CN103525762B

CN103525762B - 一种制备专一性t细胞的配方、方法及其配方制备方法

Info

Publication number: CN103525762B
Application number: CN201310240262.0A
Authority: CN
Inventors: 李建谋
Original assignee: Fullhope Biomedical Co ltd
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: TW201402814A; US20140010794A1; CN103525762A; TWI503414B

Abstract

本发明提供一种制备专一性T细胞的配方、方法及其配方制备方法。其中，上述配方可用以活化T细胞并使经活化的T细胞具有专一性，其该配方至少包含一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群。另外，上述制备专一性T细胞的方法包含下列步骤：首先，提供一T细胞群。接着，加入上述配方与该T细胞群混合。最后，经培养后，收取一专一性T细胞。又，上述配方制备方法包含下列步骤：首先，提供一树突状杀手细胞群。接着，提供一目标检体。再来，将该树突状杀手细胞群与该目标检体共同培养。最后，经培养后，收取一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群。

Description

一种制备专一性T细胞的配方、方法及其配方制备方法

技术领域

本发明涉及制备专一性T细胞的配方、方法及配方制备方法，尤其涉及一种利用呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群活化T细胞，制备专一性T细胞的配方、方法及配方制备方法。

背景技术

人体对外来异物具有辨识和启动一连串反应的防御机转，这防御系统就是免疫系统。免疫系统拥有不同作用的白血球及淋巴细胞、不同功能的蛋白质因子，如免疫球蛋白、介白质及细胞激素等，互相协调合作，形成人体的防御力。免疫反应依其特异性及记忆性的有无，分为先天性及后天性。先天性免疫系统包括可溶性化学因子、干扰素、补体系统、嗜中性淋巴球及巨噬细胞的吞噬作用和自然杀手细胞的毒杀作用等。后天性免疫系统包括体液免疫及细胞免疫，前者包括抗体生成系统，后者包括淋巴细胞、淋巴激素及免疫记忆系统。记忆的功能使免疫系统对已对付过的抗原，引发强而快速的次发反应，可将外来危害因子有效去除。

免疫反应对抗原会有不同反应是由于主要组织兼容复合物（MajorHistocompatibility Complex,MHC）的作用。外来抗原通常需要经过细胞处理与MHC分子结合后，才能被免疫系统所认知。因此MHC的类型与个人对特定因子的免疫力有关，是造成个体对疾病易感性的重要因素。人类的MHC又名人类白血球抗原（Human Leukocyte Antigen,HLA）。HLA可分为class I、class II，为结构相似的醣蛋白，与抗原呈现功能有关。HLAclass I抗原表现于所有体细胞上，而class II只表现于巨噬细胞、B细胞及树突状细胞（Dendritic Cell,DC）的细胞表面上。

人体内有一种高度分化的免疫细胞，叫做抗原呈现细胞（Antigen PresentingCells,APC）。抗原呈现细胞的功能是摄取、加工、处理外源性抗原并将加工后抗原呈现给T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞进行增殖进而分化成效应细胞，产生免疫反应，以辨识并抵抗感染甚至癌症细胞。树突细胞（Dendritic cells，DCs）是目前所知的人体内功能最强大的抗原呈现细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC的最大特点是能够显著刺激初始T细胞进行增殖，而其他的抗原呈现细胞，如巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。因此DC是机体免疫反应的始动者，在免疫反应的诱导中具有独特的地位。

另外，自然杀手细胞（Natural Killer cell,NK cell）也是一种在免疫反应中占有重要地位的细胞，其起源于淋巴前驱细胞，占人类血液中淋巴球的5～10％。NK细胞表面缺乏专一性的抗原受体，负责非专一性防御，可以胞杀肿瘤细胞和被病毒感染细胞。NK细胞表面虽然没有抗原专一性受体，但其表面有许多其他的膜蛋白接受来自目标细胞的刺激，以调节NK细胞的活性，这些膜蛋白大致可分为“抑制性受体”和“活化性受体”。当NK细胞与细胞接触后，获得活化性受体的讯息，若与正常细胞接触，则正常细胞表面的第一型MHC分子与抑制性受体结合，传递了“抑制”NK细胞活性的讯息，故NK细胞不会被活化，以避免杀死正常细胞。若正常细胞被病毒感染或转为肿瘤细胞后，第一型MHC分子的表现常会发生异常，因此当NK细胞接触不正常细胞时，便无法获得抑制性受体的讯息，于是NK细胞便活化进行胞杀作用。也就是说，只有“活化”讯息存在，且“抑制”的讯息异常或不存在时，NK细胞才会进行胞杀作用。

近年来，同时具有上述两种DC与NK细胞功能的干扰素分泌型杀手树突细胞逐渐受到关注。干扰素分泌型杀手树突细胞可以从毒杀目标、抗原呈现到活化T细胞都由自己完成，也即干扰素分泌型杀手树突细胞找到目标后会毒杀目标，接着把碎片吞噬后呈现抗原给T细胞，并活化T细胞。然而，正如同前文述及，干扰素分泌型杀手树突细胞虽然在免疫反应中扮演了相当重要的角色，但因为干扰素分泌型杀手树突细胞在体内的量非常稀少，如此低的细胞比率及数目，需要繁琐的步骤来加以纯化，也限制了针对干扰素分泌型杀手树突细胞的进一步研究。不仅如此，目前的技术仅能从老鼠的脾脏、淋巴结或骨髓中分离出干扰素分泌型杀手树突细胞，使得要实际将其应用于研究或临床上都面临了不小的瓶颈。

因此，发明人经过长年的努力以及无数次的试验，已成功筛选出了人类体内同时具有毒杀及抗原呈现功能的细胞，并定义该细胞为树突状杀手细胞（Dendritic KillerCell,DKC），又称为毒杀型树突细胞(cytoDC)或干扰素分泌型杀手树突细胞(IKDC)。

然而，从发明人实验的结果严格说来，树突状杀手细胞在人类周边淋巴细胞中所占的比率仍低于0.01%。请参考图1至图2B，图1显示健康者与癌症患者在外围血中树突状杀手细胞含量百分比对照图，图2A显示藉流式细胞仪分析癌症患者外围血的结果，图2B显示藉流式细胞仪分析健康者外围血的结果。如图1所示，在癌症患者的外围血中树突状杀手细胞（DKC）的含量百分比明显低于健康者。另外，如图2A所示，请见右上角处，癌症患者所提供的外围血中树突状杀手细胞群组10内细胞的含量只有百分之0.036，而如图2B所示，同样请见右上角处，在健康者所提供的外围血中树突状杀手细胞群组10内细胞的含量为百分之0.436，明显高于癌症患者。

另外一个问题就是，在免疫疗法上，由于肿瘤细胞会改变其抗原，如此可以躲避免疫细胞的辨识，有时反而无法达到很好的疗效。

发明内容

有鉴于此，发明人除了设法将人体外围血中微量的树突状杀手细胞扩增至200至400倍外，并进一步处理经放大培养后的树突状杀手细胞，将其转变为呈现专一性抗原的树突状杀手细胞，再将该呈现专一性抗原的树突状杀手细胞与细胞可接受的培养基或缓冲液制备为一配方，用以活化一T细胞，并使经活化的该T细胞具有专一性。

承上所述，本发明提供制备专一性T细胞的配方，用以活化一T细胞，并使经活化之该T细胞具有专一性，其中该配方至少包含一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群及细胞可接受的培养基或缓冲液。较佳的，该呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群的浓度为10⁶细胞/毫升。

本发明的另一个目的在于，提供上述配方的制备方法，包含下列步骤：首先，提供一树突状杀手细胞群；接着，提供一目标检体；再来，将该树突状杀手细胞群与该目标检体共同培养；最后，经培养后，收取一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群。其中树突状杀手细胞群会对目标检体进行毒杀作用，并将该目标检体的专一性抗原呈现于细胞表面，形成呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群。上述树突状杀手细胞群将一人类外围血检体中的树突状杀手细胞，于生物体之外通过细胞激素放大培养而得，且该细胞激素包含介白素15号。较佳的，其中目标检体为一癌症病患的一肿瘤细胞，而树突状杀手细胞群呈现的专一性抗原为肿瘤专一性抗原。较佳的，上述目标检体与树突状杀手细胞群系从同一该癌症病患的检体中获得。

在本发明的一实施例中，利用上述配方的制备方法可作为一种专一性抗原的筛选平台，利用树突状杀手细胞群细胞毒杀及抗原呈现的特性，可筛选出目标检体的专一性抗原。

本发明的另一目的在于，提供一种制备专一性T细胞的方法，此方法至少包含下列步骤：首先，提供一T细胞群；接着，加入上述配方与该T细胞群混合；最后，经培养后，收取一专一性T细胞。其中上述配方包含一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群，而上述T细胞群被呈现专一性抗原之树突状杀手细胞群活化，并对树突状杀手细胞所呈现出的抗原具有专一性，形成专一性T细胞。

在本发明的一实施例中，其中该呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群所呈现的专一性抗原为肿瘤专一性抗原，而呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群活化的专一性T细胞为肿瘤专一性T细胞。

由下文的说明，可更进一步了解本发明的特征及其优点，阅读时请参考图1至图10。

附图说明

图1显示健康者与癌症患者在外围血中树突状杀手细胞群组含量百分比对照图；

图2A显示藉流式细胞仪分析癌症患者外围血的结果；

图2B显示藉流式细胞仪分析健康者外围血的结果；

图3显示本发明一实施例之培养树突状杀手细胞的方法流程图；

图4A至图4C显本发明一实施例中培养树突状杀手细胞的结果；

图5显本发明一实施例中树突状杀手细胞作用机转的示意图；

图6显本发明一实施例中制备本发明的配方的方法流程图；

图7A至图7B显本发明一实施例中卵巢癌细胞于加入树突状杀手细胞群组前后的情形；

图8显本发明一实施例中制备专一性T细胞的方法流程图；

图9A至图9B显示本发明一实施例中藉流式细胞仪检测呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群活化T细胞的结果；以及

图10A至图10B显示本发明一实施例中藉流式细胞仪检测树突状杀手细胞活化T细胞的情形；

附图标记说明

S100～S103 培养树突状杀手细胞群组的步骤

S200～S204 制备本发明配方的步骤

S300～S303 制备专一性T细胞的步骤

10 树突状杀手细胞

20 经流式细胞仪分选出的树突状杀手细胞

30 自然杀手细胞

40 肿瘤细胞

50 呈现专一性抗原的树突状杀手细胞

60 细胞毒杀型T细胞

具体实施方式

名词定义

除非有其他定义，所有在此所用的技术及科学词汇，如同作为本发明所属技术领域中具有一般技艺者一般性地了解具有相同意义。在此指称的所有专利、申请案、公开申请案及其他应用，以及基因库登录号都完整以参考文献被整合起来。若本章节提出的定义与其他专利、申请案、公开申请案及其他在此引用的参考文献所提出的定义相反或不一致，以本章节提出的定义为主。

如本发明所使用，术语“树突状杀手细胞（DKC）”指同时具有细胞毒杀及抗原呈现功能的细胞。

如本发明所使用，术语“呈现专一性抗原之树突状杀手细胞”指上述之树突状杀手细胞的细胞表面呈现有专一性抗原，即定义为呈现专一性抗原之树突状杀手细胞。

如本发明所使用，术语“专一性T细胞”指T细胞经由抗原呈现细胞活化后，对该抗原呈现细胞所呈现之抗原具有专一性。

如本发明所使用，符号“+”指细胞表面标记有表现于细胞表面，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量大于阴性控制组的表现量。

如本发明所使用，符号“-”指细胞表面标记没有表现于细胞表面，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量等于阴性控制组的表现量。

上述细胞表面标记的表现量，使用的流式细胞仪测量结果，但本发明不以此为限，若他人采相关技艺的替代技术，执行与本发明精神相同的利用，均为本发明的专利范围中。

如本发明所使用，术语“介白素”指一组细胞因子，可以由多种细胞产生，人体免疫系统的功能在很大程度上依赖于介白素。

实施例

虽然下文详述本发明多个实施例之配方及培养方法，但应了解本发明可提供许多可在多种具体背景下实施的实用发明概念。本文所述之具体实施例仅系制备及使用本发明之具体方式的例示性说明且并不界定本发明之范畴。下文将定义若干术语以便于理解本发明。本文所定义之术语具有熟习与本发明相关领域之一般技术者通常理解之含义。例如“一（a、an）”及“该（the）”等术语非欲仅指单数实体，而是包括可使用具体实例说明之一般类别。本文术语用以阐述本发明的具体实施例，但除申请专利范围所概述之外，其用法并不界定本发明。

另外，本发明所揭示的方法中的多个分离或筛选步骤均通过一流式细胞检测技术（即流式细胞仪）来完成，并适合使用各一或多种流式细胞仪来利用不同群组的细胞拥有不同的细胞表面标记物区分筛选出目标细胞群组。流式细胞仪能够以远远超过相关技艺任何其他单细胞分析技术的速度实施单细胞分析，相比于使用其他替代技术能够较快速地分析统计学上有意义的数量的细胞，但本发明并不欲以此为限。较佳地，在一个实施例中，使用本领域技术人员常用的任一适宜试样制备自动装置或液体处理器的流式细胞仪。另外，使用单路雷射流式细胞仪或多路雷射流式细胞仪来实施分析步骤均可，本发明并不以此为限。较佳地，大量荧光染料及偶联化学品的研发及优化使得能够将诸如免疫球蛋白及小分子等各种配体偶联至荧光染料。具有介于光谱的紫外至红光区范围内的发射线的雷射能够激发该等荧光染料。因此，可使用诸多光谱学上不同的试剂来标记细胞以利用基于荧光的测试方法（如本发明所使用的流式细胞仪）进行研究。该等试剂已为熟习此项技术者所熟知。在一个实施例中，在分析步骤期间使用一或多种荧光染料。在一些实施例中，在细胞对药物组合物的效应的分析中使用一或多种染色剂。至于检测后的数据分析方法非本发明所欲探讨的主题，在此不再赘述。

首先，事先说明的是，如前文所述发明人经过长年的努力以及无数次的试验，已成功筛选出了人类体内同时具有毒杀及抗原呈现功能的细胞，并定义该细胞为树突状杀手细胞（DKC），即具有包含有细胞表面标记为HLA-G^-CD14^-CD19^-CD3^-CD56⁺HLA-DR⁺的细胞。

承上述，既然能够鉴定出人体外围血中的树突状杀手细胞，后续请参考图3，图3进一步说明本发明所谓的经放大培养的树突状杀手细胞群究竟如何将人体外围血中微量的树突状杀手细胞放大以利应用。

首先，如图3所示，先取得人类血液检体的外围血单核细胞群组S100。接着，加入有效量细胞激素与外围血单核细胞群组混合S101。其中，上述细胞激素包含有效量的介白素15号。再来，静置一合适时间S102。最后，便可分离出本发明所需的树突状杀手细胞群组S103。

较佳地，上述细胞激素更包含有效量之介白素12号。较佳地，上述所使用之介白素15号的浓度为10ng/mL，介白素12号的浓度介于0.5-20ng/mL。

另外，上述步骤S100更包含下述步骤。首先，收集人类血液检体40ml，并以同体积磷酸缓冲液两倍稀释人类血液检体。接着，自人类血液检体中分离出外围血单核细胞群组。接着，去除外围血单核细胞群组中的T细胞与B细胞。最后，调整外围血单核细胞群组的浓度至10⁶细胞/毫升。基本上，人类外围血单核细胞可分为五类细胞，如：单核细胞（Monocyticcells）、小细胞（small cells）、淋巴细胞（Lymphoid cells）、大细胞（large cells）与大颗粒细胞（large and granular cells），可先利用流式细胞仪选取其中一种或多种类型的细胞为基准来进行后续步骤。该细胞较佳地可包含单核细胞群组或淋巴细胞群组或上述两者同时包含在内等，但本发明并不欲以此为限，后续将以单核细胞群组为例来说明。

另外，上述第一合适时间指将介白素15号与外围血单核细胞群组均置入培养基后放置一段时间使其开始进行细胞扩增。较佳地，一合适时间为培养后的第七天。

请参照图4所示，图4A为人类外围血单核细胞（PBMC）去除T细胞与B细胞（CD3^-CD9^-PBMC），在培养前以流式细胞仪测量CD56及HLA-DR的结果。图4B为在细胞培养第七天以流式细胞仪测量CD56及HLA-DR的结果。图4C为利用流式细胞仪分选出树突状杀手细胞群的结果。本试验将人类外围血检体中的单核细胞去除B细胞及T细胞后，加入浓度10ng/mL的介白素15号，及浓度2ng/mL的介白素12号，培养七天后收取经放大培养的树突状杀手细胞。

如图4A所示，在培养前同时具有自然杀手细胞表面标记（CD56⁺）与树突细胞表面标记（HLA-DR⁺）的细胞数量很少，而图中央如纺锤状的细胞群30，为带有CD56但不具HLA-DR的自然杀手细胞。再请参考图4B，经培养七天后，细胞会转变成同时具有自然杀手细胞表面标记（CD56⁺）与树突细胞表面标记（HLA-DR⁺）的树突状杀手细胞（DKC）10，不只原本的树突状杀手细胞会增生更会趋化自然杀手细胞转变成树突状杀手细胞。最后，请参考图4C，将经培养放大的细胞群利用流式细胞仪分选出一细胞群（sorted cells），该细胞群的表面标记为HLA-G^-CD14^-CD19^-CD3^-CD56⁺HLA-DR⁺的树突状杀手细胞群20。

然而，必须说明的是，上述一合适时间为一较佳实验手段，但本发明并不欲以此为限。也就是说，本发明也可于培养后第四天进行步骤S103，或于培养后第十天进行步骤S103。再者，于步骤S103之后，可再重复进行步骤S101～S103，也即再次收集未附着的细胞，重复上述步骤即可将树突状杀手细胞放大至所需数量。

再者，本发明中所进行的步骤均于生物体之外进行（ex vivo），且其所收集的人类血液检体系来自于癌症病患，且此癌症患者所患的癌症可选择自于鳞状细胞癌、原位性与小叶性乳癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或是眼内的恶性黑色素瘤、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、睪丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏症、非何杰金氏症、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、孩童硬肿瘤、淋巴癌、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾脏细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波希氏瘤、表皮样癌和这些癌症的任何组合及其散播或转移形式所组成的群组。

另外，本发明的目的即在于，提供制备专一性T细胞的配方，此配方至少包含一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群，更进一步，上述配方更可包含一细胞可接受的培养基或缓冲液。而该呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群组系将上述经放大培养后的树突状杀手细胞群组更进一步处理，形成与该树突状杀手细胞不同特性的呈现专一性抗原的树突状杀手细胞，提供本发明的制备专一性T细胞的配方。

必须说明的是，此配方中所包含的树突状杀手细胞群组为一呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群组，且此配方用以活化T细胞并使经活化的T细胞具有专一性。也就是说，本发明同时揭露了利用呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群用以制备专一性T细胞的方法，因此相关制备专一性T细胞配方、方法及配方的制备方法请搭配图示揭露如后。

请参照图5，图5为树突状杀手细胞作用机转的示意图，树突状杀手细胞10具有肿瘤辨识能力，会辨识到肿瘤细胞后分泌γ型干扰素（IFN-γ）对肿瘤细胞40进行细胞毒杀作用，并吞噬遭毒杀的肿瘤细胞碎片把肿瘤专一性抗原呈现于细胞表面，形成呈现专一性抗原的树突状杀手细胞50；而上述呈现专一性抗原的树突状杀手细胞会将肿瘤专一性的抗原给CD8⁺的T细胞（细胞毒杀型T细胞）60，活化CD8⁺的T细胞并使其对树突状杀手细胞所呈现出的专一性抗原具有专一性，形成专一性T细胞。

接着，请同时参考图6以及图7，图6显示本发明一实施例中制备本发明的配方的方法流程图，图7A至图7B显示卵巢癌细胞于加入树突状杀手细胞群前后的情形。

如图6所示，于上述步骤S103取得上述经放大培养后的树突状杀手细胞群组之后，提供该树突状杀手细胞群S200进行制备本发明的配方，接着再提供一目标检体S201。在本发明中，目标检体较佳地为同一癌症病患的肿瘤细胞，举例来说，目标检体为该名癌症病患的卵巢癌细胞，即如图7A图所示，图中将该名癌症病患经手术取出的卵巢癌细胞放置于培养基中，可以看出在与树突状杀手细胞群培养反应前癌细胞呈现正常生长的状态。接着，将上述树突状杀手细胞群加入目标检体中共同培养S202。树突状杀手细胞群会对肿瘤细胞进行细胞毒杀，请参照图7B所示，可明显看出肿瘤细胞与树突状杀手细胞群组反应后大量死亡的情形，且树突状杀手细胞会将肿瘤碎片吞噬而呈现出上述目标检体的肿瘤专一性抗原，转变成呈现肿瘤抗原专一性的树突状杀手细胞群S203。最后，收取呈现肿瘤专一性抗原的树突状杀手细胞群组S204，即为本发明的制备专一性T细胞的配方，而配方中呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群较佳的浓度为10⁶细胞/毫升。

请接着参考图8，图为制备专一性T细胞的方法流程。首先，提供一T细胞S300，再加入上述包含有呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群的配方S301。而配方中的呈现肿瘤专一性抗原的树突状杀手细胞群组利用其呈现出的肿瘤专一性抗原活化了T细胞S302，使得被活化的T细胞因辨识了肿瘤专一性抗原所以也具有肿瘤专一性。最后，收取经活化的专一性T细胞S303。在本实施例中所使用的配方浓度为10⁶细胞/毫升，但本发明不以之为限。

请参考图9至图10，图9显示本发明一实施例中呈现专一性抗原的树突状杀手细胞活化T细胞的情形。图10显示未与肿瘤细胞反应的树突状杀手细胞活化T细胞的情形。如前文所述，呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群组具有活化T细胞的功能，据此本发明从上述患有卵巢癌的癌症病患外围血分离出CD8⁺的T细胞（细胞毒杀型T细胞），将分离出的T细胞标记上6.5μM的CFSE，以观察呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群在活化T细胞的效果。必须说明的是，CFSE为一种荧光染料，用以量化细胞增生程度，可辨认7-10个连续细胞世代，细胞分裂期间每分裂一次，CFSE的相对荧光强度由一半减少，如此可用来测量细胞分裂的次数及相对应的比例。而本实施例是通过流式细胞仪测量，但不以之为限。又再须说明的是，上述树突状杀手细胞、呈现专一性抗原的树突状杀手细胞、肿瘤细胞及CD8⁺的T细胞都从同一卵巢癌病患取得。

请参照图9，图9显示将树突状杀手细胞与上述卵巢癌细胞反应后所形成的呈现专一抗原的树突状杀手细胞群，与该卵巢癌病患的标记有CFSE的CD8⁺的T细胞反应的结果。图9A显示利用流式细胞仪测量标记有CFSE的T细胞被活化后分裂的情形。图9B利用流式细胞仪测量反应后的T细胞其细胞内的γ型干扰素（IFN-γ）的结果。本试验将呈现专一抗原的树突状杀手细胞与CD8⁺的T细胞共同培养48小时，再藉流式细胞仪测量T细胞活化分裂情形。

如图9A所示，可以看出呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群可活化T细胞，使55.5％标记有CFSE的T细胞复制增生。另外，如图9B所示，被呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群活化的T细胞，其多数细胞内具有IFN-γ（图左上的框格中），即表示被活化的T可分泌IFN-γ，具有细胞毒杀功能，且因是由呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群所活化，因此对树突状杀手细胞呈现出的抗原具有专一性。

最后，请参照图10，图10将未与肿瘤细胞反应的树突状杀手细胞与标记有CFSE的T细胞反应的结果。可以看出未与肿瘤细胞的树突状杀手细胞与并没有办法活化T细胞使其复制增生，如图10A所示，只有百分之0.046的T细胞复制增生，其结果为阴性；又如图10B所示，其T细胞内无测得IFN-γ。由图10的结果可知，未与肿瘤细胞反应的树突状杀手细胞，因其细胞表面没有呈现专一性抗原，无法活化自体的CD8⁺T细胞。

综上所述，树突状杀手细胞是一种同时拥有自然杀手细胞与树突细胞功能的细胞，在人体内的量非常稀少，但其于免疫反应中扮演重要的角色。经由发明人所研究的放大培养、筛选与鉴定等技术可在体外从人类外围血中将微量的树突状杀手细胞放大200至400倍，再以树突状杀手细胞群组本身就具有的肿瘤辨识能力，可毒杀肿瘤并将肿瘤专一性的抗原呈现给T细胞，让肿瘤细胞无法回避免疫细胞的辨识。同时，发明人使用的目标检体来自同一癌症病患，也即用癌症病患本身的外围血培养出的树突状杀手细胞群组与该癌症病患自体取得的肿瘤细胞反应，反应后呈现专一性抗原的树突状杀手细胞群组可进一步活化由该名癌症病患自体取得的CD8⁺T细胞，形成肿瘤专一性T细胞。

如此可证明利用本发明所提供的技术让肿瘤细胞无法躲避自体的免疫细胞，更确实地加强了呈现专一性抗原树突状杀手细胞群组运用于制备专一性T细胞的效果，其经由本发明于体外制备的专一性T细胞更可用于对抗肿瘤的免疫疗法，作为未来肿瘤免疫疗法的新契机。额外地，本发明所提供的方法也可以作为一种专一性抗原的筛选平台，利用树突状杀手细胞群组筛选出肿瘤专一性的抗原。

以上所述实施例只用于说明本发明的技术思想及特点，其目的是使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但不应该以此限定本发明专利的范围，所属领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行等同变化和改进，都应该属于本发明所保护的技术范围。

Claims

1.一种用以制备专一性T细胞的组合物，其特征在于，该组合物包含一呈现肿瘤专一性抗原的人类树突状杀手细胞群，其中，该呈现肿瘤专一性抗原的人类树突状杀手细胞群的细胞表面标记为HLA-G^－CD14^－CD19^－CD3^－CD56⁺HLA-DR⁺。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，更包含一细胞可接受的培养基。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，更包含一细胞可接受的缓冲液。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该呈现肿瘤专一性抗原的人类树突状杀手细胞群的浓度为10⁶细胞/毫升。

5.一种医药组成物，包含一呈现肿瘤专一性抗原的人类树突状杀手细胞群，其中，该呈现肿瘤专一性抗原的人类树突状杀手细胞群的细胞表面标记为HLA-G^－CD14^－CD19^－CD3^－CD56⁺HLA-DR⁺。

6.一种用以制备专一性T细胞的组合物，为包含下列步骤的制备方法所制得的组合物:

(a)取得一人类血液检体的外围血单核细胞群组；

(b)加入介白素15以及介白素12，培养复数天，获得一细胞群；

(c)从该细胞群中，分离细胞表面标记为HLA-G^－CD14^－CD19^－CD3^－CD56⁺HLA-DR⁺之细胞，以获得人类树突状杀手细胞群；

(d)将该人类树突状杀手细胞群与一目标检体共同培养，其中，该目标检体具有至少一肿瘤专一性抗原；以及

(e)经培养后，收取一呈现该肿瘤专一性抗原的人类树突状杀手细胞群。

7.根据权利要求6所述的组合物，步骤(b)中，介白素12之浓度为0.5～20ng/mL。

8.根据权利要求6所述的组合物，步骤(b)中，介白素15之浓度为10ng/mL，且介白素12之浓度为2ng/mL。

9.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，该目标检体与该人类血液检体系从同一位癌症病患的检体中获得。

10.一种用以制备专一性T细胞的组合物的制备方法，至少包含下列步骤:

(a)取得一人类血液检体的外围血单核细胞群组；

(b)加入介白素15以及介白素12，培养复数天，获得一细胞群；

(d)将该人类树突状杀手细胞群与一目标检体共同培养，其中，该目标检体具有至少一专一性抗原；以及

(e)经培养后，收取呈现该专一性抗原的人类树突状杀手细胞群。

11.根据权利要求10所述的制备方法，步骤(b)中，介白素12之浓度为0.5～20ng/mL。

12.根据权利要求10所述的制备方法，步骤(b)中，介白素15之浓度为10ng/mL，且介白素12之浓度为2ng/mL。

13.一种制备专一性T细胞的方法，其特征在于，步骤包含:

(a)取得一人类血液检体的外围血单核细胞群组；

(b)加入介白素15以及介白素12，培养复数天，获得一细胞群；

(d)将该人类树突状杀手细胞群与一目标检体共同培养，其中，该目标检体具有至少一专一性抗原；

(e)经培养后，收取呈现该专一性抗原的人类树突状杀手细胞群，以获得一制备专一性T细胞的组合物；

(f)提供一T细胞群；以及

(g)将该制备专一性T细胞的组合物与该T细胞群混合；及(h)经培养后，收取专一性T细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该目标检体、该人类血液检体、以及该T细胞群系从同一位病患之检体中获得。

15.根据权利要求13所述的方法，步骤(b)中，介白素12之浓度为0.5～20ng/mL。

16.根据权利要求13所述的方法，步骤(b)中，介白素15之浓度为10ng/mL，抑或是，介白素12之浓度为2ng/mL。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该专一性抗原为肿瘤专一性抗原，该T细胞群为CD8⁺的T细胞，且该专一性T细胞为肿瘤专一性T细胞。