内外仍属空白，从治疗性疫苗问世至今，尚无统一、标准、完善的评价手段出现。目前临床评价治疗性疫苗主要在于受试者临床表型的变化、治疗性疫苗所诱导产生的抗体以及相应免疫记忆能力，评价体系较为单一。而这种单一的评价方式只能针对于所研发治疗性疫苗的有效与否给予初步的结论，无法从治疗性疫苗对于免疫系统整体影响的评价来预测其治疗效果，更无法从本质上解释受试者治疗成功或失败的根本原因。
治疗性疫苗对于免疫系统的整体影响，主要体现在对各类免疫细胞的抗原特异性影响方面。但此类评价的细胞免疫学指标国内外研究尚处于初期，没有统一的标准去对研发的治疗性疫苗进行有效的评价，如何从特异性细胞免疫学水平上，通过免疫细胞上重要的生物学标志物进行治疗性疫苗的评价是现今研发领域所面临的重大问题。
对于评价体系的摸索，目前研究最多的治疗性疫苗是人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗。HIV的治疗性疫苗至今已有三十多年的时间，在不断的失败中摸索前进，对于HIV的治疗性疫苗评价的研究也有了新的进展，最初的评价为能生成广泛的HIV包膜特异性中和抗体，及病人病毒量、CD4+T细胞数量的变化等HIV临床表征的评价，却无法从免疫学角度预测疫苗的治疗效果，解释治疗性疫苗有效或失败的原因，以及以后的改进方向问题，从而大大地延迟此类疫苗的上市，甚至扼杀有效疫苗探索。随着HIV病毒作用机理研究的深入，目前大多数的HIV疫苗诱导的保护重点是CD8+T细胞的反应，因而在评价临床疫苗的过程中开始涉猎CD8+T细胞单一表达功能性细胞因子如IFN-γ、TNF-α等的评价，但是这种评价也是不全面的，而且如果分别独立地进行多种指标评价将在极大程度上消耗珍贵的临床样品。
伴随免疫学及病毒学的进一步发展深入，在疫苗的评价中逐渐认识到从单一的某一群淋巴细胞或者是某一种细胞因子并不能全面和系统的评价疫苗产生作用的方式及成败的原因。于是在HIV疫苗的临床评价方面，在受试过程及后期随访过程中，利用多色流式细胞仪技术对血液中CD8+T细胞表达所有相关细胞因子进行总体评价，与相关临床表型相结合，找出多能性的一种或者几种类型的CD8+T细胞亚群作为疫苗效果预测评价指标，已成为HIV疫苗评价的一条新的发展思路，并被逐步地应用于正在开发中的结核治疗性疫苗、乙肝治疗性疫苗、肿瘤治疗性疫苗等的评价中。
而目前国内治疗性疫苗研究的热点之一是乙型肝炎治疗性疫苗。乙肝治疗性疫苗最初的评价主要是针对于乙肝五项抗原抗体指标、HBV DNA水平和ALT的水平。这些指标只能在评价的最后给出治疗和预防方法是否起到了保护作用，无法预测治疗性疫苗可能起到的效果及成败的原因。后来随着治疗性疫苗评价的深入，人们也开始关注血清中各种细胞因子的水平以及T细胞免疫应答的水平。研究表明，乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+T细胞能够通过分泌细胞因子，清除感染肝细胞的病毒。这些细胞因子主要是干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)和直接的细胞毒作用(穿孔素和颗粒酶)，从而诱导细胞死亡。因此体外检测CD8+T细胞的功能成为目前细胞免疫学检测的重点，并且通过细胞因子表达的水平，能够从一定程度上推测治疗性疫苗可能的治疗效果。但与HIV所不同的是，在慢乙肝病人中，人们发现大多数病人的T细胞处于病毒诱导的免疫耐受状态，在体外并不能够在抗原的再次刺激下很好地表达功能相关的细胞因子。因此，如何活化CD8+T细胞使其恢复对抗原应答的功能，成为体外评价HBV治疗性疫苗治疗效果的一个难点。通过研究发现，在体外采用特异性或者非特异性富集的方式，能够很好地重新激发T细胞的活性，使其恢复对抗原的应答能力。
而且随着进一步的探入研究，人们发现了越来越多的T细胞的分类亚群，而T细胞的整体功能的体现是各种亚群细胞相互影响、共同作用的结果，只检测某一种T细胞亚群或者是某一类特殊功能的亚群并不能够完整的体现免疫系统的整体影响，随着多色流式仪器等技术的进一步发展，我们已经能够在一个细胞中同时检测十几种甚至二十几种细胞因子，因此，我们不仅可以检测CTL细胞的功能，我们还能够同时检测辅助性T细胞(Th细胞)、调节性T细胞(Treg细胞)在疫苗注射后细胞因子表达水平的变化，这就为全面地评价疫苗对于细胞因子整体表达的影响及疫苗疗效间关系提供了可能性。
上世纪80年代，复旦大学医学院闻玉梅院士率领课题组通过分析我国慢性乙型肝炎患者大多为母婴传播所导致的对HBV耐受的特点，认为患者对乙肝表面抗原的免疫耐受为我国乙型肝炎发生慢性化的主要机理，据此提出组建新抗原、改变耐受原的提呈方式，构建乙肝治疗性疫苗以消除机体对病毒抗原的免疫耐受，达到治疗乙型肝炎的目的，进而构建了乙肝表面抗原(HBsAg)和人抗HBs免疫复合物疫苗——乙克(抗原抗体复合物型治疗性乙型肝炎疫苗)。在研究中发现，在慢乙肝患者体内HBsAg很难被树突状细胞(DC细胞)识别进行抗原递呈，而按一定比例组建成HBsAg-抗HBs复合物，它可以通过抗体的Fc段介导，HBsAg可经抗原呈递细胞表面的Fc受体被动地带进抗原呈递细胞。
目前，乙克疫苗成为唯一一个进入III期临床试验的慢性乙型肝炎治疗性疫苗。临床试验结果证实了乙克对于慢性乙肝的治疗效果，但是目前除了临床表现结果之外，尚无特定的免疫学评价指标或替代终点对乙克的治疗效果进行早中期评价，因此在免疫学层面上，仍缺乏对治疗慢性乙肝疫苗的免疫学替代终点的研究。
发明内容
为了对治疗性疫苗临床治疗效果进行免疫学评价，本发明提供了一种新的评价疫苗效果的细胞免疫学检测试剂盒。
本发明第一个方面是提供一种评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒，包括MHC(主要组织相容性复合体，Major Histocompatibility Complex)限制性抗原肽。
所述疫苗优选为治疗性疫苗。
其中，所述抗原表位肽可以是肿瘤细胞表面的抗原表位肽和/或病毒表面的抗原表位肽中的任意一种或几种。
其中，所述病毒优选为对人和动物致病的病毒，并优选为疱疹病毒、流感病毒、狂犬病病毒、天花病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、HIV病毒、人类乳头瘤病毒中的任意一种或几种。
其中，所述肿瘤可以是胃肠道肿瘤(如胃癌、结肠癌、直肠癌等)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、恶性畸胎瘤、甲状腺肿瘤、颅内肿瘤、食管癌、膀胱癌、皮肤癌、血癌、淋巴瘤、子宫肌瘤、宫颈癌、泌尿道肿瘤、骨肿瘤等。
其中，所述MHC限制性抗原肽优选为至少包括如下a)、b)抗原表位肽中的任意一种或几种：a)针对CD4+T细胞抗原表位肽和/或CD8+T细胞抗原表位肽，b)所述表位抗原氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有该抗原表位肽功能的氨基酸序列。
在一种优选实施例中，所述MHC限制性病毒抗原肽优选为至少包括如下a1)、b1)抗原表位肽中的任意一种或几种：a1)针对CD4+T细胞乙肝表面抗原(HBsAg)表位肽和/或CD8+T细胞乙肝表面抗原(HBsAg)表位肽，b1)所述表位抗原氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有HBsAg抗原表位肽功能的氨基酸序列。
上述的抗原表位肽可以是任意已知的抗原表位肽。
在一种更优选实施例中，所述针对CD4+T细胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列中的任意一种或几种：
FFLLTRILTI；
FFLLTRILTIPQSLD；
TSLNFLGGTTVCLGQ；
QSPTSNHSPTSCPPIC；
CTTPAQGNSMFPSC；
CTKPTDGN；
WASVRFSW；
LLPIFFCLW；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD4+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
在一种更优选实施例中，所述针对CD8+T细胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列中的任意一种或几种：
VLQAGFFLL；
FLLTRILTI；
FLGGTPVCL；
LLCLIFLLV；
LVLLDYQGML；
LLDYQGMLPV；
WLSLLVPFV；
GLSPTVWLSV；
SIVSPFIPLL；
ILSPFLPLL；
LLVPFVQWFV；
FLPSDFFPSI；
FLPSDFFPSV；
CLTFGRETV；
EYLVSFGVW；
TPPATRPPNAPIL；
KYTSFPWL；
IPIPSSWAF；
WMMWYWGPSLY；
ILLLCLIFLL；
RWMCLRRFII；
RFSWLSLLVPF；
LYNILSPFL；
PFLPLLPIF；
PFVQWFVGL；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
在一种更优选实施例中，所述针对CD8+T细胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列组A)-C)中的任意一组或几组：
A)CD8+T细胞A2HBsAg表位肽
VLQAGFFLL；
FLLTRILTI；
FLGGTPVCL；
LLCLIFLLV；
LVLLDYQGML；
LLDYQGMLPV；
WLSLLVPFV；
GLSPTVWLSV；
SIVSPFIPLL；
ILSPFLPLL；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列；
B)CD8+T细胞HBV混合表位肽
FLLTRILTI；
WLSLLVPFV；
GLSPTVWLSV；
LLVPFVQWFV；
FLPSDFFPSI；
FLPSDFFPSV；
CLTFGRETV；
EYLVSFGVW；
TPPATRPPNAPIL；
KYTSFPWL；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列；
C)CD8+T细胞非A2HBsVg混合表位肽
IPIPSSWAF；
WMMWYWGPSLY；
ILLLCLIFLL；
RWMCLRRFII；
RFSWLSLLVPF；
LYNILSPFL；
PFLPLLPIF；
PFVQWFVGL；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
本发明上述内容中，针对CD4+T细胞HBsAg表位肽和针对CD8+T细胞HBsAg表位肽可以单独使用，也可以组合使用。
本发明上述内容中，各组针对CD8+T细胞HBsAg表位肽可以是单独使用，也可以是两组或三组组合使用。
在一种优选实施例中，所述评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒还可以包括待测细胞的富集激活信号和共刺激信号。
在一种优选实施例中，所述富集激活信号选择为凝集素类分子、离子霉素(Iono)和/或抗-CD3抗体中的任意一种或几种，并优选至少包括抗-CD3抗体。
其中，本发明所述凝集素类分子指的是凝集素以及具有凝集素功能的凝集素衍生物。
其中，所述凝集素可以是豆科植物凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素(如黄精凝集素)。
所述黄精凝集素如：多花黄精凝集素(PMA)、新疆黄精凝集素(PRA)、囊丝黄精凝集素(PCA)中的一种或几种。
所述都可植物凝集素如：如刀豆凝集素(如Con A)、豌豆凝集素、花生凝集素、蚕豆凝集素、二花扁豆凝集素、菜豆凝集素中的一种或几种。
在一种优选实施例中，所述共刺激信号优选为至少包括抗-CD28抗体。
本发明所述待测细胞优选为病毒特异性T细胞。
所述病毒特异性T细胞更优选为分离自所述病毒感染者。
本发明上述内容中，所述T细胞的亚群可以是包括辅助性T细胞(Th1、Th2和Th17)、杀伤性T细胞(Tc1和Tc17)以及调节性T细胞(Treg和Tcreg)。
本发明上述内容中，所述T细胞的标志物分子包括CD3、CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α、IL-2、MIP-1β、IL-17A、IL-13、IL-10、IL-22、PD-1、Foxp3、TGF-β、IFN-α、IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12p70、IL-15、IL-16、IL-21、IL-27、IL-29、IL-33、IP-10、MIP-1α、G-CSF和CXCL9等。
在一种优选实施例中，所述评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒还可以包括蛋白转运阻断剂。
在一种优选实施例中，所述评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒还可以包括移液设备、离心管、细胞培养容器中的任意一种或几种。
所述细胞培养容器如多孔板，如96孔预包被细胞刺激板。
本发明上述内容中，所述MHC限制性病毒表位肽在进行细胞免疫学检测中与待检测细胞接触时，优选为能够实现浓度1-20μg/ml，更优选为5-15μg/ml，更优选为8-10μg/ml。
本发明上述内容中，所述抗-CD3和抗-CD28在进行细胞免疫学检测中与待检测细胞接触时，优选为分别能够实现浓度0.05-0.2μg/ml，更优选为0.1-0.15μg/ml，如分别为0.1μg/ml和0.05μg/ml、0.05μg/ml和0.05μg/ml、0.2μg/ml和0.05μg/ml、0.1μg/ml和0.1μg/ml以及0.1μg/ml和0.2μg/ml。
本发明第二个方面是提供一种上述评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒的储存方法。
所述储存方法中，MHC限制性病毒抗原肽储存温度≤5℃，更优选为≤4℃，更优选为≤3℃，更优选为≤0℃，并优选为0℃至4℃。
所述储存方法中，细胞培养容器储存温度≤-10℃，更优选为≤-15℃，更优选为≤-20℃，更优选为≤-30℃，并优选为-30℃至-10℃。
所述储存方法中，如果存在的话，其他试剂和/或仪器储存温度优选为≤5℃，更优选为≤4℃，更优选为≤3℃，更优选为≤0℃，并优选为0℃至4℃。
本发明上述内容中，所述氨基酸序列、及其经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列，可以是通过生物合成、化学合成中的任意一种或几种来获得，比如设计相关基因进行表达，通过固相合成获得相应的氨基酸序列。在本发明没有特定限定的情况下，本领域技术人员可采用已知的氨基酸表达或合成方法来实施。
本发明评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒，能够利用处于临床试验阶段的治疗性疫苗研究数据库与标本，并应用流式细胞技术，对免疫细胞及其分泌的细胞因子进行全面检测，从而建立细胞免疫学疗效评价体系。并且所述评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒稳定性好，储存一年以上时稳定性仍能保持90％以上。
附图说明
图1为慢乙肝患者未使用本发明试剂盒检测，直接用表位肽刺激后IFN-γ表达结果，其中，阳性富集刺激物为PMA+Iono，表位肽为CD8+T细胞S表位肽肽池，阴性对照为未刺激细胞；
图2为慢乙肝患者细胞冻存后，经复苏、富集3天，刺激后检测IFN-γ表达的结果，其中，阳性刺激物为PMA+Iono，实验组刺激物为CD8+T细胞S表位肽肽池，阴性对照为未刺激细胞；
图3为慢乙肝病人PBMC富集3天，刺激后冻存，复苏后IFN-γ流式检测的结果，其中，阳性刺激为PMA+Iono，实验组所用刺激物为CD8+T细胞S抗原表位肽，阴性对照为富集3天后未刺激细胞；
图4为实施例1中治疗前后不同T细胞亚群比例的变化，其中，A为不同CD4+T细胞亚型比例随免疫进程变化的饼图；B为不同CD8+T细胞亚型比例随免疫进程变化的饼图；横坐标为免疫次数(第0、2、4、6次免疫)；YIC：乙克组；ALUM：铝佐剂组；SALINE：生理盐水组；
图5为实施例1中治疗前后不同亚群CD4+T细胞的细胞因子变化，其中，图5A为三个治疗组CD4+T细胞因子表达水平的平均数随免疫进程变化趋势图；YIC：乙克组，绿色；ALUM：铝佐剂组，蓝色；SALINE：生理盐水组，黑色；图5B为乙克组(左)、铝佐剂组(中)和生理盐水组(右)中每个受试者CD4+T细胞IFN-γ的分泌水平随免疫进程变化；横坐标为免疫次数(第0、2、4、6次免疫)；
图6为实施例1中治疗前后不同亚群CD8+T细胞的细胞因子变化，其中，图6A为三个治疗组CD8+T细胞因子表达水平的平均数随免疫进程变化趋势图；YIC：乙克组，绿色；ALUM：铝佐剂组，蓝色；SALINE：生理盐水组，黑色；图6B为乙克组(左)、铝佐剂组(中)和生理盐水组(右)中每个受试者CD8+T细胞IL-2的分泌水平随免疫进程变化，横坐标为免疫次数(第0、2、4、6次免疫)；
图7为实施例2中乙克临床样本细胞免疫学检测试剂盒保存1个月、3个月、6个月和12个月的稳定性，其中，图7A为乙克临床样本细胞免疫学检测试剂盒保存1个月、3个月、6个月和12个月后CD8+T细胞IFN-γ表达水平；Positive：阳性刺激孔(PMA+离子霉素iono)；Negative：阴性刺激孔；图7B为乙克临床样本细胞免疫学检测试剂盒保存1个月、3个月、6个月和12个月后的稳定性百分比平均值，横坐标均为保存时间；样本数为3例乙克治疗后慢性乙肝患者。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从已知的生物公司购买。
(1)治疗性乙型肝炎疫苗(商品名：乙克)60μg/1ml/安瓿，北京生物制品研究所有限责任公司生产，批号：20120301，20100501。
(2)氢氧化铝佐剂注射液：0.1％氢氧化铝佐剂1ml每安瓿，外观及一般检定同治疗用药，由北京生物制品研究所有限责任公司提供。批号：20120302，20100801。
(3)生理盐水注射液：1ml生理盐水每安瓿，由北京生物制品研究所有限责任公司提供。批号：20110705。
(4)阿德福韦酯片：采用国内上市疗效佳的产品，由申办方统一提供。100mg/片，14片/盒。批号：110980，111195，120661，120871，1211105，130436，1312102。
实施例1，乙肝治疗性疫苗乙克的临床样本细胞免疫学评价
一、材料与试剂
10ml EDTA抗凝采血管(BD，货号：367525)、冻存管(Corning，430659)、15ml离心管(Corning，430791)、12孔细胞培养板(Costar，3513)、96孔U底细胞培养板(Costar，3799)、10ml移液管(Costar，4488)、无菌1.5ml LEP管、流式细胞管，及其他耗材。
(1)无菌磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)购自Gibco公司,货号为20012-027。(2)人淋巴细胞分离液(LymphoprepTM)购自Axis-Shield公司，货号为11114547。(3)4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)，购自国药集团化学试剂有限公司)：将8g PFA溶解于PBS，终体积200mL，加热搅拌并加几滴浓NaOH，待完全溶解后冷却至室温，加HCl调节溶液pH至7.4，室温保存。(4)0.2％破膜剂(Triton X-100，购自Genview)：将400μL TritonX-100加入到PBS中，终体积为200ml，放置在60℃水浴中直至完全溶解(约20min)，冷却至室温，4℃保存。(5)双抗、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI1640培养基：均购自gibco公司，货号分别为10099-141和22400-089。(6)DMSO、PMA和离子霉素(Iono)：均购自sigma公司。(7)蛋白转运阻断剂(BFA)购自BD公司。(8)抗-CD3抗体(anti-CD3)和抗-CD28抗体(anti-CD28)，购自Miltenyi Biotec公司。(9)荧光标记抗体见下表。
病毒抗原肽见下表：
CD4+T细胞HBsAg表位肽
CD8+T细胞HBsAg表位肽
CD8+T细胞HBV混合表位肽池
CD8+T细胞非A2HBsAg表位肽
二、实验方法
研究设计及研究对象：
研究采用随机、多中心、联和用药的研究。研究对象为HBeAg阳性慢性病毒性乙型肝炎患者，计划入组病例总数为60例，受试者按1:1:1的比例随机分到下列三组：
研究对象分组治疗情况
最终入组52例，其中铝佐剂组、乙克组和生理盐水组分别为18例、17例和17例，所有研究对象肌肉注射6针乙克、铝佐剂或生理盐水，每隔四周注射一次，连续注射6针。用药结束时为24周，接着随访24周时间，总体研究时间为48周。出于伦理考虑，所有研究对象均结合抗病毒药物阿德福韦酯治疗。于0、4、12和20周采集抗凝血，分离外周血单个核细胞(PBMC)样本
采血、外周血单个核细胞(PBMC)分离及体外T细胞的富集：
(1)用BD EDTA抗凝管采集10ml全血。取血后缓慢颠倒混匀5-10次，竖放静置，室温保存运输，并于24小时内处理检测。
(2)将采血管置于离心机中室温离心(转速为1600rpm)10min，取上层血浆，并按每管1ml分装于冻存管内，放置于-70℃保存，待血清学检测时用。
(3)取2支15ml离心管，分别加入5ml预热后的淋巴细胞分离液。
(4)将步骤2中离心后的剩余血液与无菌PBS混匀，至终体积20ml，每10ml沿管壁加到5ml淋巴细胞分离液的液面上，避免血液冲到管底。
(5)将离心管置于水平转子中，并将离心机的升降速调至最低(升降速0)，在22-23℃离心(转速为2000rpm)30min。
(6)吸取白膜层细胞(此为PBMC)，吸取的液体分别置于2个新15ml离心管中，分别加入无菌PBS至15ml并重悬，在水平转头22-23℃离心(2000rpm)5min，弃上清。可重复此洗涤步骤一次。
(7)可重复洗涤步骤6一次。
(8)用3mL完全培养基R10(RPMI 1640培养基含10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)重悬细胞后，细胞计数。
(9)用含R10培养基调整细胞悬液浓度至5×106细胞/ml。
(10)取3ml步骤9中的细胞，加入anti-CD3(终浓度0.1μg/ml)和anti-CD28(终浓度0.05μg/ml)，随后按每孔1ml放入12孔细胞培养板中，在细胞培养箱中培养富集3天。
但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定其它的抗-CD3和抗-CD28抗体刺激浓度，例如0.05μg/mL和0.05μg/mL、0.2μg/mL和0.05μg/mL、0.1μg/mL和0.1μg/mL以及0.1μg/mL和0.2μg/mL等。
但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定其它的富集时间，例如一天、五天和七天等。
但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定可用的亚群包括辅助性T细胞(Th1、Th2和Th17)、杀伤性T细胞(Tc1和Tc17)以及调节性T细胞(Treg和Tcreg)。
抗原肽体外特异性刺激：
(1)3天后，将富集的细胞用R10培养基洗一次后重悬，加入anti-CD28(终浓度0.1μg/ml)和BFA(1μl/ml)，按100μl/孔加入96孔预包被细胞培养板。
(2)96孔预包被细胞培养板中设置阳性对照组、抗原肽刺激组和空白对照组。阳性对照组加入PMA(终浓度0.1μg/ml)和离子霉素(终浓度1μg/ml)；抗原肽刺激组分别加入针对HBsAg的CD4/CD8肽池(每种肽的终浓度均为10μg/ml)。但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定其它的抗原肽刺激浓度，例如1μg/mL、5μg/mL和20μg/mL等。
(3)37℃，5％二氧化碳细胞培养箱培养8小时。但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定其它的刺激时间，例如4小时、6小时和12小时等。
细胞冻存：
(1)将细胞整个96孔板22-23℃离心(2000rpm)5min，弃上清。
(2)加入200μl/孔冻存液(10％DMSO+90％胎牛血清)，重悬后，梯度降温：4℃ 1小时，-20℃ 40分钟，-80℃冻存。待统一批次流式检测。
流式检测：
(1)37℃快速解冻刺激后96孔细胞培养板中的细胞。1500rpm离心5min，弃上清，加入2％FBS的PBS(表面稀释液)200μl洗一次，1500rpm离心5min，弃上清。
(2)将表面染色用抗体用表面稀释液稀释好，每孔50μl，吹吸混匀3-5次，冰上避光染色30min。
(3)加入150μl表面稀释液，终止表面染色，1500rpm离心5min，弃上清。
(4)加入200μl 4％PFA室温避光固定8min，2000rpm离心5min,，弃上清，快速加入200μl表面稀释液吹吸重悬细胞，2000rpm离心5min，弃上清。
(5)以0.2％Triton X-100(含2％FBS)作为胞内抗体稀释液预先配好破膜染色液，每孔50μl，吹吸混匀，避光冰上染色2小时。
(6)用表面稀释液150μl/孔终止反应，2000rpm离心5min，弃上清。
(7)用表面稀释液200μl/孔重悬细胞，转移到流式管进行检测。
(8)检测指标：
——T细胞表面标志物：anti-CD4、anti-CD8，但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定其它的T细胞表面标志物，如anti-CD3。
——功能相关细胞标志物：anti-IFN-γ、anti-TNF-α、anti-IL-2、anti-MIP-1β、anti-IL-17A、anti-IL-13、anti-IL-10、anti-IL-22、anti-PD-1、anti-Foxp3和anti-TGF-β，但是本领域技术人员在本发明公开内容的基础上，可以确定其它的功能相关细胞标志物，如anti-IFN-α、anti-IL-1β、anti-IL-3、anti-IL-4、anti-IL-5、anti-IL-6、anti-IL-7、anti-IL-8、anti-IL-12p70、anti-IL-15、anti-IL-16、anti-IL-21、anti-IL-27、anti-IL-29、anti-IL-33、anti-IP-10、anti-MIP-1α、anti-G-CSF和anti-CXCL9等。
(9)细胞获取使用LSR Fortessa多色流式细胞仪(BD Biosciences,USA)，先用单荧光染色调补偿。流式结果分析用FlowJo 7.6.1(TreeStar,US)，结果呈现采用阳性细胞百分比。
统计分析：
两组之间用t检验进行数据分析，两组以上的数据用One-way ANOVA检测，P＜0.05的差异被认为具有统计学意义。*表示P＜0.05。
三、实验结果
1、由于慢乙肝病人的T细胞对HBV抗原具有耐受性，因此为了寻找合适的实验条件，对慢乙肝病人的PBMC进行预处理，我们对刺激和冻存方案进行了摸索。我们以CD8+T的IFN-γ表达量为例，首先对未进行任何富集和冻存的慢乙肝病人的细胞分别用阳性刺激物PMA+Iono，10μg/mL S抗原表位肽和20μg/mL S抗原表位肽进行刺激，如图1中结果所示，未进行任何预处理的病人PBMC对S抗原表位肽未有阳性反应。在摸索了合适的富集条件后，我们对先冻存还是先富集刺激进行了方法学上的摸索，发现，先冻存慢乙肝病人的PBMC，后进行富集和刺激，如图2所示，慢乙肝病人CD8+T的IFN-γ表达量整体下降，而且未有明显的阳性反应，而经过富集刺激后再进行细胞冻存，复苏后直接流式检测，如图3所示，可以看到慢乙肝病人CD8+T的IFN-γ表达量经过S抗原表位肽刺激后相对于未刺激组有明显上升，证明试剂盒说明书所提供的方法可以有效地检测慢乙肝病人T细胞对S抗原的反应。
2、为了评价疫苗的效果，我们研究了乙克组、铝佐剂组和生理盐水组中不同T细胞亚型的比例随着免疫进程变化的规律，我们按照细胞因子在免疫应答中所发挥的不同免疫功能，将检测到的T细胞因子分类。我们将检测的CD4+T细胞因子归类为Th1、Th2、Th17和Treg，Th1中的因子主要在抗病毒过程中起到活化作用，Th2中的因子主要在体液免疫中发挥作用，Th17中主要是炎症因子，Treg中的因子主要发挥免疫抑制作用。而CD8+T细胞因子归类为Tc1、Tc17和Tcreg，Tc1中的因子主要起杀伤作用，Tc17中主要是炎性细胞因子，Tcreg中主要是发挥免疫抑制作用的因子。
如图4-A所示，对于CD4+T细胞，乙克治疗组中Treg细胞比例从基线时的78％下降至治疗终点时的35％，Th1细胞比例从7％增加至24％，Th2细胞比例从15％增加至41％；在铝佐剂和生理盐水治疗组中并未观察到类似的变化，Th1、Th2和Treg细胞比例随着免疫进程基本未发生变化。如图4-B所示，对于CD8+T细胞，乙克治疗组中Tc1和Tc17细胞比例随着免疫进程均有着一定的增加，Tcreg细胞比例从基线时的60％下降至治疗终点时的39％；铝佐剂治疗组中Tc17细胞比例随着免疫进程有着微弱的增加(从基线时的8％增加至治疗终点时的14％)，生理盐水组中Tc17细胞比例随着免疫进程呈现不规律的变化；铝佐剂和生理盐水治疗组中Tc1细胞比例均有所下降，Tcreg细胞比例均有所增加。
3、我们进一步分析了乙克组、铝佐剂组和生理盐水组Th1细胞IL-2、IFN-γ、TNF-β这三种代表性细胞因子，Th2细胞代表性细胞因子IL-13，Th17细胞代表性细胞因子IL-17A，Treg细胞代表性细胞因子IL-10、TGF-β和转录调节因子Foxp3以及抑制性分子IL-22和PD-1在第0、2、4、6次免疫后的表达水平变化。根据三个治疗组细胞因子在不同免疫次数表达水平的平均数，我们做了以上各种特征性标记物表达水平随免疫进程变化的趋势图，如图5-A所示。乙克治疗组中CD4+T细胞表达IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平随着治疗进程均有着上升趋势，而铝佐剂组和生理盐水组中这三种细胞因子的表达水平呈现不规律的变化。乙克治疗组中CD4+T细胞表达这五种抑制性因子的水平随着治疗进程均有着下降趋势，而铝佐剂组中这五种抑制性因子的表达水平首先上升随后又下降，生理盐水组呈现不规律的变化。
同时，根据乙克组、铝佐剂组和生理盐水组中每个受试者CD4+T细胞IFN-γ在不同免疫次数的表达水平,我们分析了三个治疗组中每个受试者这种细胞因子分泌水平随免疫进程变化的趋势，如图5-B所示。
4、我们也研究了CD8+T细胞的细胞因子变化，并分析了乙克组、铝佐剂组和生理盐水组Tc1细胞代表性细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和趋化因子MIP-1β，Tc17细胞代表性细胞因子IL-17A，Tcreg细胞代表性细胞因子IL-10、TGF-β和转录调节因子Foxp3以及抑制性分子IL-22和PD-1在第0、2、4、6次免疫后的表达水平变化。根据三个治疗组这些因子在不同免疫次数表达水平的平均数，我们做了以上各种特征性标记物表达水平随免疫进程变化的趋势图，如图6-A所示。乙克治疗组中CD8+T细胞表达IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平随着治疗进程均有着上升趋势；而铝佐剂组和生理盐水组中这三种因子的表达水平呈现不规律的变化。乙克治疗组中CD8+T细胞表达TGF-β、Foxp3、IL-22的水平随着治疗进程均有着下降趋势，PD-1的表达水平有一定升高，IL-10的表达水平基本未发生变化；而铝佐剂组中TGF-β、PD-1的表达水平随着治疗进程有明显的升高，IL-10、Foxp3和IL-22的表达水平变化不明显；生理盐水组这五种抑制性因子的表达基本未发生变化。
同时，根据乙克组、铝佐剂组和生理盐水组中每个受试者CD8+T细胞IL-2在不同免疫次数的表达水平,我们分析了三个治疗组中每个受试者这种因子分泌水平随免疫进程变化的趋势，如图6-B所示。
实施例2：乙克临床样本细胞免疫学检测试剂盒长期稳定性监测
材料与试剂参考实施例1，PBMC来源于乙克治疗组慢性乙肝病人，检测指标主要为CD8+T细胞IFN-γ的表达。
我们监测了乙克临床样本细胞免疫学检测试剂盒保存1个月、3个月、6个月和12个月的稳定性。试剂盒中96孔预包被细胞刺激板于-20℃保存，其它试剂于4℃保存。
如图7A所示，与0天相比，保存1个月、3个月、6个月和12个月的试剂盒经检测，阳性刺激孔CD8+T细胞IFN-γ的表达水平基本未发生变化，阴性刺激孔作为对照。如图7B，假定0天时试剂盒稳定性为100％，经换算，保存1个月、3个月、6个月和12个月的试剂盒的稳定性仍保持在90％以上。这些结果表明乙克临床样本细胞免疫学检测试剂盒保存一年后仍有着较好地稳定性。
本发明上述内容中，CD8+T细胞S是指两组或三组CD8+T细胞HBsAg表位肽同时使用。
本发明虽然以乙肝疫苗为例进行了介绍，但是在本发明上述实施例的指导下，本发明试剂盒也同样适用于其他含有针对CD4+T细胞的抗原表位肽和/或CD8+T细胞抗原表位肽的肿瘤细胞和/或病毒，以及针对所述肿瘤细胞和/或病毒的疫苗疗效的评价。
以上具体实施例并不限制本发明范围，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明的精神和范围下，对本发明进行的等同修改和替代也在本发明范围内。

Claims (13)

1.一种评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，包括MHC限制性抗原肽。
2.根据权利要求1所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述抗原表位肽选自肿瘤细胞表面的抗原表位肽和/或病毒表面的抗原表位肽中的任意一种或几种。
3.根据权利要求2所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述病毒为对人和动物致病的病毒。
4.根据权利要求3所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述病毒为乙型肝炎病毒。
5.根据权利要求1所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述MHC限制性抗原肽至少包括如下a)、b)抗原表位肽中的任意一种或几种：a)针对CD4+T细胞抗原表位肽和/或CD8+T细胞抗原表位肽，b)所述表位抗原氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有该抗原表位肽功能的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述MHC限制性病毒抗原肽至少包括如下a1)、b1)抗原表位肽中的任意一种或几种：a1)针对CD4+T细胞HBsAg表位肽和/或CD8+T细胞HBsAg表位肽，b1)所述表位抗原氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述针对CD4+T细胞HBsAg表位肽包括如下氨基酸序列中的任意一种或几种：
FFLLTRILTI；
FFLLTRILTIPQSLD；
TSLNFLGGTTVCLGQ；
QSPTSNHSPTSCPPIC；
CTTPAQGNSMFPSC；
CTKPTDGN；
WASVRFSW；
LLPIFFCLW；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD4+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述针对CD8+T细胞HBsAg表位肽包括如下氨基酸序列中的任意一种或几种：
VLQAGFFLL；
FLLTRILTI；
FLGGTPVCL；
LLCLIFLLV；
LVLLDYQGML；
LLDYQGMLPV；
WLSLLVPFV；
GLSPTVWLSV；
SIVSPFIPLL；
ILSPFLPLL；
LLVPFVQWFV；
FLPSDFFPSI；
FLPSDFFPSV；
CLTFGRETV；
EYLVSFGVW；
TPPATRPPNAPIL；
KYTSFPWL；
IPIPSSWAF；
WMMWYWGPSLY；
ILLLCLIFLL；
RWMCLRRFII；
RFSWLSLLVPF；
LYNILSPFL；
PFLPLLPIF；
PFVQWFVGL；
上述任意氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述针对CD8+T细胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列组A)-C)中的任意一组或几组：
A)CD8+T细胞A2HBsAg表位肽
VLQAGFFLL；
FLLTRILTI；
FLGGTPVCL；
LLCLIFLLV；
LVLLDYQGML；
LLDYQGMLPV；
WLSLLVPFV；
GLSPTVWLSV；
SIVSPFIPLL；
ILSPFLPLL；
上述任意氨基酸序列经过经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列；
B)CD8+T细胞HBV混合表位肽
FLLTRILTI；
WLSLLVPFV；
GLSPTVWLSV；
LLVPFVQWFV；
FLPSDFFPSI；
FLPSDFFPSV；
CLTFGRETV；
EYLVSFGVW；
TPPATRPPNAPIL；
KYTSFPWL；
上述任意氨基酸序列经过经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列；
C)CD8+T细胞非A2HBsVg混合表位肽
IPIPSSWAF；
WMMWYWGPSLY；
ILLLCLIFLL；
RWMCLRRFII；
RFSWLSLLVPF；
LYNILSPFL；
PFLPLLPIF；
PFVQWFVGL；
上述任意氨基酸序列经过经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生得到的具有CD8+T细胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，还包括待测细胞共刺激信号、富集激活信号和、蛋白转运阻断剂中任意一种或几种；所述富集激活信号选择为凝集素类分子、离子霉素(Iono)和/或抗-CD3抗体中的任意一种或几种。
11.根据权利要求9所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述共刺激信号至少包括抗-CD28抗体；所述富集激活信号至少包括抗-CD3抗体。
12.根据权利要求1所述的细胞免疫学检测试剂盒，其特征在于，还包括移液设备、离心管、细胞培养容器中的任意一种或几种。
13.一种储存权利要求1所述细胞免疫学检测试剂盒的方法，其特征在于，试剂盒中预包被细胞刺激板于≤-20℃保存，其它试剂于≤4℃保存。
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