CN103525895A - 树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法 - Google Patents
树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103525895A CN103525895A CN201310240738.0A CN201310240738A CN103525895A CN 103525895 A CN103525895 A CN 103525895A CN 201310240738 A CN201310240738 A CN 201310240738A CN 103525895 A CN103525895 A CN 103525895A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- hla
- group
- surface marker
- cell surface
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 221
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims description 49
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 38
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 claims description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 9
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 102000004018 Caspase 6 Human genes 0.000 description 5
- 108090000425 Caspase 6 Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 5
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 210000004332 phalangeal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001313855 Bletilla Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010029379 Neutrophilia Diseases 0.000 description 1
- 108010046685 Rho Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013098 chemical test method Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种树突状杀手细胞的鉴定方法，涉及鉴定多个选自由HLA-G-、CD14-,CD3-,CD19-,CD56dim与HLA-DR+所组成的群组的细胞表面标记。同时，本发明还提供一种从人类外围血单核球细胞中筛选出树突状杀手细胞的方法，上述筛选方法至少包含下列步骤。首先，提供第一细胞群组，并检测第一细胞群组中CD14与HLA-G的表现以分选出第二细胞群组。接着，检测第二细胞群组中CD19与CD3的表现以分选出第三细胞群组。最后，检测第三细胞群组中HLA-DR与CD56的表现以得到树突状杀手细胞群组。
Description
技术领域
本发明涉及一种树突状杀手细胞的鉴定及筛选方法，主要是利用不同群组的细胞拥有不同的表面标记的特性，进而分选细胞群组，最后从人类外围血单核球细胞中筛选出细胞表面标记为HLA-G-CD14-CD19-CD3-CD56dimHLA-DR+的树突状杀手细胞的方法。
背景技术
人体对外来异物具有辨识和启动一连串反应的防御机转，这防御系统就是免疫系统。免疫系统拥有不同作用的细胞，如白血球及淋巴细胞、不同功能的蛋白质因子，如免疫球蛋白、介白质及细胞激素等，互相协调合作，形成人体的防御力。免疫反应依其特异性及记忆性的有无，分为先天性及后天性。先天性免疫系统包括可溶性化学因子、干扰素、补体系统、嗜中性淋巴球及巨噬细胞的吞噬作用和自然杀手细胞的毒杀作用等。后天性免疫系统包括体液免疫及细胞免疫，前者包括抗体生成系统，后者包括淋巴细胞、淋巴激素及免疫记忆系统。记忆的功能使免疫系统对已对付过的抗原，引发强而快速的次发反应，可将外来危害因子有效去除。
免疫反应对抗原会有不同反应是由于主要组织兼容复合物（MajorHistocompatibility Complex,MHC）的作用。外来抗原通常需要经过细胞处理与MHC分子结合后，才能被免疫系统所认知。因此MHC的类型与个人对特定因子的免疫力有关，是造成个体对疾病易感性的重要因素。人类的MHC又名人类白血球抗原（Human Leukocyte Antigen,HLA）。HLA可分为class I、class II，为结构相似的醣蛋白，与抗原呈现功能有关。HLAclass I抗原表现于所有体细胞上，而class II只表现于巨噬细胞、B细胞及树突状细胞（Dendritic Cell,DC）的细胞表面上。
人体内有一种高度分化的免疫细胞，叫做抗原呈现细胞（AntigenPresenting Cells,APC）。抗原呈现细胞的功能是摄取、加工、处理外源性抗原并将加工后抗原呈现给T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞进行增殖进而分化成效应细胞，产生免疫反应，以辨识并抵抗感染甚至癌症细胞。树突细胞（Dendritic cells，DCs）是目前所知的人体内功能最强大的抗原呈现细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC的最大特点是能够显著刺激初始T细胞进行增殖，而其他的抗原呈现细胞，如巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。因此DC是机体免疫反应的始动者，在免疫反应的诱导中具有独特的地位。
另外，自然杀手细胞（Natural Killer cell,NK cell）也是一种在免疫反应中占有重要地位的细胞，其起源于淋巴前驱细胞，占人类血液中淋巴球的5～10％。NK细胞表面缺乏专一性的抗原受体，负责非专一性防御，可以胞杀肿瘤细胞和被病毒感染细胞。NK细胞表面虽然没有抗原专一性受体，但其表面有许多其他的膜蛋白接受来自目标细胞的刺激，以调节NK细胞的活性，这些膜蛋白大致可分为“抑制性受体”和“活化性受体”。当NK细胞与细胞接触后，获得活化性受体的讯息，若与正常细胞接触，则正常细胞表面的第一型MHC分子与抑制性受体结合，传递了“抑制”NK细胞活性的讯息，故NK细胞不会被活化，以避免杀死正常细胞。若正常细胞被病毒感染或转为肿瘤细胞后，第一型MHC分子的表现常会发生异常，因此当NK细胞接触不正常细胞时，便无法获得抑制性受体的讯息，于是NK细胞便活化进行胞杀作用。也就是说，只有“活化”讯息存在，且“抑制”的讯息异常或不存在时，NK细胞才会进行胞杀作用。
近年来，同时具有上述两种DC与NK细胞功能的干扰素分泌型杀手树突细胞逐渐受到关注。干扰素分泌型杀手树突细胞可以从毒杀目标、抗原呈现到活化T细胞都由自己完成，还即干扰素分泌型杀手树突细胞找到目标后会毒杀目标，接着把碎片吞噬后呈现抗原给T细胞，并活化T细胞。然而，正如同前文述及，干扰素分泌型杀手树突细胞虽然在免疫反应中扮演了相当重要的角色，但因为干扰素分泌型杀手树突细胞在体内的量非常稀少，如此低的细胞比率及数目，需要繁琐的步骤来加以纯化，也限制了针对干扰素分泌型杀手树突细胞的进一步研究，不仅如此，目前的技术仅能从老鼠的脾脏、淋巴结或骨髓中分离出干扰素分泌型杀手树突细胞，使得要实际将其应用于研究或临床上皆面临了不小的瓶颈。
发明内容
有鉴于此，发明人经过长年的努力以及无数次的试验，成功筛选出了人类体内同时具有毒杀及抗原呈现功能的细胞，定义该细胞为树突状杀手细胞（Dendritic Killer Cell,DKC），又称为毒杀型树突细胞(cytoDC)或干扰素分泌型杀手树突细胞(IKDC)，更进一步，本发明不需要通过反复的手续从脾脏、淋巴结或骨髓中取得树突状杀手细胞，本发明技术可从人类外围血中鉴定并筛选出树突状杀手细胞。从发明人实验的结果严格说来，树突状杀手细胞在人类周边淋巴细胞中所占的比率低于0.01%，因此，能从人类外围血液样本中，鉴定及筛选出非常微量的树突状杀手细胞是相当困难的。故，本发明可从人类外围血中鉴定并筛选出树突状杀手细胞，不但检体取得方便且处理容易，对未来树突状杀手细胞的研究及一系列的免疫细胞疗法应用，具有非常显著的突破及贡献。
因此，本发明提供一种树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法，可以经由鉴定树突状杀手细胞的细胞表面标记，而从人类外围血中分选出树突状杀手细胞。后续将可针对这些分选出的树突状杀手细胞进行更深入的研究（如：培养与实际疗效），预期将可开启人类细胞免疫疗法的新契机。
首先，本发明提供一种树突状杀手细胞的鉴定方法，涉及鉴定多个选自由HLA-G-、自然杀手细胞表面标记及树突细胞表面标记所组成的群组的细胞表面标记。较佳地，该自然杀手细胞表面标记为CD56+，更进一步，CD56+为CD56dim。较佳地，该树突细胞表面标记为HLA-DR+。更进一步，其中由该些细胞表面标记所组成的群组，包含不表现单核细胞表面标记、B细胞表面标记与T细胞表面标记的组成，其中不表现单核细胞表面标记、B细胞表面标记与T细胞表面标记的组成，分别为CD14-、CD19-与CD3-。较佳地，上述鉴定方法可鉴定人类外围血检体中的树突状杀手细胞，更进一步，该人类外围血检体选自于一癌症病人的外围血。
本发明的另一个目的在于，提供一种树突状杀手细胞的筛选方法，至少包含下列步骤。首先，提供一第一细胞群组，并检测第一细胞群组中CD14与HLA-G的表现以分选出一第二细胞群组。接着，检测第二细胞群组中CD19与CD3的表现以分选出一第三细胞群组。最后，检测第三细胞群组中HLA-DR与CD56的表现以得到一树突状杀手细胞群组。
在本发明的一实施例中，其中第二细胞群组包含细胞表面标记为CD14-HLA-G-的细胞。
在本发明的一实施例中，其中第三细胞群组包含细胞表面标记为CD14-HLA-G-CD3-CD19-的细胞。
在本发明的一实施例中，其中树突状杀手细胞群组包含细胞表面标记为CD14-HLA-G-CD3-CD19-HLA-DR+CD56+的细胞。
在本发明的一实施例中，其中上述提供第一细胞群组的步骤至少包含下列步骤。首先，收集人类外围血，随后利用细胞大小与细胞表面颗粒性筛选出第一细胞群组。较佳地，上述人类外围血来自于一癌症患者。另外，第一细胞群包含淋巴细胞与单核细胞。
在本发明的一实施例中，其中该些检测步骤通过一流式细胞仪来执行。
由下文的说明，可更进一步了解本发明的特征及其优点，阅读时请参考图1至图4。
附图说明
图1显示本发明一实施例的树突状杀手细胞的筛选方法流程图；
图2A至图2D显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分选癌症患者外围血中树突状杀手细胞的结果；
图3A至图3D显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分析健康者外围血中树突状杀手细胞的结果；
图4显示健康者与癌症患者在外围血中树突状杀手细胞含量百分比对照图；
图5显示本发明藉流式细胞仪的结果定义细胞标记表现量的示意图；
图6A至图6B显示本发明一实施例中藉由本发明技术筛选出的树突状杀手细胞细胞毒杀的结果；以及
图7A至图7B显示本发明一实施例中藉由本发明技术筛选出的树突状杀手细胞其抗原呈现功能的结果。
附图标记说明
S100～S107树突状杀手细胞的筛选步骤
10第一细胞群组的单核细胞
20第一细胞群组的淋巴球细胞
30第二细胞群组
40第三细胞群组
50树突状杀手细胞群组
具体实施方式
除非有其他定义，所有在此所用的技术及科学词汇，如同作为本发明所属技术领域中具有一般技艺者一般性地了解具有相同意义。在此指称的所有专利、申请案、公开申请案及其他应用，以及基因库登录号都完整以参考文献被整合起来。若本章节提出的定义与其他专利、申请案、公开申请案及其他在此引用的参考文献所提出的定义相反或不一致，以本章节提出的定义为主。
例如本发明所使用的术语“树突状杀手细胞（DKC）”指同时具有细胞毒杀及抗原呈现功能的细胞。
如本发明所使用的术语“HLA-G”指通常会表现于调控细胞表面的细胞表面标记，该些调控细胞通常会分泌抑制型细胞激素。
如本发明所使用的术语“自然杀手细胞表面标记”指会表现于自然杀手细胞的细胞表面标记，如CD56、CD16或Kp46等。
如本发明所使用，术语“树突细胞表面标记”指会表现于树突细胞的细胞表面标记，如HLA-DR、CD11c或CD123等。
如本发明所使用，术语“单核细胞表面标记”指会表现于单核细胞的细胞表面标记，如CD14等。
如本发明所使用，术语“B细胞表面标记”指会表现于B细胞的细胞表面标记，如CD19等。
如本发明所使用，术语“T细胞表面标记”指会表现于T细胞的细胞表面标记，如CD3等。
如本发明所使用，符号“+”指细胞表面标记有表现于细胞表面，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量大于阴性控制组的表现量。
如本发明所使用，符号“-”指细胞表面标记没有表现于细胞表面，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量等于阴性控制组的表现量。
如本发明所使用，术语“dim”指细胞表面标记有表现于细胞表面，但表现量低，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量大于阴性控制组的细胞中，又可依表现量的高与低分为两群细胞群，而细胞表面标记表现量低但大于阴性控制组的细胞群即定义为“dim”。
上述细胞表面标记的表现量，使用的流式细胞仪测量结果，但本发明不以此为限，若他人采相关技艺的替代技术，执行与本发明精神相同的利用，均为本发明的专利范围中。
实施例
请参考图1与图2A图至图2D。图1显示本发明一实施例的树突状杀手细胞的筛选方法流程图，图2A图至图2D显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分选癌症患者外围血中树突状杀手细胞的结果。
首先，在步骤S100中，从健康人或癌症病人各采集40ml全血，以相同体积的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，并以Ficoll1.077离心介质梯度，分离出人类外围血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。基本上，人类外围血单核细胞可分为五类细胞，如：单核细胞（Monocyticcells）、小细胞（small cells）、淋巴细胞（Lymphoid cells）、大细胞（large cells）与大颗粒细胞（large and granular cells）。因此，本发明利用流式细胞仪（如图2A图所示），其中横轴为细胞大小，纵轴为细胞表面颗粒性，即可看出人类外围血中各种类型细胞群的分布，在图2A中中间偏右处为单核细胞群10，而左下角处为淋巴细胞群20，这两种细胞群藉由流式细胞仪筛选作为第一细胞群组S101。另外，本试验中所收集的人类外围血来自于癌症病患。
必须说明的是，本发明所揭示筛选方法中的检测步骤均藉由流式细胞仪来完成，并适合使用各一或多种流式细胞仪来利用不同群组的细胞拥有不同的细胞表面标记物区分筛选出目标细胞群组。流式细胞仪能够以远远超过相关技艺任何其他单细胞分析技术的速度实施单细胞分析，相比于使用其他替代技术能够较快速地分析统计学上有意义的数量的细胞，但本发明并不欲以此为限。
较佳地，在一个实施例中，本领域技术人员常用的任一适宜试样制备自动装置或液体处理器的流式细胞仪。另外，使用单路雷射流式细胞仪或多路雷射流式细胞仪来实施分析步骤均可，本发明并不欲以此为限。
较佳地，大量荧光染料及偶联化学品的研发及优化使得能够将诸如免疫球蛋白及小分子等各种配体偶联至荧光染料。具有介于光谱的紫外至红光区范围内的发射线的雷射能够激发该等荧光染料。因此，可使用诸多光谱学上不同的试剂来标记细胞以利用基于荧光的测试方法（如本发明所使用的流式细胞仪）进行研究。该等试剂已为本领域技术人员公知常识。在一个实施例中，在分析步骤期间使用一或多种荧光染料。在一些实施例中，在细胞对药物组合物的效应的分析中使用一或多种染色剂。至于检测后的数据分析方法非本发明所欲探讨的主题，在此不再赘述。
请继续参考图1，在步骤S102中，以流式细胞仪检测第一细胞群组中，细胞表面标记CD14与HLA-G的表现，并选择细胞表面标记为CD14-与HLA-G-的细胞作为第二细胞群组30（步骤S103），还即图2B中左下角处。
在步骤S104中，进一步检测第二细胞群组中细胞表面标记CD19与CD3的表现。紧接着，如图2C所示，后续在步骤S105中筛选出第三细胞群组40，所谓第三细胞群组40也就是在第二细胞群组30中细胞表面标记具有CD3-与CD19-表现的细胞。其中，CD3为T细胞的细胞表面标记，而CD19为B细胞的细胞表面标记，还即步骤S105的目的在于去除T细胞与B细胞。
在步骤S106中，检测第三细胞群组40中，细胞表面标记HLA-DR与CD56的表现。最后，选取图2D中分布于右上角部分的细胞S107，也就是包含细胞表面标记为HLA-DR+与CD56dim的细胞，这就是本发明最终欲筛选出的树突状杀手细胞群组50。
根据上述步骤S100～S107可以了解，本发明提供一种树突状杀手细胞的鉴定方法，其涉及鉴定多个选自由HLA-G-、CD56+与HLA-DR+所组成的群组的细胞表面标记。较佳地，上述细胞表面标记所组成的群组更包含CD14-、CD19-与CD3-。较佳地，上述细胞表面标记所组成的群组，其中CD56+为CD56dim。进一步来说，利用上述这些细胞表面标记再搭配步骤S100～S107所述的筛选方法，便可从人类外围血中成功地筛选出拥有HLA-G-CD14-CD19-CD3-CD56dimHLA-DR+的树突状杀手细胞群组，也就是DKC。
请参考图3A至图3D，图3A至图3D显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分析健康者外围血的结果。基本上，图3A至图3D的筛选方法与图2A图至图2D一致，唯一不同的是外围血的来源。图3A至图3D中所收集进而进行筛选的人类外围血来自于一健康者，从图3A开始进行的筛选步骤也是先依据细胞大小与细胞表面颗粒性的关系将淋巴细胞与单核细胞分选出来。接着，依序检测HLA-G-CD14-、CD3-CD19-、CD56+HLA-DR+的表现，进而筛选出拥有HLA-G-CD14-CD19-CD3-CD56dimHLA-DR+的树突状杀手细胞群组（DKC）。如图3D所示，请见右上角处，在健康者所提供的外围血中树突状杀手细胞的含量明显高于癌症患者。同样的结果也可以参考图4，图4显示健康者与癌症患者的外围血单核细胞中树突状杀手细胞含量百分比对照图。如图所示，在癌症患者外围血单核细胞中树突状杀手细胞的含量百分比约为正常人的14.5%。
为证明利用本案鉴定及筛选方法所选出的树突状杀手细胞细胞群具有杀手细胞功能，发明人将筛选出的树突状杀手细胞与标靶肿瘤细胞反应，并使用流式细胞仪测量标靶细胞死亡的情况，如图6所示，纵轴为细胞大小，横轴为细胞内Capase6的量，Caspase6是细胞凋亡的重要蛋白质水解酶，若细胞内有Caspase6被染上就代表该细胞死亡或正在死亡，因此可藉由测量标靶细胞内的Capase6得知与树突状杀手细胞反应后死亡的情况。请继续参照图6，图6结果会分成4区块：图上半的细胞为标靶细胞；图下半的细胞为树突状杀手细胞；图左半的细胞为细胞内没有Caspase6被染上的细胞（活细胞）；图右半的细胞为细胞内有Caspase6被染上的细胞（死细胞）。在本实施例中，上述目标细胞选自K562细胞株。
请参照图6A，在标靶细胞未和树突状杀手细胞反应前，细胞内没有Capase6被染上，细胞分布于图6A左上角区域。将标靶细胞与树突状杀手细胞反应后，如图6B所示，图上半部的目标细胞明显右移，表示大量目标细胞的细胞内产生Capase6，也就是标靶细胞与树突状杀手细胞反应后大多死亡；而图下半部的树突状杀手细胞多数细胞内没有Caspase6被染上，也就是树突状杀手细胞与标靶细胞反应后大多继续存活。由上述结果可证明，利用本发明的鉴定及筛选方法所筛选出的树突状杀手细胞，对标靶细胞具有细胞毒杀的功能。
为证明利用本案鉴定及筛选方法所选出的树突状杀手细胞具有抗原呈现细胞功能（还即树突细胞功能），发明人从第一受试者的外围血中筛选出的树突状杀手细胞，与从第二受试者外围血筛选出的外围血单核球细胞反应，并使用流式细胞仪测量第二受试者的T细胞活化、分裂的情况，如图7所示，本试验系利用混合淋巴球反应，将第二受试者外围血检体中分离出的外围血单核球细胞标记上CFSE，再将第一受试者的树突状杀手细胞与第二受试者的标记有CFSE的外围血单核球细胞反应，第一受试者的树突状杀手细胞会活化第二受试者的T细胞。因此，藉由测量第二受试者的T细胞被树突状杀手细胞活化分裂的情况，便可得知利用本案技术所筛选出的树突状杀手细胞是否具有抗原呈现的功能。上述CFSE是可量化细胞增生程度的染剂，可辨认7-10个连续细胞世代，细胞分裂期间每分裂一次，CFSE的相对荧光强度由一半减少，如此可用来测量细胞分裂的次数及相对应的比例。
图7B是将树突状杀手细胞与标记有CFSE的T细胞反应，并用流式细胞仪所测得的结果；图的纵轴为细胞数量，横轴为细胞内CFSE的荧光强度；从图7B可看出，经第一受试者的树突状杀手细胞与标记有CFSE的第二受试者的T细胞反应后，第二受试者有23.6％的T细胞被树突状杀手细胞活化进行细胞分裂，其结果证明了利用本发明的鉴定及筛选方法所筛选出的树突状杀手细胞，确实具有抗原呈现的功能。图7A是本试验的阴性对照组，将第二受试者的T细胞单独置于培养基中，并测量细胞分裂的情况，结果显示为阴性，只有4.01％的T细胞分裂。
综上所述，本发明提供一种树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法，可以经由鉴定树突状杀手细胞的细胞表面标记，而从人类外围血中分选出树突状杀手细胞。一旦成功地将树突状杀手细胞从外围血筛选出来后，便可针对这些分选出的树突状杀手细胞进行更深入的研究，如培养与实际疗效等，预期将开启人类癌症的细胞免疫疗法的新契机。
以上所述实施例只用于说明本发明的技术思想及特点，其目的是使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但不应该以此限定本发明专利的范围，所属领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行等同变化和改进，都应该属于本发明所保护的技术范围。
Claims (16)
1.一种树突状杀手细胞的鉴定方法，其特征在于，涉及鉴定多个选自由HLA-G-、表现自然杀手细胞表面标记及树突细胞表面标记所组成的群组的细胞表面标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，自然杀手细胞表面标记为CD56+。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，CD56+进一步为CD56dim。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，树突细胞表面标记为HLA-DR+。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由该些细胞表面标记所组成的群组更进一步包含，不表现单核细胞表面标记、B细胞表面标记与T细胞表面标记的组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，不表现单核细胞表面标记、B细胞表面标记与T细胞表面标记的组成，分别为CD14-、CD19-与CD3-。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法可鉴定人类外围血检体中的树突状杀手细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该人类外围血检体选自于一癌症病人的外围血。
9.一种树突状杀手细胞的筛选方法，其特征在于，至少包含下列步骤：
提供一第一细胞群组；
检测该第一细胞群组中CD14与HLA-G的表现以分选出一第二细胞群组；
检测该第二细胞群组中CD19与CD3的表现以分选出一第三细胞群组；以及
检测该第三细胞群组中HLA-DR与CD56的表现以得到一树突状杀手细胞群组。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该第二细胞群组包含细胞表面标记为CD14-与HLA-G-的细胞。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该第三细胞群组包含细胞表面标记为CD14-、HLA-G-、CD3-与CD19-的细胞。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该树突状杀手细胞群组包含细胞表面标记为CD14-HLA-G-CD3-CD19-HLA-DR+CD56dim的细胞。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该提供该第一细胞群组的步骤至少包含下列步骤：
提供人类外围血；以及
利用细胞大小与细胞表面颗粒性筛选出该第一细胞群组。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该人类外围血来自于一癌症患者。
15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该第一细胞群包含淋巴细胞与单核细胞。
16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该些检测步骤通过一流式细胞仪来执行。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101124290A TW201403067A (zh) | 2012-07-05 | 2012-07-05 | 毒殺型樹突細胞的鑑定與篩選方法 |
| TW101124290 | 2012-07-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103525895A true CN103525895A (zh) | 2014-01-22 |
| CN103525895B CN103525895B (zh) | 2015-12-02 |
Family
ID=49878793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310240738.0A Expired - Fee Related CN103525895B (zh) | 2012-07-05 | 2013-06-18 | 树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140011230A1 (zh) |
| CN (1) | CN103525895B (zh) |
| TW (1) | TW201403067A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103852407A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-06-11 | 浙江大学 | 通过检测hla-dr表达量评估cd14阳性细胞抗原呈递能力的方法 |
| CN115895864A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-04-04 | 重庆大学 | 一种基于平面电极的微流控芯片检测系统 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3668187B1 (en) * | 2013-12-06 | 2023-10-04 | Huawei Technologies Co., Ltd. | Accessing an access point by a station device |
| JP6588465B2 (ja) * | 2014-01-03 | 2019-10-09 | アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ | 修飾ナチュラルキラー細胞、その組成物および用途 |
| CN105911292B (zh) * | 2016-05-19 | 2018-06-26 | 深圳市衍生生物科技有限公司 | 用于组合分析CD11c+CD11b+ DC亚群以及其分化程度和功能的试剂盒及方法 |
-
2012
- 2012-07-05 TW TW101124290A patent/TW201403067A/zh unknown
-
2013
- 2013-06-14 US US13/918,529 patent/US20140011230A1/en not_active Abandoned
- 2013-06-18 CN CN201310240738.0A patent/CN103525895B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MATHIEU BONMORT ET AL: ""Killer dendritic cells: IKDC and the others"", 《CURRENT OPINION IN IMMUNOLOGY》 * |
| 钟国成等: "产生干扰素的杀伤树突状细胞( IKDC)", 《细胞与分子免疫学杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103852407A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-06-11 | 浙江大学 | 通过检测hla-dr表达量评估cd14阳性细胞抗原呈递能力的方法 |
| CN115895864A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-04-04 | 重庆大学 | 一种基于平面电极的微流控芯片检测系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201403067A (zh) | 2014-01-16 |
| US20140011230A1 (en) | 2014-01-09 |
| CN103525895B (zh) | 2015-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4502814B2 (ja) | 細胞性免疫応答を測定する診断アッセイ法 | |
| Lehmann et al. | Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics | |
| CN102713619B (zh) | 测量细胞介导免疫反应的试验 | |
| JP5700934B2 (ja) | 細胞性免疫反応アッセイおよびそのためのキット | |
| CN103756967B (zh) | 抗hla-g的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用 | |
| US20110262468A1 (en) | Method for Monitoring Vaccine Response Using Single Cell Network Profiling | |
| CN103525895B (zh) | 树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法 | |
| KR20170094523A (ko) | 생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법 | |
| US9891213B2 (en) | Granulocyte-based methods for detecting and monitoring immune system disorders | |
| CN112331344B (zh) | 免疫状态评估方法及应用 | |
| CN108179134A (zh) | 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用 | |
| Parachuru et al. | FoxP3+ regulatory T cells, interleukin 17 and mast cells in chronic inflammatory periodontal disease | |
| CN1444043A (zh) | 一种个体化特异性免疫细胞功能测定方法 | |
| US20180348208A1 (en) | Systems And Methods For Determining The Risk Of Severe Allergic Reaction To Allergen, And The Immunological Protection Afforded By Vaccines | |
| Staupe et al. | Single cell multi-omic reference atlases of non-human primate immune tissues reveals CD102 as a biomarker for long-lived plasma cells | |
| Takaishi et al. | Evaluation of basophil activation caused by transgenic rice seeds expressing whole T cell epitopes of the major Japanese cedar pollen allergens | |
| CN103525762B (zh) | 一种制备专一性t细胞的配方、方法及其配方制备方法 | |
| CN103520208B (zh) | 树突状杀手细胞群组用于制备药物的用途及其医药组合物 | |
| WO2004003548A1 (de) | Verfahren zur eigenschaftsbestimmung und/oder klassifikation von zirkulierenden macrophagen sowie analyseanordnung zur durchführung des verfahrens | |
| CN103525764B (zh) | 培养树突状杀手细胞的配方及其方法 | |
| CN114121162A (zh) | 一种关于免疫力评估的方法 | |
| JP7021633B2 (ja) | 細胞観察装置及び免疫細胞の品質管理方法 | |
| JP7061342B2 (ja) | エフェクター制御性ｔ細胞の検出及び調製 | |
| Al-Sukruwah et al. | Impact of Fixation of Camel Lymph Node Cells on Marker Expression Stability in Flow Cytometry | |
| CN111579779B (zh) | 用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的标志物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Jianmou Inventor after: Liao Nanshi Inventor before: Li Jianmou |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180511 Address after: Nangang District Institute of Taiwan city Taipei two Chinese Road No. 128 Patentee after: ACADEMIA SINICA Address before: Nei Hu District, Taipei, Taiwan, China. Section 6 of civil rights East Road 160, 5, 3 Patentee before: FULLHOPE BIOMEDICAL CO.,LTD. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151202 |