TWI503414B - 一種製備專一性ｔ細胞之配方、方法及其配方製備方法 - Google Patents
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Description
本發明係有關於製備專一性T細胞之配方、方法及配方製備方法，尤其是一種利用呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群活化T細胞，製備專一性T細胞之配方、方法及配方製備方法。
人體對外來異物具有辨識和啟動一連串反應的防禦機轉，這防禦系統就是免疫系統。免疫系統擁有不同作用的白血球及淋巴細胞、不同功能的蛋白質因子，如免疫球蛋白、介白質及細胞激素等，互相協調合作，形成人體的防禦力。免疫反應依其特異性及記憶性的有無，分為先天性及後天性。先天性免疫系統包括可溶性化學因子、干擾素、補體系統、嗜中性淋巴球及巨噬細胞的吞噬作用和自然殺手細胞的毒殺作用等。後天性免疫系統包括體液免疫及細胞免疫，前者包括抗體生成系統，後者包括淋巴細胞、淋巴激素及免疫記憶系統。記憶的功能使免疫系統對已對付過的抗原，引發強而快速的次發反應，可將外來危害因子有效去除。
免疫反應對抗原會有不同反應是由於主要組織相容複合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)的作用。外來抗原通常需要經過細胞處理與MHC分子結合後，才能被免疫系統所認知。因此MHC的類型與個人對特定因子的免疫力有關，是造成個體對疾病易感性的重要因素。人類的MHC又名人類白血球抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)。HLA可分為class I、class II，為結構相似的醣蛋白，與抗原呈現功能有關。HLA class I抗原表現於所有體細胞上，而class II只表現於巨噬細胞、B細胞及樹突狀細胞(Dendritic Cell,DC)的細胞表面上。
人體內有一種高度分化的免疫細胞，叫做抗原呈現細胞(Antigen Presenting Cells,APC)。抗原呈現細胞的功能是攝取、加工、處理外源性抗原並將加工後抗原呈現給T淋巴細胞，誘導T淋巴細胞進行增殖進而分化成效應細胞，產生免疫反應，以辨識並抵抗感染甚至癌症細胞。樹突細胞(Dendritic cells，DCs)是目前所知的人體內功能最強大的
抗原呈現細胞，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC的最大特點是能夠顯著刺激初始T細胞進行增殖，而其他的抗原呈現細胞，如巨噬細胞、B細胞僅能刺激已活化的或記憶性T細胞。因此DC是機體免疫反應的始動者，在免疫反應的誘導中具有獨特的地位。
另外，自然殺手細胞(Natural Killer cell,NK cell)也是一種在免疫反應中佔有重要地位的細胞，其起源於淋巴前驅細胞，佔人類血液中淋巴球的5~10%。NK細胞表面缺乏專一性的抗原受體，負責非專一性防禦，可以胞殺腫瘤細胞和被病毒感染細胞。NK細胞表面雖然沒有抗原專一性受體，但其表面有許多其他的膜蛋白接受來自目標細胞的刺激，以調節NK細胞的活性，這些膜蛋白大致可分為「抑制性受體」和「活化性受體」。當NK細胞與細胞接觸後，獲得活化性受體的訊息，若與正常細胞接觸，則正常細胞表面的第一型MHC分子與抑制性受體結合，傳遞了「抑制」NK細胞活性的訊息，故NK細胞不會被活化，以避免殺死正常細胞。若正常細胞被病毒感染或轉為腫瘤細胞後，第一型MHC分子的表現常會發生異常，因此當NK細胞接觸不正常細胞時，便無法獲得抑制性受體的訊息，於是NK細胞便活化進行胞殺作用。也就是說，只有「活化」訊息存在，且「抑制」的訊息異常或不存在時，NK細胞才會進行胞殺作用。
近年來，同時具有上述兩種DC與NK細胞功能的干擾素分泌型殺手樹突細胞逐漸受到關注。干擾素分泌型殺手樹突細胞可以從毒殺目標、抗原呈現到活化T細胞都由自己完成，亦即干擾素分泌型殺手樹突細胞找到目標後會毒殺目標，接著把碎片吞噬後呈現抗原給T細胞，並活化T細胞。然而，正如同前文述及，干擾素分泌型殺手樹突細胞雖然在免疫反應中扮演了相當重要的角色，但因為干擾素分泌型殺手樹突細胞在體內的量非常稀少，如此低的細胞比率及數目，需要繁瑣的步驟來加以純化，也限制了針對干擾素分泌型殺手樹突細胞的進一步研究。不僅如此，目前的技術僅能從老鼠的脾臟、淋巴結或骨髓中分離出干擾素分泌型殺手樹突細胞，使得要實際將其應用於研究或臨床上皆面臨了不小的瓶頸。
因此，發明人經過長年的努力以及無數次的試驗，已成功篩選出
了人類體內同時具有毒殺及抗原呈現功能的細胞，並定義該細胞為毒殺型樹突細胞(CytotoxicDendritic Cell,CytoDC)。
然而，從發明人實驗的結果嚴格說來，毒殺型樹突細胞在人類周邊淋巴細胞中所佔的比率仍低於0.01%。請參考第一圖至第二B圖，第一圖顯示健康者與癌症患者在週邊血中CytoDC含量百分比對照圖，第二A圖顯示藉流式細胞儀分析癌症患者週邊血的結果，第二B圖顯示藉流式細胞儀分析健康者週邊血的結果。如第一圖所示，在癌症患者的週邊血中毒殺型樹突細胞(CytoDC)的含量百分比明顯低於健康者。另外，如第二A圖所示，請見右上角處，癌症患者所提供的週邊血中毒殺型細胞群組10內細胞的含量只有百分之0.036，而如第二B圖所示，同樣請見右上角處，在健康者所提供的週邊血中毒殺型細胞群組10內細胞的含量為百分之0.436，明顯高於癌症患者。
另外一個問題就是，在免疫療法上，由於腫瘤細胞會改變其抗原，如此可以躲避免疫細胞的辨識，有時反而無法達到很好的療效。
有鑑於此，發明人除了設法將人體週邊血中微量的毒殺型樹突細胞擴增至200至400倍外，並進一步處理經放大培養後的毒殺型樹突細胞，將其轉變為呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞，再將該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞與細胞可接受之培養基或緩衝液製備為一配方，用以活化一T細胞，並使經活化之該T細胞具有專一性。
承上所述，本發明提供製備專一性T細胞之配方，用以活化一T細胞，並使經活化之該T細胞具有專一性，其中該配方至少包含一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群及細胞可接受之培養基或緩衝液。較佳的，該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群的濃度為106
細胞/毫升。
本發明之再一目的在於提供上述配方之製備方法，包含下列步驟：首先，提供一毒殺型樹突細胞群；接著，提供一目標檢體；再來，將該毒殺型樹突細胞群與該目標檢體共同培養；最後，經培養後，收取一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群。其中毒殺型樹突細胞群會
對目標檢體進行毒殺作用，並將該目標檢體之專一性抗原呈現於細胞表面，形成呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群。上述毒殺型樹突細胞群係將一人類週邊血檢體中的毒殺型樹突細胞，於生物體之外藉由細胞激素放大培養而得，且該細胞激素包含介白素15號。較佳的，其中目標檢體為一癌症病患之一腫瘤細胞，而毒殺型樹突細胞群呈現之專一性抗原為腫瘤專一性抗原。較佳的，上述目標檢體與毒殺型樹突細胞群係從同一該癌症病患之檢體中獲得。
在本發明之一實施例中，利用上述配方之製備方法系可作為一種專一性抗原的篩選平台，利用毒殺型樹突細胞群細胞毒殺及抗原呈現的特性，可篩選出目標檢體的專一性抗原。
本發明之另一目的在於提供一種製備專一性T細胞之方法，此方法至少包含下列步驟：首先，提供一T細胞群；接著，加入上述配方與該T細胞群混合；最後，經培養後，收取一專一性T細胞。其中上述配方包含一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群，而上述T細胞群係被呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群活化，並對毒殺型樹突細胞所呈現出之抗原具有專一性，形成專一性T細胞。
在本發明之一實施例中，其中該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群所呈現之專一性抗原為腫瘤專一性抗原，而呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群活化之專一性T細胞為腫瘤專一性T細胞。
由下文的說明，可更進一步瞭解本發明的特徵及其優點，閱讀時請參考第一圖至第十圖。
除非有其他定義，所有在此所用的技術及科學詞彙，如同作為本發明所屬技術領域中具有一般技藝者一般性地了解具有相同意義。在此指稱的所有專利、申請案、公開申請案及其他應用，以及基因庫登錄號皆完整以參考文獻被整合起來。若本章節提出的定義與其他專利、申請案、公開申請案及其他在此引用的參考文獻所提出的定義相反或不一致，以本章節提出的定義為主。
如本發明所使用，術語「毒殺型樹突細胞(CytoDC)」係指同時具有細胞毒殺及抗原呈現功能的細胞。
如本發明所使用，術語「呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞」係指上述之毒殺型樹突細胞的細胞表面呈現有專一性抗原，即定義為呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞。
如本發明所使用，術語「專一性T細胞」係指T細胞經由抗原呈現細胞活化後，對該抗原呈現細胞所呈現之抗原具有專一性。
如本發明所使用，符號「+」係指細胞表面標記有表現於細胞表面，如利用流式細胞儀測得細胞表面標記量大於陰性控制組的表現量。
如本發明所使用，符號「-」係指細胞表面標記沒有表現於細胞表面，如利用流式細胞儀測得細胞表面標記量等於陰性控制組的表現量。
上述細胞表面標記之表現量，係使用的流式細胞儀測量結果，但本發明不以此為限，若他人採相關技藝之替代技術，執行與本發明精神相同之利用，均為本發明之專利範圍中。
如本發明所使用，術語「介白素」係指一組細胞因子，可以由多種細胞產生，人體免疫系統的功能在很大程度上依賴於介白素。
雖然下文詳述本發明多個實施例之配方及培養方法，但應瞭解本發明可提供許多可在多種具體背景下實施的實用發明概念。本文所述之具體實施例僅係製備及使用本發明之具體方式的例示性說明且並不界定本發明之範疇。下文將定義若干術語以便於理解本發明。本文所定義之術語具有熟習與本發明相關領域之一般技術者通常理解之含義。諸如「一(a、an)」及「該(the)」等術語非欲僅指單數實體，而是包括可使用具體實例說明之一般類別。本文術語用以闡述本發明之具體實施例，但除申請專利範圍所概述之外，其用法並不界定本發明。
另外，本發明所揭示的方法中的多個分離或篩選步驟均藉由一流式細胞檢測技術(即流式細胞儀)來完成，並適合使用各一或多種流式細胞儀來利用不同群組的細胞擁有不同的細胞表面標記物區分篩選出目標細胞群組。流式細胞儀能夠以遠遠超過相關技藝任何其他單細胞分
析技術之速度實施單細胞分析，相比於使用其他替代技術能夠較快速地分析統計學上有意義之數量的細胞，但本發明並不欲以此為限。較佳地，在一個實施例中，使用帶有熟習此項技術者習知之任一適宜試樣製備自動裝置或液體處理器的流式細胞儀。另外，使用單路雷射流式細胞儀或多路雷射流式細胞儀來實施分析步驟均可，本發明並不欲以此為限。較佳地，大量螢光染料及偶聯化學品之研發及最佳化使得能夠將諸如免疫球蛋白及小分子等各種配體偶聯至螢光染料。具有介於光譜之紫外至紅光區範圍內之發射線的雷射能夠激發該等螢光染料。因此，可使用諸多光譜學上不同之試劑來標記細胞以利用基於螢光之測試方法(如本發明所使用之流式細胞儀)進行研究。該等試劑已為熟習此項技術者所熟知。在一個實施例中，在分析步驟期間使用一或多種螢光染料。在一些實施例中，在細胞對藥物組合物之效應的分析中使用一或多種染色劑。至於檢測後的數據分析方法非本發明所欲探討之主題，在此不再贅述。
首先，事先說明的是，如前文所述發明人經過長年的努力以及無數次的試驗，已成功篩選出了人類體內同時具有毒殺及抗原呈現功能的細胞，並定義該細胞為毒殺型樹突細胞(CytoDC)，即係具有包含有細胞表面標記為HLA-G-
CD14-
CD19-
CD3-
CD56+
HLA-DR+
的細胞。
承上述，既然能夠鑑定出人體週邊血中的毒殺型樹突細胞，後續請參考第三圖，第三圖進一步說明本發明所謂之經放大培養之毒殺型樹突細胞群究竟係如何將人體週邊血中微量的毒殺型樹突細胞放大以利應用。
基本上，人類周邊血單核細胞可分為五類細胞，如：單核細胞(Monocytic cells)、小細胞(small cells)、淋巴細胞(Lymphoid cells)、大細胞(large cells)與大顆粒細胞(large and granular cells)，可先利用流式細胞儀選取其中一種或多種類型的細胞為基準來進行後續步驟。該細胞較佳地可包含單核細胞群組或淋巴細胞群組或上述兩者同時包含在內等，但本發明並不欲以此為限，後續將以單核細胞群組為例來說明，合先述之。
實施例一：培養人類毒殺型樹突細胞
請參閱圖三，其為本發明一實施例之培養毒殺型樹突細胞的方法流程圖。本發明培養毒殺型樹突細胞的方法的較佳實施例至少包括下列步驟：步驟S100：取得人類血液檢體之週邊血單核細胞群組；步驟S101：加入有效量之細胞激素與該週邊血單核細胞群組混合；步驟S102：靜置一合適時間；以及步驟S103：分離出一毒殺型樹突細胞群組。
其中，步驟S100更包括步驟：S100(1)：將40mL人類血液檢體與磷酸緩衝液混合，以兩倍稀釋人類血液檢體；S100(2)：分離出週邊血單核細胞；S100(3)：去除週邊血單核細胞中的T細胞以及B細胞，以獲得CD3-
CD19-
之週邊血單核細胞；以及S100(4)：將步驟S100(3)所得之週邊血單核細胞之濃度，調整至106
細胞/毫升。
再則，步驟S101之細胞激素係介白素15以及介白素12。
較佳者，介白素15的濃度為10ng/mL。
較佳者，介白素12的濃度為0.5~20ng/mL。
較佳者，介白素12的濃度為2ng/mL。
且，步驟S102之靜置一合適時間，係指將介白素15、介白素12、與週邊血單核細胞群組均置入培養基後，放置一段時間，使其開始進行細胞擴增。
較佳者，靜置一合適時間指靜置至第七天。
本發明進一步提供下列具體實驗步驟及該具體實驗步驟之實驗結果。
步驟S100’：自一卵巢癌病患之體內取得40mL血液檢體，與磷酸緩衝液混合，以兩倍稀釋該血液檢體。分離出週邊血單核細胞，並去
除週邊血單核細胞中的T細胞以及B細胞，以獲得CD3-
CD19-
之週邊血單核細胞。調整細胞濃度至106
細胞/毫升，以獲得一週邊血單核細胞群組。
步驟S101’：在呈裝該週邊血單核細胞群組的容器中添加介白素15以及介白素12，使介白素15的濃度為10ng/mL，且使介白素12的濃度為2ng/mL；步驟S102’：培養7天；以及步驟S103’：利用流式細胞儀，分選出細胞表面標記為HLA-G-
CD14-
CD19-
CD3-
CD56+
HLA-DR+
之細胞，以獲得本案之毒殺型樹突細胞群組。
請參照第四圖所示，第四A圖為人類周邊血單核細胞(PBMC)去除T細胞與B細胞(CD3-
CD19-
PBMC)，在培養前以流式細胞儀測量CD56及HLA-DR的結果，亦即，為經過上述步驟S100’所得之細胞群組之分析結果。第四B圖為在細胞培養第七天，以流式細胞儀測量CD56及HLA-DR的結果，亦即，為經過上述步驟S100’~S102’所得之細胞群組之分析結果。第四C圖為利用流式細胞儀分選出毒殺型樹突細胞群的結果，亦即，為經過上述步驟S100’~S103’所得之細胞群組之分析結果。
如第四A圖所示，在培養前同時具有自然殺手細胞表面標記(CD56+
)與樹突細胞表面標記(HLA-DR+
)的細胞數量很少，僅0.4%，而圖中央如紡錘狀之細胞群30，為帶有CD56但不具HLA-DR的自然殺手細胞。再請參考第四B圖，經培養七天後，細胞會轉變成同時具有自然殺手細胞表面標記(CD56+
)與樹突細胞表面標記(HLA-DR+
)的毒殺型樹突細胞(CytoDC)10，不只原本的毒殺型樹突細胞會增生，更會趨化自然殺手細胞轉變成毒殺型樹突細胞，使得樹突毒殺型樹突細胞(CytoDC)10之比例顯著提升至63%。最後，請參考第四C圖，系將上述經培養放大七天後之細胞群，利用流式細胞儀分選出其中的樹突毒殺型樹突細胞(CytoDC)10後，所得之本案表面標記為HLA-G-
CD14-
CD19-
CD3-
CD56+
HLA-DR+
之毒殺型樹突細胞群。分選後，樹突毒殺型樹突細胞(CytoDC)佔97%，用以進行後續實驗。
必須說明的是，上述一合適時間為一較佳實驗手段，但本發明並不欲以此為限。也就是說，本發明亦可於培養後第四天進行步驟S103，或於培養後第十天進行步驟S103。再者，於步驟S103之後，可再重複進行步驟S101~S103，亦即再次收集未附著的細胞，重複上述步驟即可將毒殺型樹突細胞放大至所需數量。
再者，本發明中所進行的步驟均於生物體之外進行(ex vivo)，且其所收集之人類血液檢體係來自於癌症病患，且此癌症患者所罹患之癌症係可選擇自於鱗狀細胞癌、原位性與小葉性乳癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭部或頸部癌症、皮膚或是眼內的惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、結腸癌、乳癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏症、非何杰金氏症、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、孩童硬腫瘤、淋巴癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎臟細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統癌、原發性中樞神經系統淋巴瘤、腫瘤血管新生、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、腦垂體腺瘤、卡波希氏瘤、表皮樣癌和這些癌症的任何組合及其散播或轉移形式所組成的群組。
後續，本發明(1)利用毒殺型樹突細胞以及腫瘤細胞，製備一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群；(2)利用該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群以及一細胞可接受之培養基或緩衝液，製備出一製備專一性T細胞之配方；以及(3)利用該製備專一性T細胞之配方，活化專一性T細胞。
本案毒殺型樹突細胞、呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞、專一性T細胞之作用機轉，請參照第五圖。
第五圖為本案毒殺型樹突細胞作用機轉之示意圖。毒殺型樹突細胞10具有腫瘤辨識能力，在辨識腫瘤細胞後會分泌γ型干擾素(IFN-γ)，對腫瘤細胞40進行細胞毒殺作用，並吞噬遭毒殺之該腫瘤細胞40的碎片，進而把腫瘤專一性抗原呈現於細胞表面，形成一呈現專一性抗原
之毒殺型樹突細胞50。該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞50會將腫瘤專一性的抗原呈現給表現CD8+
之T細胞(細胞毒殺型T細胞)60，形成專一性T細胞。其中，該專一性T細胞係對該腫瘤專一性抗原具有專一性。
實施例二：製備呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞
請參閱圖六，圖六為本發明製備呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞的方法流程圖。本發明製備呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞的方法，其較佳實施例至少包括下列步驟：步驟S200：提供一毒殺型樹突細胞群；步驟S201：提供一目標檢體；步驟S202：將該毒殺型樹突細胞群與該目標檢體共同培養；步驟S203：毒殺型樹突細胞與目標檢體反應，使毒殺型樹突細胞群呈現目標檢體之專一性抗原；以及步驟S204：收取一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群。
本發明進一步提供下列具體實驗步驟及該具體實驗步驟之實驗結果。
步驟S200’：取得上述步驟S103’所得之毒殺型樹突細胞群；步驟S201’：取得步驟S100’之該卵巢癌病患的卵巢癌細胞，作為目標檢體。其中，該卵巢癌細胞係經由手術方法取出；步驟S202’：將該毒殺型樹突細胞群與該卵巢癌細胞置於培養基中，共同培養；步驟S203’：共同培養至卵巢癌細胞呈現大量死亡的狀態；以及步驟S204’：收取與卵巢癌細胞共同培養後之毒殺型樹突細胞群，以獲得一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群。
步驟S205’：調整細胞濃度至106
細胞/毫升。
請參閱圖七A~七B，其顯示卵巢癌細胞於加入毒殺型樹突細胞群前後的情形，亦即，圖七A為步驟S201’之細胞情形，圖七B為步驟S203’之細胞情形。
第七A圖係將該名卵巢癌症病患經手術取出的卵巢癌細胞，放置於培養基中之情形(即步驟S201’之細胞情形)，可以看出在與毒殺型樹突細胞群培養反應前，癌細胞呈現正常生長的狀態。接著，將上述毒殺型樹突細胞群也加入該含有卵巢癌細胞的培養基中，以共同培養該毒殺型樹突細胞群與該卵巢癌細胞。其中，毒殺型樹突細胞群會對腫瘤細胞進行細胞毒殺，使腫瘤細胞大量死亡。請參照第七B圖，可明顯看出腫瘤細胞與毒殺型樹突細胞群組反應後大量死亡的情形。
在毒殺型樹突細胞群使腫瘤細胞死亡後，毒殺型樹突細胞會將腫瘤碎片吞噬而呈現出上述腫瘤細胞的腫瘤專一性抗原，進而從毒殺型樹突細胞群轉變成呈現腫瘤專一性抗原的毒殺型樹突細胞群。
最後，收取呈現腫瘤專一性抗原之毒殺型樹突細胞群組，即為本發明之製備專一性T細胞的配方，而配方中呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群較佳的濃度為106
細胞/毫升。
實施例三：製備專一性T細胞
請接著參考第八圖，為本發明製備專一性T細胞的方法流程。本發明製備專一性T細胞的方法之較佳實施例至少包括下列步驟：步驟S300：提供一T細胞群；步驟S301：加入一配方，該配方包含一呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群；步驟S302：該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群活化該T細胞群；以及步驟S303：收取經活化之專一性T細胞。
本發明進一步提供下列具體實驗步驟及該具體實驗步驟之實驗結果。
步驟S300’：取得步驟S100’之該卵巢癌病患的CD8+
之T細胞(細胞毒殺型T細胞)，其中，該CD8+
之T細胞係分離自該卵巢癌病患的週邊血；步驟S301’：加入步驟S205’之該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群；
步驟S302’：將該呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群及該CD8+
之T細胞共同培養48小時；以及步驟S303’：收取經活化之專一性T細胞。
其中，步驟S302’中，該呈現腫瘤專一性抗原之毒殺型樹突細胞群組利用其呈現出的腫瘤專一性抗原活化了該CD8+
之T細胞，使得被活化之該CD8+
之T細胞因辨識了腫瘤專一性抗原，所以也具有腫瘤專一性。
再則，步驟S301’中所使用之濃度為106
細胞/毫升，但本發明不以之為限。
此外，為了觀察呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞活化T細胞的效果，本發明將步驟S300’之該CD8+
T細胞標記上6.5M的CFSE。必須說明的是，CFSE為一種螢光染料，用以量化細胞增生程度，可辨認7-10個連續細胞世代，細胞分裂期間，每分裂一次，CFSE的相對螢光強度由一半減少，如此可用來測量細胞分裂的次數及相對應的比例。而本實施例是藉由流式細胞儀測量，但不以之為限。
又再須說明的是，上述毒殺型樹突細胞、呈現專一性抗原的毒殺型樹突細胞、腫瘤細胞及CD8+
之T細胞皆從同一卵巢癌病患取得。
請參照第九圖，第九圖系顯示將毒殺型樹突細胞與上述卵巢癌細胞反應後所形成之呈現專一抗原之毒殺型樹突細胞群，與該卵巢癌病患之標記有CFSE的CD8+
之T細胞反應的結果，亦即，經過步驟S300’~S303’所得之T細胞之分析結果。第九A圖系顯示利用流式細胞儀測量標記有CFSE的T細胞被活化後分裂的情形。第九B圖系利用流式細胞儀測量反應後之T細胞，以觀察其細胞內的γ型干擾素(IFN-γ)的結果。
本試驗系將呈現專一抗原之毒殺型樹突細胞與CD8+
之T細胞共同培養48小時，再藉流式細胞儀測量T細胞活化分裂情形。
如第九A圖所示，可以看出呈現專一性抗原的毒殺型樹突細胞群可活化T細胞，使55.5%標記有CFSE的T細胞複製增生。另外，如第九B圖所示，被呈現專一性抗原的毒殺型樹突細胞群活化的T細胞，
其多數細胞內具有IFN-γ(圖左上的框格中)，即表示被活化之T系可分泌IFN-γ，具有細胞毒殺功能，且因是由呈現專一性抗原的毒殺型樹突細胞群所活化，因此對毒殺型樹突細胞呈現出之抗原具有專一性。
最後，請參照第十圖，第十圖系將未與腫瘤細胞反應之毒殺型樹突細胞與標記有CFSE的T細胞反應的結果。可以看出未與腫瘤細胞反應的毒殺型樹突細胞，沒有辦法活化T細胞而使其複製增生，如第十A圖所示，只有百分之0.046的T細胞複製增生，其結果為陰性；又如第十B圖所示，其T細胞內無測得IFN-γ。由第十圖的結果可知，未與腫瘤細胞反應之毒殺型樹突細胞，因其細胞表面沒有呈現專一性抗原，無法活化自體的CD8+
T細胞。
綜上所述，毒殺型樹突細胞是一種同時擁有自然殺手細胞與樹突細胞功能的細胞，在人體內的量非常稀少，但其於免疫反應中扮演重要的角色。經由發明人所研究之放大培養、篩選與鑑定等技術可在體外從人類週邊血中將微量的毒殺型樹突細胞放大200至400倍，再以毒殺型樹突細胞群組本身就具有的腫瘤辨識能力，可毒殺腫瘤並將腫瘤專一性的抗原呈現給T細胞，讓腫瘤細胞無法迴避免疫細胞的辨識。同時，發明人使用的目標檢體來自同一癌症病患，亦即用癌症病患本身之週邊血培養出的毒殺型樹突細胞群組與該癌症病患自體取得之腫瘤細胞反應，反應後呈現專一性抗原的毒殺型樹突細胞群組可進一步活化由該名癌症病患自體取得的CD8+
T細胞，形成腫瘤專一性T細胞。
如此可證明利用本發明所提供之技術讓腫瘤細胞無法躲避自體的免疫細胞，更確實地加強了呈現專一性抗原毒殺型樹突細胞群組運用於製備專一性T細胞的效果，其經由本發明於體外製備之專一性T細胞更可用於對抗腫瘤之免疫療法，作為未來腫瘤免疫療法之新契機。額外地，本發明所提供的方法也可以作為一種專一性抗原的篩選平台，利用毒殺型樹突細胞群組篩選出腫瘤專一性之抗原。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本發明之專利範圍中。
S100~S103‧‧‧培養毒殺型樹突細胞群組的步驟
S200~S204‧‧‧製備本發明之配方的步驟
S300~S303‧‧‧製備專一性T細胞的步驟
10‧‧‧毒殺型樹突細胞
20‧‧‧經流式細胞儀分選出之毒殺型樹突細胞
30‧‧‧自然殺手細胞
40‧‧‧腫瘤細胞
50‧‧‧呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞
60‧‧‧細胞毒殺型T細胞
第一圖顯示健康者與癌症患者在週邊血中毒殺型樹突細胞群組含量百分比對照圖；第二A圖顯示藉流式細胞儀分析癌症患者週邊血的結果；第二B圖顯示藉流式細胞儀分析健康者週邊血的結果；第三圖顯示本發明一實施例之培養毒殺型樹突細胞的方法流程圖；第四A至四C圖顯本發明一實施例中培養毒殺型樹突細胞的的結果；第五圖顯本發明一實施例中毒殺型樹突細胞作用機轉之示意圖；第六圖顯本發明一實施例中製備本發明之配方的方法流程圖；第七A至六B圖顯本發明一實施例中卵巢癌細胞於加入毒殺型樹突細胞群組前後的情形；第八圖顯本發明一實施例中製備專一性T細胞的方法流程圖；第九A至九B圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀檢測呈現專一性抗原之毒殺型樹突細胞群活化T細胞之的結果；以及第十A至十B圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀檢測毒殺型樹突細胞活化T細胞之情形；
S300~S303‧‧‧製備專一性T細胞的步驟
Claims (11)
- 一種醫藥組成物的製備方法，該醫藥組成物係包含一呈現腫瘤專一性抗原之人類毒殺型樹突細胞群，該醫藥組成物的製備方法包含下列步驟：(a)取得一人類個體之週邊血單核細胞群組；(b)加入介白素15以及介白素12，培養複數天，獲得一細胞群，其中，該介白素15之濃度為10ng/mL，且該介白素12之濃度為0.5~20ng/mL；(c)從該細胞群中，單離細胞表面標記為HLA-G- CD14- CD19- CD3- CD56+ HLA-DR+ 之細胞，以直接獲得複數個單離的人類毒殺型樹突細胞，且該單離的人類毒殺型樹突細胞具備細胞毒殺功能以及抗原呈現功能；(d)自該人類個體取得一腫瘤細胞，且該腫瘤細胞具有至少一腫瘤專一性抗原；(e)將該單離的人類毒殺型樹突細胞與該腫瘤細胞共同培養；以及(f)經培養後，收取該呈現腫瘤專一性抗原之人類毒殺型樹突細胞群。
- 如申請專利範園第1項所述之醫藥組成物的製備方法，其中該人類毒殺型樹突細胞群係對該腫瘤細胞進行毒殺作用，並將該腫瘤細胞之該腫瘤專一性抗原呈現於該單離的人類毒殺型樹突細胞表面，形成該呈現該 腫瘤專一性抗原之人類毒殺型樹突細胞群。
- 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物的製備方法，其中該腫瘤細胞與該單離的人類毒殺型樹突細胞係從同一位癌症病患之檢體中獲得。
- 如申請專利範園第1項所述之醫藥組成物的製備方法，其中該介白素12之濃度為2ng/mL。
- 如申請專利範園第1項所述之醫藥組成物的製備方法，該醫藥組成物可活化一專一性T細胞，其中，該專一性T細胞係可辨識該腫瘤專一性抗原之T細胞。
- 如申請專利範園第5項所述之方法，其中該專一性T細胞為分離的CD8+ T細胞。
- 一種活化專一性T細胞的方法，步驟包含：(a)取得一人類個體之週邊血單核細胞群組；(b)加入介白素15以及介白素12，培養複數天，獲得一細胞群，其中，該介白素15之濃度為10ng/mL，且該介白素12之濃度為0.5~20ng/mL；(c)從該細胞群中，單離細胞表面標記為HLA-G- CD14- CD19- CD3- CD56+ HLA-DR+ 之細胞，以直接獲得複數個單離的人類毒殺型樹突細胞，且該單離的人類毒殺型樹突細胞具備細胞毒殺功能以及抗原呈現功能；(d)自該人類個體取得一腫瘤細胞，且該腫瘤細胞具有至少一腫 瘤專一性抗原；(e)將該單離的人類毒殺型樹突細胞與該腫瘤細胞共同培養；(f)收取一呈現該腫瘤專一性抗原之人類毒殺型樹突細胞群；(g)將一T細胞群與該呈現該腫瘤專一性抗原之人類毒殺型樹突細胞群混合；以及(h)經培養後，收取被活化之一專一性T細胞，其中，該專一性T細胞係可辨識該腫瘤專一性抗原之T細胞。
- 如申請專利範園第7項所述之方法，其中該腫瘤細胞、該單離的人類毒殺型樹突細胞、以及該T細胞群係從同一位癌症病患之檢體中獲得。
- 如申請專利範園第7項所述之方法，其中該T細胞群中包含該專一性T細胞，該專一性T細胞可被該呈現該腫瘤專一性抗原之人類毒殺型樹突細胞群活化。
- 如申請專利範園第7項所述之方法，其中該專一性T細胞為腫瘤專一性T細胞。
- 如申請專利範園第7項所述之方法，其中該T細胞群為分離的CD8+ T細胞群。
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