JP6134785B2

JP6134785B2 - 樹状細胞成熟化組成物、およびこれを用いて抗原特異的樹状細胞を製造する方法

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Publication number: JP6134785B2
Application number: JP2015514904A
Authority: JP
Inventors: ユンイ，; ヘ−ウォンカン，; スン−スハン，; ヨン−モクキム，; ヨン−スペ，; ソ−ヒアン，
Original assignee: ジェイダブリュクレアジェンインコーポレイテッド
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2033-05-30
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Description

本発明は、樹状細胞成熟化組成物、およびこれを用いて抗原特異的樹状細胞を製造する方法に関するものである。

樹状細胞（ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌ、ＤＣ）は、免疫系に存在する細胞の中で抗原を伝達する能力が最も強い抗原提示細胞（ＡＰＣ、ＡｎｔｉｇｅｎＰｒｅｓｅｎｔｉｎｇＣｅｌｌ）である。樹状細胞は、抗原と接したことのない原始Ｔ細胞（ｎａｉｖｅＴ細胞）と反応して免疫を誘導することができ、他の抗原提示細胞とは異なって一次免疫反応（ｐｒｉｍａｒｙｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）を効果的に誘導し、これによって強い免疫記憶を誘導可能な特性を有する唯一の兔疫細胞である。樹状細胞が免疫反応を強く誘導可能な理由は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、ＡｎｔｉｇｅｎＰｒｅｓｅｎｔｉｎｇＣｅｌｌ）として細胞表面にＭＨＣ分子（Ｉ／ＩＩ）だけでなく、補助刺激分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を高濃度に発現しており、Ｔ細胞の活性化に必要なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ＩＦＮ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８など）を分泌するためと知られている。また、ｔｙｐｅ１樹状細胞は、ＩＦＮ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−１２などのＴｈ１免疫誘導関連のサイトカインを分泌するため、抗原特異的なＴｈ１細胞の増殖および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を誘導することができ、免疫療法に有用に適用可能である。

樹状細胞を抗癌免疫治療に活用するためには、体外で樹状細胞を分化製造する技術と、Ｔ細胞の免疫を効果的に誘導するための成熟化技術が必須である。体外で単核球から未成熟樹状細胞を製造する方法や成熟化過程は全世界的にまだ標準化されていない。特に、分化製造された未成熟樹状細胞の成熟化は、樹状細胞をリンパ節に移動させてリンパ節の原始Ｔ細胞に抗原を提示して、Ｔｈ１免疫反応を誘導可能な細胞に転換させる過程で、完全に成熟した樹状細胞は、未熟な樹状細胞に比べて、細胞表面にＭＨＣＩ型およびＩＩ型分子、およびＴ細胞補助刺激因子、すなわち、ＣＤ８０およびＣＤ８６などを高濃度に発現する。また、成熟した樹状細胞は、多量のサイトカインを発現し、これらのサイトカインはＴ細胞の免疫反応誘導に直接的に関与する。成熟化によるこのような変化によって、樹状細胞のＴ細胞の免疫反応誘導能が大きく増加する。

樹状細胞の成熟化技術として、単核球培養由来の培地（ＭＣＭ：ＭｏｎｏｃｙｔｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉａ）を用いる技術が知られている。前記ＭＣＭは、単核球を試験管に培養しながら採取した培地が成熟化因子の供給源として使用される。しかし、ＭＣＭを用いる方法の場合、外部の危険信号を認識して、単核球が分泌する炎症誘発サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌量が人ごとに変動幅が大きいため、結果的に、同一の成熟化条件の製造工程を維持しにくいだけでなく、ＭＣＭ製造のために、多量の抹消血液単核細胞を採取して使用しなければならないという非常に大きな欠点がある。そこで、ＭＣＭを代替可能な方法として、ＭＣＭの成分のうち重要なサイトカインを組み合わせて作ったｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌ（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ_２）を用いる技術が開発された。Ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌを用いる場合、ＭＣＭの問題を解決できるだけでなく、機能の面においても比較優位を示す樹状細胞を安定的に製造することができる。しかし、これらの成熟化ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌだけでは、樹状細胞の成熟化が十分に誘導されない。

一方、特許文献１には、Ｔｈ１細胞と樹状細胞を用いた細胞毒性Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ誘導方法が記載されているが、前記方法は樹状細胞が十分に成熟化されていない状態で用いられるため、実質的に十分な免疫治療効果を期待しにくい。

したがって、樹状細胞を用いた抗癌免疫治療効果を極大化するためには、樹状細胞のより効果的な成熟化技術と、これによる抗原特異的な抗癌免疫誘導能強化技術が絶対的に要求される。

韓国公開特許第１０−２０１１−００３５６３３号公報

本発明の目的は、樹状細胞の免疫反応誘導能を向上させるだけでなく、樹状細胞の抗原非特異的免疫反応を減少させ、抗原特異的免疫反応を増加させることで、免疫治療効果を極大化させる樹状細胞成熟化組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記樹状細胞成熟化組成物を用いて製造される抗原特異的樹状細胞を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、抗原特異的樹状細胞を製造する方法を提供することである。

本発明は、成熟化因子として、インターロイキン−１ベータ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、プロスタグランジンＥ−２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；ＰＧＥ_２）、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）、およびポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）のうちの１つ以上を含む、樹状細胞成熟化組成物を提供する。

本発明は、前記樹状細胞成熟化組成物を用いて製造される抗原特異免疫誘導用樹状細胞を提供する。

また、本発明は、未成熟樹状細胞に抗原を感作させるステップと、インターロイキン−１ベータ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、プロスタグランジンＥ−２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；ＰＧＥ_２）、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）、およびポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）のうちの１つ以上の成熟化因子を時間差をおいて処理するステップとを含む、抗原特異的Ｔ細胞の免疫反応誘導用樹状細胞を製造する方法を提供する。

本発明の樹状細胞成熟化組成物は、樹状細胞の免疫反応誘導能を向上させるだけでなく、樹状細胞の抗原非特異的免疫反応を減少させ、抗原特異的Ｔ細胞の免疫反応を増加させることで、免疫治療効果を極大化させる効果がある。

抗原（Ａｇ）とすべての成熟化因子（ＣＭ）を同時に処理したり（Ｂ）、または成熟化因子のうちのピシバニール（ＯＫ４３２）だけを時間差をおいて処理（Ａ）して樹状細胞を成熟させる製造方法を示したものである。実施例１−１（ＭＡＧＥ−１／ＯＫ＋）および比較例１−１の樹状細胞を製造する時、成熟化過程中に各樹状細胞が分泌した培養液でのＩＬ−１２とＩＬ−１０の量を測定した結果である。図において、ｃｖＤＣは実施例１−１であり、ｓＤＣは比較例１−１である。実施例１−１（ＭＡＧＥ−１）および比較例１−１の樹状細胞を用いて末梢血液細胞から分離したＴ細胞との共培養時、Ｔｃｅｌｌの増殖をＭＴＴａｓｓａｙで分析した結果である。図において、ｃｖＤＣは実施例１−１であり、ｓＤＣは比較例１−１である。実施例１−１（ＭＡＧＥ−１）および比較例１−１の樹状細胞を用いて末梢血液細胞から分離したＴ細胞との共培養時、培養液でのＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果である。図において、ｃｖＤＣは実施例１−１であり、ｓＤＣは比較例１−１である。実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）、比較例２（Ｕｎ／ＯＫ＋）、比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）および比較例４（Ｕｎ／ＯＫ−）の樹状細胞で自己Ｔ細胞を一定割合で刺激および再刺激を進行させながら、ＩＦＮ−γの量を３回にわたって測定した結果である。実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）と比較例２（Ｕｎ／ＯＫ＋）、比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）および比較例４（Ｕｎ／ＯＫ−）の樹状細胞で誘導したＣＴＬの抗原−特異性を確認したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析結果である。実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）、比較例２（Ｕｎ／ＯＫ＋）、比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）および比較例４（Ｕｎ／ＯＫ−）の樹状細胞によって誘導されたＣＴＬの活性を標的（Ｔａｒｇｅｔ）細胞と反応させた場合、培養液に分泌されたＩＦＮ−γの量を測定した結果である。実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）および比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）の樹状細胞を製造する時、成熟化過程中に各樹状細胞が培養液に分泌したＩＬ−１２とＩＬ−１０の量を測定した結果である。実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）の樹状細胞を用いて末梢血液細胞から分離したＴ細胞との共培養時、Ｔｃｅｌｌの増殖をＭＴＴａｓｓａｙで分析した結果である。実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）および比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）の樹状細胞を用いて末梢血液細胞から分離したＴ細胞との共培養時、培養液でのＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果である。実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）の樹状細胞を用いてＣＴＬ増幅時、毎反応ステップごとに細胞の増殖を測定した結果である。実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）の樹状細胞を用いてＣＴＬ誘導時、培養液でＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および実施例２−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）の抗原−特異性を示した結果である。図１のＢのように、抗原およびピシバニール以外の成熟化因子を処理した後、ピシバニール（ＯＫ４３２）を０時間または４時間差をおいて処理した樹状細胞を用いて誘導したＣＴＬの抗原−特異性を確認したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析結果である。実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および実施例２−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）の抗原−特異的細胞毒性の活性を示した結果である。実施例３−１〜３−５の樹状細胞のＴ細胞の増殖反応率を示した結果である。実施例３−１〜３−５の樹状細胞のＴｈ１免疫反応誘導能力を示した結果である。実施例３−１〜３−５の樹状細胞を用いて誘導したＣＴＬの抗原−特異性を確認したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析結果である。

本発明は、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）などの成熟化因子を含む樹状細胞成熟化組成物に関するものである。特に、本発明者は、本発明の成熟化物質のうちのピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）と抗原を時間差をおいて処理して樹状細胞を製造する場合、樹状細胞の免疫反応誘導能が極めて向上するだけでなく、樹状細胞の抗原非特異的免疫反応を減少させ、むしろ抗原特異的免疫反応が増加することで、免疫治療効果が極大化されることを確認して、本発明を完成した。

本発明の成熟化因子は、インターロイキン−１ベータ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、プロスタグランジンＥ−２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；ＰＧＥ_２）、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）、およびポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）のうちの１つ以上であってよく、特に、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）を含むことが好ましい。

前記ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）は、細胞性免疫を増強させて腫瘍に対抗する薬として溶血性連鎖球菌をペニシリンで処理して作ったものを意味し、当業界においてピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）として称されるものであれば、特に限定されることなく本発明に適用することができる。前記ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）は、従来、消化器官癌、甲状腺癌、肺癌の治療に使用されたが、本発明者は、これを樹状細胞の成熟化因子として用いる場合、樹状細胞の免疫反応誘導能が極大化されることを確認した。また、前記インターロイキン−１ベータ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、プロスタグランジンＥ−２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；ＰＧＥ_２）、およびポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）は、当業界において前記物質として認識される物質であれば、特に制限されることなく本発明に適用することができる。

本発明の樹状細胞は、ＲＰＭＩ（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０とｓｅｒｕｍｆｒｅｅ培地のＸ−ＶＩＶＯ１５などの特定の培地に限らず、優れた免疫反応誘導能を示す。

本発明の成熟化組成物は、樹状細胞の免疫反応誘導能を向上させるだけでなく、樹状細胞の抗原非特異的免疫反応を減少させ、抗原特異的免疫反応を増加させる作用をする。

また、本発明は、前記成熟化組成物を用いて製造される抗原特異的免疫反応を誘導する樹状細胞を含む。

一方、本発明は、未成熟樹状細胞に抗原を感作させるステップと、成熟化因子を処理するステップとを含む、抗原特異的免疫反応を誘導する樹状細胞を製造する方法に関するものである。

前記抗原感作と成熟化因子の処理は、同時にまたは時間差で処理することができ、抗原感作と成熟化因子の処理を同時に行ったり、前記抗原を感作させ、１〜３０時間後に前記成熟化因子を処理することが好ましい。

特に、前記成熟化因子のうちのピシバニールは、ピシバニール以外の前記成熟化因子の組み合わせとは別個に、時間差で処理することがより好ましい。すなわち、ピシバニールを除いた成熟化因子の組み合わせである、インターロイキン−１ベータ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、プロスタグランジンＥ−２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；ＰＧＥ_２）、およびポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）のうちの１つ以上の成熟化因子を処理した後、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ４３２）を処理することができる。ピシバニールを除いた成熟化因子の組み合わせは、抗原感作と同時または１時間以内に処理することが最も好ましく、ピシバニールは、好ましくは、抗原感作１時間後、より好ましくは、抗原感作および成熟化因子の組み合わせ処理後、樹状細胞の収獲（Ｈａｒｖｅｓｔ）１〜４時間前に処理することが好ましい。

成熟化因子の組み合わせ投与とピシバニールの処理に時間差をおく場合、樹状細胞の抗原非特異的免疫反応を減少、および抗原特異的免疫反応の増加効果が極大化される。

前記成熟化因子は上述したのと同様である。

樹状細胞は、免疫系に存在する細胞の中で抗原を伝達する能力が最も強い抗原提示細胞であるので、大きさの大きい組換え蛋白質またはペプチド、癌粉砕物、リボ核酸、癌細胞との融合、またはａｐｏｐｔｏｔｉｃまたはｎｅｃｒｏｔｉｃ癌細胞などの抗原の形態に限らず、抗原の吸入（ｕｐｔａｋｅ）と抗原の分解過程（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によりＭＨＣＩ／ＩＩ分子に提示可能な能力を有するため、特定の抗原に限らず利用可能である。例えば、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ−３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３）、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ−１（Ｍｅｌａｎｏｍａ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＡｎｔｉｇｅｎ１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、癌細胞株（ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉｎｅ）、または癌組織破砕物（ｔｕｍｏｒｌｙｓａｔｅ）などを利用可能であるが、これらに限らない。

以下、発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明は、下記の実施例によって限定されず、多様に修正および変更可能である。

＜実施例および比較例＞
下記の表１に示した構成の通り、実施例と比較例の成熟した樹状細胞を製造した。

実施例１．抗原と樹状細胞成熟化組成物の同時処理による樹状細胞の製造

前記表１に示した構成の通り、実施例１の成熟した樹状細胞を製造した。

（１）末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未成熟樹状細胞の分化（ＰＢＭＣ→ｉｍＤＣ）

健康な個体の血液単核細胞に対して、室温のＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓ（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅｇｒａｄｅ）を用いた密度勾配遠心分離（ＤｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行い、赤血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）、顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）、血漿などが除去された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集した。

前記末梢血液単核細胞を採取して遠心分離して細胞を収穫し、細胞を一定濃度で自己血漿の含まれているＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、細胞培養器に入れて培養した。凍結したＰＢＭＣを用いる場合には、解凍して、ＨＢＳＳ溶液と無血清培地で洗浄して使用することができる。

末梢血液単核細胞からの単核球の分離は、動物細胞培養器の通常の材質であるプラスチックに対する吸着性（ｐｌａｓｔｉｃａｄｈｅｒｅｎｃｙ）を利用して実施した。単核球が細胞培養器の底材質であるプラスチックに対する吸着性（ｐｌａｓｔｉｃａｄｈｅｒｅｎｃｙ）が非常に高いため、培地に懸濁させた末梢血液単核細胞を３７℃で培養した後、浮遊細胞（ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ細胞）を培地と共に除去することによって、選択的に患者の単核球細胞が全体血液細胞数の８０％以上に調整された、分画としての付着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ細胞）を得た。

単核球からの樹状細胞の分化を誘導する樹状細胞分化培地としては、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）混合物（Ｅ．ｃｏｌｉ発現ヒト組換え蛋白質のＩＬ−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４、最終濃度：５００ｎｇ／ｍＬ以下）とＧＭ−ＣＳＦ（ＪＷＣｒｅａＧｅｎｅ、最終濃度：１００ｎｇ／ｍＬ以下）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。

（２）未成熟樹状細胞に抗原を感作

培養開始３日後、底から落ちて浮遊する細胞を採取して計数した後、一定量ずつ培養容器に移して抗原処理培養を行った。

癌特異的免疫反応のために、癌−特異的抗原（ＡＦＰ、ＧＰＣ−３またはＭＡＧＥ−１；５〜１０μｇ／ｍＬ、ＪＷＣｒｅａＧｅｎｅ）、または癌組織粉砕物（Ｔ９８Ｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉｎｅｌｙｓａｔｅ；５０〜１００μｇ／ｍＬ、自体製造）を一定濃度でそれぞれの培養容器に処理した。

（３）未成熟樹状細胞の成熟化誘導（ｉｍＤＣ→ｍＤＣ）

前記（２）の抗原感作と同時に、未成熟樹状細胞の成熟化を誘導した（図１のＢ）。すなわち、樹状細胞の成熟化誘導のために、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＧＥ_２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；１μｇ／ｍＬ）を一定割合で入れた。この培地にはさらに、樹状細胞の成熟化および活性化因子であって細胞性免疫誘導因子として、ＴＬＲ信号物質として知られているＰｏｌｙＩＣ（最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）とピシバニール（ＯＫ４３２）（医薬品、Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ、中外製薬、最終濃度：１〜２μｇ／ｍＬ）とＩＦＮ−γ（ＬＧ生命科学、最終濃度：３０〜１０００Ｕ／ｍＬ）を一定濃度で添加した。

培養最終日に浮遊細胞を最終治療剤として採取して２回洗浄し、細胞凍結安定化剤［ＤＭＳＯを含むヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）またはヒト血漿］に懸濁して、原液を完成した。

実施例２．ピシバニール（ＯＫ４３２）の時間差処理による樹状細胞の製造

抗原（２）およびピシバニール以外の成熟化因子を処理（３）し、４時間経過後、ピシバニールを処理した点を除いて、前記実施例１と同様の方法で樹状細胞を製造した（図１のＡ）。

実施例３．ピシバニール（ＯＫ４３２）の時間差処理による樹状細胞の製造

抗原（２）およびピシバニール以外の成熟化因子の処理（３）時点と、ピシバニール（ＯＫ４３２）の処理時点を次のようにそれぞれ調節した点を除いて、前記実施例１と同様の方法で樹状細胞を製造した（図１参照）。

比較例１〜４．抗原を感作しなかったり、ピシバニール（ＯＫ４３２）を処理しなかった樹状細胞の製造

前記表１に示した構成の通り、抗原処理（２）するステップを行わない点、および／またはピシバニールを処理しない点を除いて、実施例１と同様の方法で樹状細胞を製造した。

＜実験例＞

実験例１．樹状細胞の成熟化過程での樹状細胞の分泌物質の測定

実施例１−１（ＭＡＧＥ−１／ＯＫ＋）および比較例１−１（ＭＡＧＥ−１／ＯＫ−）の樹状細胞を製造する時、成熟化過程中に各樹状細胞が分泌した培養液でのＩＬ−１２とＩＬ−１０の量を測定して図２に示し、末梢血液細胞から分離したＴ細胞と前記実施例１−１および比較例１−１の樹状細胞の共培養時、Ｔｃｅｌｌの増殖とＩＦＮ−γを測定してそれぞれ図３および図４に示した。

具体的には、ＩＬ−１２とＩＬ−１０の量を測定するために、抗原処理および成熟化過程で樹状細胞が分泌した培養液でＩＬ−１２とＩＬ−１０をＥＬＩＳＡ方法で分析した。実験方法は、ＥＬＩＳＡｋｉｔ提供会社のマニュアルに従って進行させた。実験の結果を図２に示した。

また、Ｔｃｅｌｌの増殖を測定するために、Ｎｙｌｏｎｗｏｏｌで分離した自己Ｔ細胞１ｘ１０^５個と樹状細胞１ｘ１０^４個を１０：１の割合で９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅして、５日間培養した。培養後、ＭＴＴ溶液を用いて、生きている細胞染色により細胞の増殖を確認した。実験の結果を図３に示した。

ＩＦＮ−γを測定するために、自己Ｔ細胞と樹状細胞を５日間培養後、培養液でのＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ方法で分析した。その結果を図４に示した。

実験例２．ピシバニール（ＯＫ４３２）による非特異的Ｔ細胞の誘導効果の確認（Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎｂｙＯＫ４３２）

ピシバニール（ＯＫ４３２）による非特異的Ｔ細胞の誘導効果を確認するために、実施例と比較例により製造した成熟した樹状細胞（ｍＤＣ）を用いて、次のような実験を行った。

実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）、比較例２（Ｕｎ／ＯＫ＋）、比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）および比較例４（Ｕｎ／ＯＫ−）の樹状細胞と末梢血液細胞（ＰＢＭＣ）から分離した自己Ｔ細胞を、次のように反応させ、毎刺激１日目の培養液を通してＩＦＮ−γの量を測定した。樹状細胞の製造に使用された同じヒトの末梢血液細胞から、ｎｙｌｏｎｗｏｏｌを用いてＴ細胞を分離した。成熟した樹状細胞と分離されたＴ細胞を１：１０（２ｘ１０^５：２ｘ１０^６）の割合で混合して、６〜７日間培養した。一次刺激したＴ細胞は採取して、抗原に感作した樹状細胞と同じ割合（１：１０）で再刺激を行った。培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＡＢｓｅｒｕｍ）は、培養２〜３日ごとに新しい培地を添加または交換して、適切な培養環境を提供した。最初の刺激時にＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を５ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、２番目の刺激からはＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を１００Ｕ／ｍＬ処理した。抗原−感作した樹状細胞で２〜４回繰り返しＴ細胞を刺激して誘導したＣＴＬに対して、抗原−特異性およびＣＴＬの活性試験を行った。誘導過程中にＴ細胞と樹状細胞の共培養時、刺激の翌日に上層液の一部を採取して、ＩＦＮ−γの分泌量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。その結果を図５に示した。

また、ＧＰＣ−３抗原をそれぞれの樹状細胞で誘導された活性Ｔ細胞に対して、抗原−特異的免疫反応を確認するために、実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）、比較例２（Ｕｎ／ＯＫ＋）、比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）および比較例４（Ｕｎ／ＯＫ−）の樹状細胞で誘導したＣＴＬの抗原−特異性をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析した。具体的には、ピシバニール（ＯＫ４３２）が処理された樹状細胞（図６のｗ／ＯＫ４３２）、またはピシバニール（ＯＫ４３２）を処理しなかった樹状細胞（図６のｗ／ｏＯＫ４３２）で刺激してＩＦＮ−γを分泌する活性Ｔ細胞の数を測定した。１〜２ｘ１０^４個の活性Ｔ細胞と１〜２ｘ１０^３個の樹状細胞を１０：１の割合で１８〜２４時間細胞培養器で培養後、ｋｉｔで提示する方法に従ってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。その結果を図６に示した。

誘導したＣＴＬの活性および抗原−特異的な反応を確認するために、実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）、比較例２（Ｕｎ／ＯＫ＋）、比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）および比較例４（Ｕｎ／ＯＫ−）の樹状細胞によって誘導されたＣＴＬの活性を標的（Ｔａｒｇｅｔ）細胞と反応させて、培養液に分泌されたＩＦＮ−γの量を測定した。具体的には、ＣＴＬとＨＬＡｔｙｐｅが一致しながら、抗原（ＡＦＰ）を発現する標的細胞のＨｅｐＧ２細胞１ｘ１０^４個と誘導したＣＴＬ１ｘ１０^５個を１：１０の割合で処理して、１８〜２４時間細胞培養器で反応させた後、上澄液を採取して、これからＩＦＮ−γの分泌量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。このように測定されたＩＦＮ−γの量を図７に示した。

実験の結果、樹状細胞（ＤＣ）にピシバニール（ＯＫ４３２）を処理すると、抗原−非特異的免疫が強く誘導されることが分かった。

実験例３．ピシバニール（ＯＫ４３２）の樹状細胞成熟化効果の確認

抗原感作後の成熟化過程時、ピシバニール（ＯＫ４３２）の処理の有無による樹状細胞（ＤＣ）の機能を評価するために、ＡＦＰまたはＧＰＣ−３を抗原に用いた実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）および比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）、実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）の樹状細胞を用いてＣＴＬ誘導時、細胞の増殖および培養液での成熟化効果を次のように測定した。

具体的には、実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）および比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）の樹状細胞を製造する時、成熟化過程中に各樹状細胞が培養液に分泌したＩＬ−１２とＩＬ−１０の量をＥＬＩＳＡ方法で測定して図８に示した。

Ｎｙｌｏｎｗｏｏｌで分離した自己Ｔ細胞１ｘ１０^５個と、実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）の樹状細胞１ｘ１０^４個を１０：１の割合で９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅして、５日間培養した。培養後、ＭＴＴ溶液を用いて、生きている細胞染色により細胞の増殖を確認し、その結果を図９に示した。

また、実施例１−２（ＡＦＰ／ＯＫ＋）および比較例３−２（ＡＦＰ／ＯＫ−）の樹状細胞を用いて末梢血液細胞から分離したＴ細胞との共培養時、培養液でのＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果を図１０に示した。

実施例１−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ＋）および比較例３−３（ＧＰＣ−３／ＯＫ−）の樹状細胞を用いてＣＴＬ誘導時、細胞の増殖を測定した結果を図１１に示し、各樹状細胞とＴ細胞の繰り返し刺激時、毎刺激１日目に取った上澄液を採取して、ＥＬＩＳＡ方法で測定したＩＦＮ−γの量を分析して図１２に示した。

実験の結果、ピシバニール（ＯＫ４３２）の処理によりＴｈ１免疫反応誘導において重要なＩＬ−１２が増加し（図８：抗原ＡＦＰ使用）、Ｔ細胞の増殖能が向上し（図９：抗原ＧＰＣ−３使用）、Ｔｈ１免疫反応の強化を誘導（図１０：抗原ＡＦＰ使用）することが分かった。また、活性Ｔ細胞の増殖能力の向上（図１１：抗原ＧＰＣ−３使用）および機能（ＩＦＮ−γ）強化（図１２：抗原ＧＰＣ−３使用）につながることが分かった。

実験例４．抗原とピシバニール（ＯＫ４３２）の時間差投与による効果の確認（ＲＰＭＩ１６４０培地）

ＧＰＣ−３を抗原に感作後、ピシバニール（ＯＫ４３２）の処理時期を調節して成熟化誘導した実施例１−３と実施例２−３を対象として、次のようにＥＬＩＳＰＯＴ分析および細胞毒性活性試験（ＣＶ）を行った。

ピシバニール（ＯＫ４３２）を抗原および成熟化因子と同時に処理した群（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）（実施例１−３）と、４時間経過後、ピシバニール（ＯＫ４３２）を処理した群（４ｈ）（実施例２−３）の樹状細胞を用意した。それぞれの樹状細胞を自己Ｔ細胞と反応させて誘導したＣＴＬ１〜５ｘ１０^４個と、ピシバニール（ＯＫ４３２）を処理しなかった樹状細胞１〜５ｘ１０^３個を１０：１の割合で、ＩＦＮ−γ ｃａｐｔｕｒｅ抗体でコーティングされたプレートで１８〜２０時間細胞培養器で培養した。以後、ＥＬＩＳＰＯＴキットで提供したマニュアルに従って実験を進行させた。すなわち、培養後、各ウェルを蒸留水と洗浄用バッファーで洗浄した後、検出用抗体を入れて反応させた。以後、二次抗体を入れて１時間反応させた後、酵素に適した基質を入れて反応させた後、反応を終了した。１日間乾燥させた後、ＥＬＩＳＰＯＴｒｅａｄｅｒ（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）を用いてｓｐｏｔ数をｃｏｕｎｔｉｎｇ後、分析し、その結果を図１３に示した。

それぞれ誘導されたＣＴＬを標的細胞と反応させた後、細胞毒性の活性を測定した。標的細胞としては、ＨＬＡ−ｔｙｐｅが一致し、抗原を発現する細胞（ＨｅｐＧ２）、ＨＬＡ−ｔｙｐｅは一致するものの、抗原を発現しない細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）と、両方とも一致しない細胞株（ＳＮ１２Ｃ）を標的細胞として細胞毒性活性試験を行った。標的細胞１ｘ１０^４個を反応１日前に９６ｗｅｌｌｆｌａｔｂｏｔｔｏｍｅｄｐｌａｔｅに分注し、翌日、ＣＴＬ活性試験に使用した。活性Ｔ細胞は、標的細胞に一定割合で入れて１８〜２４時間培養後、１０％のｆｏｒｍａｌｉｎで１時間固定させ、０．４％のｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔで３０分間染色した後、８０％のｍｅｔｈａｎｏｌを添加し、５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞毒性の活性を確認した。その結果を図１４に示した。

実験の結果、抗原処理４時間経過後、ピシバニール（ＯＫ４３２）を処理した群（実施例２−３）で、同時処理した群（実施例１−３）より高い抗原−特異性を確認（図１３）することができ、細胞毒性の結果においても、４時間後の処理群で高い活性を示した（図１４）。

実験例５．抗原とピシバニール（ＯＫ４３２）の時間差投与による効果の確認

ＡＦＰ、ＧＰＣ−３およびＭＡＧＥ−１をそれぞれ抗原に感作後、ピシバニール（ＯＫ４３２）の処理時期を調節して成熟化誘導した実施例３−１〜３−５を対象として、次のように樹状細胞の免疫誘導能力およびＣＴＬの抗原−特異的免疫反応誘導能力を確認した。

まず、分離した自己Ｔ細胞５ｘ１０^６の細胞を２ｍＬの培養培地に懸濁し、ＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ）の最終濃度が５〜２５μＭの濃度となるように添加して、３７℃の培養器で１５分間培養した。培養培地で２回洗浄した後、細胞を計数して、１ウェルあたり１ｘ１０^５の細胞で入れて用意された樹状細胞１ｘ１０^４個と５日間培養した。培養後、ＣＤ３抗体で染色して、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を行って増殖したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＦＳＥ^１０）の割合を分析し、その結果は、ＡＦＰ、ＧＰＣ−３およびＭＡＧＥ−１を抗原に用いたそれぞれの結果を取りまとめて図１５に示した。

また、分離した自己Ｔ細胞と樹状細胞を１０：１の割合で混合して５日培養後、培養液を採取して、ＥＬＩＳＡ方法でＩＦＮ−γを分析し、ＡＦＰ、ＧＰＣ−３およびＭＡＧＥ−１を抗原に用いたそれぞれの結果を取りまとめて図１６に示した。

それぞれ誘導されたＣＴＬは、比較例３の樹状細胞で１０：１の割合で１８〜２０時間反応させた後、ＩＦＮ−γを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴ分析法で分析し、ＡＦＰ、ＧＰＣ−３およびＭＡＧＥ−１を抗原に用いたそれぞれの結果を取りまとめて図１７に示した。実験の結果、抗原処理後、４時間後にピシバニール（ＯＫ４３２）処理グループのｋｉｌｌｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ、ＥＬＩＳＰＯＴの抗原特異性に優れていることを確認した。

Claims

未成熟樹状細胞に抗原を感作させるステップと、
インターロイキン−１ベータ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、プロスタグランジンＥ−２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２；ＰＧＥ２）、およびポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）のうちの１つ以上の成熟化因子を処理し、その４〜３０時間後、ＯＫ４３２を処理する成熟化ステップとを含む、抗原特異的樹状細胞を製造する方法。
前記抗原は、癌細胞株または癌組織粉砕物、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ−３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３）、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ−１（Ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、またはこれらの組換え蛋白質のうちの１つ以上である、請求項１に記載の抗原特異的樹状細胞を製造する方法。