KR101112641B1

KR101112641B1 - ＣＸＣＲ3+ＣＣＲ4-를 발현하는 Ｔｈ1 세포와 수지상 세포를 이용한 세포독성 Ｔ 세포의 ｉｎｖｉｔｒｏ 유도방법

Info

Publication number: KR101112641B1
Application number: KR1020090093438A
Authority: KR
Inventors: 김태규
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2012-03-09
Also published as: KR20110035633A

Abstract

본 발명은 CXCR3⁺CCR4^-를 발현하는 Th1 세포와 수지상 세포를 이용한 세포독성 T 세포의 in vitro 유도방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, CXCR3⁺CCR4^-를 발현하는 Th1 세포는 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하며, 이로부터 성숙된 수지상 세포는 in vitro에서 항원 특이 세포독성 T 세포를 유도할 수 있는 특성을 가지고 있어, 입양 T 세포 면역치료법에 적용할 수 있다.

입양 면역치료(adoptive immunotherapy), 수지상 세포, 분화(differentiation), 성숙(maturation), 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte), CCR4, CXCR3, Th 1 세포

Description

ＣＸＣＲ3+ＣＣＲ4-를 발현하는 Ｔｈ1 세포와 수지상 세포를 이용한 세포독성 Ｔ 세포의 ｉｎｖｉｔｒｏ 유도방법{In vitro generation of cytotoxic T cells by using CXCR3+CCR4-CD4+ T cells and dendritic cell}

본 발명은 CXCR3⁺CCR4^-를 발현하는 Th1 세포와 수지상 세포를 이용한 세포독성 T 세포의 in vitro 유도방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, CXCR3⁺CCR4^-를 발현하는 Th1 세포는 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하며, 이로부터 성숙된 수지상 세포는 in vitro에서 항원 특이 세포독성 T 세포를 유도할 수 있는 특성을 가지고 있어, 입양 T 세포 면역치료법에 적용할 수 있는 CXCR3⁺CCR4^-를 발현하는 Th1 세포와 수지상 세포를 이용한 세포독성 T 세포의 in vitro 유도방법에 관한 것이다.

종양 연관 항원(tumor associated antigen, TAA) 또는 바이러스 항원에 대한 생체외에서 생산된 세포 독성 T 세포주(cytotoxic T cell lines, CTLs)의 양자 전이는 면역 체계를 복구할 수 있으며, 악성종양의 제거 및 바이러스 감염 조절을 위 한 대단한 장래성을 보여주었다(Knutson et al., Cancer Immunol Immunother 2005;54:721-8; Mocellin et al., Curr Opin Investig Drugs 2005; 6:576-81; Palucka et al., Adv Exp Med Biol 2005;560:105-14). CD8⁺ T 세포에 의한 항종양 반응에 초점을 맞춘 선행 연구들과는 달리, 최근 보고들에서 APC 활성화 및 CD8⁺ T에 의한 종양 제거 조절 둘 다에서 CD4⁺T 세포의 필수 역할이 입증되었다(Nishimura et al., J Exp Med 1999;190:617; Surman et al., J Immunol 2000;164:562; Janssen et al., Nature 2005; 434:88). 생리학적 측면에서, APC는 활성화를 위해 CD4⁺T 세포에게 공통자극 신호를 전달하여 공통자극 분자(costimulatory molecules), 특히 CD40-CD40L 상호반응에 의해 APC를 서로 활성화한다(Prilliman et al., J Immunol 2002;169:4094-7). 이러한 상호반응은 결국 미분화 CD8⁺ T 세포를 준비시킨다. 기능성 CD4⁺ T 세포가 결핍된 쥐는 낮은 빈도의 항원 특이 CTL을 생산하며, 항종양 반응을 나쁘게 한다(Gao et al., Cancer Res 2002;62:6438). 또한, 활성화된 CD4⁺T 세포는 CTL의 활성을 유지하고 있고, 장기간 생존하는 CD27, 4-1BB 및 MHC II를 포함하여 표면 상에 공통자극 분자를 발현한다(Giuntoli et al., Clin Cancer Res 2002;8:922-31).

수지상 세포(DC)는 항원 흡수, 제시 및 공통자극 신호 전달 능력을 위한 APC의 선택이다. 그러나, 활성화 및 성숙된 형태로 분화하기 위한 신호가 없는 경우, DC는 보다 내성을 발생할 것이다(Lutz et al., Trends Immunol 2002;23:445-9). 위험 신호를 제공하는 성숙화 칵테일이 널리 사용되었을지라도, DC 백신의 제한된 임상적 성공을 통해 Th1 분극을 매개하기 위한 IL-12의 지속적인 생성을 위한 개선된 방법이 필요하다. CD40-CD40L의 상호반응은 주로 IL-12 합성 및 생성을 억제하는 TGF-β 및 IL-10를 포함한 인자들에게 주로 달려있다(Lyakh et al., J Immunol 2005;174:2061-670170; Larmonier et al., Cancer Immunol Immunother 2007;56:48-59). 생체 내 환경을 모방한 조건에서, DC를 성숙시키기 위해 성숙화 시약 대신 CD40L을 발현하는 활성화된 CD4⁺T 세포를 사용한 결과, DC의 타입 I 헬퍼 T 세포(Th1) 분극 능력을 나타내는 IL-12의 분비가 증가함이 입증되었다(Sato et al., Cancer Immunol Immunother 2004;53:53-61).

CD4⁺ T 세포의 서브세트에 Th1 세포를 도입함으로써, APC 및 T 세포 간의 상호작용을 향상시키고, 종양주위 임파절 임파구에서 미분화 CD8⁺ T 세포를 종양 특이 CTL로 전달한다. 또한, Th1으로의 PBL의 사전조정(preconditioning)은 배양 시 항원 특이 CD8⁺ T 세포에 의한 활력도 및 세포독성 활성(Chattopadhyay et al., Hum Immunol 2005;66:884-91)과, 종양주위 임파절 임파구에서 어쥬번트가 조절 T(Tr) 세포의 축적을 억제하므로 Th1 세포의 주입을 유의하게 증가시켰다(Zhang et al., Int Immunol 2007;19:151-61). Th1 및 Th2 세포는 표면 상에 케모카인 수용체, CCR5, CXCR3 및 CXCR6, 및 CCR3, CCR4, CCR7, CCR8, CRTh2 및 CXCR5 발현에 의거하 여 특정적으로 한정된다(Mosmann et al., Annu Rev Immunol 1989;7:145-73; Mackay et al., J Exp Med 1996;184:799-802; Ward et al., Immunity 1998;9:1-11; Lukacs et al., Nat Rev Immunol 2001;1:108). 케모카인 수용체의 발현이 겹침에도 불구하고, Th1/Th2 세포는 CXCR3⁺ 및 CCR4^-의 대표적인 마커 발현에 따라 분류할 수 있으며, 상기 타당성은 각 서브세트의 사이토카인 프로파일로 확인하였다(Kim et al., J Immunol 2003a;171:152-8).

본 발명의 목적은 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺T 세포가 수지상 세포의 성숙 및 분극, 종양 특이 세포독성 T 세포 유도능을 조사하여 입양 T 세포 치료법을 위한 새로운 전략을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포 및 미성숙 수지상 세포를 배양하는 단계를 포함하는 수지상 세포를 성숙시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한

종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포; 및

CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 포함하는 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포 및 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 이용하여 CD8⁺ T 세포를 자극시키는 단계를 포함하는 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 CXCR3⁺CCR4^-를 발현하는 Th1 세포는 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하며, 이로부터 성숙된 수지상 세포는 in vitro에서 항원 특이 세포독성 T 세포를 유도할 수 있는 특성을 가지고 있어, 입양 T 세포 면역치료법에 적용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 Th1 세포는 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현율이 높고, CCR4 발현율이 낮은 CD4⁺ T 세포로, Th1 타입의 사이토카인, 예를 들어, IFN-γ, TNF-α, 또는 IL-2의 발현율이 높고, IL-4, IL-5, 또는 IL-10의 발현율이 현저히 낮은 특징을 가지고 있다.

또한, 본 발명의 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포는 공통자극 분자, 예를 들어, CD80 등의 발현율이 현저히 높고, 수지상 세포를 활성화시킬 수 있는 사이토카인, 예를 들어, IL-12p70 등을 높은 수준으로 분비하여 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도할 수 있다.

또한, IL-12p70은 높은 수준으로 분비하지만, IL-10은 생성하지 않아 수지상 세포 성숙 시 세균성 자극과 관련된 지속적인 IL-12 합성의 부족을 극복할 수 있는 대안으로 적용할 수 있다. 따라서, 기존의 세균성 산물, 전염증성 사이토카인, 재조합 CD40L 등의 성숙 자극원을 대체할 수 있다.

본 발명의 Th1 세포는 건강한 사람의 말초혈 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)에서 분리할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 Th1 세포는 CXCR3 및 CCR4에 대한 형광물질이 결합된 단클론성 항체를 이용하여 FACs VANTAGE에 따라 분리할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 또한 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포 및 미성숙 수지상 세포를 배양하는 단계를 포함하는 수지상 세포를 성숙시키는 방법에 관한 것이다.

상기 미성숙 수지상 세포는 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포와 공동 배양함으로써 성숙될 수 있다.

본 발명의 수지상 세포를 성숙시키는 방법은 미성숙 수지상 세포를 포함하는 배양 접시에 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 첨가하여 37℃ 정도의 온도에서 24 내지 48 시간 동안 배양하여 실시할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포의 첨가량은 미성숙 수지상 세포의 세포수에 대해 1:2 내지 1:5 비율로 첨가할 수 있다.

본 발명은 또한

종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포; 및

CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 포함하는 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물은 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포에 상기 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포로 자극시킬 경우, 종양 또는 바이러스 항원에 특이적인 사이토카인, 예를 들어, IFN-γ를 높은 수준으로 분비하는 항원 특이 세포독성 T 세포의 빈도가 높고, 상기 항원에 대한 용혈율이 높아 종양 또는 바이러스성 질병 치료에 사용할 수 있다.

상기 종양 항원은 Wilm's Tumor antigen 1 (WT-1) 펩타이드일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열(RMFPNAPYL)을 가질 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

또한, 상기 바이러스 항원으로 Cytomegalovirus(CMV) 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열(NLVPMVATV)을 가질 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 항암제 또는 항바이러스제로서 특히 유용하게 사용할 수 있으며, 구체적으로는 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선앙, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종 등의 각종 고형암뿐만 아니라 백혈병을 비롯한 각종 혈액암 등의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있다.

구체적으로, 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명 의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여용 제형 또는 주사제와 같은 비경구 투여용 제형으로 제조할 수 있다. 경구 투여용 제형의 예로서는 정제, 트로치제, 로젠지, 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)를 들 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해서 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 마니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아질 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 또한 캡슐 제형의 경우에는 상기에서 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물의 다른 바람직한 양태는 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포 및 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 이용하여 CD8⁺ T 세포를 자극시키는 단계를 포함하는 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

제1단계는 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 성숙된 수지상 세포를 제조하는 단계이다.

상기 종양 또는 바이러스 항원은 전술한 바와 같다.

종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포는 성숙된 수지상 세포의 성 장을 완전히 억제할 수 있는 선량의 방사선을 조사하여 사용할 수 있다.

제2단계는 상기 단계에서 성숙된 수지상 세포와 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포로 CD8⁺ T 세포를 자극시켜 미분화된 세포독성 CD8⁺ T 세포를 유도하는 단계이다.

상기 CD8⁺ T 세포는 효과적인 자극을 위해 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포 및 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포에 대하여 세포수 대비 10 ～ 20:2:1의 비율로 혼합될 수 있다.

상기 단계에서 1차 자극된 CD8⁺ T 세포는 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 성숙된 수지상 세포 및 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포에 의한 2차 이상의 자극을 추가로 받을 수 있다.

상기 자극 후 IL-2 또는 IL-5 등의 사이토카인을 단독 또는 2종 이상 제공할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제 한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 케모카인 수용체를 이용한 Th1 타입의 세포로서의 CXCR3⁺CD4⁺ T 세포 특성 규명

케모카인 수용체가 다른 헬퍼 T 세포 세브세트를 특정하는 중요한 인자인지를 평가하기 위해, 3명의 건강한 개체로부터 CD4⁺ T 세포를 분리하여 표면 상에서 케모카인 수용체 발현 및 자극 시 사이토카인 분비 타입을 분석하였다.

이를 위해, Ficoll density gradient centrifugation (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 HLA A2⁺ 건강한 개체에서 PBMC를 분리하였다. AutoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 포함하는 마커 특이 마이크로비드를 이용하여 PBMCs로부터 CD14⁺ 단핵구 및 CD4+, CD8⁺ T 림프구를 분리하였다. 각 MACS 정제는 포지티브 셀렉션에 의해 실시되었다. 서브집단 세포의 상기 분리율은 95.5% (SD, 0.9%)였다. 본 발명을 위한 동의 형태 및 승인은 기증자 및 가톨릭대학교 의과대학 임상시험심사위원회로부터 얻었다.

각 케모카인 수용체들을 발현하는 헬퍼 T 세포의 빈도에서 현저한 차이가 있었다. 도 1A에 나타난 바와 같이, 3종류의 개체에서 유래한 CD4⁺ T 세포의 18 내지 21%는 Th1 타입 서브세트의 대표적인 분자인 CXCR3를 발현한 반면, Th2 타입 서브세트에 의해 발현되는 것으로 알려진 CCR4 포지티브 서브집단은 21 내지 33%로 발 현되었다. 또한, 헬퍼 T 세포 내 대다수는 CXCR3 또는 CCR4의 발현 없이 미분화된 상태로 남아있고 둘 다 거의 발현되지 않았다(미도시됨).

Th1- 및 Th2-타입 세포 둘 다에서 CCR4가 발현되었으므로, Th2 마커로서 CRTH2를 선택하여 CD4⁺ T 세포의 서브집단에서 활성화를 위한 사이토카인의 발현 패턴을 측정하였다. 이를 위해, Th1-타입 세포로 CXCR3 및 CCR4를, Th2-타입 세포로 CRTH2를 이용하여 VANTAGE sorting에 따라 CD4⁺ T 세포의 서브집단을 분리하고(도 1B), 48시간 자극 후 사이토카인 발현을 추적하였다. 구체적으로, 다음의 과정을 통해 세포를 염색하고, FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 분석을 실시하였다. CD4, CD8, CD80, CD83, CD86, HLA-ABC 및 HLA-DR에 대한 mAbs는 BD Pharmingen (San Diego, CA)에서 구입하여 사용하였다. 마이크로비드(Miltenyi, Auburn, CA)를 이용하여 CD4⁺ T 세포를 분리한 후, BD Pharmingen (San Diego, CA)에서 구입한 CXCR3 및 CCR4에 대한 형광물질이 결합된 단클론성 항체로 세포를 염색하였다. FACs vantage에 따라 CXCR3⁺CCR4^- Th1 서브집단을 다량 포함하는 세포 집단을 분리하였다. 이로부터 CXCR3^high/CCR4^low를 주로 포함하는 분리물을 얻었다.

사이토카인 분석을 위해, Human Th1/Th2 cytokine Cytometric bead array kit 및 CBA software (BD Pharmingen, San Jose, CA)를 이용하여 Th1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α 및 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-10)을 동시에 정량하였다. 이 분 석 키트는 5개의 마이크로비드의 혼합물을 제공한다. 또한, CBA Flex Set 및 FCAP Array software (BD Pharmingen, San Jose, CA)를 이용하여 염증성 사이토카인(IL-6)을 정량하였다. 뚜렷한 형광강도(FL-3)를 갖는 세포집단에 대해 각 사이토카인에 특이적인 항체들로 코팅하였다. 12×75 mm 팔콘 튜브(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 50㎕의 혈청 및 제공된 표준 사이토카인들을 혼합전의 마이크로비드에 첨가하였다. 시료들을 포함하는 비드(catching beads)의 혼합물을 2시간 동안 배양하고, PE와 결합된 사이토카인 항체들의 혼합물 50㎕를 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온에서 암 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 혼합물을 세척하고, 500×g, 5분간 원심분리한 다음, 300㎕의 세척용 완충용액으로 펠렛을 현탁하였다. FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA)는 셋업 비드로 조정하고, 각 시료 당 1200 이벤트를 얻었다. 각각의 사이토카인 농도 비율은 pg/mL로 나타내었다.

도 2는 총 CD4⁺ T 세포와 비교하여 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포의 사이토카인 프로파일을 나타낸 것으로, CXCR3⁺ 발현에 근거하여 VANTAGE sorting 후, anti-CD3/CD28 비드(1 비드/1 세포)를 이용하여 48시간 동안 세포(5×10³/well)를 자극하고, Th1/Th2 CBA에 의해 CD4⁺ T 세포와 분리한 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포의 사이토카인 비교 분석을 실시하였다. 상기 그래프는 3명의 다른 기증자로부터 실시한 3회 실험 결과에서 대표 실험의 3반복 수치의 평균±SD를 나타낸 것이다.

도 2에 나타난 바와 같이, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 생성이 CD4⁺ 및 분리된 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 서브집단을 유의하게 바꾸지는 않았으나, CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포로부터 분비된 타입 II 사이토카인, 예를 들어, IL-4, IL-5 및 IL-10의 수준은 기초 수준으로 유의하게 감소하였다.

CRTH2⁺CD4⁺ T 세포에서 분비된 사이토카인 타입은 주로 IL-4 및 IL-5 및 IL-10였고, IFN-γ 및 TNF-α는 자극 후 거의 검출되지 않았다. 심지어, Vantage sorting 후, 소수의 CXCR3^-CCR4^-CD4⁺ T 세포들이 여전히 존재하였으나, 이들은 활성화 후 어떠한 사이토카인도 발현되지 않으므로 상기 결과에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(미도시됨).

<실시예 2> CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포의 세포독성 CD8⁺ T 세포의 증식 유도 조사

CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포의 효과를 추측하기 위해, CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포를 이용하여 미성숙 DC를 활성화시키고(CXCR3⁺CD4⁺/DC), 증식 및 종양 항원인 WT-1에 대한 CD8⁺ T 세포의 세포독성을 유도하였다.

배양 실험은 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 서 실시하였다. DC 발생을 위해, 분리한 CD14⁺ 세포를 100 ng/ml GM-CSF (Endogen, Woburn, MA) 및 500 U/ml IL-4 (Genzyme, Cambridge, MA)를 포함하는 RPMI 완전배지에서 6일간 배양하였다. 세포의 75 내지 80%가 전형적인 DC의 형태 및 면역 표현형상을 나타냈으며, MHC class I 및 class II 분자 및 CD86의 발현을 포함하였다. 3-4일 후 상기 배지에 사이토카인을 보충하였다. 6일 째, 1000 U/ml TNF-α 및 1 ㎍/ml LPS (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)를 포함하는 성숙화 칵테일 또는 anti-CD3/CD28 자성비드(Dynal Biotech, Lake Success, NY) 하에서 1:5의 비율로 포함하는 헬퍼 T 세포를 첨가하여 48시간 동안 최종 성숙을 유도하였다.

성숙화 칵테일(MC) 또는 anti-CD3/CD28 자성비드를 1:5의 비율(DC:헬퍼 T 세포)로 포함하는 헬퍼 T 세포 하에서 96-웰 배양접시(5×10³ cells/well in 200 ㎕ vol.) 또는 24-웰 배양접시(2×10⁴cells/well in 1 ml vol.)에서 미성숙 DC를 자극하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 50㎕의 배양 상등액을 수득하여 -20℃에서 보관하고, 제조업체의 설명서에 따라 Cytometric Bead Array (CBA) kit (BD Biosciences, San Diego, CA), Bio-Plex Cytokine Assays (BioRad, CA) 또는 ELISA (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 사이토카인 생성을 분석하였다. 각 사이토카인 검출을 위한 최저 함량은 20 pg/ml였다.

자가 수지상 세포에 의한 WT-1 특이 CTL의 발생을 조사하기 위해, 다양한 자극원을 처리하여 성숙된 DC는 10 ㎍/ml에서 HLA-A02-restricted Wilm's Tumor antigen 1 (WT-1) peptide (RMFPNAPYL)을 이용하여 2시간 동안 감작시키고 나서, 성숙된 DC의 성장을 완전히 억제하는 선량(25 Gy)으로 방사선 조사하고, 대조군으로 Th 세포를 첨가하였다. 방사선 조사된 성숙된 DC 및 활성화된 Th 세포는 웰당 1×10⁵ 및 2×10⁵ 세포수를 24-웰 플레이트에 씨딩하였다. 그 후, 분리된 CD8⁺ T 세포를 첨가하여 웰당 DC 대 T 세포의 비율이 1:10이 되게 하였다. 공동배양 7일 후, 상기 자극된 세포를 수확하여 웰당 1×10⁶ 의 세포수로 재현탁하였다. 그 후, 펩타이드 감작 후 방사선 조사된 1×10⁵ 의 DC 및 2×10⁵의 Th 세포를 처리하여 상기 세포들을 다시 자극하였다. 2차 자극 후, 3-4일마다 상기 세포들에게 10 U/ml 인터루킨 2 (IL-2; Genzyme, Cambridge, MA) 및 인터루킨 15 (IL-15; R&D Systems, Minneapolis, MN)를 제공하였다. 상기 세포들은 최초 자극 이후 14일 또는 21일 이후 수확하여 즉시 분석하였다.

또한, CTL의 세포독성 활성은 4시간 동안 ⁵¹Cr 방출 분석을 통해 측정하였다. 간단히 말해, 다른 작동-표적세포의 비율(20:1 내지 40:1)로 하여, 작동세포로 항원 특이 T 세포를 사용하고 펩타이드에 의해 감작된 자가 LCL(1×10⁴ cells)을 표적세포로 사용하였다. 상기 실험은 3반복으로 실시하였고, 용혈율은 다음의 식에 따라 계산하였다.

용혈율=100%×(실험방출-자연방출)/(최대방출-자연방출)

상기 식에서, 최대 방출은 표적세포를 포함하는 배지 100㎕에 0.2% Triton X-100 100㎕를 첨가하여 얻었다.

데이터는 용혈 유니트 30 (LU30)로 나타내었으며, 1 용혈 유니트는 표적의 30% 특이 용혈을 달성하는데 필요한 배양액 유래의 세포 수이다. 용혈 유니트의 총 수는 다음의 식에 따라 얻었다:

2차 배양 후 얻은 작동세포의 총 수/30% 용혈(LU30)을 얻기 위한 작동 세포의 수

SD는 커브의 특정 영역에서 특이 용혈율의 평균±표준편차를 통해 라인의 최대 및 최소 기울기로부터 유래한 것이다.

각 실험에 대한 대조군 값은 다수의 대조군 개체에 대해 얻은 데이터로에서 얻었으며, 각 실험은 단일 대조군 값, 평균 및 표준편차를 갖는다. 그 후, 실험군간의 이분산성을 가정하고, 각 평균 분산은 각 실험을 위한 대조군 반응에 대해 비교하였고, 단측검정(one-tail unpaired t test)을 사용하여 통계적 유의값을 분석하였다. 유의적인 차이는 별표로 나타내었다.

도 3은 CXCR3⁺CD4⁺/DCs에 의한 항원 특이 CTL의 자극을 나타낸 것이다. 3A)는 WT-1 펩타이드로 감작된 자가 수지상 세포로 매주마다 자극한 CD8⁺ T 세포이고, 별표는 CXCR3⁺CD4⁺/DC로부터 CTL이 발생할 때 얻은 스팟 수가 mDC 및 CD4⁺/DC (*P = 0.031) 보다 유의적으로 높음을 나타낸다. 3B)는 자극원으로서 펩타이드 또는 빈 LCL에 대한 CTL(반응자)을 10:1의 비율로 하여 시험하였다. computer-assisted image analysis을 통해 스팟 수를 카운팅하였다. 별표는 CXCR3⁺CD4⁺/DC로 인해 CTL 이 발생할 때 스팟 수가 유의적으로 더 높음을 나타낸다(mDC에 대해 *P = 0.05; CD4⁺/DC에 대해 **P = 0.0092).

도 3A에 나타난 바와 같이, CXCR3⁺CD4⁺/DC에 의해 자극된 미분화된 CD8⁺ T 림프구는 CD4⁺ T 세포(CD4⁺/DC) 또는 LPS 및 TNF-α (mDC) (P = 0.031)를 포함하는 성숙 칵테일(maturation cocktail, MC) 중 어느 하나가 처리된 DC와 비교하여 WT-1 항원에 대해 약 2.5배 확대되었다. 따라서, CXCR3⁺CD4⁺/DC는 미분화된 T 세포를 준비시킴을 알 수 있었다.

또한, flow cytometry에 의한 분석 시 상기 확대된 집단은 비특이적 CD8⁺CD56⁺ T 세포를 포함하지 않았다(미도시됨).

또한, 증식된 T 세포가 항원 특이적인지 시험하기 위해, ELISPOT 분석에 따라 WT-1-펩타이드가 탑재된 표적에 대해 IFN-γ를 분비하는 CD8⁺ T 세포의 빈도를 측정하였다.

제조업체 설명서(BD Biosciences, San Diego, CA)에 따라 ELISPOT 분석을 실시하였다. 간단히 말해, 자극세포로 HLA-A02를 발현하는 펩타이드에 의해 감작된 자가 림프아구양(Lymphoblastoid) 세포주(LCL) 및 반응세포로 항원 특이 T-세포를 사용하여 각각 1×10³ 및 1×10⁴/well 로 플레이팅하였다. 반응세포집단은 10 내지 100 spots/well을 얻기 위해 과량 씨딩하여 정확하고 재현가능한 카운팅을 용이하게 하였다. 모든 세포들은 10% FBS가 첨가된 RPMI(최종 농도: 100 ㎕/well)에서 배양하였다. 5% CO₂ 하에서 37℃에서 20 내지 24시간 동안 독립 배양한 후, 플레이트는 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(PBS/0.05% Tw)로 4회 세척하였다. IFN-γ에 대한 바이오틴이 부착된 "검출" 항체(BD Biosciences, San Diego, CA)를 첨가하여 상기 웰을 배양하였다. 상기 플레이트는 PBS/0.05% Tw로 4회 세척하였다. 각 웰에 Avidin-peroxidase-complex (AEC, 100 ㎕; 제조업체 설명서에 따라 제조함; BD Biosciences, San Diego, CA)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 상기 플레이트는 PBS/0.05%Tw로 3회 세척한 다음, PBS로 다시 3회 세척하였다. AEC 기질(BD Biosciences, San Diego, CA)은 제조업체의 설명서에 따라 제조하였고, 0.45-㎛ 필터로 여과하여 사용하였다. 웰당 100 ㎕를 첨가하였다. 50-60분 후, 증류수를 첨가하여 반응을 종결시키고, 상기 플레이트는 멤브레인 제거 전에 완전히 건조하였다. 스팟 수는 independent blinded fashion (AID, Germany)에서 측정하였다. 각 실험에서, 결과는 spots/10000 세포로 나타냈고, 3 반복 실험 결과는 평균 및 표준편차로 계산하여 나타냈다.

도 3B에 나타난 바와 같이, CXCR3⁺CD4⁺/DCs (53±4 spots forming cells per 10⁴ cells)로부터 생성된 CTL에서 WT-1에 특이적인 IFN-γ를 분비하는 CD8⁺ T 세포가 매우 높은 빈도로 관찰된 반면, mDC (31.5±2 스팟) (P = 0.05) 및 CD4⁺/DC (22 ±3 스팟) (P ＜0.0092)로 자극된 것들에 의해 형성된 IFN-γ 스팟은 상대적으로 낮았다.

또한, 자가 수지상 세포에 의한 WT-1 특이 CTL 발생을 조사하였다. 도 4는 CXCR3⁺CD4⁺/DC에 의한 전체 용혈 활성 유도를 나타낸 것이다. WT-1-특이 CTL은 정상 기증자로부터 발생하였으며, 4A는 표준 4-h ⁵¹Cr 방출 분석에서 E:T 비율이 40:1 내지 20:1의 범위인 peptide-pulsed LCL(10 ㎍/ml)에 대한 반응에서, WT-1에 대한 3 종류의 수지상 세포에 의해 발생한 T 세포의 세포독성을 시험한 것이다. 상기 결과는 특이 용혈 비율; 펩타이드 하에서 용혈 비율(filled) 및 펩타이드가 없는 상태에서 용혈 비율(empty)로 표현하였다. 별표는 E:T 비율이 40:1인 조건에서 CXCR3⁺CD4⁺/DC로 인해 발생한 CTL의 용혈 활성이 CD4⁺/DC (*P = 0.04)에서 얻은 것 보다 유의하게 더 높음을 나타낸다. 4B는 공동배양하여 WT-1에 대한 용혈 유니트(Lytic units)를 계산한 것으로, 작동세포의 표적에의 노출로부터 용혈 유니트를 나타내기 위해 도 3A 및 4A의 결과를 결합한 것이다. 1 용혈 유니트는 30% 특이 용혈로 정의하였다. 상기 계산된 용혈 유니트는 작동세포의 수율(도 3A)을 단일 용혈 유니트를 얻기 위해 필요한 세포 수로 나눈 것이다. 3회 실험 중 대표 실험을 나타낸 것이다.

도 4A에 나타난 바와 같이, CXCR3⁺ CD4⁺/DCs에 의해 생성된 CTL의 WT-1 항원 에 대한 특이적인 용혈은 mDCs 및 CD4⁺/DCs (P = 0.04)에 의한 것보다 표적세포 비율(E:T)이 40:1에서 상대적으로 더 높은 수준에 도달하였다.

CTL의 전체 용혈 활성을 나타내기 위해 도 3A 및 4A의 결과를 합쳐보면, CXCR3⁺CD4⁺/DC에 의해 유도된 전체적인 용혈 가능성에서 차이가 훨씬 더 두드러졌다. 전체 용혈 유니트는 단일 배양 시 생성되는 세포독성 활성을 갖는 CD8⁺ T 세포를 나타낸다.

도 4B에 나타난 바와 같이, 배양 당 용혈 유니트의 총 수로 측정한 결과 CXCR3⁺CD4⁺/DC에 의한 CD8⁺ T 세포의 자극은 WT-1 항원에 대한 전체적인 작동 능력(effector activity)을 강하게 증가시켰다. 반대로, mDC에 의한 작동 T 세포의 자극은 WT-1에 대해 3배 이상 낮은 용혈 능력을 나타낸 반면, CD4⁺/DCs에 의해 자극된 CD8⁺ T 세포는 WT-1에 대한 CXCR3⁺CD4⁺/DCs 보다 약 4배 낮은 능력을 유도하였다.

상기 결과로부터 배양 당 용혈 유니트의 총 수로 측정한 결과 CXCR3⁺CD4⁺/DC는 어떤 종류의 약한 면역성 종양 항원에 대해서도 미분화된 T 세포를 준비시킴을 알 수 있었다.

<실시예 3> CXCR3+CD4+/DC의 공통자극 및 MHC 분자 발현 프로파일 조사

CXCR3⁺CD4⁺/DC는 CTL 발생에 효과적이므로 그러한 효과에 관여하는 요인들의 특성을 규명하였다. DC의 성숙 상태에 초점을 맞추어, flow cytometry를 이용하여 공통자극 및 MHC 분자들의 발현 프로파일을 분석하였다.

도 5는 수지상 세포에 의한 사이토카인 분비 타입 및 성숙 마커 분석 결과를 나타낸 것으로, 5A는 다양한 자극원과 48시간 동안 배양한 미성숙 DC(1×10⁵ cells)를 나타낸다. 각 마커에 대해, 발현은 마커 포지티브 세포의 %(bar graph) 및 다른 조건에서 얻은 평균 형광강도(MFI, line)로 나타냈다. 5B는 수지상 세포의 48시간 배양액(5×10³ cells)에서 CBA 분석을 통해 3종류의 사이토카인(IL-6, IL-10 및 IL-12p70)의 동시 정량을 실시한 결과이다. CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ 또는 CD4⁺ T 세포에 의해 분비되는 함량을 뺀 후 전체 농도로 표시하였다. 시료들은 3반복으로 준비되었고, 림포카인 농도는 평균±SD로 나타내었다. 상기 실험들은 적어도 두 번 실시하였고 결과는 유사하였으며, 대표 실험 세트의 결과를 나타내었다. 별표는 mDC 및 CXCR3⁺CD4⁺/DC (IL-12 및 IL-6에 대해 각각 *P = 0.009 및 0.003) 또는 CD4⁺/DC (IL-12는 *P = 0.007, IL-6은 0.002)를 비교하여 통계적 유의성을 나타낸 것이다.

도 5A에 나타난 바와 같이, 48시간 배양한 후, iDC에 비해 DC에서 발현하는 성숙 마커들의 수와 발현 강도의 수준이 증가하였다. 시험 마커들 중에서, MC 처리한 것과 비교하여 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ 또는 CD4⁺ T 세포를 포함하여 세포 자극원과 공동 배양할 때 CD80 발현이 크게 증가하였다. 그러나, DC의 표현형 발현에 대한 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 효과 간의 유의적인 차이는 없었다.

다음으로, 활성화된 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포가 DC에 의한 전염증성 사이토카인의 패턴에 영향을 주는 지 시험하였다.

도 5B에 나타난 바와 같이, mDC (CXCR3⁺CD4⁺/DC와 비교하여 P = 0.009, CD4⁺/DC와 비교하여 P = 0.03)와 비교하여 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ 및 CD4⁺ T 세포 둘 다 Th-1을 분극화하는 사이토카인 IL-12p70의 분비를 크게 유도하였다. 그러나, 대조군인 mDC에 의해 생성된 IL-10의 수준을 보면, CXCR3⁺CD4⁺/DC에 의한 분비는 절반 정도 감소한 반면, CD4⁺ T 세포가 유의적으로 IL-10을 분비함에도 불구하고(도 2A) CD4⁺/DC는 mDC 만큼 유지하고 있었다.

IL-6는 MC에 의해 성숙된 DC의 상등액에서 측정하였으며, 세포성 자극원(CXCR3⁺CD4⁺/DC와 비교하여 P = 0.007, CD4⁺/DC와 비교하여 P = 0.002)에 의해 성숙된 세포에서는 거의 검출되지 않았다. T 세포는 림포카인 생성에 관여하기 때문에서, 상기 데이터는 T 세포 단독의 사이토카인 생성을 밴 후 나타낸 것으로, DC는 주로 사이토카인 생성에 관여한다.

상기 결과로부터 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포는 in vitro 에서 통상의 성숙화 시약을 대신하여 DC 성숙화뿐만 아니라 CTL 발생을 개선하는데 사용될 수 있다. 이는 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포에 의해 Th2 사이토카인이 발현되지 않아 in vitro에서 DC에 의해 자극된 세포독성 T 세포의 발생을 향상시킬 수 있다.

또한, 활성화된 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포는 기초 수준의 IL-6, 낮은 수준의 IL-10, 높은 수준의 IL-12를 분비하여 성숙한 형태로의 DC 분화를 효과적으로 유도하므로, 세균성 산물, 전염증성 사이토카인 및 재조합 CD40L을 포함하여 통상적으로 사용되는 성숙화 자극원을 대체할 수 있다. CXCR3⁺ CD4⁺ T 세포는 mDC 및 CD4⁺/DC에 의해 분비된 수준과 비교하여 IL-10 생성을 촉진하지 않는 반면, IL-12p70은 지속적으로 높은 수준으로 분비하므로, DC 성숙화에서 Th1 세포의 이용은 세균성 자극과 관련된 지속된 IL-12 합성 부족을 극복하기 위한 대안을 제공할 수 있다.

또한, CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ 분자를 발현하는 Th1-타입 세포는 Th1-타입의 사이토카인을 보다 많이 제조하고, DC 활성화에 영향을 주어 CD8⁺ 작동 T 활성을 향상시킬 수 있다. 이는 Th1-타입 세포가 Th1-타입 반응으로의 DC 성숙화를 도우며, Th1-타입 세포에 의해 성숙된 DC는 in vitro 에서 항원 특이 CTL을 유도할 수 있다.

도 1은 CD4⁺ T 세포의 케모카인 수용체 발현 분석 결과를 나타낸 것으로, A)는 flow cytometry에 의한 3명의 기증자에서 분리한 말초 CD4⁺ T 세포의 다른 케모카인 수용체, CXCR3 및 CCR4의 표면 발현을 평가한 결과이고, B)는 FACs VANTAGE에 의한 선별된 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포 및 상기 선별된 집단의 분리율을 재실험한 결과(＞95%)이다.

도 2는 총 CD4+ T 세포와 비교하여 CXCR3⁺CCR4^-CD4⁺ T 세포의 사이토카인 프로파일을 나타낸 것이다.

도 3은 CXCR3⁺CD4⁺/DCs에 의한 항원 특이 CTL의 자극을 나타낸 것으로, A)는 WT-1 펩타이드로 감작된 자가 수지상 세포의 자극에 의한 유도된 CD8⁺ T 세포수이고, B)는 자극원으로서 펩타이드 또는 빈 LCL에 대한 CTL(반응자)을 10:1의 비율로 하여 얻은 CTL 스팟 수이다.

도 4는 CXCR3⁺CD4⁺/DC에 의한 전체 용혈 활성 유도를 나타낸 것으로, A)는 표준 4-h ⁵¹Cr 방출 분석에서 E:T 비율이 40:1 내지 20:1의 범위인 peptide-pulsed LCLs (10 ㎍/ml)에 대한 반응에서, WT-1에 대한 3 종류의 수지상 세포에 의해 발생한 T 세포의 세포독성 실험 결과이고, B)는 도 3A 및 4A의 결과를 종합하여 작동세포의 표적에 노출된 경우 용혈 유니트를 나타낸 것이다.

도 5는 수지상 세포에 의한 사이토카인 분비 타입 및 성숙 마커 분석 결과를 나타낸 것으로, A)는 다양한 자극원과 배양한 미성숙 DC에서 발현된 사이토카인이고, B)는 수지상 세포 배양액에서 정량된 사이토카인 IL-6, IL-10 및 IL-12p70이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> In vitro generation of cytotoxic T cells by using CXCR3+CCR4-CD4+ T cells and dendritic cell <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wilm's Tumor antigen 1 <400> 1 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Cytomegalovirus <400> 2 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5

Claims

CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물.
CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포 및 미성숙 수지상 세포를 배양하는 단계를 포함하는 수지상 세포를 성숙시키는 방법.
CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포에 의해 성숙화되고, 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포; 및

CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 포함하는 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물.
제3항에 있어서,

종양 항원이 Wilm's Tumor antigen 1 (WT-1) 펩타이드인 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물.
제4항에 있어서,

펩타이드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물.
제3항에 있어서,

바이러스 항원이 Cytomegalovirus(CMV) 펩타이드인 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,

펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 종양 또는 바이러스성 질병 치료용 약제학적 조성물.
Th1 세포와 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 성숙화된 수지상 세포를 자극원으로 하여 CD8⁺ T 세포로부터 항원 특이 세포독성 T 세포를 유도함에 있어서,

미성숙 상태의 수지상 세포 및 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 공동 배양하여 미성숙 상태의 수지상 세포를 성숙화 시키는 단계; 및

상기 단계에서 성숙화된 수지상 세포를 종양 또는 바이러스 항원으로 감작시키고, 상기 항원이 감작된 수지상 세포와 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포를 자극원으로 하여 CD8⁺ T 세포를 자극시키는 단계를 포함하는 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법.
제8항에 있어서,

종양 항원이 Wilm's Tumor antigen 1 (WT-1) 펩타이드인 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법.
제9항에 있어서,

펩타이드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법.
제8항에 있어서,

바이러스 항원이 Cytomegalovirus(CMV) 펩타이드인 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법.
제11항에 있어서,

펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법.
제8항에 있어서,

CD8⁺ T 세포, 종양 또는 바이러스 항원이 감작된 수지상 세포 및 CXCR3^high/CCR4^low를 발현하는 Th1 세포는 10 ～ 20:1:2의 세포수 비율로 혼합되는 항원 특이 세포독성 T 세포를 in vitro 유도하는 방법.